专利名称：唐氏综合征21号染色体相关miRNA、基因、筛选方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种与唐氏综合征21号染色体相关的miRNA、基因、筛选方法和应用。
背景技术：
唐氏综合征(Down syndrome,简称DS)又叫21三体(Trisomy 21,Ts21)综合征，因多出一条或部分21号染色体而导致的一种出生缺陷型疾病。约每700例婴儿中就有I例。患者表现为先天性智力低下、精神迟钝、体格发育不全和先天性心脏缺陷等80多种临床症状。生物学研究已发现21号染色体上含有500多个基因，包括5个miRNAUicroRNA，微小 RNA)基因miR-99a、let_7c、miR-125b_2、miR-155 和 miR-802。miRNA 是一类长度为19^25个核苷酸的内生性单链非编码调节RNA。miRNA可与靶基因mRNA的3’端特异性结合，使其降解或转录抑制，在细胞的增值、分化、凋亡、胚胎的发育和组织的分化等生物学过程中具有非常重要的作用。研究表明21号染色体上5个miRNA的过表达均与DS患者各种临床性状有关，如智力缺陷、儿童白血病、免疫缺陷、低血压等。但与21号染色体相关的miRNA还有很多，因此，研究这些miRNA，特别是与唐氏综合征特异性相关的miRNA具有重要的研究价值。
发明内容
基于此，有必要提供一种与唐氏综合征21号染色体相关的miRNA、基因、筛选方法和应用。一种与唐氏综合征21号染色体相`关的miRNA基因，具有如SEQ ID NO.1的核苷酸序列。一种与唐氏综合征21号染色体相关的miRNA的前体，具有如SEQ ID NO. 2的核苷酸序列。一种与唐氏综合征21号染色体相关的miRNA，具有如SEQ ID NO. 3的核苷酸序列。上述miRNA、其基因及其前体基因在制备诊断或检测唐氏综合征试剂中的应用。上述miRNA、其基因及其前体基因在制备诊断或检测唐氏综合征基因检测芯片中的应用。一种唐氏综合征21号染色体相关miRNA的筛选方法，包括如下步骤分别采集唐氏综合征胎儿和正常胎儿的脐带血单个核细胞样品；提取所述样品中的总RNA，用变性聚丙烯胺凝胶电泳分离回收长度不大于30个核苷酸的小RNA，在T4RNA连接酶的作用下，在回收的小RNA的5’端加上如SEQ ID NO. 4的核苷酸序列接头，3’端加上如SEQ ID NO. 5的核苷酸序列接头，经TBE聚丙烯胺凝胶电泳纯化后，经Solexa小RNA反转录引物和PCR扩增后制成小RNA的cDNA文库，再使用TBE聚丙烯胺凝胶电泳对所述cDNA文库进行纯化并进行测序分析；对测序后所得的小RNA分子进行去接头和去污染处理，并从中筛选出长度为18^30nt的核苷酸序列，用SOAP软件将所得序列与人全基因组序列进行比对分析，将匹配上的序列按照GenBank>Rfam>miRBasel7. 0>repeat>exon>intron的优先级顺序进行分类注释，然后将intron和未比对上序列的小RNA分子序列作为新miRNA的数据源，用MIREAP和MiPred两种软件对所述新miRNA所在的染色体进行分析，得到所述唐氏综合征21号染色体相关miRNA。上述唐氏综合征21号染色体相关miRNA或其前体是与唐氏综合征患者特异性相关的miRNA,进一步研究发现，其与基因的表达、细胞分化的调节、胚胎形态的发生和心脏的发育有关。因此，该新的miRNA的发现，为进一步研究21号染色体的功能，探索唐氏综合征患者新的治疗靶点提供了实验理论基础和新的方向，并可应用在制备诊断或检测唐氏综合征患者试剂的领域，为唐氏综合征疾病的诊断和检测提供简便的手段。
图1为一实施方式的唐氏综合征胎儿的脐带血染色体核型分析结果图；图2为正常胎儿的脐带血染色体核型分析结果图；图3为miR_nov21在21号染色体上的座位分析图。
具体实施例方式下面主要结合具体实 施例和附图对唐氏综合征21号染色体相关miRNA、基因、筛选方法和应用作进一步详细的说明。一实施方式的筛选方法、结果及相关检测包括如下步骤1、筛选1.1、样本收集及胎儿脐带血的采集和保存收集2011年2月 2011年6月于深圳市人民医院行产前诊断、经常规G显带染色体核型分析确诊为标准型DS胎儿的脐带血样本5例，正常胎儿脐带血3例。5例DS胎儿脐带血中，2例用于小RNA建库进行测序分析，3例用于PCR验证。该研究由深圳市人民医院伦理委员会批准，且征得所有孕妇知情同意。在超声引导下，抽取If 22孕周DS胎儿和正常胎儿脐带血2 3mL于EDTA抗凝管中(BD公司)，然后运用淋巴细胞分离液(Invitrogen公司)提取脐带血单个核细胞,融入Trizol试剂(Invitrogen公司)，置于冻存管中，冻存于_80°C备用。1. 2、脐带血RNA提取和Solexa测序脐带血单个核细胞小RNA文库的建立与测序、生物信息学分析在华大基因研究院协助下完成，整个实验过程严格按照试剂和仪器操作说明书进行。主要实验流程包括采用Invitrogen T rizol试剂盒抽提2例DS胎儿脐带血样本的总RNA，再把2个样本等量混合，取10μ g混合RNA样品用15%的变性聚丙烯胺凝胶电泳分离回收核苷酸(nucleotide, nt)长度不大于30个核苷酸的小RNA ;再在T4RNA连接酶(Promega公司)作用下，在小RNA两端分别加上接头，其中，5 ’端接头的序列是 5 ’ -GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3 ’ (SEQ ID NO. 4 )和 3 ’ 端接头的序列是5’-pUCGUAUGCCGUCUUCUGCUUGidT-3’ (SEQ ID NO. 5) (P 表示磷酸基团(phosphate);idT 表不反向脱氧胸腺卩密唳(inverteddeoxythymidine)),经 10wt% 的 tr1-borate-EDTA (TBE)聚丙烯胺凝胶电泳纯化后，由Solexa小RNA反转录引物和PCR扩增后制成小RNA的cDNA文库。然后用6wt%TBE聚丙烯胺凝胶电泳对cDNA文库进行纯化,用Illumina Hiq-2000测序仪进行测序分析。1. 3、数据处理和新miRNA的预测首先对测序所得的小RNA分子序列进行去接头、去低质量和去污染等处理得到18 30个核苷酸长度的干净序列。然后用SOAP (2.0)软件将所得干净序列与人全基因组序列进行比对分析，将匹配上的序列按照GenBank>R fam (10.0)>miRBasel7. 0>repeat>exon>intron的优先级顺序进行分类注释,对未比对上任何注释信息的序列用“Unanno”表示。然后将Intron和Unanno的小RNA分子序列作为新miRNA预测的数据源，运用MIREAP和MiPred两种软件进行新miRNA的预测分析。1. 4、Stem-loop RT-PCR 验证为验证Solexa测序分析结果的可靠性以及21号染色体上新miRNA基因在DS胎儿和正常胎儿中的表达变化，运用SYBR Green Stem-loop RT-PCR对21号染色体上新miRNA的成熟体进行验证。运用Invitrogen Trizol试剂盒分别提取剩余3例DS胎儿脐带血和3例正常胎儿脐带血单个核细胞的总RNA ;在AB1- 7500实时定量PCR仪上，采用20 μ L反应体系，运用miRNA分子特异性茎环逆转录引物(中国上海吉玛公司)和M-MLV反转录试剂盒(Promega公司)，经逆转录反应后，在95°C预变性5min，95°C变性15s，60°C退火15s，72°C延伸32s的反应条件下连续扩增40个循环，每个基因设置3个复孔，cDNA浓度为1:20，以rRNAU6为内参，采用2-Λ Aet方法计算21号染色体上新miRNA基因的相对表达量。2、结果2.1、胎儿脐带血染色体核型分析如图1所示，5例DS胎儿脐带血经染色体核型分析，显示均为标准DS核型。图2为正常胎儿的脐带血染色体核型。2. 2、小RNA分子序列分类注释通过Solexa高通量测序技术对DS胎儿脐带血单个核细胞小RNA文库的测序分析，总共得到23324424条1(Γ30核苷酸长度的高质量序列，经去接头、去低质量和去污染序列等处理后获得21770729条18 30核苷酸长度的干净序列，占总量的90. 6%，合计280056种小RNA。运用S0AP(2. O)软件把所得各种小RNA与人全基因组序列(hgl9)进行比对，比对过程中最多允许2个碱基的错配，得到8087250匹配序列，共58523种小RNA分子。与公共数据库比对，将匹配上全基因组的小RNA序列分类注释为miRNA、tRNA、rRNA、细胞核小RNA序列(snRNA)、核仁小RNA序列(snoRNA)>piRNA>mRNA降解片段、重复序列(repeat)、细胞浆小RNA序列(scRNA)、信号识别颗粒小RNA序列(srpRNA)、内含子序列(Intron)和未注释序列(Unanno)，共12类。见表I。表I与全基因组序列匹配的小RNA分类注释表
权利要求
1.一种与唐氏综合征21号染色体相关的miRNA基因，具有如SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的miRNA基因在制备诊断或检测唐氏综合征试剂中的应用。
3.如权利要求1所述的miRNA基因在制备诊断或检测唐氏综合征基因检测芯片中的应用。
4.一种与唐氏综合征21号染色体相关的miRNA的前体，具有如SEQ IDNO. 2的核苷酸序列。
5.如权利要求1所述的miRNA的前体在制备诊断或检测唐氏综合征试剂中的应用。
6.如权利要求1所述的miRNA的前体在制备诊断或检测唐氏综合征试剂中的应用。
7.一种与唐氏综合征21号染色体相关的miRNA，具有如SEQ ID NO. 3的核苷酸序列。
8.如权利要求1所述的miRNA在制备诊断或检测唐氏综合征试剂中的应用。
9.如权利要求1所述的miRNA在制备诊断或检测唐氏综合征基因检测芯片中的应用。
10.一种唐氏综合征21号染色体相关miRNA的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤 分别采集唐氏综合征胎儿和正常胎儿的脐带血单个核细胞样品； 提取所述样品中的总RNA，用变性聚丙烯胺凝胶电泳分离回收长度不大于30个核苷酸的小RNA，在T4RNA连接酶的作用下，在回收的小RNA的5’端加上如SEQ ID NO. 4的核苷酸序列接头，3’端加上如SEQ ID NO. 5的核苷酸序列接头，经TBE聚丙烯胺凝胶电泳纯化后，经Solexa小RNA反转录引物和PCR扩增后制成小RNA的cDNA文库，再使用TBE聚丙烯胺凝胶电泳对所述cDNA文库进行纯化并进行测序分析； 对测序后所得的小RNA分子进行去接头和去污染处理，并从中筛选出长度为18 30nt的核苷酸序列，用SOAP软件将所得序列与人全基因组序列进行比对分析，将匹配上的序列按照GenBank>Rfam>miRBasel7. 0>repeat>exon>intron的优先级顺序进行分类注释，然后将intron和未比对上序列的小RNA分子序列作为新miRNA的数据源，用MIREAP和MiPred两种软件对所述新miRNA所在的染色体进行分析，得到所述唐氏综合征21号染色体相关miRNA。
全文摘要
本发明涉及一种与唐氏综合征21号染色体相关的miRNA及其前体序列，其具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列，该miRNA位于21号染色体“DS关键区域”内，与DS疾病的发生和发展相关。因而，该新的miRNA可以广泛应用在制备诊断或检测DS基因检测芯片或相关试剂的制备过程中。此外，本发明还涉及一种该miRNA的筛选方法。
文档编号C12Q1/68GK103045596SQ201210555209
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月20日 优先权日2012年12月20日
发明者徐勇, 李武县, 戴勇 申请人:徐勇