利用鱼的che活性检测水体污染程度的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用鱼的胆碱酯酶(CHE)活性检测水体污染的方法。本方法通过获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的CHE作为敏感生物标记物，实现检测待测水体的污染。本方法利用鱼的CHE作为敏感生物标记物，可敏感地监测镉等重金属污染、菲(Phe)等多环芳烃污染的污染程度和危害程度，为水体生态环境监测、毒理诊断、调控和防治提供准确、快速的科学方法。
【专利说明】
利用鱼的CHE活性检测水体污染程度的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及利用生物敏感标志物检测水体污染，更具体地说，本发明涉及一种利 用鱼的胆碱酯酶(CHE)活性检测水体污染程度的方法。
【背景技术】
[0002] 随着城镇化和工农业的迅猛发展，水体污染日益加剧。水域中的水体污染物也各 有不同，有的为单一污染物，也有多种污染物混合污染。对于未知水域中，不管是单一污染 物的污染，还是多种污染物的污染，怎样获悉水体是否被污染，甚至知道其污染程度，并能 直观判断该水域的污染对生物的危害已达到何种程度。对于水体中受到重金属或菲一种或 两种污染时，用化学方法可以定性、定量检测到污染，但是无法检测其危害性和危害程度以 及污染程度的准确性。
【发明内容】
[0003] 本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优 点。
[0004] 本发明还有一个目的就是提供一种利用鱼的CHE活性检测水体污染程度的方法， 本方法利用鱼的CHE作为敏感生物标记物，可敏感地监测镉等重金属污染的污染程度和危 害程度，还可以敏感检测菲(Phe)等多环芳烃污染的污染程度和危害程度，为水体生态环境 监测、毒理诊断、调控和防治提供准确、快速的科学方法。
[0005] 为了实现根据本发明的这些目的和其他优点，提供了一种利用鱼的CHE活性检测 水体污染程度的方法。本检测方法为获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的CHE作为 敏感生物标记物。其中，CHE是胆碱酯酶的简写。
[0006] 优选的是，所述鱼的CHE活性与水体中重金属镉的浓度呈负相关。
[0007] 优选的是，所述鱼的CHE活性与水体中菲的浓度呈负相关。
[0008] 优选的是，建立鱼的CHE活性与污染物浓度关系的标准曲线，然后将待检测水域中 的同种同大小的鱼的CHE活性与所述标准曲线比对，得到待检测水域中水体污染物浓度。
[0009] 优选的是，所述标准曲线为鱼的CHE活性与重金属镉浓度关系的曲线，或者鱼的 CHE活性与菲浓度关系的曲线。
[0010] 优选的是，所述鱼的CHE活性测定包括如下步骤：
[0011] 步骤一、待测样本处理:制备全鱼匀浆，然后离心分层，取上层清液为待测样本；
[0012] 步骤二、待测样本蛋白浓度的测定:分别将等量的双蒸水、蛋白标准品和待测样本 加入1、2、3号管中，并分别向各管加入等量的考马斯亮蓝显色剂，分别混匀，静置，预热，用 分光光度计并用双蒸水调零后，于lcm光径，在波长595nm处，测定1、2、3号管中物质的光密 度，分别记为1号0D值，2号0D值，3号0D值，然后代入如下公式计算得待测样本蛋白浓度：
[0014] 步骤三、在测定管中加入待测样本0.05mL，在空白管中加入双蒸水0.3mL，在对照 管中加入双蒸水0.05mL，然后分别在对照管和测定管中各加入乙酰胆碱应用液0.25mL，再 分别在测定管、空白管和对照管中各加入试剂盒的试剂一〇.5mL，混匀，37°C水浴反应;其 中，所述乙酰胆碱应用液为标准品；
[0015] 步骤四、分别在所述测定管、空白管和对照管中各加入试剂盒的试剂三应用液 lmL、试剂四0.5mL、试剂五0.25mL和试剂六0.5mL，混勾，然后用冷冻离心机，离心力为900g， 4°C，离心10分钟，取上清液，用分光光度计并用双蒸水调零后，于lcm光径，520nm波长处分 别测所述对照管、测定管和空白管的光密度，分别记为对照0D值，测定0D值，空白0D值，其中 取样量为加入测定管的待测样本的量，然后代入如下公式计算得鱼的CHE活性：
[0017] 优选的是，所述步骤一中全鱼匀浆为全鱼与浓度0.65%的鱼用生理盐水按质量比 为1:9配置，且所述离心用冷冻离心机，11028g，4°C，离心10min。
[0018] 优选的是，所述步骤二中等量的双蒸水、蛋白标准品和待测样本均为0.05ml，蛋白 标准品的浓度为〇.563g/L，分别加入考马斯亮蓝显色剂的量均为3ml，静置lOmin;所述步骤 三中添加的乙酰胆碱应用液为8μηιο 1/mL，反应时间为20min。
[0019] 优选的是，所述鱼为海水青鏘或淡水青鏘。
[0020] 本发明至少包括以下有益效果:本发明以水域中鱼的CHE作为敏感生物标记物，通 过对比CHE活性就可以检测出水体是否受到污染，不但检测准确和敏感，而且直观反映该水 域的污染对生物的危害程度。特别是鱼的CHE活性与水体中重金属镉或菲的一种或一种以 上的浓度均呈负相关，所以检测到鱼的CHE活性越低，其的水域受污染的程度越大，并且明 示受到重金属镉、菲的一种或一种以上的污染。通过建立鱼的CHE活性与重金属镉浓度关系 的标准曲线，鱼的CHE活性与菲浓度关系的曲线，可以将待检测水域中与建立标准曲线同种 同大小的鱼的CHE活性比对，获得水域中重金属镉浓度、菲浓度或综合污染浓度值，并且能 反映出目前的污染程度对生物是否在安全范围或受到危害。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书 能够据以实施。
[0022] 实施例1
[0023] 本方案利用鱼的CHE活性检测水体污染程度的方法，获取需要检测的水域中的鱼， 并采用所述鱼的CHE作为敏感生物标记物，通过检测鱼的CHE活性，然后比对同类同大小的 鱼的CHE活性与某污染物浓度关系的标准曲线，就可以检测出水体是否受到某污染物的污 染，不但检测准确，且敏感度高，而且能直观反映该水域的某污染物的污染程度及其对生物 的危害程度。
[0024] 实施例2
[0025] 本方案利用鱼的CHE活性检测水体污染程度的方法，获取需要检测的水域中的鱼， 并采用所述鱼的CHE作为敏感生物标记物，根据鱼的CHE活性与水体中重金属镉的浓度呈负 相关，通过测定鱼的CHE活性，然后比对同类同大小的鱼的CHE活性与镉浓度关系的标准曲 线，如果检测样本鱼的CHE活性比正常情况下的同类同大小的鱼的CHE活性低，则判断水域 受到镉的污染;CHE活性越低，则判断水域的镉污染越严重，甚至可判断是否达到危害水体 生物的程度。
[0026] 实施例3
[0027] 本方案利用鱼的CHE活性检测水体污染程度的方法，获取需要检测的水域中的鱼， 并采用所述鱼的CHE作为敏感生物标记物，根据鱼的CHE活性与水体中菲(Phe)等多环芳烃 的浓度呈负相关，通过测定鱼的CHE活性，然后比对同类同大小的鱼的CHE活性与菲浓度关 系的标准曲线，如果检测样本鱼的CHE活性比正常情况下的同类同大小的鱼的CHE活性低， 则判断水域受到菲的污染;鱼的CHE活性越低，则判断水域的菲污染越严重，甚至可判断是 否达到危害水体生物的程度。
[0028] 实施例4
[0029] 本方案利用鱼的CHE活性检测水体污染程度的方法，获取需要检测的水域中的鱼， 并采用所述鱼的CHE作为敏感生物标记物。首先通过实验建立鱼的CHE活性与某污染物浓度 关系的标准曲线，然后将待检测水域中的同种同大小的鱼的CHE活性与所述标准曲线比对， 得到待检测水域中某污染物的浓度。
[0030] 通过实验建立鱼的CHE活性与重金属镉浓度关系的标准曲线如下：
[0031] 本实验的检测样本以海水青鏘为例，分十组，每组3个平行在下述各组镉浓度中进 行养鱼实验，养鱼结束每个平行取3尾鱼样品测定，每组测定3x3 = 9个数据，将每组9个数据 数理统计后得到每组鱼的CHE活性大小。各组镉浓度分别为0，80，160，240，320，400，480， 560，640，720yg/L，养殖条件是盐度30 ± 2，水温为28 ± 2°C，pH为8 · 10，溶氧量彡6 · 1 Omg/L， 光暗比为14h:10h，各组实验操作均相同。每天投喂饲料三次，总投喂量为投喂时鱼体湿重 的5%。每天仔细观察和记录仔稚鱼活动、摄食、畸形、死亡等，并跟踪检测水体和鱼体镉的 变化，7天后随机采集鱼样品，分别称鱼湿体重，存于-80°C冰箱中（暂存保鲜)用于分子、基 因、生理、毒理和生化测定。测定并经数理统计的各组CHE活性分别是:37.36、30.10、28.55、 24.54、22.86、20.23、19.07、16.27、16.19、16.021]/11^口1〇1海水青鏘的(：册活性与水体中重 金属镉的浓度呈负相关，然后根据实验结果绘制标准曲线。
[0032] 通过实验建立鱼的CHE活性与菲(Phe)浓度关系的标准曲线如下：
[0033] 本实验的检测样本以海水青鏘为例，分五组，每组3个平行在下述各组菲浓度中进 行养鱼实验，养鱼结束每个平行取3个样品测定，每组测定3x3 = 9个数据，将每组9个数据数 理统计后得到每组鱼的CHE活性大小。各组菲浓度分别为0、250、500、750、100(^ 8/1，养殖条 件是盐度30±2，水温为28±2°C，pH为8.10，溶氧量彡6.10mg/L，光暗比为14h: 10h，各组实 验操作均相同。每天三次投喂饲料，总投喂量为投喂时鱼体湿重的5 %。每天仔细观察和记 录仔稚鱼活动、摄食、畸形、死亡等，并跟踪检测水体和鱼体菲的变化，7天后随机采集鱼样 品，分别称鱼湿体重，暂存于-80°C用于分子、基因、生理、毒理和生化测定。测定并经数理统 计的各组 CHE 活性分别是:44.347、33.02129.733、18.684、14.757U/mgprot。海水青鏘的CHE 活性与水体中菲(Phe)的浓度呈负相关，然后根据实验结果绘制标准曲线。
[0034]测定待测水域中的海水青鏘的CHE活性的具体步骤如下：
[0035]步骤一、待测样本处理:制备全鱼匀浆，然后离心分层，取上层清液为待测样本；
[0036]步骤二、待测样本蛋白浓度的测定:分别将等量的双蒸水、蛋白标准品和待测样本 加入1、2、3号管中，并分别向各管加入等量的考马斯亮蓝显色剂，分别混匀，静置，预热，用 分光光度计并用双蒸水调零后，于lcm光径，在波长595nm处，测定1、2、3号管中物质的光密 度(0D)，分别记为1号0D值，2号0D值，3号0D值，然后代入如下公式计算得待测样本蛋白浓 度：
[0038]步骤三、在测定管中加入待测样本0.05mL，在空白管中加入双蒸水0.3mL，在对照 管中加入双蒸水0.05mL，然后分别在对照管和测定管中各加入浓度为8umo 1 /mL的乙酰胆碱 应用液0.25mL，然后分别在测定管、空白管和对照管中各加入试剂盒的试剂一 0.5mL，混匀， 37 °C水浴反应20分钟;其中，所述乙酰胆碱应用液为标准品；
[0039]步骤四、分别在所述测定管、空白管和对照管中各加入试剂盒的试剂三应用液 lmL、试剂四0.5mL、试剂五0.25mL和试剂六0.5mL，混勾，然后用冷冻离心机，离心力900g，4 °C，离心10分钟，取上清液，用分光光度计并用双蒸水调零后，于lcm光径，520nm波长处分别 测所述对照管、测定管和空白管的光密度，分别记为对照0D值，测定0D值，空白0D值，其中取 样量为加入测定管的待测样本的量，然后代入如下公式计算得鱼的CHE活性：
[0041] 然后将计算得海水青鏘的CHE活性大小与标准曲线比对，不但可以知道水体是否 受到污染，而且从标准曲线中可以知道水体中镉浓度或菲浓度的大小或综合污染的大小， 更能知道水体对生物体危害程度。
[0042] 实施例6
[0043] 利用实验可以建立任何水体任何鱼种的鱼的CHE活性与重金属镉浓度关系的标准 曲线，或者建立不同种类的鱼的CHE活性与菲浓度关系的标准曲线，然后取待测水域中的鱼 做样本，只要做样本的鱼与建立标准曲线的鱼是同类同大小的即可进行比对。
[0044] 测定待测水域中的鱼的CHE活性具体步骤如下：
[0045] 步骤一、待测样本处理:取与建立标准曲线用鱼一样和大小相当的鱼制备全鱼匀 浆，全鱼匀浆为全鱼与0.65%浓度的鱼用生理盐水按质量比为1:9配置，然后用冷冻离心 机，11028g，4°C，离心10min分层，取上层清液为待测样本；
[0046] 步骤二、待测样本蛋白浓度的测定:分别将等量的双蒸水、蛋白标准品和待测样本 加入1、2、3号管中，并分别向各管加入等量的考马斯亮蓝显色剂，分别混匀，静置，预热，用 分光光度计并用双蒸水调零后，于lcm光径，在波长595nm处，测定1、2、3号管中物质的OD，分 另IJ记为1号0D值，2号0D值，3号0D值，然后代入如下公式计算得待测样本蛋白浓度：
[0048]步骤三、在测定管中加入待测样本0.05mL，在空白管中加入双蒸水0.3mL，在对照 管中加入双蒸水0.05mL，然后分别在对照管和测定管中各加入浓度为8umo 1 /mL的乙酰胆碱 应用液0.25mL，然后分别在测定管、空白管和对照管中各加入试剂盒的试剂一 0.5mL，混匀， 37 °C水浴反应20分钟;其中，所述乙酰胆碱应用液为标准品；
[0049]步骤四、分别在所述测定管、空白管和对照管中各加入试剂盒的试剂三应用液 lmL、试剂四0.5mL、试剂五0.25mL和试剂六0.5mL，混勾，然后用冷冻离心机，离心力为900g， 4°C，离心10分钟，取上清液，用分光光度计并用双蒸水调零后，于lcm光径，520nm波长处分 别测所述对照管、测定管和空白管的光密度，分别记为对照0D值，测定0D值，空白0D值，其中 取样量为加入测定管的待测样本的量，然后代入如下公式计算得鱼的CHE活性：
[0051 ]将计算得鱼的CHE活性大小与标准曲线比对，不但可以知道水体是否受污染，而且 从标准曲线中可以知道水体中镉浓度或菲浓度浓度的大小或综合污染的大小，更能知道水 体对生物体危害程度。
[0052]利用实验建立20日龄的淡水青鏘的CHE活性与重金属镉浓度关系的标准曲线，CHE 活性与菲浓度关系的标准曲线，然后取待测水域中的鱼做样本，只要取得样本的鱼与建立 标准曲线的鱼是同类同大小的即可进行比对。
[0053]取得待测水域中20日龄的淡水青鏘做样本，然后测定待测水域中的该鱼的CHE活 性具体步骤如下：
[0054]步骤一、待测样本处理:取与建立标准曲线用鱼一样和大小相当的鱼制备全鱼匀 浆，全鱼匀浆为全鱼与0.65%浓度的鱼用生理盐水按质量比为1:9配置，然后用冷冻离心 机，离心力为ll〇28g，4°C，离心10min分层，取上层清液为待测样本；
[0055]步骤二、步骤二、待测样本蛋白浓度的测定:分别将双蒸水、浓度为0.563g/L的蛋 白标准品和待测样本各0.05ml加入1、2、3号管中，并分别向各管加入考马斯亮蓝显色剂 3ml，分别混勾，静置lOmin，预热到35°C，预热待用分光光度计并用双蒸水调零后，于lcm光 径，波长595nm处，测定1、2、3号管中溶液的光密度(0D)，分别记为1号0D值，2号0D值，3号0D 值，然后代入如下公式计算得待测样本蛋白浓度：
[0057]步骤三、在测定管中加入待测样本0.05mL，在空白管中加入双蒸水0.3mL，在对照 管中加入双蒸水0.05mL，然后分别在对照管和测定管中各加入浓度为8umo 1 /mL的乙酰胆碱 应用液0.25mL，然后分别在测定管、空白管和对照管中各加入南京生物工程研究所生产的 试剂盒的试剂一〇. 5mL，混匀，37°C水浴反应20分钟;其中，所述乙酰胆碱应用液为标准品； [0058]步骤四、分别在所述测定管、空白管和对照管中各加入试剂盒的试剂三应用液 lmL、试剂四0.5mL、试剂五0.25mL和试剂六0.5mL，混勾，然后用冷冻离心机，离心力900g，4 °C，离心10分钟，取上清液，用分光光度计并用双蒸水调零后，于lcm光径，520nm波长处分别 测所述对照管、测定管和空白管的光密度，分别记为对照0D值，测定0D值，空白0D值，其中取 样量为加入测定管的待测样本的量，然后代入如下公式计算得鱼的CHE活性为25.10U/ mgprot：
[0060] 将计算得鱼的CHE活性大小，与CHE活性与重金属镉浓度关系的标准曲线，CHE活性 与菲浓度关系的标准曲线，分别比对，得到待测水域的镉污染浓度为232yg/L，菲浓度为601 yg/L，这样既可以知道水体已受到污染，而且从标准曲线中可以知道水体中镉浓度、菲浓度 的大小，更能知道水体对生物体危害程度。
[0061] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 应用范例，它完全适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地另 行修改他用，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特 定的细节和这里示出与描述的实施例。
【主权项】
1. 一种利用鱼的CHE活性检测水体污染程度的方法，其特征在于，获取需要检测的水域 中的鱼，并采用所述鱼的CHE作为敏感生物标记物。2. 根据权利要求1所述的利用鱼的CHE活性检测水体污染程度的方法，其特征在于，所 述鱼的CHE活性与水体中重金属镉的浓度呈负相关。3. 根据权利要求1所述的利用鱼的CHE活性检测水体污染程度的方法，其特征在于，所 述鱼的CHE活性与水体中菲的浓度呈负相关。4. 根据权利要求1-3任一项所述的利用鱼的CHE活性检测水体污染程度的方法，其特征 在于，建立鱼的CHE活性与污染物浓度关系的标准曲线，然后将待检测水域中的同种同大小 的鱼的CHE活性与所述标准曲线比对，得到待检测水域中水体污染物浓度。5. 根据权利要求4所述的利用鱼的CHE活性检测水体污染程度的方法，其特征在于，所 述标准曲线为鱼的CHE活性与重金属镉浓度关系的曲线，或者鱼的CHE活性与菲浓度关系的 曲线。6. 根据权利要求5所述的利用鱼的CHE活性检测水体污染程度的方法，其特征在于，所 述鱼的CHE活性测定包括如下步骤： 步骤一、待测样本处理:制备全鱼匀浆，然后离心，取上层清液为待测样本； 步骤二、待测样本蛋白浓度的测定:分别将等量的双蒸水、蛋白标准品和待测样本加入 1、2、3号管中，并分别向各管加入等量的考马斯亮蓝显色剂，分别混匀，静置，预热分光光度 计并用双蒸水调零后，于Icm光径，在波长595nm处，测定1、2、3号管中物质的光密度，分别记 为1号OD值，2号OD值，3号OD倌，然后代入如下公式计筧得待测样本蛋白浓度： 待測样本蛋白味度蛋白标准晶浓度（g/L) 步骤三、在测定管中加入待测样本0.05mL，在空白管中加入双蒸水0.3mL，在对照管中 加入双蒸水〇. 〇5mL，然后分别在对照管和测定管中各加入乙酰胆碱应用液0.25mL，再分别 在测定管、空白管和对照管中各加入试剂盒的试剂一〇.5mL，混匀，37°C水浴反应;其中，所 述乙酰胆碱应用液为标准品； 步骤四、分别在所述测定管、空白管和对照管中各加入试剂盒的试剂三应用液ImU试 剂四0.5mL、试剂五0.25mL和试剂六0.5mL，混勾，然后用冷冻离心机，离心力为900g，4°C，离 心10分钟，取上清液，用分光光度计并用双蒸水调零后，于Icm光径，520nm波长处分别测所 述对照管、测定管和空白管的光密度，分别记为对照OD值，测定OD值，空白OD值，其中取样量 为加入测定管的待测样本的量，然后代入如下公式计算得鱼的CHE活性：7. 根据权利要求6所述的利用鱼的CHE活性检测水体污染程度的方法，其特征在于，所 述步骤一中全鱼匀浆为全鱼与浓度0.65%的鱼用生理盐水按质量比为1:9配置，且所述离 心用冷冻离心机，ll〇28g，4°C，离心10min。8. 根据权利要求6所述的利用鱼的CHE活性检测水体污染程度的方法，其特征在于，所 述步骤^中等量的双蒸水、蛋白标准品和待测样本均为〇 . 〇 5m 1，蛋白标准品的浓度为 0.563g/L，分别加入考马斯亮蓝显色剂的量均为3ml，静置IOmin;所述步骤三中添加的乙酰 胆碱应用液为8ymol/mL，反应时间为20min。9.根据权利要求6-8任一项所述的利用鱼的CHE活性检测水体污染程度的方法，其特征 在于，所述鱼为海水青鏘或淡水青鏘。
【文档编号】G01N21/31GK106018304SQ201610546256
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月12日
【发明人】许友卿, 丁兆坤, 刘阳, 刘富娟, 李云杰
【申请人】广西大学