专利名称：表达破骨细胞相关受体的细胞活性和分化的调节的制作方法
技术领域：
本发明涉及胶原肽，尤其涉及调节破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞如破骨细胞活性和/或分化的胶原肽。
背景技术：
骨是由成骨细胞和破骨细胞不断重建的动态组织。新骨由成骨细胞构建，而旧骨由破骨细胞再吸收，骨骼系统的发育和稳态取决于骨形成和再吸收之间的此平衡。破骨细胞活性不足导致被再吸收旧骨量不足，并可引起骨硬化病，一种患者的骨变得更密实和更硬的疾病。类似地，破骨细胞活性提高导致被再吸收旧骨量增加，并也可引起疾病。与破骨细胞活性提高有关的疾病包括原发和继发骨癌，以及骨质疏松和类风湿性关节炎。破骨细胞在它们的细胞表面上表达破骨细胞相关受体(OSCAR) (W00220718)。该受体可调节破骨细胞活性(W00220718)，并也表达于破骨细胞前体细胞(Kim等，200 以及人单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和嗜中性粒细胞表面(Merck，Ε.等，2004 ;Merck，Ε.等， 2005 ；Merck, Ε.等，2006)。发明概述本申请的发明人已发现，胶原是破骨细胞相关受体(OSCAR)的配体，且由胶原肽结合的OSCAR刺激OSCAR表达细胞活化和/或分化。具体而言，本申请的发明人已表明，胶原肽可刺激OSCAR介导的信号转导以及破骨细胞前体细胞的分化。本发明一个方面提供调节破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞的分化和/或活化的胶原肽。本发明另一方面提供用于治疗骨缺陷或以改变的破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞分化和/或活化为特征的病症的方法的胶原肽。本发明另一方面提供治疗骨缺陷或以改变的破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞分化和/或活化为特征的病症的方法，包括将胶原肽给予有需要的个体。本发明另一方面提供胶原肽在制备用于治疗骨缺陷或以改变的破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞分化和/或活化为特征的病症的药物中的应用。本发明另一方面提供筛选破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞分化和/或活化的调节剂的方法，包括在受试化合物存在或不存在情况下将OSCAR表达细胞与胶原肽接触。本发明另一方面涉及胶原肽用于体外调节破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞分化和/或活化的应用。本发明另一方面提供调节破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞分化和/或活化的体外方法，包括将破骨细胞相关受体(0SCAI )表达细胞与胶原肽接触。本发明另一方面提供一种药物组合物，其包括胶原肽和能够改变破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞活化和/或分化的药剂，以及药学上可接受的赋形剂。本发明其它方面提供用于培养破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞的培养容器， 其包括用胶原肽包被的表面，还提供包括这样的培养容器的试剂盒，例如用于表征破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞。这样的培养容器和试剂盒可用于例如筛选破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞分化和/或活性的调节剂。图表简述
图1显示OSCAR是胶原的受体。将人Ig样受体OSCAR的Fc融合蛋白(OSCAR-Fc)、 OSCAR样转录物-2的Fc融合蛋白(0LT2-Fc)、TREM样转录物-1的Fc融合蛋白(TLTl-Fc) 和涎免凝集素-15的Fc融合蛋白(涎免凝集素15-Fc)用于ELISA，以评估与用以下物质包被的板的结合I_V 型胶原(χ 轴)，Ethion、Devro-Ethicon(Dev-Eth)、Horm 和 ProcColl CS全是胶原-1的不同制剂，还包括整联蛋白α2β1同源三聚体肽配体‘GF0GER’和单体胶原相关肽(mCRP)。将牛血清白蛋白(BSA)用作阴性对照蛋白包被(χ轴)。血小板胶原受体糖蛋白Vl(gpVI)的Fc-融合体用作阳性对照，纯化人IgG(IgG)用作阴性对照。利用 HRP缀合兔抗人第二抗体检测第一 Fc-融合体，并记录光密度450nm(0D)处的吸收(y轴)。图2显示OSCAR-Fc明显不结合其它α 2 β 1整联蛋白肽配体。将三螺旋肽(GPP) 10 用作由N端和C端(GPP)5重复序列结合以形成三螺旋肽结构的三螺旋肽的阴性对照。图3显示OSCAR-Fc明显不结合胞外基质蛋白一玻连蛋白和纤连蛋白。将三螺旋肽(GPP)ltl用作由N端和C端(GPP)5重复序列结合以形成三螺旋肽结构的三螺旋肽的阴性对照。图4显示抗人OSCAR mAb 11. 1CN5阻断OSCAR-Fc结合I型、II型和III型胶原， 而同种型对照mAb无影响。图5显示FITC缀合I型胶原(I型胶原-FITC，5 μ g/ml)结合表达OSCAR-FLAG的 RBL-2H3稳定细胞系(空白柱形图)，但不结合未转染细胞(灰色阴影)。该相互作用被 2 μ g/ml 的抗人 OSCAR mAbll. 1CN5 阻断。图6显示胶原酶处理(空白柱形图)从前列腺素-E2和维生素D3刺激的鼠骨髓基质细胞(BMSC)和鼠颅盖成骨细胞(OB)移除假定OSCAR配体(灰色阴影柱形图)。图7显示OSCAR-Fc结合用与以下序列一致的III-36同源三聚体肽衍生物包被的板的ELISA试验结果含与预测模体(下划线的)一致的假定OSCAR结合序列的111-36 的对应部分(halve)、仅含该模体的整理肽(trimmed peptide)和其中沿非螺旋断裂残基 (Gxx')对整理序列从头至尾进行丙氨酸扫描(粗体)的肽。图8显示由ELISA测定的不同氨基酸取代对人OSCAR-Fc结合活性的影响。图9显示GFP表达(y轴)对人OSCAR-⑶3 ξ NFAT-GFP报告物细胞系响应在用以下物质包被的组织培养板上过夜培养的前向散射(X轴)的斑点图BSA、I型(ProColl CS)、 II型(牛ΙΙ)、ΙΠ型(人III)、IV型(人IV)和V型(人V)胶原，以及肽(GPP)ic^nMSj 和 C 端结合的(GPP) 5 三螺旋肽(GPP) s-'GLOGPSGEO'- (GPP) 5、(GPP) 5-GP0GPAGF0GA0_ (GPP) 5 或(GPP)5-GA0GPAGFA_(GPP)5。在每个斑点图中显示了 2000个事件。图10显示hOSCAR-⑶3 ξ NFAT-GFP报告物细胞系响应丙氨酸扫描和组织培养板上包被的氨基酸取代肽的GFP表达的平均荧光强度(MFI)的图。显示的肽序列全部被N端和 C端(GPP)5重复序列结合。
图11显示人OSCAR胶原结合模体的鉴定。通过ELISA将人OSCAR-Fc用于筛选板结合的重叠II型三螺旋胶原肽文库(II型胶原工具盒(type-II collagen toolkit))。来自该文库的肽序列(肽#1-56)示于表1。图12显示人OSCAR胶原结合模体的鉴定。通过ELISA将人OSCAR-Fc用于筛选板结合的重叠III型三螺旋胶原肽文库(III型胶原工具盒(type-in collagen toolkit))。 来自该文库的肽序列(肽#1-57)示于表2。图13显示用OSCAR结合胶原肽包被的组织培养板促进破骨细胞发生。在用BSA ； 对照卵清蛋白肽 _)、(GPP) 10、(GPP) 5-GL0GPSGE0-(GPP) 5、(GPP) 5-GP0GPAGF0GA0_ (GPP) 5 或者(GPP)5-GA0GPAGFA_(GPP)5U轴)包被的平底96孔组织板中培养人外周血单核细胞。 将培养物进行抗酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)染色(暗红/紫色染色)。在与lOOng/ml重组 RANK-L和30ng/ml M-CSF(y轴)培养7天后，对巨多核TRAP+破骨细胞(OC)计数。OSCAR 结合胶原肽(GPP) 5-GP0GPAGF0GA0- (GPP) 5和(GPP) 5_GA0GPAGFA_ (GPP) 5增强破骨细胞发生， 而结合人 OSCAR-Fc 的 BSA、OVA、(GPP) 10 和(GPP) 5_GL0GPSGE0_ (GPP) 5 则没有。图14 显示在 2. 5 μ g/ml 鼠抗人 OSCAR mAb 11. 1CN5 或抗 MHCI 类 mAb (χ 轴)存在下在用(GPP) 5-GP0GPAGF0GA0_(GPP)5包被的平底96孔组织板中培养人外周血单核细胞7 天后计算的TRAP+巨多核细胞数(y轴)。图15显示在图14的培养条件下产生的TRAP+细胞的实例。在7天培养后，巨 TRAP+多核细胞以较高的细胞密度存在于用除BSA、OVA或(GPP) 5_GL0GPSGE0_ (GPP) 5之外的(GPP) 5-GP0GPAGF0GA0- (GPP) 5 或(GPP)「GAOGPAGFA- (GPP) 5 包被的板中。图16显示来自野生型C57BL/6小鼠的B匪在用(GPP) 5_GP0GPAGF0GA0_ (GPP) 5而非 BSA、0VA或(GPP)ltlU轴)(左上面板)包被的组织培养板中也表现出增强的破骨细胞发生 (y 轴)。与 BSA、OVA 或(GPP) 10 相比，在用(GPP)「GP0GPAGF0GA0- (GPP) 5 包被的板中，来自 OSCAR-缺陷(OSCAR-/-)(右上)或FcR γ -缺陷(FcR γ -/-)(左下)小鼠的BMM不表现出增强的破骨细胞发生。通过在 30ng/ml RANK-L+10ng/ml M-CSF 或 100ng/ml RANK-L+IOng/ mlM-CSF 浓度下并用(GPP) 5-GP0GPAGF0GA0_ (GPP)5 而非 BSA、OVA 或(GPP) 1(1 包被的板中培养，挽救了 DAP12-缺陷(DAP12-/-)BMM(右下)的体外破骨细胞发生缺陷。图17A显示在用(GPP) 5_GP0GPAGF0GA0_ (GPP) 5包被的板上形成的挽救的 DAP12-/"巨TRAP+(红色/紫色组织学染色)多核细胞的实例(x20物镜)。图17B显示用于比较的在(GPP)ltl包被板上培养的TRAP+单核DAP12-/-细胞的实例。通过免疫荧光法， 挽救的DAP12-/-巨多核细胞(DAPI，蓝色染色)形成由鬼笔环肽-Alex 488 (绿色染色)显示的肌动蛋白环。图18显示OSCAR配体结合挽救了 DAP12-缺陷和TREM2-缺陷的Nasu-Hakola患者的破骨细胞发生缺陷。在用BSA、0VA、(GPP)ltl或(GPP)5-GP0GPAGF0GA0_(GPP)5包被的板中，(RH小组(panel))DAP12的逆转录病毒转导挽救了 0SCAR-/-DAP12-/-B匪(y轴)的体外破骨细胞发生缺陷，而仅在用(GPP) 5-GP0GPAGF0GA0_(GPP) 5包被的板而非用BSA或 OVA包被的板中，(LH小组)0SCAR(长信号肽同种型(SP-L))的逆转录病毒转导挽救了 0SCAR-/-DAP12-/-BMM的体外破骨细胞发生缺陷。(GPP) 10包被的板也在较低程度上产生了巨TRAP+多核细胞。图19显示在空的pMx载体、DAP12或OSCAR SP-L的逆转录病毒转导下在用BSA或(GPP) 5-GP0GPAGF0GA0- (GPP) 5包被的板上形成的TRAP+ (红色/紫色组织学染色)细胞的实例(x20物镜)。在任何受试条件下，在利用空pMx逆转录病毒载体对0SCAR-/-DAP12-/-BMM 进行逆转录病毒转导时不形成巨TRAP+多核细胞。 图20显示在用(GPP) 5-GP0GPAGF0GA0- (GPP) 5包被的组织培养板而非用BSA或 (GPP)ltl包被的板上培养时，挽救了来自TREM2-缺陷(LHS)或DAP12-缺陷的Nasu-HakoIa 患者(RHS)的人外周血单核细胞的体外破骨细胞发生缺陷。 图21显示在用(GPP) 5-GP0GPAGF0GA0- (GPP) 5而非BSA或(GPP) 10包被的孔中来自 TREM2-缺陷(NH2)或DAP12-缺陷(NH6)的Nasu-Hakola患者的挽救的巨TRAP+多核细胞的实例(x20物镜)。图 22 通过 RT-PCR 显示在 BSA、(GPP)「GP0GPAGF0GA0-(GPP) 5 禾口 (GPP) 5-GA0GPAGFA- (GPP) 5包被的组织培养板上培养的DAP12-缺陷BMM破骨细胞表达破骨细胞特异性基因。在 BSA、GPP) 5-GP0GPAGF0GA0- (GPP) 5 和(GPP) 5_GA0GPAGFA_ (GPP) 5 包被的组织培养板上培养来自DAP12-缺陷小鼠的BMM。在破骨细胞发生后Mh，提取总RNA并反转录。通过RT-PCR将得到的cDNA用于检测破骨细胞特异性基因组织蛋白酶-K、降钙素受体、整联蛋白α v> ADAM8, ΜΜΡ-9和OSCAR的表达。GAPDH用作阳性对照。将来自B匪前体 (在用 100ng/ml RANK-L+10ng/ml M-CSF进行分化前于 100ng/ml M-CSF 中培养3 天)的总 RNA用作这些基因表达的阴性对照群体。图23显示N-糖基化对OSCAR-Fc结合胶原的作用。将人Ig样受体OSCAR的Fc 融合体(OSC-Fc) ,OSCAR样转录物-2 (0LT-2)用于ELISA，以评估在肽-N-糖苷酶F (PNGase F)(其从糖蛋白和糖肽释放天冬酰胺连接(N-连接)的寡聚糖)存在和不存在情况下与I-V 型胶原的结合。Ethicon、Devro-Ethicon (Dev-Eth)、Horm 和 ProColl CS 全是 I 型胶原的不同制剂。与牛血清白蛋白(BSA)的结合用作阴性对照。黑色条表明不存在PNGase F情况下的OSCAR-Fc结合，浅灰色条表明存在PNGase F情况下的OSCAR-Fc结合。空白条表明不存在PNGase F情况下的OSCAR样转录物_2结合，深灰色条表明存在PNGase F情况下的 OSCAR样转录物-2结合。图M显示可溶性三螺旋OSCAR结合肽阻断人OSCAR-Fc结合固定化的三螺旋肽。(A)将三螺旋肽DB"、(GPP) 5-GAOGPAGSA-(GPP) 5 ；NR325, (GPP) 5_GAOGPAGFA_ (GPP) 5 ； NR338、(GPP) 5-GAOGASGDR- (GPP) 5 和 NR340、(GPP) 5-GAOGPAGYA- (GPP) 5 固定到 96 孔 Nunc 免疫吸附板上。将人OSCAR-Fc (2. 5 μ g/ml)与指定加倍浓度范围(0-200 μ Μ，χ轴)的每种肽的可溶形式一起在室温下孵育30分钟。然后，通过固相测定分析OSCAR-Fc 肽复合体与它们各自的固定肽的结合情况，并记录450ηΜ光密度的吸光度(y轴)。虽然每种肽清楚地具有各自对OSCAR-Fc的亲和力，但是随着每种可溶性肽浓度的增加，清楚地抑制 OSCAR-Fc结合到相同肽的固定形式。⑶可溶性肽对人OSCAR-Fc的阻遏活性的对照实验。 将三螺旋肽DB"、(GPP) 5-GAOGPAGSA- (GPP) 5 ；NR325, (GPP) 5-GAOGPAGFA- (GPP) 5 ；NR338, (GPP) 5-GAOGASGDR- (GPP) 5 和 NR340、(GPP) 5-GAOGPAGYA- (GPP) 5 固定到 96 孔 Nunc 免疫吸附板上。将人OSCAR-Fc (2. 5 μ g/ml)与指定加倍浓度范围(0-200μΜ，χ轴)的可溶性(GPP)ltl 一起在室温下孵育30分钟，随后通过固相测定法分析OSCAR-Fc与固定化的DB99、NR325、 NR338或NR340结合情况，并记录450ηΜ光密度的吸光度(y轴)。类似浓度的可溶性对照三螺旋肽(GPP) 10不阻断人OSCAR-Fc结合固定化的DB99、NR325、NR338或NR340肽，表明阻断效应是因为含OSCAR结合模体的OSCAR结合三螺旋肽配体的可溶性“非固定化”状态。图25显示展示人(h)和鼠(m) OSCAR-⑶3 ξ NFAT-GFP报告物细胞系对以下物质反应的斑点图(10，000个事件)固定化的BSA ；含最小OSCAR结合序列“GP0GPAGF0”的线性肽以及设计成最小OSCAR结合序列“(GPP) 5-GP0GPAGF0- (GPP) 5”的三螺旋肽。GFP表达，y 轴；前向散射，χ轴。表1显示包括完整II型胶原序列的重叠同源三聚体II型胶原肽文库(II型胶原工具盒)的序列。还显示以道尔顿(Da)计的肽质量。表2显示包括完整II型胶原序列的重叠同源三聚体III型胶原肽文库(III型胶原工具盒)的序列。还显示以道尔顿(Da)计的肽质量。表3显示111-36肽衍生物的氨基酸序列，包括它们以道尔顿(Da)计的质量。表4显示最强结合OSCAR-Fc的基于同源三聚体胶原的肽序列的比对。表5显示假定OSCAR结合位点的预测。实施方案详述本发明涉及与破骨细胞相关受体(OSCAR)相互作用并调节OSCAR表达细胞分化和 /或活化的胶原肽。破骨细胞相关受体(OSCAR)是在哺乳动物破骨细胞和其它细胞类型表面上表达的细胞表面受体。破骨细胞相关受体的实例包括人破骨细胞相关受体(基因ID =126014 ； 参比氨基酸序列AAH35023. IGI :23273932)、小鼠破骨细胞相关受体(基因ID :232790 ；参比氨基酸序列AAI37777. IGI :187950779)和大鼠破骨细胞相关受体(基因ID :292537 ；本文序列)。合适的破骨细胞相关受体(OSCAR)可包括上文确定的参比序列或其等位变体的氨基酸序列。等位变体的氨基酸序列相对参比序列可具有例如至少90%、至少95%、至少 96 %、至少97 %、至少98 %或者至少99 %的序列同一性。可利用本领域的标准方法如免疫技术鉴定破骨细胞相关受体。针对OSCAR的特异性抗体为市售的，包括例如 mAb 11. 1CN5 (Beckman coulter)、mAb 18D440. 1 (Abeam)、山羊 OSCAR 多克隆 Ab (Novus Biologicals)；以及 OSCAR (Μ-17)、(N-16)禾 Π (D-19)山羊多克隆 IgG(Santa Cruz Biotechnology)。破骨细胞相关受体(OSCAR)可由哺乳动物细胞表达，例如人细胞或鼠细胞(如小鼠细胞和大鼠细胞)。表达破骨细胞相关受体(OSCAR)的细胞包括破骨细胞、破骨细胞前体、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和嗜中性粒细胞。如本文所述，可利用在合适条件下形成异源或同源三聚体并结合OSCAR的任何胶原肽。例如，适合本文所述应用的胶原肽可包括氨基酸序列GX1OGX2X3GX4X5,其中0为羟脯氨酸残基，以及&独立地为任何非极性氨基酸，)(2独立地为？、六或￥，X3独立地为任何氨基酸，父4独立地为F、S、D、Y、A或E ；
)(5独立地为任何氨基酸。在一些实施方案中，适合本文所述应用的胶原肽可包括氨基酸序列GX1OGX2X3GX4X5,其中0为羟脯氨酸残基，以及X1独立地为A、P或G，优选P或A，更优选A，)(2独立地为？、々或￥，更优选？或八，X3独立地为A、M、P、0、Q或S，更优选A或S，X4独立地为F、S、D、Y、A或E，优选F、S、D或Y，更优选F，)(5独立地为0、々、1 或0，优选0。在一些优选实施方案中，胶原肽可包括氨基酸序列GX1OGPX3GFO,其中X1和知如上所述定义。例如，胶原肽可包括氨基酸序列GX1Ogpx3GFOGX6O,其中&和如上所述定义，X6独立地为A、P、L或A。胶原肽可包括这样的氨基酸序列相对选自GP0GPAGF0GA0、GA0GPAGFA、 GERGETGP0GPAGF0GA0GQN、GP0GPAGF0GA0GQNGE0GGK、GA0GPAGF0GA0、GP0GAAGF0GA0、 GPOGPAGFAGAO、GPOGPAGFOGAA、GAOGPAGSA、GAOGVMGFA、GAOGPAGFAGEA、GA0GAAGFA、 GAOGPPGFA、GA0GP0GFA、GAOGPQGFA、GAOGASGDR、GAOGPAGYA、GP0GPAGA0GA0、GA0GPAGEA、 GA0GPAGFD和GA0GPQGPA的序列(其中0为羟脯氨酸残基)，其具有至少50%、至少60 %、 至少70%、至少90%或至少95%的序列同一性。序列同一性通常根据GAP 算法(Genetics Computer Group，Madison，WI)限定。 GAP利用Needleman和^msch算法来比对两条完整序列，其最大化匹配数且最小化空位数。 一般地，利用空位产生罚分(gap creation penalty) = 12和空位延伸罚分(gap extension penalty) = 4的默认参数。可优选使用GAP，但可利用其它算法，例如BLAST (McGirmis S 等(2004)32 ；W20-W25 ；Altschul 等(1990))，FASTA(其利用 Pearson 和 Lipman 1988 的方法)或 Smith-Waterman 算法(Smith 和 Waterman 1981)或上述 Altschul 等(1990)的 TBLASTN程序(通常使用默认参数)。特别地，可利用psi-Blast算法(Altschul等1997)。 BLAST算法可通过NCBI网址(Johnson等2008)上的界面获得。序列同一性和相似性也可利用 Genomequest 软件(Gene-IT，Worcester MA USA)确定。优选在本文所述相关序列全长内进行序列比较。 合适的胶原肽可包括选自以下的氨基酸序列GP0GPAGF0GA0、GA0GPAGFA、 GERGETGP0GPAGF0GA0GQN、GP0GPAGF0GA0GQNGE0GGK、GA0GPAGF0GA0、GP0GAAGF0GA0、 GPOGPAGFAGAO、GPOGPAGFOGAA、GAOGPAGSA、GAOGVMGFA、GAOGPAGFAGEA、GA0GAAGFA、 GAOGPPGFA、GA0GP0GFA、GAOGPQGFA、GAOGASGDR、GAOGPAGYA、GP0GPAGA0GA0、GA0GPAGEA、 GA0GPAGFD和GA0GPQGPA，其中0为羟脯氨酸残基。在一些实施方案中，胶原肽可包括上述胶原序列的两个或更多个重复序列。胶原肽长度可为至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少 45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95 或者至少100个氨基酸。或者，胶原肽长度可多达10、多达15、多达20、多达25、多达30、多达35、多达40、多达45、多达50、多达55、多达60、多达65、多达70、多达75、多达80、多达85、多达90、多达95、多达100、多达200或多达300个氨基酸。胶原肽序列可为天然存在的胶原序列(即在自然界中存在的胶原序列)，例如在I 型、II型或III型胶原中发现的胶原序列，或者非天然存在的胶原序列(即非天然存在的人工胶原序列)。可将胶原肽包括在非天然存在的融合肽和融合多肽中，例如其中胶原肽融合到非天然融合该肽的一个或多个序列。非天然融合胶原肽的序列可包括人工胶原序列、非胶原序列或肽序列自身的附加拷贝。在一些实施方案中，可将一个或多个异源氨基酸连接或融合到本文所述胶原肽的 N端和C端，并且多肽或肽可包括连接或融合一个或多个异源氨基酸的上述肽。异源氨基酸序列为胶原中非天然存在的氨基酸序列，例如非胶原序列。异源氨基酸序列包括人工序列，即非天然存在的序列。异源氨基酸序列为以下序列其不存在于任何天然胶原(例如I型、II型或III 型胶原)中并且在没有间插氨基酸下通过肽键与本文所述肽连接，换言之，通常为非天然存在的在本文所述胶原肽的融合位置与所述肽连接的氨基酸链。通常，当异源氨基酸融合到胶原肽的N端或C端时，整个邻接的氨基酸序列不存在于胶原内。在一些优选实施方案中，将上述胶原肽融合到支持三螺旋多脯氨酸II螺旋结构的异源N端和C端氨基酸序列，例如GXaXb重复序列，其中Xa和)(b为非G的任何氨基酸，优选Xa独立地为除甘氨酸或0外的任何氨基酸。合适的三螺旋序列包括GPP和/或GPO重复序列。例如(GPP)n，其中η为2-6或更大以及(GPO)nl，其中Ii1为2_6或更大。优选地，胶原肽在其N端和C端包括“GPP”序列的多个重复，例如2、3、4、5或6个。 例如，胶原肽在其N端和C端可包括(GPP)5序列。在一些实施方案中，胶原肽可包括一份或多份拷贝的“GPC”序列，以促进二硫键交联。例如，肽可在其N端包括GPC(GPP)5序列， 并可在其C端包括(GPP) 5GPC序列。例如，合适的胶原肽可包括序列(GPP) 5-GP0GPAGF0GA0-(GPP)5或 (GPP) 5-GA0GPAGFA- (GPP) 5,或者更优选的 GPC (GPP) 5-GP0GPAGF0GA0_ (GPP) 5GPC 或 GPC (GPP) g-GAOGPAGFA- (GPP) 5GPC。本文所述胶原肽或多肽N端或C端的异源氨基酸可形成附加序列或模体。事实上， 任何期望附加氨基酸序列可包含在与本文所述肽的融合体中，包括通过对肽三聚体化形成的三螺旋的非三螺旋延伸。合适的异源氨基酸序列包括生物活性肽和多肽序列，包括趋化因子和细胞因子，例如RANKL和护骨蛋白(osteoprotegrin，0PG)。本文所述胶原肽和多肽优选地在合适条件下形成三聚体。肽基三聚体可为本文所述胶原肽的同源三聚体或异源三聚体。例如，结合OSCAR 的胶原肽基三聚体可包括三个含以下氨基酸序列的肽GX1OGX2X3GX4X5,其中0为羟脯氨酸残基，以及X1独立地为任何非极性氨基酸，)(2独立地为？、六或￥，)(3独立地为任何氨基酸，
父4独立地为F、S、D、Y、A或E ；)(5独立地为任何氨基酸。在一些实施方案中，胶原肽基三聚体可包括三个含以下氨基酸序列的肽GX1OGX2X3GX4X5,其中0为羟脯氨酸残基，以及X1在至少一个所述肽中独立地为A、P或G，优选P或A，更优选A，X2在至少一个所述肽中独立地为P、A或V，更优选P或A，X3在至少一个所述肽中独立地为A、M、P、0、Q或S，更优选A或S，X4在至少一个所述肽中独立地为F、S、D、Y、A或E，优选F、S、D或Y，更优选F，&在至少一个所述肽中独立地为0、々、1 或0，优选0。例如X1在三聚体的一个、两个或三个所述肽中可为A、P或G。X2在三聚体的一个、两个或三个所述肽中可为P、A或V。X3在三聚体的一个、两个或三个所述肽中可为A、M、P、0、Q或S。X4在三聚体的一个、两个或三个所述肽中可为F、S、D、Y、A或E。X5在三聚体的一个、两个或三个所述肽中可为0、A、R或Q。胶原异源三聚体的生产例如在Slatter DA等.J Mol Biol. (2006) 2 ；359 (2) 289-98中有述。如上所述，形成肽基三聚体的肽可融合一个或多个非天然融合该肽的序列，例如一个或多个异源氨基酸，以形成非天然存在的肽和多肽融合体。在一些实施方案中，肽可在三聚体中交联，例如利用共价键如己酸交联(例如赖氨酰-赖氨酰氨基己酸酯(lysyl-lysyl amino hexanoate)交联)。或者，可产生、选择性保护和去保护二硫键节点(disulphide knot)，以依次和相互对准地连接三条链。在其它实施方案中，肽可在无任何交联下三聚体化，并可在无交联下提供由本文所述肽组成的三聚体。肽基三聚体可通过提供本文所述肽并引起或致使(在合适条件下) 肽缔合以形成三聚体来产生。三螺旋结构可通过任何合宜技术测定，例如旋光测量法或圆二色性法。三聚体化之后，可分离三聚体，例如用于后续使用和/或操作。本文所述胶原肽及其三聚体可用于调节破骨细胞相关受体表达细胞的活化和/ 或分化，例如通过活化OSCAR介导的信号转导。例如，胶原肽可例如通过特异结合OSCAR来刺激破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞的分化和/或活化。或者，胶原肽可例如通过阻断OSCAR结合胶原配体来抑制破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞的分化和/或活化。合适的胶原肽及其三聚体结合破骨细胞相关受体。例如，与包含选自以下序列的胶原肽相比，胶原肽可以相同或更好的亲和力结合破骨细胞相关受体GP0GPAGF0GA0、 GA0GPAGFA、 GERGETGP0GPAGF0GA0GQN、 GP0GPAGF0GA0GQNGE0GGK、 GA0GPAGF0GA0、 GP0GAAGF0GA0、GP0GPAGFAGA0、GP0GPAGF0GAA、GA0GPAGSA、GAOGVMGFA、GA0GPAGFAGEA、 GA0GAAGFA、GA0GPPGFA、GA0GP0GFA、GA0GPQGFA、GA0GASGDR、GA0GPAGYA、GP0GPAGA0GA0、 GAOGPAGEA、GA0GPAGFD 和 GA0GPQGPA。优选地，与含有选自GP0GPAGF0GA0和GA0GPAGFA的氨基酸序列的胶原肽相比，胶原肽以相同或更好的亲和力结合破骨细胞相关受体。例如，与胶原肽 GPC (GPP) 5-GP0GPAGF0GA0- (GPP) 5GPC 或 GPC (GPP) 5-GA0GPAGFA- (GPP) 5GPC 相比，胶原肽可以相同或更好的亲和力结合破骨细胞相关受体。本文所述胶原肽或三聚体可表现出不结合或基本不结合已知胶原受体，例如整联蛋白α 2 β工、网柄菌凝素结构域受体DDRl和DDR2或者血小板糖蛋白VI。测定胶原肽对破骨细胞相关受体的亲和力的方法是本领域公知的，并亦在本文他处有述。本文所述胶原肽或三聚体可以分离和/或纯化形式提供，即不含其它胶原肽或片段或天然存在与胶原相关的其它生物分子。用于本文所述应用的胶原肽优选为合成的，即通过合成或重组方法生产。例如，本文所述胶原肽可全部或部分地通过化学合成来产生。例如依据充分确立的标准液体肽合成法或优选的固相肽合成法(这些方法的一般说明是广泛可得的(参见例如 J. M. Stewart 和 J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis (固相肽合成)，第二版，Pierce Chemical Company, Rockford,Illinois(1984)、Μ·Bodanzsky 禾口 k. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis (月太合成实践)，Springer Verlag, New York (1984)； J. H. Jones, The Chemical Synthesis of Peptides (月太的化学合成)· Oxford University Press, Oxford 1991 ；Applied Biosystems 430A 用户手册，ABI Inc.，Foster City,
California、G. A. Grant (主编)Synthetic Peptides, A User's Guide (合成妝-用户
指南).W. H. Freeman & Co.，New York 1992、Ε. Atherton 禾P R. C. Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach (固相肽合成一实践方法)· KL Press 1989 以及 G. B. Fi elds 版 So lid-Phase Peptide Synthesis (固相月太合成)(Methods in Enzymology 卷28 . Academic Press, New York和London 1997))，可容易地制备肽，或者可通过液相法在溶液中制备它们，或者通过固相、液相和溶液化学的任何组合，例如通过首先完成各自的肽部分，接着视需要酌情，在移除存在的任何保护基团后，通过分别的碳酸或磺酸或其活性衍生物的反应引入残基X来制备。例如，可在自动化合成仪的TentaGel R RAM树脂上通过Fmoc (N-(9-芴基)甲氧羰基)化学作为C端酰胺合成肽。产生本文所述胶原肽的另一合宜方法是在表达系统中通过利用核酸表达编码前体(其中脯氨酸替换期望的羟脯氨酸存在)的核酸。如利用赖酰胺残基已完成的 (Nokelainen等1998Matrix Biol. 16(6) :3四_38)，可例如通过合适羟化酶的共表达来实现包含GPO的肽的制备。对于含有待翻译后通过羟化转化成羟脯氨酸(0)的脯氨酸残基的肽，可共表达脯氨酰羟化酶。Myllyharju等Biochem Soc trans 2000，4353-7描述了人重组胶原的有效表达系统，其可用于提供本文所述肽。该系统利用甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，以及期望肽链和脯氨酰4_羟化酶α -亚基和β -亚基的共表达。在一些实施方案中，本文所述胶原肽或多肽可被化学修饰，例如通过添加一个或多个聚乙二醇分子、糖、磷酸酯和/或其它这样的分子，其中上述分子不与野生型胶原蛋白天然连接。合适的化学修饰对于本领域技术人员而言是公知的。在肽或多肽的数个位点处可以相同或不同的程度存在同一类型的修饰。另外，既定肽或多肽可包含多种类型的修饰。修饰可发生在肽序列中任何位置，包括肽骨架、氨基酸侧链、和氨基或羧基末端。 修饰包括例如乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂类或脂类衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸酯的形成、甲酰化、Y -羧基化、糖基化、GPI锚定形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白酶水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、糖基化、脂类连接、硫酸酯化(sulfation)、 谷氨酸残基的Y-羧基化、羟基化和ADP-核糖基化、硒酰基化、硫酸盐化(sulfation)、转运RNA介导的蛋白的氨基酸添加如精氨酰化和泛素化。参见例如ftOteins-Structure And Molecular Properties (蛋白质结构和分子性质)，第二版，T. E. Creighton, W. H. Freeman 禾口 Company,New York (1993)以及Wold,F. ,"Posttranslational Protein Modifications Perspectives and Prospects (翻译后蛋白修饰前景与展望)，“Posttranslational Covalent Modification Of Proteins (蛋白质的翻译后共价修饰)第1-12页， B. C. Johnson 主编，Academic Press, New York(1983) ；Seifter 等，Meth. Enzymo 1. 182 626-646(1990)禾口 Rattan 等，“Protein Synthesis :Posttranslational Modifications and Aging (蛋白质合成翻译后修饰和老化)，“Ann. N. Y. Acad. Sci. 663 :48-62(1992)。在一些实施方案中，保护基团可偶联到胶原肽的N端和/或C端，以保护胶原肽免受酶消化。合适的保护基团在本领域内是公知的。可对本文所述胶原肽或多肽进行结构修饰。结构修饰肽在三维形状和生物活性方面均基本类似于本文所述胶原肽，并优选包括极其类似于肽序列中活性基团的三维排布的反应性化学部分空间排布。结构修饰肽的实例包括假肽(pseudo-p印tide)、半肽和拟肽。可对本文所述胶原肽或多肽进行结构修饰，以包括一个或多个非肽键，例如假肽键(pseudop印tide bond)。许多合适的假肽键是本领域已知的，包括逆反(retro-inverso) 假肽键(Rivier, J. E.和 Marshall，G. R.(主编)“P印tides，Chemistry, Structure and Biology (肽、化学、结构和生物学)”，Escom, Leiden (1990)，第 722-773 页中的 "Biologically active retroinverso analogues of thymopentin(胸腺喷丁的生物活性逆反类似物)”，Sisto A 等，以及 Dalpozzo 等· (1993)，Int. J. P印tide Protein Res.， 41 :561-566)、还原等排体假肽键(Couder 等.(1993)，Int. J. Peptide Protein Res. ,41 181-184)、南五味子酮键和二甲硫键。含有假肽键的胶原肽或多肽可具有与上述序列相同的氨基酸序列，区别在于一个或多个肽键由假肽键所取代。在一些实施方案中，大多数N端肽键被取代，因为这样的取代将赋予针对由外肽酶作用于N端的蛋白酶水解作用的抗性。也可通过用其它类似结构的化学基团取代氨基酸的化学基团作其它修饰。可对本文所述胶原肽或多肽进行结构修饰以除去肽键。合适的结构修饰肽包括拟肽(Simon 等，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 :9367-9371)，它是 N-取代甘氨酸的寡聚物。每个甘氨酸残基的N-烷基对应天然氨基酸的侧链。可用对应被取代氨基酸的N-取代甘氨酸取代肽氨基酸的部分或全部。可对本文所述胶原肽或多肽进行结构修饰以包括一个或多个D-氨基酸。例如，肽可为对映体，其中肽的氨基酸序列中的一个或多个L-氨基酸残基被对应的D-氨基酸残基或反向D-肽置换，反向D-肽是由与上述L-氨基酸序列相比以相反顺序排列的D-氨基酸组成的肽(Smith C. S. φ, Drug Development Res.，15，pp. 371-379 (1988))。产生合适的结构修饰肽的方法是本领域内公知的。
可将本文所述胶原肽或多肽连接到偶联配偶体(partner)，例如效应物分子、标签、标记、药物、毒素和/或载体或转运分子和/或靶分子例如抗体或其结合片段或其它配体。将肽偶联到肽基和非肽基偶联配偶体的技术是本领域内公知的。例如，可将胶原肽或多肽缀合到产生生物学作用的活性剂，例如药剂。合适的药剂可产生对病症的治疗效果。例如，可将胶原肽缀合至改变破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞活化和/或分化的药剂。能够改变OSCAR表达细胞活化和/或分化的示例性药剂包括佐剂、趋化因子、细胞因子如RANKL、护骨蛋白(OPG)、荧光染料、重组酶和蛋白或者融合蛋白。在一些实施方案中，可将胶原肽或肽基三聚体连接或包被到固体表面或不溶性支持体上。将肽或多肽固定到不溶性支持体上的方法对本领域技术人员是已知的。例如，可将胶原肽或肽基三聚体固定到培养容器表面。在其表面固定有胶原肽或三聚体的培养容器可用于培养表达破骨细胞相关受体(OSCAR)的细胞。合适的培养容器是本领域内公知的，包括组织培养板，例如多孔组织培养板，如48 孔板或96孔板。带有固定化胶原肽或肽基三聚体的培养容器例如可用于筛选破骨细胞相关受体 (OSCAR)表达细胞分化和/或活性的调节剂的方法。带有固定化胶原肽或肽基三聚体的培养容器可作为试剂盒的一部分提供。除了培养容器之外，这样的试剂盒还可包括用于表征OSCAR表达细胞的试剂。例如，破骨细胞可通过适于检测抗酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)的试剂表征。适于检测抗酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)的试剂是本领域内公知的，且是市售的(例如TRAP染色试剂盒#386A-1KT Sigma-Aldrich)。本文所述胶原肽和肽基三聚体也可用于治疗方法。例如，胶原肽可用于治疗骨缺陷或以改变的破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞分化和/或活化为特征的病症的方法。胶原肽或肽基三聚体也可用来生产用于治疗骨缺陷或以改变的破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞分化和/或活化为特征的病症的药剂。治疗以改变的OSCAR表达细胞分化和/或活化为特征的病症的方法可包括将胶原肽或肽基三聚体给予有需要的个体。以改变的破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞分化和/或活化为特征的病症包括骨硬化病、原发骨癌、继发骨癌、骨质疏松、类风湿性关节炎、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、骨性关节炎和其它溶骨疾病。在一些优选实施方案中，本文所述胶原肽或肽基三聚体可用于治疗以改变的破骨细胞或破骨细胞前体细胞分化和/或活化为特征的病症，例如骨硬化病、原发骨癌、继发骨癌、骨质疏松和类风湿性关节炎。例如，本文所述胶原肽或肽基三聚体可用于通过提高破骨细胞前体细胞的分化和 /或提高破骨细胞的活化来治疗以破骨细胞或破骨细胞前体细胞分化和/或活化下降为特征的病症，例如骨硬化病。本文所述胶原肽或肽基三聚体也可用于治疗以提高的破骨细胞或破骨细胞前体细胞分化和/或活化为特征的病症，例如原发骨癌、继发骨癌、骨质疏松和类风湿性关节炎。本文所述胶原肽或肽基三聚体例如可通过阻断OSCAR结合胶原配体和减少OSCAR介导细胞信号转导来降低破骨细胞前体细胞的分化和/或降低(成熟)破骨细胞的活化。在其它实施方案中，本文所述胶原肽可用于治疗以改变的骨髓细胞、单核细胞和/ 或巨噬细胞分化和/或活化为特征的病症，例如急性髓性白血病和多发性骨髓瘤。本文所述胶原肽例如可调节这些细胞的分化和/或活化。本文所述胶原肽或肽基三聚体也可用于治疗骨缺陷。例如，治疗个体的骨缺陷的方法可包括将胶原肽或肽基三聚体给予有需要的个体。肽或肽基三聚体例如可通过任何合宜方法在骨缺陷位点局部给药。肽或肽基三聚体将增加破骨细胞募集到骨缺陷位点。该募集可提高骨再吸收和形成之间的骨周转(bone turnover)和偶联，由此利于骨缺陷位点处的骨组织修复。骨缺陷可在骨结构被破坏或损害的任何位点。缺陷可包括裂缝、不连续、骨折、骨不连接(non-union)或骨植入物的位点。骨植入物通常用于一系列医疗应用，可包括自体或对抗疗法的骨组织或者人工材料(如不锈钢、钛或陶瓷)植入物。在一些实施方案中，可用本文所述肽或肽基三聚体包被骨植入物，以利于植入位点的骨修复。本文提及的胶原肽或肽基三聚体也可用于体外调节破骨细胞相关受体(OSCAR) 表达细胞的分化和/或活化。例如，体外调节破骨细胞相关受体(OSCAAR)表达细胞的分化和/或活化的方法可包括将破骨细胞相关受体(0SCAI )表达细胞与本文所述胶原肽接触。胶原肽或肽基三聚体调节OSCAR表达细胞的分化和/或活化。在一些实施方案中，与不存在胶原肽情况下的分化和/或活化水平相比，在胶原肽存在情况下可提高OSCAR表达细胞的分化和/或活化。在其它实施方案中，与不存在胶原肽情况下的分化和/或活化水平相比，在胶原肽或肽基三聚体存在情况下可降低OSCAR表达细胞的分化和/或活化。可将胶原肽固定到固相支持体上。合宜地，固相支持体可在上述培养容器如多孔组织培养板中。OSCAR表达细胞例如破骨细胞前体细胞的分化可通过任何合宜的方法确定，例如通过本文所述抗酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)染色，例如利用TRAP染色试剂盒(SIGMA)。OSCAR表达细胞的活化可通过任何合宜的技术确定，例如通过利用合适的报告物细胞系确定OSCAR信号转导的水平或量。合宜地，本文所述OSCAR-⑶3 ξ NFAT-GFP报告物细胞系可用于确定胶原肽对破骨细胞中OSCAR信号转导的作用。用于确定OSCAR表达细胞的分化和/或活化的其它合适方法包括信号转导途径 (如磷酸化)翻译后活化的蛋白质印迹法、通过ELISA或流式细胞术对诱导或下调蛋白产生如趋化因子或细胞因子产生的测定(Merck等2004，200队2006)、钙流出实验(参见例如 Merck等2004，20(^&2006)；由呼吸爆发和游离氧自由基的产生界定的细胞活化(Merck等 2006)；单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或破骨细胞中受体介导胞吞或吞噬作用期间的细胞运输和抗原呈递测定(Merck等，2004&2005)；骨吸收过程中破骨细胞中胶原的细胞运输(Nesbitt&Horton, 1997 ；Stenbeck&Horton 2004) ；OSCAR 表达细胞中多核化和蛋白表达的显微测定；通过活化或分化诱导或下调的基因的RT-PCR ；通过活化或分化诱导或下调的蛋白的蛋白质印迹测定；以及在活化或分化后诱导或下调的RNA分子例如诱导的mRNA、微小RNA的RNA印迹测定。本发明其它方面涉及筛选胶原介导的表达破骨细胞相关受体(OSCAR)的细胞的分化和/或活化的调节剂(例如激活剂或抑制剂)的方法。如本文所述，这样的调节剂例如可用于开发针对以改变的OSCAR表达细胞分化和/或活化为特征的病症的治疗。筛选胶原介导的OSCAR表达细胞分化和/或活化的调节剂的方法可包括，在存在或不存在受试化合物情况下将OSCAR表达细胞与本文所述胶原肽接触，并测定细胞的分化和/或活化。在一些实施方案中，在不存在受试化合物情况下，胶原肽可具有对OSCAR表达细胞分化和/或活化的积极效果。在受试化合物存在相对于其不存在情况下胶原肽介导的OSCAR表达细胞分化和/ 或活化改变表示，受试化合物是分化和/或活化的调节剂。在受试化合物存在相对于其不存在情况下胶原介导的OSCAR表达细胞分化和/或活化提高可表示，受试化合物是胶原介导的OSCAR表达细胞分化和/或活化的激活剂。在受试化合物存在相对于其不存在情况下胶原介导的OSCAR表达细胞分化和/或活化降低可表示，受试化合物抑制或阻遏胶原介导的OSCAR表达细胞分化和/或活化。例如，抑制性化合物可抑制或阻遏胶原肽结合OSCAR。OSCAR表达细胞的分化和/或活化可根据上述确定。可利用本文所述方法筛选的合适受试化合物可为药物筛选程序中所用的天然或合成化合物。也可利用含数种已表征或未表征组分的植物、微生物或其它生物的提取物。组合文库技术提供了检验潜在大量不同化合物调节相互作用的能力的有效方法。 对于各种天然产物、小分子和肽诸如此类，这样的文库及它们的应用是本领域内已知的。在一些情况下可优选使用肽文库。可加入本发明方法的受试化合物的量通常根据所用化合物类型通过反复试验来确定。通常，可使用约0. OOlnM至ImM或更多的假定抑制剂化合物，例如0. OlnM至100 μ Μ, 例如0. 1-50 μ Μ,例如约10 μ M0适用于筛选的受试化合物包括已知调节OSCAR表达细胞分化和/或活化的化合物。这样的化合物包括本文所述胶原肽、TNF家族成员(例如TNF、TRAIL等)、RANKL、护骨蛋白(OPG)、M-CSF、GM-CSF、白介素IL_1、IL-4、IL-6 家族(例如 IL-6、IL-11、白血病抑制因子、抑癌蛋白 M 等)、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-23 (Lorenzo 和 Choi, 2008) ,Toll样受体(TLR)配体以及其它炎症介质例如LPS和抗炎介质如TGF-β和IL-10。合适的受试化合物还包括任何上述化合物的类似物、衍生物、变体和模拟物，例如利用推理式药物设计产生的化合物，以提供具有适于调节OSCAR表达细胞分化和/或活化的特定分子形状、大小和电荷特征的受试候选化合物。可分离或纯化受试化合物，或者可利用重组表达或化学合成的常规技术合成受试化合物。而且，其可在组合物(例如药剂、药物组合物或药物)的制造(即生产或配制)中制备和/或使用。可将它们给予个体，以治疗本文所述以改变的破骨细胞分化和/或活化为特征的病症，或者用于预防或延缓这样病症的发作。因此，如下文所述，本文所述方法可包括将受试化合物配制成用于治疗应用的含药学上可接受的赋形剂、溶媒或载体的药物组合物。
在鉴定调节胶原介导的破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞分化和/或活化的化合物之后，方法还可包括修饰该化合物以优化其药学性质。对鉴定为生物活性的“主导”化合物的修饰是药品开发的已知方法，且在活性化合物难以合成或合成昂贵的情况或不适合特定给药方法的情况(例如肽不是很适合作为口服组合物的活性剂，因为它们在消化道中容易被蛋白酶快速降解)下，可能是需要的。已知活性化合物的修饰(例如产生模拟物)可用于避免针对靶性质随机筛选大量分子。为优化其药学性质对“主导”化合物的修饰通常包括数个步骤。首先，确定在确定靶性质方面关键和/或重要的化合物具体部分。在肽的情况下，这可通过系统地改变肽的氨基酸残基(例如通过依次置换每个残基)来完成。构成化合物活性区域的这些部分或残基即为通常所说的“药效团”。一旦已发现药效团，则依据其物理性质如立体化学、键合、大小和/或电荷，利用一系列来源如光谱技术、X射线衍射数据和NMR的数据来模拟其结构。在该模拟过程中可利用计算分析、相似性作图(similarity mapping)(其模拟药效团的电荷、疏水性/亲水性和/或体积，而非原子间的键合)和其它技术。在该方法的变型中，模拟调节破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞分化和/或活化的化合物的三维结构。这尤其可用于所述化合物改变构象的情形，使模型得以在主导化合物的优化中顾及此项。然后选择模板分子，可将模拟药效团的化学基团接枝到它上面。可合宜地选择模板分子和接枝于其上的化学基团，以使经修饰的化合物易于合成、可能是药学上可接受的和不会体内降解，同时保留主导化合物的生物活性。然后可筛选由该方法发现的修饰化合物，以确定它们是否具有目标性质或它们表现目标性质的程度。修饰化合物包括主导化合物的模拟物。之后可进行其它优化或修饰，以得到用于体内或临床试验的一种或多种最终化合物。利用本发明方法鉴定和/或获得的化合物可配制成本文他处所述的药物组合物。虽然对于活性化合物例如胶原肽，可单独给药，但优选将其呈现为药物组合物 (例如制剂)，该药物组合物包括胶原肽以及一种或多种药学上可接受的载体、辅料、赋形剂、稀释剂、填充剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂、润滑剂或本领域技术人员公知的其它材料。例如，药物组合物可包括胶原肽和药学上可接受的赋形剂。另外，药物组合物可包括一种或多种另外的活性剂，另外的活性剂包括例如能够调节OSCAR表达细胞活化和/或分化的药剂。例如，药物组合物可包括胶原肽、能够调节破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞活化和/或分化的药剂和药学上可接受的赋形剂。包含本文所述胶原肽或三聚体的药物组合物可用于本文所述方法，所述胶原肽或三聚体例如与一种或多种如本文所述的药学上可接受的载体、赋形剂、缓冲剂、佐剂、稳定剂或其它材料混合或配制在一起。本文所用术语“药学上可接受的”涉及以下化合物、材料、组合物和/或剂型在合理的药学判断范围内，它们适用于在无过多毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症下与受试者(例如人)的组织接触，并与合理的效益/风险比(可接受的高化疗指数)相当。在与制剂其它成分兼容的意义上，每种载体、赋形剂等也必须是“可接受的”。合适的载体、赋形剂等可参见标准药学文献，例如Remington，s Pharmaceutical kiences (雷氏药物学)，第 21 版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，2005。制剂可合宜地以单位剂型存在，并可通过药学领域中任何公知方法制备。这样的方法包括以下步骤将活性化合物与可构成一种或多种配合剂的载体结合。一般而言，通过均一且密切地使活性化合物与液体载体或细碎的固体载体或二者结合并在之后视需要使制品成形来制备制剂。制剂可为以下形式液体剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、酏剂、糖浆剂、片剂、锭剂、颗粒齐U、散剂、胶囊剂、扁囊剂、丸剂、安瓿剂、栓剂、阴道栓剂、软膏剂、凝胶剂、糊剂、乳膏剂、喷雾剂、合剂、泡沫剂、洗剂、油剂、大丸剂、舐剂或气雾剂。胶原肽或三聚体或包括胶原肽或三聚体的药物组合物可通过任何常规给药途径给予受试者，无论全身/外周地或在期望作用位点给药，包括但不限于口服(例如通过摄入)；局部(包括例如透皮、鼻内、眼内、含服、舌下)；经肺(例如通过口或鼻利用如气雾剂的吸入或吹入治疗)；胃肠外，例如通过注射，包括皮下、皮内、肌内、静脉内、动脉内、心内、 鞘内、脊髓内、囊内、囊下、眼眶内、腹腔内、气管内、表皮下、关节内、蛛网膜下和胸骨内；通过植入贮库制剂，例如皮下或肌内；或者通过非吸收性肠缓释。适于口服给药的药物组合物可为片剂、散剂、液体剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂或胶囊剂的形式。片剂可包括固体载体，例如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包括液体载体，例如水、石油、动物油或植物油、矿物油或合成油。可包括生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖溶液或二元醇如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。适合胃肠外给药的制剂包括水和非水等渗、无热原、无菌注射用溶液剂，其可包含抗氧剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、制菌剂以及使制剂与预定接收者血液等渗的溶质；和可包含助悬剂和增稠剂的水和非水无菌混悬剂，以及脂质体或其它设计为将化合物靶向血液组分或者一种或多种器官的微粒系统。适合用于这样的制剂的等渗溶媒的实例包括氯化钠注射液、林格氏液或乳酸盐林格氏液。通常，溶液中活性化合物浓度为约lng/ml至约10 μ g/ ml，例如约lOng/ml至约1 μ g/ml。制剂可存在于单位剂量或多剂量的密封容器中，例如安瓿或小瓶，并可贮存在冷冻干燥(冻干)条件下，在使用前，仅需即时添加无菌液体载体，例如注射用水。上述技术和方案的实例可参见 Remington，s !Pharmaceutical Sciences ( ^ ^ ψ ),% 21 片反，Mack Publishing Company, Easton, Pa. ，2005。应当理解，胶原肽或三聚体的合适剂量可因患者而异。确定最佳剂量通常包括诊断益处水平相对给药的任何风险或有害副作用的平衡。选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于给药途径、给药时间、联合使用的胶原肽、其它药物、化合物和/或材料的排泄速率以及患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和先前医疗史。合成胶原肽或三聚体的量和给药途径最终取决于医师的判断，但通常剂量在不引起实质有害或有毒副作用下在损伤位点达到胶原肽或三聚体的浓度。体内给药可以单剂量连续或间断(例如以适当间隔分开的剂量)地实现。确定最有效的给药方法和剂量的方法对本领域那些技术人员是公知的，且将随治疗用制剂、治疗目的、待治疗靶细胞和待治疗受试者而不同。利用医师选择的剂量水平和方式，可进行单次或多次给药。胶原肽、三聚体或包括胶原肽或三聚体的组合物可以局部方式给药至期望位点， 或可以将其靶向至特定细胞或组织的方式递药。例如，可将其直接给药至包括OSCAR表达细胞的组织。根据本发明公开内容，本发明的各种其它方面和实施方案对本领域技术人员而言将显而易见。该说明书中提及的所有文献和数据库入口通过引用以其整体结合本文中。本文所述氨基酸序列中，0表示羟脯氨酸残基。本文所用“和/或”应理解为，两具体特征或组分中的任一个与或不与另一个一起的具体公开。例如，“A和/或B”应理解为，⑴A、(ii)B以及(iii)A和B中任一个的具体公开，正如每一个均在本文中单独提出。除非上下文另外指明，上述特征的说明和定义不限于本发明任何具体方面或实施方案，并同样适用于所有阐述的方面和实施方案。现在通过实例并参照上述图表阐述本发明的一些方面和实施方案。鐘材料和方法肽合成该研究中所用肽序列示于表1、表2和表3。如所述(Merck等2004)，在Applied Biosystems Pioneer自动合成仪中iTentaGel R RAM树脂上通过Fmoc (N-(9-芴基)甲氧羰基)化学作为C端酰胺合成肽，并纯化。通过质谱确证所有肽，并通过旋光测定法表明呈现三螺旋构象。简而言之，和我们先前研究(Raynal N等J Biol Chem. 2006. 281 (7) :3821-31) 中一样，应用主-客策略(host-guest strategy) (Arase H 等 Science. 2002. 296 (5571) 1323-6)，其中将目标客(一级)序列置于将三螺旋构象赋予整个肽的(GPP)5主序列(惰性侧翼序列)之间。每个工具盒肽包含27个氨基酸的客序列，其C端的9个氨基酸形成下一个肽最前的9个客氨基酸。因此，工具盒的容序列利用每个连续肽沿II型和III型胶原的三螺旋结构域前移了 18个氨基酸，并在相邻肽之间包括9-氨基酸重叠。固相结合测定将10ug/ml的不同胶原、蛋白和肽重悬于0.01M醋酸中，并在Maxisorp 96孔 ELISA板(Nunc)中4°C固定过夜。之后洗去过量蛋白，并在含5% BSA的Tyrodes缓冲液 +0. 05%吐温(Ty-T)中室温(RT)封闭1小时。然后移除封闭，并于RT孵育100 μ 1纯化 Fc-融合蛋白(5 μ g/ml) 1小时。用200 μ 1 Ty-T洗涤Fc-融合蛋白5次，随后利用用Ty-T 以1 10，000比例稀释的100 μ 1山羊抗人HRP缀合物(Sigma)室温检测1小时。将孔再洗涤5次，随后用过氧化物酶底物(peroxidise substrate)+H202 (Pierce)显影。用2M H2S04停止反应，然后通过板读数器于450nm读数。mAb阻断实验将Fc-融合蛋白与 2. 5 μ g/ml 抗-OSCAR mAb 11. 1CN5 (Beckmancoulter)或者 IgGl同种型匹配的对照mAb (Dako) —起预孵育1小时，随后通过ELISA评估胶原结合活性。 将RBL-2H3细胞与2. 5 μ g/ml抗-OSCAR mAb 11. 1CN5或IgGl同种型匹配的对照mAb细胞一起孵育，随后结合5 μ g/ml I型胶原-FITC，再通过流式细胞术进行分析。骨髓基质细胞和颅骨成骨细胞
使骨髓C57/B6小鼠的股骨和胫骨中流出，在补充有10%胎牛血清(FCS)以及 100U/ml青霉素和链霉素的α-MEM中培养贴壁骨髓基质细胞(BMQ。利用标准方法从初生小狗的颅骨中分离颅骨成骨细胞(OB)，并在补充有10%胎牛血清(FCS)、100U/ml青霉素和链霉素、ΙΟΟμ g/ml抗坏血酸、ΙΟΛ 维生素1，25-(OH)2D3和ΙΟ—Μ前列腺素氏(精制)的DMEM 中培养。在胶原酶处理(37°C 30分钟)前后通过流式细胞术评估与⑶45-BM和OB结合的 m0SCAR-Fc 和 h0SCAR-Fc。利用山羊抗人 IgG-PE (Southern biotechnologies)检测 Fc-融合蛋白。0SCAR-CD3 ξ NFAT-GFP 2Β4 报告物细胞2Β4 NFAT-GFP 报告物细胞惠赠自 Lewis Lanier (Arase 等， Science. 2002. 296(5571) :1323-6)。将人 OSCAR 的胞外结构域克隆到 pDISPLAY 中，一种编码N端HA标签和PDGF受体跨膜结构域的构建体(Invitrogen)。然后将N端标记OSCAR 和PDGFR跨膜结构域与pMx puro逆转录病毒载体中编码的人CD3 ξ链的胞质尾区亚克隆到读框中。利用得到的pMx puro 0SCAR-CD3 ξ构建体转染凤凰细胞，并将所得病毒用于感染2Β4 NFAT-GFP报告物细胞，随后利用2. 5 μ g/ml嘌呤霉素选择单克隆。在OSCAR-⑶3 ξ 报告物细胞测定中，用0. OlM醋酸中的不同蛋白和肽于4°C包被组织培养板过夜。在加入 OSCAR-⑶3 ξ报告物细胞之前，用PBS洗涤过量蛋白和肽3次，并在补充有100U/ml青霉素和链霉素以及10% FCS的RPMI-1640中封闭1小时。破骨细胞培养用0. OlM醋酸中的10 μ g/ml不同蛋白和肽于4°C包被48孔或96孔组织培养板过夜。用PBS洗涤过量蛋白和肽3次，随后在完全培养基中封闭。使鼠骨髓从2-3周龄小鼠的胫骨和fibias流出。将骨髓孵育过夜以除去贴壁基质细胞，并将非贴壁部分(不含基质细胞和成骨细胞)移出，在lOOng/ml鼠M-CSF中经3天培养成骨髓巨噬细胞(BMM)， 随后在包被组织培养板中用10ng/ml M-CSF和30ng/ml或100ng/ml鼠RANK-L进行破骨细胞分化。从健康供体或来自TREM2-缺陷型(患者“NH2”)或DAP12-缺陷型(患者 “NH6”)Nasu-Hakola(NH)患者的冷冻PBMC中获得人破骨细胞。首先在IL-4和GM-CSF中将外周血单核细胞培养成单核细胞衍生树突细胞，随后用30ng/ml人M-CSF和lOOng/ml人 RANK-L(Peprotech)使之分化成破骨细胞。用4%低聚甲醛固定巨多核破骨细胞，然后利用 TRAP染色试剂盒(Sigma)进行抗酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)染色。通过RT-PCR检测破骨细胞特异性基因表达从在BSA或OSCAR结合三螺旋胶原肽存在下孵育的鼠破骨细胞培养物中分离总RNA，并利用superscript-III (Invitrogen)反转录成cDNA。将以下引物用于RT-PCR以评估鼠破骨细胞特异性基因的表达；组织蛋白酶-K， 5， -GCAGTATAACAGCAAGGTGG-3，和 5， -TTCATCCTGGCCCACATATG-3，；基质金属蛋白酶-9，5， -TATCTGTATGGTCGTGGCTC-3，和 5， -CAAGTCGAATCTCCAGACAC-3，；降钙素受体，5，-AGGAGGTCCAGAGTGAAAAG-3，和 5，-TCTGGCAGCTAAGGTTCTTG-3，；整联蛋白 α V， 5，-CMCGAAGCCTTAGCAA-GAC-3，和 5，-ATTCCACAGCCCAAAGTGTG-3，；解联蛋白和金属蛋白酶结构域 8，5，-TGAATGCAAGGTGAAGCCAG-3，和 5，-GTAGACGCTGCTTGTTCATC-3，；甘油酸 _3_ 磷酸脱氢酶，5，-AAGGGCTCATGACCACAGTC-3，和 5，-GGCCCCTCCTGTTATTATGG-3，；以及 0SCAR， 5， -ACTGCTGGTAACGGATCAGC-3’ 和 5’ -TCCAAGGAGCCAGAA-CCTTC-3，。
MSOSCAR强结合胶原I型、II型和III型而弱结合胶原IV型为了寻找OSCAR配体，我们首先通过ELISA筛选不同胞外基质蛋白结合人 OSCAR-Fc融合蛋白的能力(图1-6)。人OSCAR-Fc强结合用胶原I型、II型和III型包被的板，弱结合胶原IV型，且根本不结合胶原V型(图1和2)或胞外基质蛋白玻连蛋白或纤连蛋白(图3)。人OSCAR-Fc明显不结合已知胶原受体的三螺旋肽配体例如整联蛋白 α 2 β i ( “GF0GER”和肽衍生物)或GpVI配体、单体胶原相关肽(mCRP)，这表明0SCAR具有不同的和特异的胶原结合模体(图1和2)。与gpVI对比，N-糖基化对人OSCAR-Fc的胶原结合活性没有影响(图20)。OSCAR-Fc与抗人OSCAR mAb 11. 1CN5的预孵育彻底破坏人OSCAR-Fc与胶原I型、II型和III型的结合，而同种型匹配对照抗体无影响(图4)。另外，I型胶原-FITC结合稳定表达人OSCAR的RBL-2H3细胞，但不结合未转染的RBL-2H3 (图 5)。通过人OSCAR表达RBL-2H3细胞与阻遏性抗人OSCAR mAbll. 1CN5 一起的预孵育，I型胶原-FITC结合受到抑制(图幻。胶原酶处理从鼠骨髓基质细胞和用前列腺素-E2和维生素D3活化的鼠颅盖成骨细胞除去假定的OSCAR配体(图6)。为建立人OSCAR的序列特异性结合位点，针对包括完整II型和III型胶原序列的重叠三螺旋肽文库(表1和表2~)筛选人OSCAR-Fc蛋白。OSCAR-Fc特异性结合工具盒II和III的数种肽。最强结合OSCAR-Fc的六种工具肽的比对示于表4，从中推导共有的OSCAR结合模体(表5)。为检测该相互作用的特异性，我们合成肽III-36的衍生物，其包括含与预测OSCAR结合模体一致的氨基酸序列 “GP0GPAGF0GA0”(下划线的)的两个111-36部分。我们还合成了被整理成该假定最小 OSCAR结合模体的肽，并进行通过多聚体的χ和χ’位置的丙氨酸扫描(III-36肽和这些衍生物的序列示于表3)。这些肽用于评估人OSCAR-Fc结合的特异性，并证明了第3 位(P3)羟脯氨酸和P8苯丙氨酸的侧链极其重要的作用(图7)。附加的氨基酸取代使我们得以探索该模体结合人OSCAR-Fc的决定簇(图8)。我们发现，从假定模体截短C端三联体(GAO)不削弱结合，导致将focOGPx' GFO确立为最小OCP序列。引人注意的是，Phe是 OSCAR结合的决定簇，这也发生于整联蛋白、DDR2和SPARC (骨粘连蛋白)，但不发生于GpVI 或LAIR-1。该大的芳香侧链似乎提供附着到其它蛋白的通用手段，但其可取代为Tyr、Asp 或Ser (而非Pro或Glu)而不损失OSCAR结合能力。如果OSCAR通过Arg-Phe或Arg-Tyr 阳离子-η键与胶原相互作用，从而或者OSCAR Arg可通过静电或氢键合与Asp或Ser相互作用，则这可得到解释。用极性氨基酸Lys、Glu或Gln置换N端χ残基削弱结合，在C端三联体中邻近F处插入带电Asp (但非Arg)也如此。示于图8的这些数据与OSCAR上基本上非极性的结合沟一致，如果三螺旋体在其N端含有大的或极性侧链，则它们从上述结合沟排除。 OSCAR肽配体诱导信号转导 将人OSCAR-⑶3 ξ NFAT-GFP报告物细胞系用于评估上文鉴定的OSCAR结合胶原肽 (OCP)是否可转导胞内信号。当将0SCAR-CD3 ξ NFAT-GFP报告物细胞铺板到用胶原I型、 II型、III型和IV型包被的组织培养板和用人OSCAR-Fc识别的大部分OCP包被的板，而非用BSA或(GPP)ltl包被的板上时，GFP得以表达(图9和10)。当在用胶原V型或明显不结合人OSCAR-Fc的三螺旋肽包被的板上培养0SCAR-CD3 ξ NFAT-GFP报告物细胞时，经ELISA观察到弱的GFP表达(图9和10)。还针对胶原II型和胶原III型重叠同源三聚体胶原肽文库筛选 h0SCAR-CD3 ξ NFAT-GFP报告物细胞系(图11和12)。信号转导通常与OSCAR-Fc结合的类似，但对此存在一些例外。结合和活化信号转导之间不精确拟合的原因是未知的。它们可能涉及两个试验之间的阈值或灵敏度差异，例如ELISA中加入0. 05%吐温-20或OSCAR-Fc 的二聚体性质。虽然是可重复的，但差异不是实质性的。这些结果显示OSCAR结合序列特异性胶原模体，且该模体的OSCAR识别可诱导胞内信号转导。结合OSCAR的配体增强破骨细胞发生已知OSCAR和FcR γ对破骨细胞发生具有共刺激效应，检验诱导OSCAR信号转导的OCP是否也会增强破骨细胞发生。与用BSA、(GPP) 10或对照三螺旋肽(GPP) 5_GL0GPSGE0_ (GPP) 5包被的孔相比，在用 OCP、(GPP) 5-GP0GPAGF0GA0- (GPP) 5 和(GPP) 5-GA0GPAGFA- (GPP) 5 包被的孔中与 RANKL —起培养7天之后，OCP增强人外周血单核细胞的体外破骨细胞发生(图13)。当用阻遏mAb 11. 1CN5而非MHC I类的同种型对照mAb处理相同的OC培养物时， 抑制了该增强的破骨细胞发生，表明该作用是对0SCAR/0CP相互作用特异的(图14)。在这些条件下产生的巨TRAP+多核细胞的实例示于图15。板结合的OCP的共刺激作用也促进了野生型小鼠BMM的体外破骨细胞发生(图 16)，但对于来自OSCAR-缺陷(OSCAR-/-) BMM的培养物或来自FcR y -/-BMM (通过它OSCAR 被信号感知的衔接子)的培养物则观察不到(图15)。显著地，OCP挽救了来自鼠DAP12-/-BMM的培养物(图16)而非来自 FcRY-/-DAP12-/_小鼠的BMM的培养物(其在被分析的任何培养条件下均不产生0CP)的体外破骨细胞发生缺陷。与在不存在RANK-L情况下用M-CSF处理3天的BM细胞相比，由 OCP挽救的巨多核DAP12-/-细胞被TRAP染色(图17A)、形成肌动蛋白环(图17B)并通过 RT-PCR检测表达OC特异性基因，例如组织蛋白酶K、降钙素受体、整联蛋白Civ、解联蛋白和金属蛋白酶结构域8(ADAM8)、基质金属蛋白酶9(MMP9)和OSCAR。为确定地显示OCP介导的对DAP12-缺陷细胞的挽救是因OSCAR而不是另一胶原结合受体而特异，我们产生了 0SCAR-/-DAP12-/-小鼠，并在存在或不存在OCP情况下比较相对于0SCAR+/+DAP12-/-同窝出生小鼠的破骨细胞发生率。0SCAR+/+DAP12+/+同窝出生小鼠以与野生型C5BL/6和1 小鼠类似的方式显示出增强的破骨细胞发生。类似于DAP12-/-细胞，0SCAR+/+DAP12-/-前体在OCP存在下产生巨TRAP+多核细胞，而 0SCAR-/-DAP12-/-类似于 FcR y -/-DAP12-/-细胞不产生 0C。为了表示该作用是OSCAR特异的而不是因为未鉴定的胶原结合受体，我们用 OSCAR以及包括的DAP12 (作为阳性对照)和骨架空ρΜχ载体(作为阴性对照)经逆转录病毒转导0SCAR-/-DAP12-/-BMM。正如预期，DAP12的逆转录病毒转导在所有受试条件下修复破骨细胞发生(图18和19)，而利用骨架ρΜχ逆转录病毒载体的对照转导则没有(图19)。 利用小鼠OSCAR的逆转录病毒转导挽救了 OCP包被孔而非OVA或BSA包被孔中的破骨细胞发生(图18和19)，表明DAP12-/-细胞的挽救是因为0SCAR/0CP相互作用。巨TRAP+多核细胞也在(GPP) 10-包被孔中产生，但程度较低。这些结果发生是由于鼠OSCAR的逆转录病毒过表达，因为用小鼠OSCAR经逆转录病毒转导的NFAT-GFP报告物细胞在用(GPP) 10包被的孔中孵育后表达GFP。当逆转录病毒转导小鼠OSCAR的“长”信号肽(SP-L)同种型(图18) 或“短”信号肽同种型(SP-S)时，这也发生，表明该作用是因为逆转录病毒过表达而非表达的鼠OSCAR同种型中存在的差异。应当注意，DAP12-/"(Fig. 16)或0SCAR+/+DAP12-/-细胞(表达内源RANKL-诱导OSCAR)均不在用(GPP) 1(1包被的板中形成巨TRAP+多核细胞，且这仅在OC和2B4 NFAT-GFP报告物细胞中OSCAR的逆转录病毒转导之后表现。结合OSCAR的配体挽救Nasu-Hakola患者的破骨细胞发生我们评估OSCAR OCP是否可挽救来自Nasu-Hakola (NH)患者的外周血单核细胞培养物的体外破骨细胞发生缺陷，上述培养物中补充有TREM2-缺陷(图20R!B)或DAP12-缺陷(图20LHS)NH患者的M-CSF和RANKL0从OCP包被孔而非用BSA或(GPP) 10包被的孔中分离自TREM2-缺陷(NH2)和DAP12-缺陷(NH6)NH患者二者的单核细胞产生了巨TRAP+多核细胞(图21)。我们还评估了可溶性三螺旋OSCAR结合肽是否阻断人OSCAR-Fc结合固定化的三螺旋肽。图M显示可溶性三螺旋肽可阻断OSCAR-Fc结合相同的固定化肽。这表示可溶性三螺旋肽可用于体外或体内阻断OSCAR结合，进而阻断信号转导。通过测定人和鼠OSCAR-⑶3 ξ NFAT-GFP报告物细胞系对以下物质的反应，显示 OSCAR结合模体的三螺旋构象对信号转导是必要的固定化BSA;含最小OSCAR结合序列 “GP0GPAGF0” 的线性肽(GPCGP0GPAGF0GPC-NH2，质量=1，341. 54Da)；以及设计成最小 OSCAR 结合序列 “ (GPP) 5-GP0GPAGF0- (GPP) 5 ” 的三螺旋肽(GPC (GPP) 5-GP0GPAGF0- (GPP) 5G PC-NH2，质量=3，854. 42Da)。这些肽的线性和三螺旋状态通过旋光测量法确认。结果示于图25。人和鼠0SCARCD3 ξ NFAT-GFP报告物细胞系均被发现仅响应最小 OSCAR结合序列的三螺旋构象表达GFP。这证实，如同天然胶原的三螺旋构象，仅含OSCAR 结合模体的三螺旋肽而非线性模体为OSCAR所识别。上述数据证明OSCAR结合特异性胶原特征(signature)以通过DAP12依赖性途径促进破骨细胞发生。不仅对于可在TREM2-缺陷和DAP12-缺陷的骨质疏松病如Nasu-Hakola 疾病中起作用的破骨细胞发生的备选途径，而且对于理解在骨重建小室(BRC)中起作用的促进破骨细胞发生和进而促进骨再吸收的分子信号，OSCAR 胶原途径的阐明具有重要含意。与RANKL—起，OSCAR:胶原轴可递送共刺激的胞外基质信号，该信号将特异性地在由 BRC中由这些配体的表达界定的重建骨表面上促进破骨细胞发生。我们在上文表明OSCAR 可特异地结合胶原II型并诱导信号转导。因此，OSCAR可能是多功能的胶原受体，其可识别不同类型的胶原以感知胞外基质环境的性质，从而促进破骨细胞发生。人OSCAR在造血细胞中广泛表达，其中它可起其它作用。当例如在募集巨噬细胞至动脉粥样硬化损伤中或在其它炎症小室中胶原暴露于循环中时，OSCAR也可有助于改变的白细胞功能。
权利要求
1.用于调节破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞分化和/或活化的胶原肽， 其中所述胶原肽结合破骨细胞相关受体。
2.权利要求1的胶原肽，其包括氨基酸序列GX1OGX2X3GX4)^ 其中0为羟脯氨酸残基，以及X1独立地为A、P或G，优选P或A，更优选A，X2独立地为P、A或V，更优选P或A，X3独立地为A、M、P、0、Q或S，更优选A或S，X4独立地为F、S、D、Y、A或E，优选F、S、D或Y，更优选F，X5独立地为0、A、R或Q，优选0。
3.权利要求2的胶原肽，其中 X2为P且&为F。
4.权利要求3的胶原肽，其中 X5 为 0。
5.权利要求2-4中任一项的胶原肽，其中所述氨基酸序列在N端和/或C端融合一个或多个异源氨基酸。
6.权利要求5的胶原肽，其中所述异源氨基酸包括式(GXaXb)n，其中Xa和)(b独立地为除甘氨酸之外的任何氨基酸，η为1-10。
7.权利要求6的胶原肽，其中所述异源氨基酸包括式(GPO)3或(GPP) 5。
8.前述权利要求中任一项的胶原肽，其中所述胶原肽缀合至偶联配偶体。
9.包括一个或多个权利要求1-8中任一项的胶原肽的肽基三聚体。
10.权利要求9的肽基三聚体，其为同源三聚体。
11.权利要求9的肽基三聚体，其为异源三聚体。
12.权利要求9-11中任一项的肽基三聚体，其中所述三聚体中的肽交联至所述三聚体中的其它肽。
13.权利要求1-8中任一项的胶原肽或权利要求9-12中任一项的三聚体，其固定在固相支持体上。
14.用于治疗方法的前述权利要求中任一项的胶原肽或三聚体。
15.用于治疗以改变的破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞分化和/或活化为特征的病症的方法的权利要求1-13中任一项的胶原肽或三聚体。
16.权利要求15的胶原肽或三聚体，其中所述病症选自骨硬化病、原发骨癌、继发骨癌、骨质疏松、类风湿性关节炎、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、骨性关节炎和其它溶骨疾病。
17.用于治疗个体骨缺陷的方法的权利要求1-13中任一项的胶原肽或三聚体。
18.权利要求1-14中任一项的胶原肽或三聚体在制备用于治疗以改变的破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞分化和/或活化为特征的病症的药物中的应用。
19.权利要求18的应用，其中所述病症选自骨硬化病、原发骨癌、继发骨癌、骨质疏松、 类风湿性关节炎、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、骨性关节炎和其它溶骨疾病。
20.权利要求1-14中任一项的胶原肽或三聚体在制备用于治疗骨缺陷的药物中的应
21.治疗以改变的破骨细胞分化和/或活化为特征的病症的方法，包括将权利要求 1-14中任一项的胶原肽或三聚体给予有需要的个体。
22.权利要求21的方法，其中所述病症选自骨硬化病、原发骨癌、继发骨癌、骨质疏松、 类风湿性关节炎、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、骨性关节炎和其它溶骨疾病。
23.治疗骨缺陷的方法，包括将权利要求1-14中任一项的胶原肽或三聚体给予有需要的个体。
24.筛选破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞分化和/或活化的调节剂的方法，包括 在存在或不存在受试化合物情况下将破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞与权利要求1-14中任一项的胶原肽接触，其中相对于不存在受试化合物，在其存在情况下改变的破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞分化和/或活化表明所述受试化合物是分化和/或活化的调节剂。
25.权利要求1-14中任一项的胶原肽在体外调节破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞分化和/或活化中的应用。
26.体外调节破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞分化和/或活化的方法，包括 用权利要求1-13中任一项的胶原肽处理破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞。
27.权利要求沈的方法，其中合成胶原肽固定在固相支持体上。
28.权利要求27的方法，其中所述固相支持体为培养容器的表面。
29.一种药物组合物，包含权利要求1-13中任一项的合成胶原肽和药学上可接受的赋形剂。
30.权利要求四的药物组合物，其中所述组合物包含另外的活性剂。
31.权利要求30的药物组合物，其中所述另外的活性剂为能够调节破骨细胞相关受体 (OSCAR)表达细胞活化和/或分化的药剂。
32.用于培养破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞的培养容器，其中所述容器包含用权利要求1-13中任一项的合成胶原肽包被的表面。
33.一种试剂盒，包含权利要求32的容器和用于表征破骨细胞相关受体(OSCAR)表达细胞的试剂，其中所述试剂适用于检测抗酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)的存在情况。
全文摘要
本发明涉及这样的发现胶原肽结合破骨细胞相关受体(OSCAR)，并刺激OSCAR表达细胞如破骨细胞和破骨细胞前体细胞活化和/或分化。描述了可用于例如在骨缺陷和以改变的OSCAR表达细胞分化和/或活化为特征的病症的治疗中调节OSCAR表达细胞分化和/或活化的胶原肽。
文档编号C07K14/78GK102282169SQ200980149026
公开日2011年12月14日 申请日期2009年10月6日 优先权日2008年10月6日
发明者A·巴罗, J·特罗斯代尔, R·法恩代尔 申请人:剑桥企业有限公司