ase-free DNase，混匀，37°C水浴反应30min; 2) 4°C，12000rpm/min，离心10min，取IOul上清到另一个无菌的1 · 5ml EP管中； 3) 加入90ul Dilution BuffeKlmM Tris-HCl, pH8.0,0.1m MEDTA，150mM NaCl)，混 勾，37°C金属浴反应30min; 4) 自然冷却至室温，加入Iul蛋白酶K，65°C水浴反应Ih; 5) 100°C金属浴反应10min，自然冷却至室温； 6) 进行Q-PCR检测滴度。
[0025]包装出的重组腺相关病毒命名为AAV-Lin28a，滴度为2.8X1011，采用同样的方法 包装空载体质粒pAAV-MCS，命名为AAV-MCS，滴度为1.9 X IO11。病毒颗粒同时存在于包装细 胞和培养上清中。可以将细胞和培养上清都收集下来以获得最好的收率。
[0026] 收到病毒液后在很短时间内即使用腺相关病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于 4°C保存;如需长期保存请放置于_80°C保存。
[0027] 实施例2 Lin28a基因过表达腺相关病毒对皮肤创伤愈合的影响。
[0028]实验动物创伤模型制作。
[0029] 将Wistar种健康大鼠（购自南方医院实验动物中心)随机分为3组，每组10只，称重 标记。将WI STAR大鼠适用性喂养1周，实验前一天脱毛、称重。2%戊巴比妥钠溶液(40mg/kg体 重)腹腔麻醉后，在两侧背部作3个直径Icm的圆形皮肤全层伤口，各伤口中心之间距离为 1.5cm。无菌纱布包扎创面。隔日去除包扎暴露创面，术后肌注青霉素一周预防抗炎并密切 观察局部情况。术后分别在创口基底部及灶内注射〇 . 2 X IO8Pfu的AAV-Lin28a或0.2 X IO8Pfu的AAV-MCS病毒液，以PBS缓冲液作为对照。致伤后大鼠单笼喂养，饮食自取。
[0030] 伤口表面状态观察及伤口残余面积测定。
[0031] 在伤后1、3、5、7、9、11、13、15天用透明薄膜覆盖创面，描摹创面面积，沿边缘剪膜， 置于万分之一分析天平上称重，换算创面面积，计算创面愈合率，评价大鼠创面愈合速度。
[0032] 伤后第15天，用游标卡尺测量每个创口愈合后皮肤全层厚及其临近无创伤处皮肤 全层厚，计算肥大指数(Hypertrophic Index，HI)(HI=愈合皮肤全层厚/临近皮肤全层厚）。 [0033] 术后1 -3天，AAV-MCS组和PBS组大鼠伤口出现少量渗出和出血，伤口周围皮肤稍红 肿，3天后创面逐渐干燥，有伽形成，伤口范围逐渐变小，术后12天开始第一次脱伽;AAV-Lin28a组大鼠在注射病毒液当天伤口表面即干燥，无明显渗出和分泌物，注射后第2天创面 已出现明显收缩、变小，术后7天开始第一次脱伽，露出的肉芽组织新鲜，无明显出血，术后 大鼠平均创面愈合率变化趋势如附图1所示。同时计算每个瘢的肥大指数，作为愈合质量的 一个指标，肥大指数与瘢痕的大小呈正比，结果显示AAV-Lin28a组肥大指数较AAV-MCS组、 PBS组小，即形成的瘢痕小。实验结果表明，AAV-Lin28a能明显促进小鼠皮肤创伤愈合并能 抑制皮肤瘢痕的形成。
[0034] 实施例3 Lin28a基因过表达腺相关病毒对烧伤修复的影响。
[0035] 实验动物SI度烧伤模型制作。
[0036] 将C57BL/6小鼠（中科院上海实验动物中心）随机分为3组，每组10只，称重标记，体 重均在20g以上。将小鼠适用性喂养1周，实验前一天剃毛、称重。2%戊巴比妥钠溶液(40mg/ kg体重)腹腔麻醉后，将四肢和尾根部用通气胶带固定于超净台上。将水浸湿的自制控制烧 伤面积的硬纸片（取约Imm厚硬纸片，裁成7cm X 9cm大小，在纸片中心用刀片刻出2cm X 1.5cm=3 cm2面积的长方形窗口）放在小鼠背部，露出剃毛区，在纸片窗口内用滴管滴加 95% 酒精，浸满皮肤，用大镊子压住纸片，打火机点火，着火燃烧20s后用湿纱布熄火。
[0037]烧伤表面状态观察及皮肤病理学检查。
[0038] 术后即刻将6 X IO8Pfu的AAV-Lin28a、6 X IO8Pfu的AAV-MCS病毒液以及PBS-次性 一次涂抹于伤口表面。涂抹重组腺相关病毒后，每天观察各组伤口愈合情况，并用透明薄膜 覆盖创面，描摹创面面积，沿边缘剪膜，置于万分之一分析天平上称重，换算烧伤面积，计算 烧伤愈合率，评价小鼠烧伤愈合速度。
[0039] 至15天时处死全部小鼠，将烧伤创面连同周边皮肤约0.5cm取下，平铺于滤纸上， 然后固定于10%福尔马林内，纵向切取宽约3_4mm皮肤，按常规制备石錯切片，切片厚度为5μ m，进行苏木素-伊红(HE)染色，100 X显微镜下观察皮肤HE染色切片。
[0040] 实验结果表明：涂抹重组腺病毒后第6天，大体外观即可观察到AAV_Lin28a组小鼠 创口愈合速度较AAV-MCS及PBS组快，至第8天时，AAV-Lin28a、AAV-MCS和PBS三组小鼠创口 未愈合率分别为69.36 %，34.66 %和32.58 %。至第18天时，涂抹AAV-Lin28a组创口已全部 愈合（10/10)，而AAV-MCS及I3BS组各有5/10和6/10个烧伤创口明显地未完全愈合。而且AAV-Lin28a组创口愈合较为平坦，有的甚至与周围邻近正常皮肤完全相同，而AAV-MCS及I 3BS组 均明显增厚。
[0041 ] 到第15天时，涂抹AAV-Lin28a组小鼠表皮已全部脱伽，只有2/20个尚未完全再表 皮化，显微镜下观察到表皮及整齐排列的细胞、血管、皮脂腺、毛囊等结构完整，真皮中纤维 薄且排列整齐，细胞核、包浆等色泽良好，表皮角化轻（附图2A)，说明AAV-Lin28a能促进深 度烧伤的真皮再生;而AAV-MCS组(附图2B)及PBS组(附图2C)各有5/10个和6/10未完全再表 皮化，表皮结痂及部分的真皮变性坏死，残存的毛囊、皮脂腺、汗腺、胶原纤维变得疏松且排 列紊乱。 实施例4 Lin28a基因过表达腺相关病毒对骨损伤修复的影响。
[0042]将Wistar种健康大鼠（购自南方医院实验动物中心)随机分为3组，每组10只，称重 标记。2%戊巴比妥钠溶液(40mg/kg体重)腹腔麻醉后，暴露大鼠股骨，用钢锯将股骨锯开，以 达到骨髓渗出为度，将创口缝合。术后第二天开始在创口处局部注射IO 9Pfu的AA V-Lin28a、 IO9Pfu的AAV-MCS病毒液以及PBS，每天1次。连续给药42天后，将动物处死。
[0043]取血清测定碱性磷酸酶(AKP)活性、血清钙、血清磷水平(按试剂盒说明进行，试剂 盒购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司），同时分离被锯开的股骨进行X光拍片，用 Image Pr Plus 5.1测量骨痂面积、密度和骨痂综合强度。实验结果如下表所示。
[0044] 血清中碱性磷酸酶增加就表示成骨细胞的成骨活性增强，骨折愈合的标志是骨折 处出现骨痂。由上表可看出，AAV-Lin28a组大鼠血清碱性磷酸酶活性均有所提高，骨痂面 积、密度和骨痂综合强度均有增加，与AA V-MCS组和PBS比较差异均有统计学意义(P〈0.05)， 显示其能促进骨痂生成，提高骨痂质量，有促进骨折愈合的作用。
[0045] 实施例5 Lin28a基因过表达腺相关病毒对软组织损伤修复的影响。
[0046] Wistar种健康大鼠（购自南方医院实验动物中心）30只随机分为3组，每组10只，用 自制的冲击装置在30era高处，用200g砝码，从上向下自由落下，经砧木锤间接撞击大鼠右 下肢软组织3次，造成面积约Icm 2大小的非开放性软组织损伤模型。术后第二天开始在创伤 处局部注射IO9Pfu的AA V-Lin28a、IO9Pfu的AA V-MCS病毒液以及PBS，连续给药10天，末次给 药后24小时处死大鼠，按以下分级标准观察记录软组织损伤程度，进行评分。显微镜下观 察："一"无明显病理组织学改变；"+"皮下及肌纤维轻度水肿、瘀血，仅见散在嗜中性白细胞 等炎性细胞浸润；"++"皮下及肌纤维间中度水肿、少许肌纤维变性坏死，有明显的嗜中性白 细胞浸润；"+++"皮下及肌纤维严重水肿、大量肌纤维变性坏死及炎性细胞浸润，或炎性肉 芽组织增生。
[0047] 实验结果如下表所示，结果显示AAV_Lin28a能有效减少急性软组织损伤的水肿， 加速瘀血的吸收，促进损伤的修复。
【主权项】
1. 重组腺相关病毒在制备用于促进创伤修复药物中的应用，其中所述重组腺相关病毒 携带Lin28a基因。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物用于促进皮肤创伤愈合。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物用于促进深度烧伤的真皮再生。4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物用于抑制皮肤瘢痕形成。5. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物用于促进骨损伤修复。6. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物用于促进软组织损伤修复。
【专利摘要】本发明属于生物医学领域，具体涉及一种携带Lin28a基因的重组腺相关病毒在制备用于促进创伤修复药物中的应用。将Lin28a基因插入到腺相关病毒载体上，获得一携带Lin28a基因的重组腺相关病毒。本发明公开的重组腺相关病毒制备方法简单，能有效促进皮肤创伤的愈合，能显著促进部分深度烧伤的真皮再生，能促进骨损伤和软组织损伤修复，并能抑制瘢痕形成。
【IPC分类】A61K38/17, A61K48/00, A61P17/02, A61P19/08
【公开号】CN105435244
【申请号】CN201510865457
【发明人】周勇, 申友锋
【申请人】重庆高圣生物医药有限责任公司
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月2日