专利名称：Ints6基因小激活rna在制备抗前列腺癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及靶向上调INTS6基因的小激活RNA在制备抗前列腺癌，提别是激素非依赖性前列腺癌药物中的应用。
背景技术：
前列腺癌正严重威胁着我国50岁以上男性的健康。内分泌治疗是临床上治疗前列腺癌的常用方法。但是绝大多数前列腺癌患者在内分泌治疗f 2年内病情出现进展，继续应用内分泌治疗药物，并不能控制病情发展。前列腺癌细胞由激素依赖转变为激素非依、赖，是前列腺癌内分泌治疗失败、患者死亡最主要的原因。2006年Li等报道靶向基因启动子区的dsRNA (双链RNA, double-strandedRNA)能引起序列特异性的基因转录激活。并把此现象命名为RNA引起的基因激活(RNA activation, RNAa),而把这样的 dsRNA 称为小激活 RNAs (small activatingRNAS, saRNAs)。该项技木通过改变染色体的结构导致内源性靶基因表达增強。它能激活许多失活的抑癌基因或増加活性较低的基因的表达量，从而起到治疗肿瘤的作用。INTS6 是一种抑癌基因，全称 Integrator complex subunit 6 gene, 1999 年由 IWieland和Zhengnan Yin两个团队同时报道,在《Oncogene》杂志的同一期刊登。INTS6定位于人类染色体13ql4. 2附近，由于这一区段在许多肿瘤细胞中存在缺失，因此INTS6又被命名Delete In Cancer I (DICEl)。INTS6调控的信号网络仍未完全阐明，有研究指出INTS6可能參与WNT信号通路的调节，在肿瘤中扮演抑癌基因的角色。INTS6在前列腺癌组织和细胞株中存在表达缺失。文献报道，杂合性缺失(loss of heterozygosity, L0H)和表观遗传学改变双重打击造成前列腺癌中INTS6表达下调。INTS6成为RNA激活干预前列腺癌的理想靶标。
发明内容
本发明的目的是提供ー种靶向上调INTS6基因的小RNA在制备抗激素非依赖性前列腺癌药物中的应用。本发明通过特定序列的小双链RNA诱导激素非依赖性前列腺癌细胞中INTS6基因的表达，从而抑制肿瘤细胞的増殖和运动能力，达到抑制肿瘤生长和进展的目的。所述靶向上调INTS6基因的小RNA的核苷酸序列由2对(4条)21个核苷酸的正义链和反义链组成，其序列分别为dsINTS6-374 S (SEQ ID N0:l):5，-CCA CUU UAC UCAACC CUU C [dTdT] -3，，dsINTS6_374 AS (SEQ ID N0:2):5，-GAA GGG UUG AGU AAA GUGG [dTdT] -3’ ；dsINTS6-390 S (SEQ ID N0:3) :5’ -CUA ACC AGG UGU UUG UCC A [dTdT]-3，，dsINTS6-390 AS (SEQ ID N0:4) :5，-UGG ACA AAC ACC UGG UUA G [dTdT] -3，。每条链的3’端均悬挂突出两个核苷酸(通常为dTdT，中间19个核苷酸配对)。本发明的有益之处小RNA操作简单,成本较低；用量较少，20nM的转染浓度即可达到良好的激活效果；激活作用确切，靶基因mRNA和蛋白水平均有升高。另外saRNA诱导基因表达属于表观遗传学调节，不破坏基因组的完整性，因此应用较为安全。
图I是不同位点dsRNAs对PC3细胞内INTS6 mRNA表达的影响程度，数据来源于3次独立实验的平均值和标准差。图2是不同位点dsRNAs对Dul45细胞内INTS6 mRNA表达的影响程度，数据来源于3次独立实验的平均值。图3是dsINTS6-374/-390上调PC3细胞内INTS6蛋白的表达，β -actin表达量作为内參。图4是dsINTS6-374/-390上调Dul45细胞内INTS6蛋白的表达，β-actin表达 量作为内參。图5是MTT法提示dsINTS6-374/-390能明显抑制PC3细胞活性，数据以平均值土
标准差表示。图6是MTT法提示dsINTS6-374/-390能明显抑制Dul45细胞活性，数据以平均值土标准差表示。图7是dsINTS6-374/_390处理后PC3细胞平板克隆形成能力减弱。图8是流式细胞仪检测提示dsINTS6-374/-390能诱导PC3细胞发生Gl期周期阻滞，数据来源于3次独立的实验，结果以平均值和标准差显示。图9是dsINTS6-374/_390处理组穿至transwell膜下表面的PC3细胞数较少，Migration :细胞迁移实验；invation :细胞侵袭实验。图10是dsINTS6-374/-390处理组穿至transwell膜下表面的Dul45细胞数较少，Migration :细胞迁移实验；invation :细胞侵袭实验。图11是dsINTS6-374/_390处理后，PC3裸鼠移植瘤生长较对照组明显放缓。图12是免疫组化显示处理组移植瘤组织中，肿瘤细胞尤其是胞核中INTS6表达增強。
具体实施例方式为了更好地理解本发明的实质，本发明结合附图和实施例作进ー步的说明。但这些具体实施方案不是要以任何方式限制所要求保护的发明范围。实施例I dsRNAs上调前列腺癌细胞中INTS6基因的表达 实验方案
1.细胞系人激素非依赖性前列腺癌细胞株PC3、Dul45(上海细胞所)
2.dsRNAs合成dsRNAs均由上海吉凯生物技术有限公司化学合成。3.实验分组
20nM的dsINTS6-374和-390组、无意义dsRNA对照组(dsControl)和空白转染试剂组(mock)。dsControl组dsRNA与已知人基因组序列非同源正义链，5’_ACU ACU GAG UGACAG UAG A [dTdT]-3’ (SEQ ID NO: 5);反义链，5’ -UCU ACU ⑶ C ACU CAG UAG U [dTdT]-3， (SEQ ID N0:6)。4.细胞培养及转染细胞培养在含10%灭活新生牛血清的RPMI1640培养基中，放置于C02含量为5%的37oC细胞培养箱内。转染前一天细胞传代后种于培养板中，密度大约30 40%。dsRNAs经过脂质体Lipofectamine 2000包裹后转染入细胞，以6孔板为例(其余培养器皿根据底面积之间的比例调整试剂量)，每孔取3μ1 20 μ M dsRNAs储存液和5μ1脂质体分别溶于250μ1无血清培养基，5min后混合，室温静置20min后加入培养板中，补充含血清培养基使dsRNA终浓度为20nM，作用持续48至144小时。5.逆转录ー聚合酶链反应(RT-PCR):
利用Trizol Reagent将各实验组的细胞提取总RNA，紫外分光光度计准确定量。取3 μ g 总 RNA 进行逆转录。GAPDH 上游引物(SEQ ID NO: 7 ): 5 ’ -ATGGCACCGTCAAGGCTGAG-3 ’，下游引物(SEQ ID N0:8):5，-GCAGTGATGGCATGGACTGT-3’，INTS6 上游引物(SEQ ID NO:9):5，- TGCCCATCTTACTGTTCCTG-3，，下游引物(SEQ ID N0:10):5，_ TCTTCGAAAGTGACCAGC-3，。采用SYBR Green染料法进行荧光实时定量PCR (real-time PCR)检测，结果按照2-delta法标准化到对照组进行比较。
6.蛋白印迹(Western Blot)
细胞转染72 h后，收集细胞，利用RIPA细胞裂解液提取总蛋白，BCA (ニ喹啉甲酸)法測定蛋白浓度，并调整待测样本的蛋白质含量。每孔加20ug的蛋白电泳、转膜、封闭，把膜放入稀释的一抗中，温和振汤3h后直4度冰箱中过夜。再温和振汤2 h ,回收一抗后在Tris缓冲液中洗膜30 min，中间更换Tris缓冲液2_3次，分别把膜置于稀释的ニ抗中温和振荡lh，后在Tris缓冲液中洗膜30 min，中间换液3-4次。曝光、显影及定影，用底片扫描仪扫描X线胶片。结果如下
I.两对dsRNAs对激素非依赖前列腺癌细胞内INTS6 mRNA表达的影响对激素非依赖前列腺癌细胞PC3和Dul45分别转染20nM dsRNAs(dsINTS6-374、_390)以及对照dsRNA(dsControl)并设置空白对照组，72小时后利用RT-PCR检测INTS6的mRNA表达情况，与对照组相比，dsINTS6-374、-390作用组细胞内的INTS6 mRNA明显增加，是对照组的2倍以上(參见图1，图2)。2. dsINTS6-374/-390上调前列腺癌细胞内INTS6蛋白的表达
进ー步通过Western Blot检测PC3和Dul45细胞转染72小时后各作用组细胞内INTS6蛋白表达情况，与对照组相比，dsINTS6-374/-390作用组细胞内的INTS6蛋白增加(參见图
3、4)。实施例2 dsINTS6-374/-390上调INTS6在体外对激素非依赖前列腺癌细胞的抑制作用
实验方案
I.细胞系同实施例I。2. dsRNAs合成同实施例I。3.实验分组同实施例I。4.细胞培养及转染同实施例I。5.四唑盐(MTT)比色法
取对数生长期的癌细胞，胰酶消化制成单细胞悬液，以每孔2000 5000个细胞的密度将细胞种于96孔培养板内(为保证结果的准确性，在实验前测定细胞的贴壁率、倍增时间以及不同接种数目细胞的生长曲线，再确定每孔细胞的接种数，以保证培养终止时细胞不至于过满)，将培养板置于37°C，5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱内培养过夜后，吸去旧培养液，加入20nM dsINTS6-374/-390，并设立阴性对照(dsControl)和空白对照(Mock)。作用48 144小时后，每孔加入20μ1 MTT溶液(5 mg/ml)，37°C孵育4小时后弃培养基，每孔加入DMSO 150μ1，室温放置10分钟，待结晶溶解后用酶标仪在490 nm波长处测定其吸光度(OD)值。按下述公式计算细胞存活率存活率=治疗组OD值/空白对照组OD值X 100% ；
6.平板克隆形成
经胰酶消化后收集20nM dsINTS6-374/-390、dsControl以及Mock组处理72h后的细胞，分别取400个细胞种于六孔板的孔中培养，直至出现肉眼可见的克隆形成，100%甲醛固定细胞，结晶紫染色，观察各处理组细胞克隆形成的数量。7.流式细胞仪检测细胞周期
经胰酶消化后收集20nM dsINTS6-374/-390、dsControl以及Mock组处理72h后的细胞，70%酒精固定，用PBS洗涤并细胞计数，取含有IXlO5个细胞的悬液，RNA酶处理细胞去除RNA，4°C、2000rpm离心5分钟，弃上清液，每个样本加入500μ1的PI染料，室温避光保存30分钟，Beckman Coulter FC500流式细胞仪检测,粗数据使用modfit软件判读,计算GO/Gl、S和G2/M各期细胞的比例。8. Transwell穿膜实验检测细胞运动能力
利用孔径8 μ m (略小于细胞直径)的transwell小室检验细胞的迁移和侵袭能力。小室的上室采用无血清的培养基，小室的下室采用含20%血清的培养基，由此建立趋化梯度。经胰酶消化后收集20nM dsINTS6-374/-390,dsControl以及Mock组处理72h后的细胞，分别将8X IO4个不同处理组的细胞置于上室的低血清环境中培养，比较一定时间后趋化至下室的细胞数，从而评价细胞的运动能力。其中，使用无基质胶的transwell小室评价细胞的迁移能力，使用基质胶预先处理的transwell小室评价细胞的侵袭能力。结果如下
I. dsINTS6-374/-390抑制激素非依赖前列腺癌细胞的活性
为了明确dsINTS6-374/-390对激素非依赖前列腺癌细胞生长和活性的抑制程度，我们进行了 MTT试验。在96孔板中，分别对PC3和Du 145细胞转染20nM的dsINTS6_374/-390和dsControl RNA,并设置空白对照组mock,姆个组共设置4个复孔,结果均标准化到mock组(以mock组为I)。參见图5、6，dsINTS6-374/-390对两种癌细胞的抑制作用出现在48h时间点，且持续至144h。在转染144h时，dsINTS6-374/-390对两种癌细胞的抑制率均超过50%。2. dsINTS6-374/-390能抑制激素非依赖性前列腺癌细胞的体外克隆形成能力 利用平板克隆形成，研究dsINTS6-374/-390抑制激素非依赖性前列腺癌细胞活性是
否与细胞增殖减弱有夫。对前列腺癌细胞PC3分别转染20nM的dsINTS6-374/-390和对照dsRNA (dsControl)，观察处理后每400个细胞最終在平板中形成克隆的数量。结果显示，与对照RNA组相比，dsINTS6-374/-390处理的PC3细胞形成克隆的数目更少。(參见图7)
3.dsINTS6-374/-390能诱导激素非依赖性前列腺癌细胞发生Gl期阻滞 对前列腺癌细胞PC3和Dul45分别转染20nM的dsINTS6_374/-390和对照dsRNA(dsCon),72小时后利用PI染色，通过流式细胞仪检测研究细胞周期分布。如图8所示，dsINTS6-374/-390处理组G0/G1期细胞增加而S期细胞减少。4. dsINTS6-374/-390能抑制激素非依赖性前列腺癌细胞的体外运动能力
利用transwell穿膜实验，研究dsINTS6-374/-390处理后激素非依赖性前列腺癌细胞PC3和Dul45运动能力的变化。结果显示，与对照RNA组相比，dsINTS6_374/-390处理的PC3和Dul45穿至transwell膜下表面的细胞数较少。(参见图9、10)
实施例3 dsINTS6-374上调INTS6在体内抑制激素非依赖性前列腺癌的生长 实验方案
I.细胞系人激素非依赖前列腺癌细胞株PC3。2.动物模型采用4周龄BALB-c裸鼠,皮下荷瘤。成瘤后分non-sense dsRNA对照组和dsINTS6-374/-390 RNA组进行干预，每组4只。3.给药方案瘤内注射30ii g脂质体包被的RNA，3天一次，共三周。4.结果观察同步观察瘤体大小变化情况。最后处死裸鼠，免疫组化染色观察肿瘤组织中INTS6蛋白的表达。结果如下 小激活RNA能够激活PC3裸鼠皮下移植瘤中INTS6的表达，同时抑制移植瘤的生长利用PC3细胞在裸鼠皮下成瘤，移植瘤内重复注射dsINTS6-374/-390小激活RNA，移植瘤生长受到抑制，同时瘤组织内INTS6表达增强。(参见图11、12)。
权利要求
1.ー种靶向上调INTS6基因的小RNA在制备抗激素非依赖性前列腺癌药物中的应用，所述靶向上调INTS6基因的小RNA的核苷酸序列由4条21个核苷酸的正义链和反义链组成，其序列分别为dsINTS6-374 S :5，-CCA CUU UAC UCA ACC CUU C [dTdT] -3’，dsINTS6-374 AS :5’ -GAA GGG UUG AGU AAA GUG G [dTdT] -3’ ；dsINTS6-390 S :5’ -CUAACC AGG UGU UUG UCC A [dTdT] -3’，dsINTS6_390 AS :5’ -UGG ACA AAC ACC UGG UUA G[dTdT] -3’。
2.根据权利要求I所述的ー种靶向上调INTS6基因的小RNA在制备抗激素非依赖性前列腺癌药物中的应用，其特征在干，每条链的3’端均悬挂突出两个核苷酸，为dTdT，中间19个核苷酸配对。
3.根据权利要求I所述的ー种靶向上调PAR-4基因的小RNA在制备抗膀胱癌药物中的应用，其特征在于，所述药物还有制剂允许的赋形剂。
全文摘要
本发明提供一种靶向上调INTS6基因的小RNA在制备抗激素非依赖性前列腺癌药物中的应用。所述的小RNA的核苷酸序列由4条21个核苷酸的正义链和反义链组成，每条链的3’端均悬挂突出两个核苷酸，通常为dTdT，中间19个核苷酸配对。本发明通过特定序列的小双链RNA诱导激素非依赖性前列腺癌细胞中INTS6基因的表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖和运动能力，达到抑制肿瘤生长和进展的目的。本发明的小RNA操作简单，成本较低；用量较少，20nM的转染浓度即可达到良好的激活效果；激活作用确切，靶基因mRNA和蛋白水平均有升高。另外saRNA诱导基因表达属于表观遗传学调节，不破坏基因组的完整性，因此应用较为安全。
文档编号A61P35/00GK102657878SQ20121013090
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月1日 优先权日2012年5月1日
发明者杨凯, 林奕伟, 毛祺琦, 秦杰, 胡政麾, 茅叶青, 谢立平, 郑祥毅, 金勇丰, 陈弘 申请人:浙江大学