产前筛选的制作方法

文档序号:9693046
产前筛选的制作方法
【专利说明】产前筛选 发明领域
[0001] 本发明设及一种筛选母体尿液样品的质谱指纹特征变化的方法,发现所述质谱指 纹特征变化是胎儿非整倍性(例如唐氏综合征)的特征,并应用于筛选妊娠的其它胎儿异常 和妊娠素乱(包括妊娠滋养细胞疾病)。
[0002] 具体而言,本发明设及一种检测胎儿非整倍性的方法,所述胎儿非整倍性例如唐 氏综合征、帕陶综合征、特纳综合征、克兰费尔特综合征、爱德华综合征和Ξ重X。
【背景技术】
[0003] 21Ξ体综合征,通常称为唐氏综合征,其特征是染色体21的额外拷贝,并且是最常 见的严重先天异常之一,其成为学龄儿童显著学习障碍的最常见单一因素。受唐氏综合征 影响的人具有严重的智力缺陷,缩短的预期寿命,W及异常免疫应答,运使其易受严重感 染。唐氏综合征患者中有40%具有先天性屯、脏病和较高的罹患白血病的风险。患有唐氏综 合征的人在40岁之后易于发展阿兹海默症疾病的神经病理学变化特点。
[0004] 在孕早期(即约15~16周),唐氏综合征的确定性测试是羊膜穿刺术后的染色体组 型分析。运种分析所需的羊水取样具有诱导自发流产的风险,100例中有约1例发生该状况。
[0005] 最初,母亲年龄是鉴定女性是否具有唐氏综合征婴儿高风险的唯一因素。40岁时, 产有唐氏综合征婴儿的几率是百分之一。运已导致多家医院为超过某一年龄(通常为35或 37岁)的女性提供羊膜穿刺术。然而,运仅能鉴定出全部唐氏综合征病例中的15-30%,因为 大多数病例仍会在更年轻的女性中出现。
[0006] 在过去的25年中,已发展出多种标志物血液测试W筛选唐氏综合征。血清α-胎蛋 白(AFP)加人绒膜促性腺激素化CG)是最常用的标志物。然而,更近期时已将非偶联雌Ξ醇 (证3)和抑制素 A添加至需要筛选的标志物。
[0007] 筛选性能根据对于所用的标志物的选择和是否采用超声来估计孕龄并检测15-22 周时的颈部皱權厚度而变化。当筛选血清标志物且将超声与母亲年龄联用时,5%假阳性率 的检出率估计为:双重测试(AFP+hCG)为59%,S重测试(AFP,hCG,证3)为69%,且四重测试 (包含抑制素 A)为76%。
[000引现有的筛选技术是昂贵的,并且要求W最小侵入性操作对血液取样,并且对针对 胎龄的水平变化进行校正的检测值进行数学建模。
[0009] 人绒膜促性腺激素化CG)是一种糖肤激素,其由胎儿胎盘的合胞滋养层产生,并且 分子量为约38千道尔顿。其可通过在受精后数天内基于母体尿液中的免疫测定来检测。完 整的hCG分子是异质二聚体,其包含特定的的5亚基,该亚基非共价结合至α亚基,运对于其 它糖蛋白是常见的。
[0010] 在唐氏综合征中,平均上,完整hCG和游离β-亚基的母体血清水平升高,但升高的 程度大于30游离β-hCG。在妊娠女性的血清和尿液中均能检测到HCG,其形式为hCG的游离α 和β亚基,W及hCG的降解产物和游离β-亚基hCG的降解产物。
[0011] hCG的β-亚基的最终降解产物是尿促性腺激素肤化GP),也称作β-核屯、-hCG、f3-核 屯、片段、e-核屯、或尿促性腺激素片段(uG巧。
[0012] UGP被分泌进入尿液。W097/03363描述了唐氏综合征的产前尿液筛选方法,其包括 在妊娠头Ξ个月中检测母体尿液样品,W测定样品中的UGP水平是否高于来自正常的10例 妊娠的尿液样品中所见的UGP水平。描述于W097/03363的方法采用UGP特异性的免疫测定。 [00 1引已通过HPLC质谱法和晶体分析成熟表征了hCG。利用膜蛋白酶消化,已采用基质辅 助激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI-ToF MS)进行hCG及其亚基的肤质量图谱分析。 化coby,E. S等在C1 inical Chemistry,46(11),1796-1803(2000)中描述了从妊娠尿液纯化 hCGf3-核屯、片段化CG化f),其因二硫苏糖醇(DTT)减少而减少,并且由MALDI-ToF MS进行分 析。他们总结称,产生了 DTT-减少的hCGPcf质谱,但并没有准确确定hCGikf糖基化可能会导 致独特的"指纹"。来自妊娠女性的未经提取的尿液样品的MLDI-ToF MS分析仅显示对应于 蛋白质化hCG化f的宽峰。
[0014] W003/065043描述了对MALDI-T0F MS祀标上的免疫球蛋白的固定,其随后用于蛋 白质(例如hCG化f)的鉴定和相对定量。
[0015] 人绒膜促性腺激素化CG)是异质二聚化的糖蛋白激素,其具有8个糖基化位点,包 含四个N-连接的寡糖和四个0-连接的寡糖。所述N-连接的寡糖通过天冬酷胺残基上的β-Ν-糖巧键连接至多至肤链;两个在α亚基上且两个在β亚基上。他们共有相同的基础结构特点: Ν-乙酷基葡萄糖胺(GLcNAc)连接至天冬酷胺残基上,然后连接至另一个化cNAc、甘露糖和 甘露糖的分支。运是单触角(monantennary)戊糖核屯、,其剩余组分保持可变。所述0-连接的 寡糖由α-Ο-糖巧键连接至β-亚基簇基末端肤的丝氨酸残基上。
[0016] 已广泛报道在正常和异常妊娠中,碳水化合物异质性的hCG的游离β-亚基化CGi3) 具有可变的单-、二-和Ξ触角碳水化合物结构化lliott MM,Kardana A,Lustbader JW, Cole LA.Endocrine.1997年8月;7(1):15-32,Carbohydrate and peptide structure of the 曰Iph曰-曰nd bet曰-subunits of hum曰n chorionic gon曰dotropin from norm曰1 曰nd aberrant pre即an巧and choriocarcinoma(来自正常和异常妊娠和绒膜癌的人绒膜促性 腺激素的α-和β-亚基的碳水化合物和肤结构))。
[0017] 被称为β-核屯、片段化CGikf)的hCG的β-亚基的降解产物由经四个二硫桥连接的来 自hCG的β-亚基的肤,即,肤β6-40和化5-92组成。其在代谢之前保留了原始hC地分子的多个 抗原决定簇,所述代谢主要在肾中发生。该说-40肤链包含两个hCGPN-连接的碳水化合物部 分,尽管寡糖因代谢而被截短。
[0018] 采用MALDI-ToF MS研究hC地cf糖基化时,导致似乎具有独特"指纹"的色谱,所用 方法设及采用二硫苏糖醇对样品预处理,W减少肤的质量,由此使其进入质谱仪的相对最 适的分辨范围。根据化coby等(2000)的MALDI-ToF MS分析,导致对应于质子化hCG化f的宽 峰。
[0019] MALDI-ToF MS的缺点在于,其并不是定量技术。因此,所得的原始质谱结果并不能 用于直接产生适用于诊断测试算法的对比数据。

【发明内容】

[0020] hCG糖基化极具可变性,并且hCG的高度糖基化发生于妊娠素乱和胎儿非整倍性 (例如唐氏综合征)中。现今已发现,通过对获自多至第二个Ξ月期(优选在怀孕第7周~第 13周)的妊娠女性的未经提取的、未处理的尿液样品进行MADLI-ToF MS分析,能够获得独特 的质谱,其可显示糖基化变体的特征变化。运些特征变化能够指示过度糖基化的hCG的代谢 产物,其具有妊娠素乱和胎儿非整倍性中滋养层的细胞中糖基化过程的特点,因此能够指 示运些病症。
[0021] 根据本发明的一个方面,提供一种检测多至第二个Ξ月期的妊娠素乱或胎儿非整 倍性的方法,所述方法包括,对来自妊娠女性的母体尿液样品进行直接质谱分析,和
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