一种先天性耳聋基因多通道荧光pcr检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，属于基因检测技术 领域。
【背景技术】
[0002] 耳聋是临床常见的遗传性疾病之一，严重影响人类的生活质量。2006年中国第二 次残疾人抽样调查显示：全国残疾总数高达8000多万，现有听力语言残疾者达2780万人， 占残疾总数的35%左右，其中单纯听力残疾2004万。听力言语残疾者中7岁以下的聋儿达 80万人并以每年新增5万聋儿的速度在增长。由此可见，我国听力损失人群的现状尤为严 重。
[0003]根据听觉系统所受影响的性质、原因和病变部位可将耳聋分为三类：传导性耳聋 (外耳病变）、感音神经性耳聋（内耳病变）、混合性耳聋。而感音神经性耳聋又分为遗传性 耳聋（遗传性耳聋包括先天性耳聋、药物性耳聋、迟发性耳聋）、非遗传性耳聋。其中先天 性耳聋占遗传性耳聋的60 %，主要表现为出生后就对声音没有反应，如果不配戴助听器和 接受语言训练，不但无法进行正常的交流，而且还阻碍了聋儿正常的智力发育，成为家庭和 社会沉重的负担。多方研宄资料证实引起先天性耳聋的基因位点有100多个，主要是GJB2 和 GJB3 基因突变，GJB2 基因常见的突变为：235delC、299-300delAT、176dell6bp、35delG、 512insAACG、155delTCTG ;GJB3基因常见的突变为538C>T、547G > A，以上位点的突变比例 占先天性耳聋突变位点的90%以上。
[0004] GJB2基因和GJB3基因主要编码间隙连接蛋白26和31，间隙连接蛋白 (connexin)，是整合膜蛋白，6分子蛋白形成一个连接子，中间有2-3mm亲水性孔道，允许钾 离子、钙离子和小的信号分子通过。在声音传导的过程中，进入毛细胞的钾离子会通过间隙 链接重新回到耳蜗血管纹；如果间隙连接蛋白突变，离子交换受到影响，毛细胞的离子梯度 失衡，从而引起听力损失。这两种基因突变导致的耳聋为语前、双侧、对称性耳聋，听力损失 程度变异较大，可由轻度到极重度，但多数为重度或极重度耳聋，干预措施有配戴助听器和 电子耳蜗移植，进行早期听力恢复。
[0005] 由上述可知，GJB2/GJB3突变患者，主要病变在耳蜗，而听神经是正常的，所以对于 此类患者，植入人工耳蜗是目前临床上最为理想的治疗方式。通过对GJB2、GJB3基因常见 突变位点检测，一方面可尽早发现尽早治疗，利用聋儿的残余听力，植入人工耳蜗，在人类 语言发育的关键时期，进行特殊的语言训练，避免聋哑残疾，对先天性耳聋患者的康复有重 大意义，另一方面可以对已生育耳聋患儿的夫妇再次生育时进行产前基因诊断，对育龄夫 妇进行携带者的筛查，发现高危人群，从而进行相应的遗传咨询和指导，从根本上降低出生 缺陷，提尚人口素质。
[0006] 随着基因检测技术的发展以及对听力健康的关注，目前市场上检测耳聋的试剂盒 所用的方法主要有基因芯片法、溶解曲线法、ARMS-PCR法、RFLP法。其中，基因芯片法一般 需要提取、PCR扩增、杂交、洗涤、扫描等步骤，操作较复杂耗时长，对操作者和实验场地要求 较高。溶解曲线法对仪器的温控性要求很高，要求仪器具有高分辨率溶解曲线分析（HRM) 功能，而我们常用的ABI系列荧光定量PCR仪一般缺少此功能。ARMS-PCR法和RFLP法需要 对PCR产物进行电泳分析，不适于临床应用。
【发明内容】
[0007] 针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种先天性耳聋基因多通道 荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒能专一地检测先天性耳聋中常见的八个位点，一个PCR反应 管内可对这八个位点同时进行检测，明确高突变率位点的类别，确定低突变率位点范围，且 操作简便快捷，结果客观可控性强，效率高、成本低，闭管操作防污染，适用多通道荧光PCR 仪，是临床上进行先天性耳聋检测的强有力产品。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0009] 一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，以GJB2基因的35delG、 155delTCTG、176dell6bp、235delC、299-300delAT、512insAACG 突变，和 GJB3 基因的 538C>T、547G > A突变为检测对象，设计特异性引物和探针，所述特异性引物包括用于扩增 35delG、155delTCTG、176dell6bp、235delC、299-300delAT 的引物 1，其序列如序列表中 SEQ ID NO:l和SEQ ID NO:2所示；用于扩增512insAACG的引物2,其序列如序列表中SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示；用于扩增538C>T和547G> A的引物3,其序列如序列表中SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示；所述探针为特异性检测GJB2基因的35、155、176、235、299 位点，和GJB3基因的538、547位点是否含有突变，其探针序列如序列表中SEQ ID N0:7至 SEQ ID NO: 14 所示。
[0010] 具体的，35、155、176、235、299五个位点在6邛2基因上的位置比较集中，故共用一 对引物（引物1)，以避免引物过多造成干扰，正向引物选在35位点上游保守区，反向引物选 在299位点下游保守区，扩增片段长度为378bp ;GJB2基因上的512位点独用一对引物（引 物2)，引物位置选在512位点两侧翼的保守区，扩增片段长度为100bp ;538、547两个位点 在GJB3基因上的距离相近，故共用一对引物（引物3)，正向引物选在538位点上游保守区， 反向引物选在547位点下游保守区，扩增片段长度为150bp。所述引物序列如下：
[0011] 引物 1F:5' -ATGGATTGGGGCACGCTG-3'（SEQ ID N0:1)，
[0012] 引物 1R :5'-GACCTTCTGGGTTTTGAT-3'（SEQ ID N0:2)
[0013] 引物 2F :5'-GTACGACGGCTTCTCCAT-3'（SEQ ID N0:3)
[0014]引物2R :5'-GACAGTCTTCTCCGTGGG-3'（SEQ ID N0:4)
[0015]引物3F:5'-CTCTTCCTCTACCTGCTGC-3'（SEQ IDN0:5)
[0016] 引物 3R :5'-GCCCACCATGAAGTAGGTG-3'（SEQ ID N0:6)
[0017] 所述探针序列如下：
[0018] 35P:5'-ATCCTGGGGGTGTGAA-3'（SEQ IDN0:7)
[0019] 155P:5'-CCGACTTTGCAACACCCTG-3'（SEQ IDN0:8)
[0020] 176P:5,-ATCGTAGCTGGCTGCAGG-3'（SEQ ID N0:9)
[0021] 235P:5'-CCGGCTATGGGCCTGCAGCT-3'（SEQ ID N0:10)
[0022] 299P:5'-TGGCCTACCGGAGACGAGAAG-3'（SEQ ID N0:11)
[0023]512P:5'-TGAAGTGCAACGAACGCCTGGC-3'（SEQ IDN0:12)
[0024] 538P:5'-TGGACTGCTACATTGCCTGA-3' （SEQ ID NO:13)
[0025] 547P:5'-AGATTTTCTTCTTGGTAGG-3' （SEQ ID N0:14)
[0026] 所述探针还分别连接有荧光发光基团和荧光淬灭基团，其中，用于检测235、299、 176位点的探针的荧光发光基团分别为VIC、ROX、Cy5;用于检测35、155、512、538、547位点 的探针的荧光发光基团均为TAMRA;各探针的荧光淬灭基团均为BHQ-1。
[0027] 该先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，还包括用于监测扩增模板的有效 性的1对0-Actin内参引物和1条内参探针，其序列分别如序列表中SEQ ID NO:15、SEQ ID NO: 16 和 SEQID NO: 17 所示。
[0028] 具体的，0-Actin内参引物的序列如下：
[0029] 0-ActinF:5'-CACCCAGCACAATGAAGA-3' (SEQ ID NO:15)
[0030] 0-ActinR:5'-AAGGTGGACAGCGAGGC-3' (SEQ ID NO:16)
[0031] 内参探针的序列为：
[0032] 0-ActinP:5'-CTCCTGAGCGCAAGTACTCCGTG-3'（SEQ ID N0:17)
[0033] 所述内参探针的荧光发光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ-1。
[0034] 该先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，还包括有阴性质控、阳性质控，阴 性质控为连入T载体的内参基因、正常GJB2基因、正常GJB3基因部分序列，其序列如序列 表中SEQ IDN0:18所示；阳性质控为连入T载体的内参基因、含235、299、176、512突变位点 部分序列，其序列如序列表中SEQ ID NO: 19所示。质控的设立可保证检测结果在控，避免 假阴性、假阳性的出现。
[0035] 具体的，一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，由DNA提取液、PCR 反应液、阴性质控和阳性质控组成，其中，每50 y 1 PCR反应液的组成为：10XPCR缓冲液 5. 0 y 1、MgCl22. 0 ~5. OmM、dNTPs 0? 5 ~1. 5mM、引物 0? 2 ~2. 0 yM、探针 0? 1 ~1. 0 yM、 Taq酶2. 0~4. 0U、UNG酶0. 5~1. 0U，加水至50 y 1。所述引物为引物1、引物2、引物3和 内参引物；所述探针为8条检测是否含有突变的探针和1条内参探针。UNG酶的加入有效 去除PCR扩增前的U-DNA污染。
[0036] 采用该先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒进行检测的方法，步骤为：
[0037] 将待检测样品的DNA提取液、PCR反应液、阴性质控和阳性质控加入到PCR反应 管内，混匀后置于荧光定量PCR仪上进行PCR扩增反应，PCR反应条件如下：50°C 2min; 95°C 3min ;95°C 15s，60°C 458,40个循环，每个循环在60°0采集荧光；根据扩增曲线的信号 情况定性判断是否存在突变。
[0038] 首先阴性质控、阳性质控的检测结果应与预期相符，即阴性质控仅有FAM曲线扩 增，无其它荧光曲线扩增，阳性质控FAM、VIC、ROX、Cy5、TAMRA曲线均有扩增。只有阴性质 控、阳性质控扩增曲线结果与预期相符后，才可对样本孔进行分析。
[0039] 若样品孔采集到FAM信号，表明内参基因扩增正常，样本DNA是有效的；
[0040] 若样品孔未采集到FAM信号，表明内参基因扩增失败，样本DNA无效或仪器存在问 题，本次检测结果无效；
[0041] 若样品孔有FAM、VIC信号，无R0X、Cy5、TAMRA信号，表明样本为235突变；
[0042] 若样品孔有FAM、R0X信号，无VIC、Cy5、TAMRA信号，表明样本为299突变；
[0043] 若样品孔有FAM、Cy5信号，无VIC、ROX、TAMRA信号，表明样本为176突变；
[0044] 若样品孔有FAM、TAMRA信号，无VIC、R0X、Cy5信号，表明样本为35、155、512、538、 547突变中的某一种或几种。