专利名称：：一种前列腺癌症早期的综合检测试剂盒及检测方法和应用的制作方法一种前列腺癌症早期的综合检测试剂盒及检测方法和应用
技术领域：
：本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种前列腺癌症早期的综合检测试剂盒及检测方法和应用。
背景技术：
：根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数170万，死亡人数近160万，患者600万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800万，患者约有8400万人，到2020年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等多家单位做了一个年度报告，"认为人类在抗癌大战中是失败"，也就是说癌症死亡率没有降低，其列举出造成抗癌大战失败的几个因素是1.肿瘤细胞异质性；2.肿瘤细胞耐药性；3.抗癌药物设计思路不完善等。同时，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌症的措施。本发明人在研究中发现，导致癌症死亡率不降的另二个重要原因是1.不能做到真正的早期诊断；2.转移的病理机制不清楚。依照传统的医学影像及和其它生化(如蛋白标记物)指标来诊断癌症，认为占位性癌块在2公分下是属于早期癌症的诊断(更小些有时无症状体征).，这一概念值得认真讨论。影像医学的2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度，l公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止2亿个肿瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块，其病理演变过程相当长，可能是一年或两年、甚至三年以上，很难证实的是在这个过程中，肿块是癌症唯一的发生地和单独的病灶。临床上己证实一旦形成肿块的同时，其他癌细胞通过不同途径迁移到其他部位克隆生长；一旦切除原发灶后，其他器官复发灶或多发癌块灶先后形成或转移。因此，在临床上以2公分以下的肿块大小来界定早期与否，不够严谨(有些病例，在发现原发病灶时，同时发现转移病灶，不在我们表述的内容中)，这时己经是晚期了，这是导致癌症死亡率不降的真正原因。随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，至今，我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆时)或突破血管壁早期转移时，就能做到早期预测诊断。几十年来，PSA在前列腺癌的诊断和治疗中具有划时代的意义。然而，近些年来越来越多低丰度PSA前列腺癌被诊断，PSA对前列腺癌诊断的敏感性和特异性越来越受到质疑。Stamey等对1317例前列腺癌根治患者分析发现，1983-1988年间与1999-2003间相比直肠指诊阳性率由91%降到17%;患者平均年龄由64岁降至59岁；肿瘤的体积由5.3cm降至2.4cm;平均PSA水平由25ng/ml降至8nh/ml;前列腺体积由44g增至53g。研究者认为，1983-1988年间PSA前列腺癌密切相关，而1999-2003年间PSA仅与前列腺增生(体积)相关。Bader等报告1493例前列腺癌根治术患者中，有相当部分的前列腺癌患者PSA水平低(8ng/ml)，而且这部分病人与前列腺增生难以鉴别。2004年StearnsME等采用逆转录聚合酶链反应、DAN蛋白结合测定法、免疫印迹等方法证实，PCADM-1是前列腺癌相关诊断标记物1。PCADM-1只在前列腺癌组织表达，在BPH、高分级前列腺上皮内瘤和精囊组织无表达，在其它肿瘤均无表达，而且PCADM-1表达的强度随着Gleasson评分增加而增强(+1——+5)。采用酶联免疫吸附方法检测尿液，结果表明，PCADM-1是前列腺癌特异的尿中肿瘤标记物。他们对533例患者(包括前列腺癌、BPH、有尿路症状患者和正常对照)尿中PCADM-和血清PSA的比较研究结果表明，尿PCA匿-1检测敏感性为79%，特异性为83%，而血清PSA检测敏感性〈50%特异性为55%。目前对PCA函-1基因和PSA基因的研究都用于科研方面，不适应临床应用，特别是个性化的应用在我国现阶尚不见报道。根据现有的文献资料PCADM-1基因和PSA基因的检测技术及诊断试剂盒未见报道。原位杂交技术(insituhybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。中国专利文献CN1556221公开了"IC53基因及其相关产物诊断和治疗结肠癌的用途及一种诊断结肠癌的试剂盒"。中国专利文献CN1769485公开了"栉孔扇贝病原类立克次氏体的原位杂交检测方法及其试剂盒"。中国专利文献CN1556410公开了"一种鱼类病毒的检测试剂盒及其检测方法"。中国专利文献CN1680597公开了"一种用于定量检测丙型肝炎病毒(HCV)的荧光定量PCR试剂盒"。中国专利文献CN2918435，公开了"一种检测肥胖相关基因SNP的寡核苷酸芯片及试剂盒"。但是，关于前列腺癌症早期的综合检测试剂盒及检测方法和应用未见报道。
发明内容本发明所要解决的技术问题是，提供一种前列腺癌症早期的综合检测试剂盒及检测方法和应用。能够检测早期前列腺癌，或者在治疗后能及早地预测转移复发状况。而且能够检测关于前列腺的其它疾病。为了解决上述问题，本发明提供了一种前列腺癌症早期的综合检测试剂盒，包括两组杂交探针、标记物，其中所述的杂交探针分别具有序列表SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的序列。(需要说明的是SEQIDNO.2序列中第126中碱基可以是g或c或t。第391中碱基可以是g或c或t。第662中碱基可以是g或c或t。)PCADM-1基因序列见SEQIDNO.2，PCADM-1基因的核苷酸序列长度是865bp，CDS是1…865bp。PSA基因序列见SEQIDNO.1，PSA基因的核苷酸序列长度是569bp，CDS是1…569bp。作为可选的技术方案，所述的杂交探针序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的RNA序列。作为可选的技术方案，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。作为可选的技术方案，所述的放射性核素选自SH、35S、1251或3￥中的一种。作为可选的技术方案，所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。作为可选的技术方案，所述的非放射性标记物优选自地高辛。作为可选的技术方案，还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。本发明还提供了，一种PCADM-1基因和PSA基因原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤a、将所述前列腺癌症早期的综合检测试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；b、检测a步骤得到的杂交复合体。作为可选的技术方案，a步骤中形成杂交复合体的条件为核酸杂交的温度为42。C;核酸杂交的时间为16—24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。本发明还提供了，所述的前列腺癌症早期的综合检测试剂盒在制备综合检测前列腺癌症早期疾病药物中的应用。本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以PCADM-1基因和PSA基因为检测对象，合成探针是PCADM-1基因和PSA基因的DNA或RNA序列，检测的底物是人体血液标本白细胞或组织细胞的RNA和DNA的表达量。原位杂交技术的显示方法能提供PCADM-1基因和PSA基因的半定量或定量表达程度判定。根据杂交后免疫组化显色判定以上基因的表达量，正常人PCADM-1基因和PSA基因不表达，即不显色，PCADM-1基因和PSA基因在前列腺癌病人高表达。本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括:仪器操作123468.将待测标本放入反应槽中；.仪器自动弃去液体，自动加消化液；.仪器自动弃去液体，自动后固定；.仪器自动弃去液体，自动预杂交(42°C);.仪器自动弃去液体，自动清洗；.仪器自动弃去液体，自动杂交(42°C);.仪器自动弃去液体，自动清洗；.仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温);9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；10).取出封片镜检。本发明优点在于1、本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。2、本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。克服了目前对PCADM-1，PSA基因的研究都采用高通量基因芯片方法，而这些方法多用于科研方面，不适应临床应用的缺陷。3、本发明的临床意义是更早期检测前列腺癌症发生，本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及影像医学检査有显著不同。本发明可以在基因水平上(癌变前期或癌细胞增殖)检测PCADM-1基因和PSA基因异常表达，在影像医学检査未发现占位性癌病灶之前，及早于PSA蛋白生化指标未产生异常之前，亦未形成肿瘤之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床前列腺癌症病患一个真正的早期诊断以及治疗后转移复发及早预测。这样才有可能实施前列腺癌的早期诊断、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治前列腺癌症恶疾。另外，还能够筛选出待检者哪些是前列腺炎症疾病或前列腺增生或假阴性；哪些是前列腺癌症。4、本发明采用核酸原位杂交技术检测PCADM-1基因和PSA基因的mRNA或DNA要比尿液的PCADM-l和血清PSA蛋白更早期、敏感性更好。图1是本发明实施例中前列腺癌症病人PSA过量表达图。图2是本发明实施例中前列腺癌症病人PCADM-1过量表达图。具体实施方式下面结合图对本发明提供的一种前列腺癌症早期的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用的具体实施方式做详细说明。一种前列腺癌症早期的综合检测试剂盒，包括两组杂交探针、标记物，其中所述的杂交探针分别具有序列表SEQIDNO.l和SEQIDNO.2所示的序列，SEQIDNO.l是PSA序列，SEQIDN0.2是PCADM-l序列。用地高辛标记。试剂盒中的其它液体和标本组成如下实施例1消化液100uL/管2管/盒无色透明液体保护液100uL/管2管/盒无色透明液体预杂交液1300uL/管4管/盒无色透明液体正义杂交液10yL/管2管/盒无色透明液体<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>上述试剂成分说明(所有试剂购自SIGMA)1、消化液20mg/ml蛋白酶K，100mg蛋白酶K，加DEPC-H205ml;2、保护液0.2g的glycine加入lml的1X缓冲液I;3、预杂交液IX缓冲液II7.5ml50XD3ml10mg/mlyestt-薩750ulllmg/mlSALMONTESTESDNA682ul0.04MEDTA3ml50%formamide15ml4、封闭液0.03g的bloking(购买自罗氏公司)加入lml1X缓冲液III;5、10x缓冲液I:(IW.1-7.4)NaCl80g<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。实施例2一种PCADM-1基因和PSA基因原位杂交检测方法及其试剂盒应用一、标本处理1、用10ml的离心管，装4.5ml淋巴细胞分离液，再将3ml抗凝血缓慢加入含有淋巴细胞分离液(血淋巴细胞分离液二l:1.5)的离心管中，2000r/min离心10min;2、吸取中间层白细胞至另一离心管中，再在此管中加入约两倍的1X缓冲液I,混匀，1500g/min离心10min;3、弃上清.沉淀加入约两倍的1X缓冲液I，混匀，1500g/min离心10min;4、弃上清，并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。再将沉淀制成悬液，滴在玻片上推片，自然干燥。(有条件的医院可以用制片机制片。)3ml血，可以做4张片子；5、用40ml4。/。固定液，在玻璃缸中，固定30min,再用lX缓冲液I洗5min。每缸可以放16片；6、标本可保存在-2(TC，或继续做实验。二、将试剂盒中试剂配制成使用浓度1、将IOX缓冲液I用三蒸水按1:10稀释成1X缓冲液I;2、将20X缓冲液II用三蒸水按1:10稀释成2X缓冲液II;按1:100稀释成0.2X缓冲液I1;按1:200稀释成0.IX缓冲液II;3、将IOX缓冲液III用三蒸水按1:10稀释成lX缓冲液m;4、10X缓冲液IV用三蒸水按1:10稀释成X缓冲液IV(取lft，2tt，3ft各10ml，加水至100ml既可)。三、实验步骤1、取每位待检者标本四张，(另外两张留作复査用)及阳性对照标本两张(每次实验做一对阳性对照)；2、在玻璃缸里加消化液(消化液100ul加1X缓冲液199.9ml，即为使用浓度)20ml。37。C水浴预热10分钟。放进16张玻片，37。C处理12min，再用1X缓冲液I洗5min;3、用0.2%的保护液(保护液lml加1X缓冲液199ml即为使用浓度)洗10min，三蒸水洗5min，以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥；4、将玻片放入保湿盒内，加预杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42。C恒温水浴箱中3h以上；5、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70%，90%，95%的乙醇各洗2min，自然干燥；6、将玻片放入保湿盒内，每位病人标本两张，一张加正义杂交液20ul/片，另一张加反义杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42。C恒温水浴箱中16-24h;7、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内在42'C恒温水浴箱中用2X缓冲液II洗两次，每次15min在42。C恒温水浴箱中用0.2X缓冲液II洗一次,每次15min在42。C恒温水浴箱中用0.1X缓冲液II洗两次，每次15min;8、用IX缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥；9、将玻片放入保湿盒内，加0.5%1封闭液(lml封闭液加5ml1X缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min;10、取出玻片，用IX缓冲液III洗30s，自然干燥；11、将玻片放入保湿盒内，加碱性磷酸酶抗体(加入1.8ml1X缓冲液III)100u1/片，盖紧保湿盒在室温下作用30min;12、取出玻片，用IX缓冲液III洗3次，每次15min;13、1X缓冲液IV洗2min，加显色剂(显色剂A73,3ul，显色剂B157.5ul加到30mllX缓冲液IV中，混匀)，室温避光12h以上；14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的1X缓冲液I混匀)封片镜检。四、结果判断在光镜下计数100-300个细胞，计算染上紫色细胞的百分比。阳性对照标本加反义杂交液的应该80%以上染上紫色。所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。前列腺癌症病人PSA过量表达见图1。前列腺癌症病人PCADM-1过量表达见图2。地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。用前列腺癌症早期的综合检测试剂盒检测待检者结果有以下几种，见表1。表l序号杂交探针杂交探针结果PSA基因PCADM-1基因第一种表达表达前列腺癌第二种不表达表达前列腺癌第三种表达不表达前列腺炎症疾病或前列腺增生或假阴性第四种不表达不表达正常本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的PCADM-1和PSA基因表达量，用来确定前列腺癌是否发生，临床研究表明，PCADM-1和PSA基因是前列腺癌的特异性基因，因为PCADM-1和PSA基因在正常人中不表达，如果PCADM-l和PSA基因表达高，说明前列腺癌已经发生，从而获得前列腺癌的诊断信息。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。16SEQUENCELISTING<110>芮屈生物技术(上海)有限公司<120>—种前列腺癌症早期的综合检测试剂盒及检测方法和应用〈130〉/<160>2〈170>Patentlnversion3.1<210>1<211>569<212>DNA<213〉智人(Homosapiens)<400>1agccccaagcttaccacctgcacccggagagctgtgtcaccatgtgggtcccggttgtct60tcctcaccctgtccgtgacgtggattggtgctgcacccctcatcctgtctcggattgtgg120gaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggca180gggcagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgca240tcaggaacaaaagcgtga/tcttgctgggtcggcacagcctgtttcatcctgaagacacag300gccaggtatttcaggtcagccacagcttcccacacccgctctacgatatgagcctcctga360agaatcgattcctcaggccaggtgatgactccagccacgacctcatgctgctccgcctgt420cagagcctgccgagctcacggatgctgtgaaggtcatggacctgcccacccaggagccag480cactggggaccacctgctacgcctcaggctggggcagcattgaaccagaggagttcttga540ccccaaagaaacttcagtgtgtggacctc569〈210>2<211>865<212>DNA<213>智人(Homosapiens)<400>2cgggctccagcccagcctcgctagctccgcctgcggtacgtgctcccgcctccgactcaaGOaatgcctgtctggggaggtgga認aagtgtgggggcctgtgggaggaccgtgtaccacg120cagaaaaggtgcagtgtgatggcaggacttccaccgctgctgctttctcgcatggtttgc180aggaaaaatttagatagacagcagtggcaattcacgatgaagagatctactgcaaatcct240gctacggaaagaagtatgggccaaaaggctacggttatggccagggcgctggcacgctta300acatggaccgtggcgagaggctgggcatcaaaccagagagtgttcagcctcacaggccta360c^caaatccaaacacttcaaatttgctcaa肌atatggagggstgtggggattctgtts420tatgctgccgaaaagataatttggactggsaaccctggcaC83^actgtttccgatgtg480caaattttggaaaaatcttgaa^caac^ctctgsctgaB3a_a_ga_a_ggtgaaatctattg540taa3gg3tgctatgc^3gaactttgggccc^gggatttggcta^tggcc犯ggagcagg600ggctcttgttcatgcccagtaagatgtaaaccctgaactaaacatcacacactgagaatcGGOtattcataatctaggcacagataatctttaacactaaactactgtgaaattctaccagca720ttaagtactgtatatcgccctgtacttggataggctggctaactcgtsgg犯gagagcac780tgtatggtatccttttgctttatcaccagcattttggggg犯catttcttttacatttta840肌te3aacttc兆cttg肌aaB肌a86518权利要求1.一种前列腺癌症早期的综合检测试剂盒，包括两组杂交探针、标记物，其特征在于所述的杂交探针分别具有序列表SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的序列。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的杂交探针序歹U如SEQIDNO.1禾口SEQIDNO.2戶万示的RNA序歹U。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述的放射性核素选自3H、35S、125I或32P中的一种。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述的非放射性标记物优选自地高辛。7.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。8.—种PCADM-1基因和PSA基因原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤a、将权利要求1或2所述试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；b、检测a步骤得到的杂交复合体。9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于a步骤中形成杂交复合体的条件为核酸杂交的温度为42°C;核酸杂交的时间为16—24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。10.根据权利要求1或2所述的试剂盒在制备综合检测前列腺癌症早期疾病药物中的应用。全文摘要本发明涉及一种前列腺癌症早期的综合检测试剂盒，包括两组杂交探针、标记物，其中所述的杂交探针分别具有序列表SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的序列。本发明还提供了一种PCADM-1基因和PSA基因原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤a.将所述前列腺癌症早期的综合检测试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；b.检测a步骤得到的杂交复合体。本发明另外还提供了前列腺癌症早期的综合检测试剂盒在制备综合检测前列腺癌症早期疾病药物中的应用。本发明优点在于本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。文档编号C12Q1/68GK101469350SQ200810042259公开日2009年7月1日申请日期2008年8月29日优先权日2008年8月29日发明者张云福,裘建英申请人:芮屈生物技术(上海)有限公司