Cd20结合分子的制作方法

专利名称：Cd20结合分子的制作方法
技术领域：
本发明涉及CD20结合分子和编码CD20结合分子的核酸序列。具体而言，本发明涉及对人CD20具有高结合亲和力和低解离速率的CD20结合分子。优选地是，本发明的CD20结合分子包含具有完整人构架(例如人种系构架(human germline framework))的轻链可变区和/或重链可变区。
背景技术：
先前已经报导了CD20抗原的抗体作为诸如B细胞淋巴瘤的疾病的诊断剂和/或治疗剂的用途。CD20是B细胞淋巴瘤的有用标记物或靶标，因为该抗原以非常高的密度表达于恶性B细胞表面，即其中不受抑制的增殖能够导致B细胞淋巴瘤的B细胞。
CD20(也称为Bp35)是在早期前-B-细胞发育期间表达的B-淋巴细胞限制性分化抗原并且保持至浆细胞分化。一些人认为CD20分子可以调控B细胞活化过程中的步骤，其中所述B细胞活化过程对于细胞周期起始和分化是需要的。而且，如所注意到的那样，CD20通常以非常高的水平表达于瘤(“肿瘤”)B细胞上。对于用于靶向治疗CD20抗原是令人感兴趣的，因为其不脱落、不受调节或者不会内化。
先前报导的涉及抗-CD20抗体的治疗涉及单独或与第二放射标记的抗-CD20抗体或化学治疗剂联合施用治疗性抗-CD20抗体。食品与药品管理局已经批准了一个此种抗-CD20抗体的治疗用途，RITUXAN用于治疗复发的和先前治疗的低度非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)。然而，虽然RITUXAN的使用已经普遍报道为对于治疗B细胞淋巴瘤有效，但治疗的患者通常面临疾病复发。
最近测试了RITUXAN用于18名患有系统性红斑狼疮(SLE)患者(他们是非免疫抑制患者)的安全性、耐受性和初期临床有效性。在2002年10月的美国风湿病学学会(ACR)第66届科学年会上公布了该研究的部分结果。在18位治疗的患者中，6位患者接受一次输注100mg/m2RITUXAN(低剂量)，6位患者接受一次输注375mg/m2RITUXAN(中等剂量)，并且6位患者接受每周四次输注375mg/m2RITUXAN(高剂量)。接受低或中等剂量的12位患者中的3位(25％)在两个月时产生上升的人抗嵌合体(HACA)滴度，而高剂量患者仍在评价之中。
因此，所需要的是具有高结合亲和力和低解离常数的CD20结合分子，从而使治疗的B细胞淋巴瘤患者不再复发，并且当施用于未被免疫抑制的患者时，不引起HACA反应或具有降低的引起HACA反应潜能的CD20结合分子。
发明概述本发明提供CD20结合分子和编码CD20结合分子的核酸序列。具体而言，本发明提供了对于人CD20具有高结合亲和力和低解离速率的CD20结合分子。优选地是，本发明的CD20结合分子包含具有完整人构架(例如人种系构架)的轻链可变区和/或重链可变区。
在一些实施方案中，本发明提供了包含CD20结合分子的组合物，其中CD20结合分子包含a)轻链可变区或部分轻链可变区，其中轻链可变区(或部分)包含i)选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5的CDRL1氨基酸序列；ii)选自SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ IDNO11和SEQ ID NO13的CDRL2氨基酸序列；iii)选自SEQ ID NO17、SEQ ID NO19和SEQ ID NO21的CDRL3氨基酸序列；和b)重链可变区或部分重链可变区，其中重链可变区(或部分)包含i)选自SEQ IDNO23和SEQ ID NO25的CDRH1氨基酸序列；ii)选自SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ ID NO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ IDNO37和SEQ ID NO39的CDRH2氨基酸序列；和iii)选自SEQ IDNO43、SEQ ID NO45、SEQ ID NO47、SEQ ID NO49、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55和SEQ ID NO57的CDRH3氨基酸序列。
在其它实施方案中，本发明提供了包含轻链可变区(或其部分)或者编码轻链可变区的核酸序列(或其部分)的组合物，其中轻链可变区(或其部分)包含a)选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5的CDRL1氨基酸序列；b)选自SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11和SEQ ID NO13的CDRL2氨基酸序列；和c)选自SEQ ID NO17、SEQID NO19和SEQ ID NO21的CDRL3氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明提供了包含重链可变区(或其部分)或者编码重链可变区的核酸序列(或其部分)的组合物，其中重链可变区(或其部分)包含a)选自SEQ ID NO23和SEQ ID NO25的CDRH1氨基酸序列；b)选自SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ ID NO31、SEQ IDNO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37和SEQ ID NO39的CDRH2氨基酸序列；和c)选自SEQ ID NO43、SEQ ID NO45、SEQ ID NO47、SEQ ID NO49、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55和SEQID NO57的CDRH3氨基酸序列。
在另外的实施方案中，本发明提供了这样的组合物，其包含a)轻链可变区，或者编码轻链可变区的第一核酸序列，其中轻链可变区包含选自SEQ ID NO17、SEQ ID NO19和SEQ ID NO21的CDRL3氨基酸序列；和b)重链可变区，或者编码重链可变区的第二核酸序列，其中重链可变区包含选自SEQ ID NO43、SEQ ID NO45、SEQ ID NO47、SEQ IDNO49、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55和SEQ ID NO57的CDRH3氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了包含编码CD20结合分子的轻链可变区的核酸分子的组合物，其中所述核酸分子包含a)选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4和SEQ ID NO6的CDRL1核酸序列；b)选自SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12和SEQ 1D NO14的CDRL2核酸序列；和c)选自SEQ ID NO18、SEQ ID NO20和SEQ ID NO22的CDRL3核酸序列。在其它实施方案中，本发明提供了包含编码CD20结合分子的重链可变区的核酸分子的组合物，其中所述核酸分子包含a)选自SEQ IDNO24和SEQ ID NO26的CDRH1核酸序列；b)选自SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36、SEQ IDNO38和SEQ ID NO40的CDRH2核酸序列；和c)选自SEQ ID NO44、SEQ ID NO46、SEQ ID NO48、SEQ ID NO50、SEQ ID NO52、SEQ IDNO54、SEQ ID NO56和SEQ ID NO58的CDRH3核酸序列。
在特定的实施方案中，本发明提供了包含CD20结合分子的组合物，其中所述CD20结合分子包含a)含有SEQ ID NO5的CDRL1氨基酸序列；b)含有SEQ ID NO13的CDRL2氨基酸序列；c)含有SEQ ID NO19的CDRL3氨基酸序列；d)含有SEQ ID NO25的CDRH1氨基酸序列；e)含有SEQ ID NO39的CDRH2氨基酸序列；和f)含有SEQ ID NO57的CDRH3氨基酸序列。在其它实施方案中，本发明提供了包含编码CD20结合分子的轻链可变区的核酸分子的组合物，其中所述核酸分子包含a)含有SEQ ID NO6的CDRL1核酸序列；b)含有SEQ ID NO14的CDRL2核酸序列；和c)含有SEQ ID NO20的CDRL3核酸序列。
在进一步的实施方案中，本发明提供了包含编码CD20结合分子重链可变区的核酸分子的组合物，其中所述核酸分子包含a)含有SEQ ID NO26的CDRH1核酸序列；b)含有SEQ ID NO40的CDRH2核酸序列；和c)含有SEQ ID NO58的CDRH3核酸序列。在其它实施方案中，本发明提供了这样的组合物，其包含a)编码轻链可变区的第一核酸序列，其中第一核酸序列包含选自SEQ ID NO18、SEQ ID NO20和SEQ ID NO22的CDRL3核酸序列；和b)编码重链可变区的第二核酸序列，其中第二核酸序列包含选自SEQ ID NO44、SEQ ID NO46、SEQ ID NO48、SEQ IDNO50、SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQ ID NO56和SEQ ID NO58的CDRH3核酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了这样的组合物，其包含a)编码轻链可变区的第一核酸序列，其中轻链可变区包含i)选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5的CDRL1氨基酸序列；ii)选自SEQ IDNO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11和SEQ ID NO13的CDRL2氨基酸序列；和iii)选自SEQ ID NO17、SEQ ID NO19和SEQ ID NO21的CDRL3氨基酸序列；和b)编码重链可变区的第二核酸序列，其中重链可变区包含i)选自SEQ ID NO23和SEQ ID NO25的CDRH1氨基酸序列；ii)选自SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ ID NO31、SEQ IDNO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37和SEQ ID NO39的CDRH2氨基酸序列；和iii)选自SEQ ID NO43、SEQ ID NO45、SEQ ID NO47、SEQ ID NO49、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55和SEQID NO57的CDRH3氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了包含选自SEQ ID NO1、SEQ IDNO3、SEQ ID NO5；SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13；SEQ ID NO17、SEQ ID NO19和SEQ ID NO21的至少2个(或至少3或4个)CDR的肽。在其它实施方案中，本发明提供了包含选自SEQ ID NO23、SEQ ID NO25；SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ ID NO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37、SEQ IDNO39；SEQ ID NO43、SEQ ID NO45、SEQ ID NO47、SEQ ID NO49、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55和SEQ ID NO57的至少2个(或至少3或4个)CDR的肽。
在某些实施方案中，本发明提供了包含轻链可变区和重链可变区的组合物，其中轻链可变区包含选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ IDNO5；SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13；SEQ ID NO17、SEQ ID NO19和SEQ ID NO21的氨基酸序列；并且其中重链可变区包含选自SEQ ID NO23、SEQ ID NO25；SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ ID NO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ IDNO37、SEQ ID NO39；SEQ ID NO43、SEQ ID NO45、SEQ ID NO47、SEQ ID NO49、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55和SEQID NO57的氨基酸序列。
在某些实施方案中，轻链可变区包含部分构架(例如含有2或3个亚区，例如FR2和FR3)。在一些实施方案中，轻链可变区包含完整人构架。在其它实施方案中，轻链可变区包含人种系构架。在特定实施方案中，轻链可变区包含选自SEQ ID NO59和63的氨基酸序列。在某些实施方案中，重链可变区包含部分构架(例如含有2或3个亚区，例如FR2和FR3)。在某些实施方案中，重链可变区包含完整人构架。在其它实施方案中，重链可变区包含人种系构架。在另外的实施方案中，重链可变区包含选自SEQ ID NO61和65的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD20结合分子包含抗体或抗体片段(例如Fv、Fab等等)。在特定实施方案中，CD20结合分子包含AME 33Fv或Fab。在其它实施方案中，CD20结合分子包含AME 5Fv或Fab。在另外的实施方案中，CD20结合分子包含选自AME 21E1 Hum、AME 6F1、AME2C2、AME 1D10、AME 15、AME 18、AME 5-3、AME 1C2和AME 4H5的Fv或Fab。
在特定实施方案中，本发明提供了包含CD20结合分子(例如抗体或抗体片段)和融合配偶体例如酶、可检测标记、碳水化合物分子、脂类等等的融合构建体。在一些实施方案中，融合构建体包含结合人CD20的Fab或Fab′2和将前体药物转化为活性形式的酶。
在某些实施方案中，CD20结合分子包含于宿主细胞(例如真核或原核宿主细胞)。在其它实施方案中，编码轻链和/或重链的核酸序列包含于质粒或其它表达载体中。
在一些实施方案中，本发明提供了包含对人CD20具有5.0×10-10M或更低(例如5.0×10-10M-5.0×10-11M)结合亲和力(Kd)的CD20结合分子的组合物。在其它实施方案中，本发明提供了包含CD20结合分子的组合物，其中CD20结合分子对人CD20具有5.0×10-10M或更低的结合亲和力(Kd)，并且对人CD20具有5.0×10-4s-1或更低的解离速率(koff)。
在另外的实施方案中，CD20结合分子对人CD20具有1.5×10-10M或更低的结合亲和力(Kd)。在一些实施方案中，CD20结合分子对人CD20具有1.0×10-10M或更低的结合亲和力(Kd)。在某些实施方案中，CD20结合分子对人CD20具有2.5×10-4s-1或更低的解离速率(koff)。在特定实施方案中，CD20结合分子对人CD20具有1.0×10-4s-1或更低(例如1.0×10-4s-1-1.0×10-5s-1)的解离速率(koff)。在一些实施方案中，CD20结合分子对人CD20具有8.0×10-5s-1或更低的解离速率(koff)。在其它实施方案中，CD20结合分子对人CD20具有1.0×105M-1s-1或更高(例如1.0×105M-1s-1-1.0×106M-1s-1)的结合速率(kon)。在某些实施方案中，CD20结合分子对人CD20具有5.0×105M-1s-1或更高的结合速率(kon)。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗B细胞淋巴瘤的方法，其包括a)提供i)受试者，和ii)组合物，其中组合物包含本发明的CD20结合分子；和b)将组合物施用于受试者。在其它实施方案中，本发明提供了治疗疾病的方法，其包括a)提供i)具有疾病症状的受试者，和ii)组合物，其中组合物包含本发明的CD20结合分子；和b)将组合物施用于受试者以使得症状减轻或消除。在特定实施方案中，疾病选自复发性霍奇金病、高度抗性的霍奇金病、低度和中度非霍奇金淋巴瘤(NHL)、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)、淋巴浆细胞淋巴瘤(LPL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡淋巴瘤(FL)、弥散性大细胞淋巴瘤(DLCL)、伯基特淋巴瘤(BL)、AIDS-相关淋巴瘤、单核B细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞淋巴腺病；小淋巴细胞、滤泡、弥散性大细胞、弥散性小卵裂细胞、大细胞成免疫细胞淋巴母细胞瘤；小的、非卵裂的伯基特氏和非伯基特氏淋巴瘤；滤泡、主要是大细胞的淋巴瘤；滤泡、主要是小卵裂细胞的淋巴瘤；以及滤泡、混合的小卵裂和大细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，本发明提供了在需要此种治疗的动物中治疗疾病(例如癌症)的方法，该方法包括将有效剂量的本发明CD20结合分子施用于动物。在某些实施方案中，本发明提供了用作药物的本发明CD20结合分子。在其它实施方案中，本发明提供了用于制备治疗疾病(例如NHL)的药物的本发明CD20结合分子。在特定实施方案中，本发明提供了用于治疗疾病(例如癌症)的药物，该药物具有包含作为活性物质的本发明CD20结合分子的特征。
在优选的实施方案中，受试者(患者)是非免疫抑制的。例如，患者患有疾病如系统性红斑狼疮(SLE)。优选地为，一旦对非免疫抑制的受试者施用CD20结合分子，不产生(或可忽略的)HACA反应(人抗嵌合抗体反应)。在某些实施方案中，施用于受试者的剂量为大约每周375mg/m2，施用4周(不产生HACA反应)。在一些实施方案中，施用剂量为大约每周50-300mg/m2，或者大约每周100-200mg/m2，施用4周(例如用于治疗慢性淋巴细胞性白血病(CLL))。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗B细胞淋巴瘤的方法，其包括a)提供i)受试者，和ii)组合物，其中组合物包含对人CD20具有5.0×10-10M或更低结合亲和力(Kd)，并且对人CD20具有5.0×10-4s-1或更低的解离速率(koff)的CD20结合分子；和b)将组合物施用于受试者。
在某些实施方案中，本发明提供了在需要此类治疗的受试者体内排除外周B细胞的方法，其包括a)提供i)受试者，和ii)组合物，其中组合物包含对人CD20具有5.0×10-10M或更低结合亲和力(Kd)，并且对人CD20具有5.0×10-4s-1或更低的解离速率(koff)的CD20结合分子；和b)将组合物施用于受试者。
在一些实施方案中，轻链可变区包含完整人构架。在其它实施方案中，轻链可变区包含人种系构架。在特定实施方案中，轻链可变区包含选自SEQ ID NO59和63的氨基酸序列。在某些实施方案中，重链可变区包含完整人构架。在其它实施方案中，重链可变区包含人种系构架。在另外的实施方案中，重链可变区包含选自SEQ ID NO61和65的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD20结合分子包含抗体或抗体片段(例如Fv、Fab等等)。在特定实施方案中，CD20结合分子包含AME 33Fv或Fab。在其它实施方案中，CD20结合分子包含AME 5Fv或Fab。在另外的实施方案中，CD20结合分子包含选自AME 21E1 Hum、AME 6F1、AME2C2、AME 1D10、AME 15、AME 18、AME 5-3、AME 1C2、AME 4H5的Fv或Fab。
在其它实施方案中，CD20结合分子以大约与C2B8相同的EC50水平介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在另外的实施方案中，CD20结合分子以大约与C2B8抗体相同的EC50水平介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)，其中以人外周血单核细胞作为效应细胞并以B淋巴瘤细胞作为靶细胞。在一些实施方案中，CD20结合分子以大约C2B8抗体的1.5-2.0倍的EC50水平介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)(C2B8抗体保藏于ATCC，编号69119)。在另外的实施方案中，CD20结合分子以大约C2B8抗体的1.5-2.0倍的EC50水平介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)，其中以人外周血单核细胞作为效应细胞并以B淋巴瘤细胞作为靶细胞。在另外的实施方案中，CD20结合分子以大约C2B8抗体的10倍或更高的EC50水平介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在另外的实施方案中，CD20结合分子以大约C2B8抗体的10倍或更高的EC50水平介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)，其中以人外周血单核细胞作为效应细胞并以B淋巴瘤细胞作为靶细胞。
在一些实施方案中，CD20结合分子包含人种系轻链构架。在某些实施方案中，该轻链人种系构架选自V1-11、V1-13、V1-16、V1-17、V1-18、V1-19、V1-2、V1-20、V1-22、V1-3、V1-4、V1-5、V1-7、V1-9、V2-1、V2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19、V2-6、V2-7、V2-8、V3-2、V3-3、V3-4、V4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6、V5-1、V5-2、V5-4和V5-6。
在其它实施方案中，CD20结合分子包含人种系重链构架。在特定实施方案中，该重链人种系构架选自VH1-18、VH1-2、VH1-24、VH1-3、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH1-8、VH2-26、VH2-5、VH2-70、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-7、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH3-9、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-4、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1和VH7-81。
在一些实施方案中，CD20结合分子是CD20结合肽或多肽。在某些实施方案中，CD20结合肽包含抗CD20抗体或抗CD20抗体片段(例如Fv、Fab、F(ab′)2等等)。在其它实施方案中，肽包含轻链可变区和/或重链可变区。在特定实施方案中，轻链可变区和/或重链可变区包含构架区或至少部分构架区(例如含有2或3个亚区，如FR2和FR3)。在某些实施方案中，至少FRL1、FRL2、FRL3或FRL4完全是人的。在其它实施方案中，至少FRH1、FRH2、FRH3或FRH4完全是人的。在一些实施方案中，至少FRL1、FRL2、FRL3或FRL4为种系序列(例如人种系)。在其它实施方案中，至少FRH1、FRH2、FRH3或FRH4为种系序列(例如人种系)。在优选的实施方案中，构架区是完整人构架区(例如显示于图4-5和8-9中的人构架区)。在一些实施方案中，构架区包含SEQ ID NO71、72、73、74、79、80、81、82，或其组合。在其它实施方案中，构架区包含SEQ ID NO87、88、89、90、95、96、97、98，或其组合。
在一些实施方案中，本发明提供了编码选自SEQ ID NO1-70的代表性核酸或氨基酸序列或其互补序列的计算机可读介质。在某些实施方案中，这些序列的代表性序列，当递送至计算机处理器时，可以呈现给用户(例如通过因特网)。
在某些实施方案中，本发明提供了与SEQ ID NO1-70中的核酸序列或编码SEQ ID NO1-70中的氨基酸序列的核酸序列杂交(在低度、中度或高度严格条件下)的核酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了文中所描述的核酸序列的互补序列(见例如表1-2，和图2、3、6、7、10和11)。在一些实施方案中，本发明提供了在高度、中度或低度严格条件下与文中所描述的核酸序列相杂交的序列(见例如表1-2，和图2、3、6、7、10和11)。
在某些实施方案中，使用KinExa平衡软件(例如来自SapidyneInstruments，Boise，Idaho)，通过IgG细胞结合测定法(即在其表面上表达人CD20的细胞)确定了亲和力常数(Kd)和结合速率常数(Kon)。在一些实施方案中，通过动力学排除测定法确定了亲和力常数和结合速率常数(见，例如Chiu等，(2001)Anal.Chem.，735477-5484；Blake等，(1996)Journal of Biological Chemistry，27127677-27685；Hongo等，(2000)Hybridoma，19303-315；Khosraviani等，(2000)Bioconjugate Chemistry，11267-277；和Powers等，(2001)Journal of Immunological Methods，251123-135，全部文献此处引用作为参考)。在特定实施方案中，使用KinExA仪器(例如来自Sapidyne Instruments，Boise，Idaho的KinExATM3000)或类似装置进行了动力学排除测定。
在其它实施方案中，CD20结合分子包含Fab，并且还包含一个或多个恒定区(例如CH2和/或CH3，见

图10-11)。在特定实施方案中，CD20结合分子包含抗体(例如包含完整人构架的具有合成CDR序列的抗体)。在某些实施方案中，抗体包含改变的(例如突变的)Fc区。例如，在一些实施方案中，Fc区已经改变为降低或增强抗体的效应子作用。在一些实施方案中，Fc区为选自IgM、IgA、IgG、IgE的同种型或其它同种型。
在一些实施方案中，将氨基酸修饰导入CD20结合分子Fc区的CH2结构域。为了产生具有改变Fc γ受体(FcγR)结合亲和力或活性的变体IgGFc区，对于修饰有用的氨基酸位置包括任意一个或多个以下氨基酸位置CD20结合分子Fc区的268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300、301、303、305、307、309、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438或439位。在优选的实施方案中，用作模板产生此类变体的亲本Fc区包含人IgG Fc区。在一些实施方案中，为了产生对FcγR结合降低的Fc区变体，可以在任意一个或多个以下氨基酸位置处导入氨基酸修饰CD20结合分子Fc区的252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、298、300、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439。在特定实施方案中，还制备了对一种或多种FcγR具有提高的结合力的Fc区变体。此类Fc区变体可以在任意一个或多个以下氨基酸位置处包含氨基酸修饰CD20结合分子Fc区的280、283、285、286、290、294、295、298、300、301、305、307、309、312、315、331、333、334、337、340、360、378、398或430位。在某些实施方案中，氨基酸修饰是Y300I。
在其它实施方案中，氨基酸修饰是Y300L。在一些实施方案中，氨基酸修饰是Q295K或Q295L。在某些实施方案中，氨基酸修饰是E294N。在其它实施方案中，在296位的氨基酸修饰是Y296P。在一些实施方案中，在298位的氨基酸修饰是S298P，在其它实施方案中，氨基酸修饰是S298N、S298P、S298V或S298D。
在某些实施方案中，CD20结合分子包含重链恒定区突变。在其它实施方案中，CD20结合分子包含具有选自D280H和K290S的突变的重链恒定区。
作为选择或者另外地，将上述氨基酸修饰与其它改变CD20结合分子Fc区C1q结合和/或补体依赖的细胞毒性功能的一个或多个氨基酸修饰相组合是有用的。特别令人感兴趣的起始多肽可以是结合C1q并呈现补体依赖的细胞毒性(CDC)的多肽。文中所描述的氨基酸替换可以用于改变起始多肽结合至C1q的能力和/或改变其补体依赖的细胞毒性功能(例如降低并优选地去除这些效应作用)。然而，文中涉及到在一个或多个所描述的位置包含替换的具有提高的C1q结合和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)功能的多肽。例如，起始多肽可能不能结合C1q和/或介导CDC并且按照文中的教导可以对其进行修饰从而使其获得这些进一步的效应功能。而且，可以对具有预先存在的C1q结合活性，任选地进一步具有介导CDC能力的多肽进行修饰，从而增强这两种活性之一或两者。改变C1q和/或改变其补体依赖的细胞毒性功能的氨基酸修饰描述于如WO0042072中，此处引用作为参考。
如上所述，例如通过修饰C1q结合和/或FcγR结合并由此改变CDC活性和/或ADCC活性，能够设计具有改变的效应子功能的CD20结合分子Fc区。例如人们能够产生具有提高的C1q结合和提高的FcγRIII结合(例如具有提高的ADCC活性和提高的CDC活性)的CD20结合分子的变体Fc区。备选地，当希望效应子功能降低或去除时，可以工程改造成降低CDC活性和/或降低ADCC活性的变体Fc区。在其它实施方案中，可以只提高这些活性之一，并且任选地还可以降低另一活性(例如产生提高ADCC活性但降低CDC活性的Fc区变体，并且反之亦然)。
还可以将Fc突变引入到本发明的CD20结合分子中以改变它们与新生Fc受体(FcRn)的相互作用并且提高它们的药物代谢动力学特性。几个试验表明抗体Fc区和FcRn的相互作用在免疫球蛋白于血清中的存留时间上起着作用。例如，在缺乏功能性FcRn的小鼠中对于IgG分子观察到非常短的血清半衰期。促进与FcRn结合的Fc突变表现出延长血清半衰期并且，相反地，导致更加紧密地与IgG结合的大鼠FcRn中的突变也提高了血清半衰期。还已经描述了对FcRn具有提高的结合的人Fc变体的集合(Shields等，(2001)High resolution mapping of the binding site on human IgGI forFcγRI，FcγRII，FcγRIII，and FcRn and design of IgG1 variants withimproved bindingto the FcγR，J.Biol.Chem.2766591-6604)。已经报道了在低pH(例如来自血清的IgG分子的胞饮或流动相内吞期间)观察到增加的IgG分子对FcRn的结合亲和力影响血清半衰期(Ghetie等，(1997)Increasing the serum persistence of an IgG fragment by randommutagenesis，Nat.Biotechnol.15637-640；Medesan等，(1998)Comparativestudies of rat IgG to further delineate the FcFcRn interaction site.Eur.J.Immunol.282092-2100；Kim等，(1999)Mapping the site on human IgGfor binding of the MHC class I-related receptor，FcRn，Eur.J.Immunol.292819-2825；Acqua等，(2002)Increasing the affinity of a human IgGIfor the neonatal Fc receptorbiological consequences，J.Immunol.1695171-5180)。然而，在高pH增加结合的突变表现出相反地影响血清半衰期(Acqua等，(2002)Increasing the affinity of a human IgG1 for theneonatal Fc receptorbiological consequences，J.Immunol.1695171-5180)。上面所有的文章在本文中引用作为参考。因此，可以在本发明的CD20结合分子中引入Fc突变以提高它们在低pH时对FcRn的亲和力但维持或降低它们在高pH时对FcRn的亲和力。
另一类型的氨基酸替代为用于改变CD20结合分子Fc区的糖基化模式。这可以通过例如删除一个或多个多肽的糖基化位点和/或加入一个或多个在多肽中不存在的糖基化位点来实现。Fc区的糖基化一般是N-连接的或者O-连接的。N-连接是指将糖部分连接到天冬酰胺残基的侧链上。肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X为除脯氨酸外的任意氨基酸)是将糖部分通过酶连接到天冬酰胺侧链上的识别序列。因此，在多肽中存在这些肽序列中的任何一个则产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指将糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或者木糖之一连接至羟基氨基酸上，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
将糖基化位点添加到CD20结合分子Fc区可以通过改变氨基酸序列以至于其包含一个或多个上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)而方便地实现。例证性的糖基化变体是重链中残基Asn 297的氨基酸替代。还可以通过对原始多肽序列添加或替代为一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(对于O-连接的糖基化位点)来实现改变。
在某些实施方案中，本发明的CD20结合分子在表达β(1，4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnT III)的细胞中表达，以至于GnT III将GIcNAc添加至CD20结合分子。以此种方式产生结合分子的方法描述于WO9954342，WO03011878，专利公开20030003097A1，和Umana等，NatureBiotechnology，17176-180，1999年2月；它们全部在文中全文详细引用作为参考。
在某些实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包含a)本发明的CD20结合分子；和b)使用CD20结合分子治疗受试者疾病的说明书或者采用CD20结合分子用于科学研究或诊断目的(例如用于进行ELISA测定法等)的说明书。在一些实施方案中，本发明提供了稳定或瞬时转染编码本发明CD20结合分子的核酸序列的细胞系。
附图简述图1显示了已标记出可变区和各部分的IgG分子的图示。还标记出两个可变区轻链之一和两个可变区重链之一的CDR和构架区(FR)。
图2A显示AME 33轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO59)，并且图2B显示AME 33轻链可变区的核酸序列(SEQ ID NO60)。
图3A显示AME 33重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO61)，并且图3B显示AME 33重链可变区的核酸序列(SEQ ID NO62)。
图4A显示具有散在CDR(interspersed CDR)的完整人轻链构架区VkII(A27)(DPK22)的氨基酸序列。四个构架亚区标记如下FRL1(SEQID NO71)、FRL2(SEQ ID NO72)、FRL3(SEQ ID NO73)和FRL4(SEQ ID NO74)。图4B显示具有散在CDR的人轻链构架区VkIII(A27)(DPK22)的核酸序列。四个构架亚区标记如下FRL1(SEQ ID NO75)、FRL2(SEQ ID NO76)、FRL3(SEQ ID NO77)和FRL4(SEQ ID NO78)。
图5A显示具有散在CDR的人重链构架区VH5-51(DP-73)的氨基酸序列。四个构架亚区标记如下FRH1(SEQ ED NO79)、FRH2(SEQ IDNO80)、FRH3(SEQ ID NO81)和FRH4(SEQ ID NO82)。图5B显示具有散在CDR的人重链构架区VH5-51(DP-73)的核酸序列。四个构架亚区标记如下FRH1(SEQ ID NO83)、FRH2(SEQ ID NO84)、FRH3(SEQID NO85)和FRH4(SEQ ID NO86)。
图6A显示AME 5轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO63)，并且图6B显示AME 5轻链可变区的核酸序列(SEQ ID NO64)。
图7A显示AME 5重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO65)，并且图7B显示AME 5重链可变区的核酸序列(SEQ ID NO66)。
图8A显示具有散在CDR的人轻链构架区VkI(DPK4)(A20)的氨基酸序列。四个构架亚区标记如下FRL1(SEQ ID NO87)、FRL2(SEQ IDNO88)、FRL3(SEQ ID NO89)和FRL4(SEQ ID NO90)。图8B显示具有散在CDR的人轻链构架区VkI(DPK4)(A20)的核酸序列。四个构架亚区标记如下FRL1(SEQ ID NO91)、FRL2(SEQ ID NO92)、FRL3(SEQID NO93)和FRL4(SEQ ID NO94)。
图9A显示具有散在CDR的人重链构架区VHI DP7/21-2的氨基酸序列。四个构架亚区标记如下FRH1(SEQ ID NO95)、FRH2(SEQ IDNO96)、FRH3(SEQ ID NO97)和FRH4(SEQ ID NO98)。图9B显示具有散在CDR的人重链构架区VHI DPI7/21-2的核酸序列。四个构架亚区标记如下FRH1(SEQ ID NO99)、FRH2(SEQ ID NO100)、FRH3(SEQID NO101)和FRH4(SEQ ID NO102)。
图10A显示AME 33轻链的完整氨基酸序列(SEQ ID NO67)，并且图10B显示AME 33轻链的完整核酸序列(SEQ ID NO68)。
图11A显示AME 33重链的完整氨基酸序列(SEQ ID NO69)，并且图11B显示AME 33重链的完整核酸序列(SEQ ID NO70)。
图12和13显示描述于实施例2中的ELISA结合测定的结果。
图14显示描述于实施例3中的活B淋巴瘤Fab结合测定的结果。
图15显示描述于实施例5中的ADCC测定的结果。
图16显示描述于实施例6中的糖工程化CD20结合分子的ADCC活性。
图17显示描述于实施例9中的涉及AME 33抗体和C2B8抗体的体内肿瘤抑制测定的结果。
定义为了易于理解本发明，下面定义了大量术语。
如文中所使用的术语“抗体”意思是指包含四条多肽链的免疫球蛋白分子，两条重(H)链和两条轻(L)链通过二硫键相互连接。每条重链包含重链可变区(文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3(见图1)。每条轻链包含轻链可变区(文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL(见图1)。VH区和VL区能够进一步细分为超变区(称为互补性决定区(CDRs))、其间分散有较保守的区域(称为构架区(FR))。每个可变区(VH或VL)包含3个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3(见图1、4和5)。每个可变区也包含4个构架亚区，命名为FR1、FR2、FR3和FR4(见图1、4和5)。
如文中所使用，术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分。抗体片段的例子包括但不限于线性抗体、单链抗体分子、Fv、Fab和F(ab′)2片段、以及由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段优选地保留至少部分重链和/或轻链可变区。
如文中所使用，术语“互补决定区”和“CDR”是指主要负责抗原结合的区域。在轻链可变区中有三个CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)，并且在重链可变区有三个CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)。组成这六个CDR的残基已经由Kabat和Chothia表征如下轻链可变区中的残基24-34(CDRL1)、50-56(CDRL2)和89-97(CDRL3)以及重链可变区中的31-35(CDRH1)、50-65(CDRH2)和95-102(CDRH3)；Kabat等，(1991)Sequencesof Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.，此处引用作为参考；以及轻链可变区中的残基26-32(CDRL1)、50-52(CDRL2)和91-96(CDRL3)以及重链可变区中的26-32(CDRH1)、53-55(CDRH2)和96-101(CDRH3)；Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196901-917，此处引用作为参考。除非另外说明，如文中所使用，术语“互补决定区”和“CDR”包括包含Kabat和Chothia定义的残基(即轻链可变区中的残基24-34(CDRL1)、50-56(CDRL2)和89-97(CDRL3)；以及26-35(CDRH1)、50-65(CDRH2)和95-102(CDRH3))。并且，除非声明，如文中所使用，依照Kabat所述进行CDR残基的计数。
如文中所使用，术语“构架”是指非文中所定义CDR残基的可变区残基。有四个组成构架的单独构架亚区FR1、FR2、FR3和FR4(见图1、4和6)。为了表明构架亚区是否在轻或重链可变区中，“L”或“H”可以加入到亚区缩写中(例如，“FRL1”表示轻链可变区的构架亚区1)。除非声明，依照Kabat所述进行构架残基的计数。值得注意，在某些实施方案中，本发明的CD20结合分子可以具有不完整的构架(例如CD20结合分子可以具有仅含四个亚区的一个或多个的构架部分)。
如文中所使用，术语“完整人构架”意思是指具有在人中天然发现的氨基酸序列的构架。完整人构架的例子包括但不限于KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(见，例如Kabat等，(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，US Department of Health and HumanServices，NIH，USA；和Wu等，(1970)J.Exp.Med.132，211-250，两篇文献此处引用作为参考)。
如文中所使用，术语“受试者”和“患者”是指任意动物，例如哺乳动物如狗、猫、鸟、家畜，并且优选地是人。
如文中所使用，术语“密码子”或“三联体”是指一组三个相邻的核苷酸单体，其定义多肽中天然存在的一个氨基酸。该术语还包括不指定任意氨基酸的密码子。值得注意，由于遗传密码的简并性，存在编码相同氨基酸的多个密码子。照这样，能够改变本发明核酸序列的许多碱基(见例如表1和2)而不改变其所编码的实际氨基酸序列。本发明旨在包括全部此类核酸序列。
如文中所使用，术语“具有编码多肽的核苷酸序列的寡核苷酸”、“具有编码多肽的核苷酸序列的多核苷酸”和“编码肽的核酸序列”意思是指包含特定多肽编码区的核酸序列。编码区可以以cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，寡核苷酸或多核苷酸可以是单链的(即有意链)或双链的。适当的控制元件如增强子/启动子、剪接点、多腺苷酸化信号等等如果需要可以放置于基因编码区的近端，以允许适当的转录起始和/或初级RNA转录本的正确加工。备选地，用于本发明表达载体中的编码区可以包含内源性增强子/启动子、剪接点、插入序列、多腺苷酸化信号等等，或者内源性和外源性控制元件的组合。
并且，如文中所使用，在术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”之间没有大小的限制或者大小的区别。两个术语仅指由核苷酸组成的分子。同样，术语“肽”和“多肽”之间没有大小的区别。两个术语仅指由氨基酸残基组成的分子。
如文中所使用，术语“互补的”或“互补性”用于指通过碱基配对规则相关联的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，序列“5′-A-G-T 3”与序列“3-T-C-A-5”是互补的。互补性可以是“部分的”，其中仅一些核酸的碱基按照碱基配对规则相匹配，或者，核酸之间可以是“完全”或“全体”互补。核酸链之间互补性的程度对杂交效率和强度具有显著的影响。
如文中所使用，术语给定序列的“互补序列”用于指在其整个长度上与给定序列完全互补的序列。例如，序列5′-A-G-T-A-3′是序列3′-T-C-A-T-5′的互补序列。本发明还提供了文中所述序列的互补序列(例如，SEQ ID NO1-70中的核酸序列的互补序列)。
如文中所使用，术语“杂交”用于指互补性核酸的配对。通过一些因素，如核酸之间的互补性程度、所涉及条件的严格性、所形成的杂交体的Tm和核酸内的GC比例，影响杂交和杂交强度(即核酸之间关联的强度)。
如文中所使用，术语“严格性”用于指温度、离子强度和其它化合物如有机溶剂的存在的条件，在这些条件下进行核酸杂交。本领域的技术人员将认识到，通过单独或协调地改变刚才所描述的参数可以改变“严格性”条件。在“高度严格性”条件下，核酸碱基配对将仅发生于具有高频率互补碱基序列的核酸片段之间(例如，在“高度严格性”条件下杂交仅发生于具有大约85-100％同一性优选地为大约70-100％同一性的同源物(homolog)之间)。在中度严格性条件下，核酸碱基配对将发生于具有中等频率互补碱基序列的核酸之间(例如，在“中度严格性”条件下杂交仅发生于具有大约50-70％同一性的同源物之间)。因此，“弱”或“低”严格性条件通常是来自遗传上不同的有机体的核酸所需要的，因为其互补序列的频率通常是较低的。
当谈及核酸杂交时，“高度严格性条件”包括相当于当使用长度为大约500个核苷酸的探针时，在包含5X SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，pH用NaOH调整至7.4)、0.5％SDS、5X Denhardt’s试剂[50X Denhardt’s，每500ml包含5g Ficoll(Type 400，Pharmacia)，5gBSA(Fraction V；Sigma)]和100μg/ml变性鲑精DNA的溶液中在42℃结合或杂交，随后在包含0.1X SSPE、1.0％SDS的溶液中在42℃洗涤的条件。
当谈及核酸杂交时，“中度严格性条件”包括相当于当使用长度为大约500个核苷酸的探针时，在包含5X SSPE、0.5％SDS、5X Denhardt’s试剂和100μg/ml变性鲑精DNA的溶液中在42℃结合或杂交，随后在包含1.0X SSPE、1.0％SDS的溶液中在42℃洗涤的条件。
“低度严格性条件”包括相当于当使用长度为大约500个核苷酸的探针时，在包含5X SSPE、0.1％SDS、5X Denhardt’s试剂和100g/ml变性鲑精DNA的溶液中在42℃结合或杂交，随后在包含5X SSPE、0.1％SDS的溶液中在42℃洗涤的条件。
术语“分离的”当用于指核酸时，如在“分离的寡核苷酸”或“分离的多核苷酸”或“分离的编码CD20结合分子的核酸序列”(见，例如表1-2)中，指从至少一种通常与其相关的污染核酸(例如宿主细胞蛋白质)中经鉴定和分离得到的核酸序列。
如文中所使用，当谈及核苷酸序列时术语“部分”(如在“部分给定核苷酸序列”中)时是指该序列的片段。片段大小可以在从10个核苷酸到全长核苷酸序列减去一个核苷酸的范围内(例如，10个核苷酸、20、30、40、50、100、200等等)。
如文中所使用，当谈及氨基酸序列时术语“部分”(如在“部分给定氨基酸序列”中)时是指该序列的片段。片段大小可以在从6个氨基酸到全部氨基酸序列减去一个氨基酸的范围内(例如，6个氨基酸、10、20、30、40、75、200等等)。
如文中所使用，术语“纯化的”或“纯化”是指从样品中去除污染物。例如，通过去除污染非免疫球蛋白蛋白质可以纯化CD20特异抗体；通过去除不结合至相同抗原上的免疫球蛋白也可以纯化这些CD20特异抗体。去除非免疫球蛋白蛋白质和/或去除不结合至特定抗原上的免疫球蛋白导致样品中抗原特异性免疫球蛋白的百分比增加。在另一个例子中，重组的抗原特异性多肽表达于细菌宿主细胞中并通过去除宿主细胞蛋白质纯化多肽；从而增加样品中重组的抗原特异性多肽的百分比。
如文中所使用，术语“载体”用于指将DNA片段从一个细胞转移入另一个细胞的核酸分子。术语“运载工具”有时与“载体”可互换地使用。
如文中所使用术语“表达载体”指包含目的编码序列和适当核酸序列的重组DNA分子，其中所述适当核酸序列对于有效连接的编码序列在特定宿主有机体中的表达是必需的。对于在原核细胞中表达所必需的核酸序列通常包括常常随同其它序列一起的启动子、操纵子(任选的)和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子以及终止和多聚腺苷酸化信号。
如文中所使用，术语“宿主细胞”指任意真核或原核细胞(例如细菌细胞如大肠杆菌(E.coli)、酵母细胞、哺乳动物细胞如PER.C6TM(Crucell，The Netherlands)和CHO细胞、禽类细胞、两栖类细胞、植物细胞、鱼类细胞和昆虫细胞)，无论其位于体外或者体内。例如，宿主细胞可以位于转基因动物中。
如文中所使用，术语“计算机存储器”和“计算机存储装置”指通过计算机处理器可读的任意存储媒介。计算机存储器的例子包括但不限于RAM、ROM、计算机芯片、数字录像盘(DVDs)、光盘(CDs)、硬盘驱动器(HDD)和磁带。
如文中所使用，术语“计算机可读介质”指为计算机处理器储存或提供信息(例如数据和指令)的任意装置或系统。计算机可读介质的例子包括但不限于DVD、CD、硬盘驱动器、磁带和在互联网上传输的介质。
如文中所使用，短语核酸或氨基酸序列的“计算机可读介质编码表示法”是指在上面已储存有信息的计算机可读介质，当递送至处理器时，允许将核酸或氨基酸序列展示于用户(例如打印出来或呈现于显示屏上)。
如文中所使用，术语“处理器”和“中央处理装置”或“CPU”可互换使用并且指能够从计算机存储器(例如ROM或其它计算机存储器)读取程序并按照程序执行一套步骤的装置。
如文中所使用，术语“Fc区”是指免疫球蛋白重链的C-末端区域(如图1)。“Fc区”可以是天然序列的Fc区或变体Fc区(例如具有增加的或降低的效应子功能)。
如文中所使用，Fc区可以拥有负责活化或降低生物学活性(例如在受试者体内)的“效应子功能”。效应子功能的例子包括但不限于C1q结合；补体依赖的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体下调(例如B细胞受体；BCR)等等。此类效应子功能需要Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)相结合并且能够使用多种测定法(例如Fc结合测定法、ADCC测定法、CDC测定法等等)进行评价。
如文中所使用，“分离的”肽、多肽或蛋白质是已经从其天然环境成分中鉴定并分离和/或回收的肽、多肽或蛋白质。其天然环境的污染成分是将干扰多肽的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素、以及其它蛋白质或非蛋白质溶质。在某些实施方案中，分离的多肽是纯化的(1)通过Lowry法测定占多肽重量的95％以上，并且优选地为，占多肽重量的99％以上，(2)通过使用旋杯式测序仪足以获得至少15个N-末端残基或内部氨基酸序列，或者(3)通过SDS-page在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或银染证明是均一的。由于多肽天然环境的至少一种成份不存在，所以分离的多肽包括重组细胞内原位的多肽。然而，通常，分离的多肽将通过至少一步纯化步骤制备。
如文中所使用，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或预防措施。需要治疗的对象包括已经具有病症的群体以及用于预防病症的群体。
短语“在使得症状减轻的条件下”是指用CD20结合分子可治疗的任意疾病的可检测症状的任意程度的定性或定量降低，包括但不限于对疾病恢复率的可检测影响(例如体重增加率)或者至少一种通常与特定疾病相关的症状的减轻。
术语“人CD20”(文中简写为hCD20)，如文中所使用，意思是指人B淋巴细胞限制性分化抗原(也已知为Bp35)。CD20在早期前B细胞发育期间表达并保留至浆细胞分化。CD20分子可以调节细胞周期起始和分化所需的活化过程中的步骤，并且通常以非常高的水平表达于瘤形成B细胞上。CD20存在于“正常”B细胞和“恶性”B细胞(即那些持续增殖能够导致B细胞淋巴瘤的B细胞)上。
术语“亲和力”、“结合亲和力”和“Kd”指与每种CD20结合分子-CD20蛋白质复合体相关的平衡解离常数(表示为浓度单位)。结合亲和力直接相关于解离速率常数(通常报道为时间倒数的单位，例如秒-1)与结合速率常数(通常报道为每单位时间浓度的单位，例如摩尔/秒)的比率。通过例如ELISA测定、动力学排除测定或表面胞质共振可以测定结合亲和力。应该注意到某些表位能够在细胞表面反复存在(多价体)，并且与具有单价体形式相应配体反应的相同抗体的解离常数相比，抗体与重复表位结合的解离常数(koff)大大降低。由于当一个抗体-配体键解离时，其它键将二价体(多价体)抗体束缚于多价体配体，允许解离键再次形成，因此出现降低的解离常数。二价体(或多价体)Ab和多价体配体之间反应的解离常数相对于其内在亲和力而言称为功能性亲和力，对于抗体代表性的各个位点，其内在亲和力是结合常数。
如文中所使用，术语“解离”、“解离速率”和“koff”意思是指CD20-结合分子从抗体/抗原复合体解离的解离速率常数。
如文中所使用，术语“结合”、“结合速率”和“kon”意思是指CD20结合分子与抗原结合形成抗体/抗原复合体的结合速率常数。
如文中所使用，术语“有效浓度”和“EC50”意思是指能够与足够量CD20分子相互作用而对大约50％处理细胞产生影响的CD20结合分子的浓度。
发明详述本发明提供了CD20结合分子和编码CD20结合分子的核酸序列。具体而言，本发明提供了对人CD20具有高结合亲和力和低解离速率的CD20结合分子。优选地，本发明的CD20结合分子包含具有完整人构架(例如人种系构架)的轻链可变区和/或重链可变区。本发明的详述可分为以下几部分以便于理解I.CD20结合分子；II.产生CD20结合分子；III.治疗性制剂和用途；和IV.CD20结合分子的其它用途。
I.CD20结合分子本发明提供了具有预期特性的CD20结合分子。具体而言，在一些实施方案中，CD20结合分子对人CD20具有高结合亲和力(Kd)。在某些实施方案中，CD20结合分子对人CD20具有低解离速率(koff)。在优选的实施方案中，本发明的CD20α结合分子具有高结合亲和力、低解离速率并且在低浓度时是有效的。虽然不是必须实践或理解本发明，但认为本发明的CD20结合分子具有高结合亲和力和低解离速率，特别适合于人类中的治疗用途并且比其它抗CD20分子如RITUXAN(C2B8)较少可能引发HACA反应。
在其它实施方案中，本发明的CD20结合分子结合人CD20。在另外的实施方案中，本发明的CD20结合分子结合来自短尾猴(Cynomolgusmacaques)的B细胞表面上的CD20。
在优选的实施方案中，本发明的CD20结合分子包含轻链可变区和/或重链可变区，优选地具有完整人构架。在特别优选的实施方案中，本发明的CD20结合分子包含轻链可变区和/或重链可变区，优选地具有人种系构架。虽然不是必须实践或理解本发明，但认为本发明的CD20结合分子(见，例如以下实施例)当施用于人类时(例如用于治疗疾病)将引发非常弱的或者无免疫原性反应，因为构架区完全是人类的。
如下面表1和2中所描述，本发明提供了大量用于产生CD20结合分子的CDR。例如，所示的一个或多个CDR能够与构架亚区(例如完整人FR1、FR2、FR3或FR4)相组合以产生CD20结合肽或编码CD20结合肽的核酸序列。并且，例如，显示于下表中的CDR可以进行组合从而使三个CDR存在于轻链可变区和/或三个CDR存在于重链可变区。
下面显示的CDR可以插入人构架(例如通过重组技术)，插入到显示于图4-5和8-9的轻链和重链构架中以产生CD20结合分子或编码CD20结合分子的核酸序列。例如，显示于图4A(或8A)中的CDRL1可以由显示于表1中的SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19或21替换。同样，显示于图4B(或8B)中的CDRL1可以由显示于表1中的SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14，16，18，20或22替换。相同的操作可以用于表1-2中所显示的所有CDR。表1和2现在显示如下。
表1-轻链CDR
*Kabat的工作用于编号残基。CDR包括Kabat和Chothia残基。
表2-重链CDR
*Kabat的工作用于编号残基。CDR包括Kabat和Chothia残基。
本发明还提供了基本上与上面表中所显示的CDR序列相同的序列(氨基酸和核酸)。例如，表中所显示序列中的一个或两个氨基酸可以改变。并且例如，表中所显示序列中的许多核苷酸碱基可以改变。通过改变编码氨基酸序列的核酸序列可以产生氨基酸序列的变化。通过本领域已知的方法利用本说明书对特定序列的指导可以制备编码给定CDR的变体的核酸序列。这些方法包括但不限于通过定点(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变和早期制备的编码CDR的核酸的盒式诱变制备。对于制备替换变体而言，定点诱变是优选的方法。该技术在本领域中是众所周知的(见，例如Carter等，(1985)Nucleics Res.134431-4443和Kunkel等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-492，两篇文献此处引用作为参考)。
简而言之，在进行DNA定点诱变时，通过首先将编码预期突变的寡核苷酸与起始DNA单链杂交而改变起始DNA。杂交后，使用杂交的寡核苷酸作为引物并使用单链起始DNA作为模板，将DNA聚合酶用于合成完整第二链。因此，编码预期突变的寡核苷酸整合入所得到的双链DNA。
PCR诱变也适合于制备起始CDR的氨基酸序列变体(见，例如，Vallette等，(1989)Nucleics Res.17723-733，此处引用作为参考)。简而言之，当小量模板DNA用作PCR中的起始材料时，与模板DNA中相应区域序列略有不同的引物能够用于产生相对大量的特异DNA片段，该特异DNA片段仅在引物不同于模板的位置不同于模板序列。
制备变体的另一种方法即盒式诱变是基于Wells等，(1985)Gene 34315-323，此处引用作为参考，所描述的技术。起始材料是包含欲突变的起始CDR DNA的质粒(或其它载体)。鉴定欲突变的起始DNA中的密码子。在所鉴定突变位点每一侧应存在唯一的限制性内切酶位点。如果不存在此类限制性位点，使用上述寡核苷酸介导的诱变方法以将限制性位点导入起始多肽DNA中的适当位点可以产生这些限制性位点。在这些位点处将质粒DNA切割使其线性化。使用标准方法合成了编码位于限制性位点之间且含预期突变的DNA序列的双链寡核苷酸，其中分别合成了寡核苷酸的两条链并且然后使用标准技术杂交在一起。该双链寡核苷酸称为盒。该盒设计为具有与线性化质粒的末端相匹配的5′和3′末端，从而使其能够直接连接至质粒。现在该质粒包含突变的DNA序列。
备选地，或者另外地，能够确定编码多肽变体的预期氨基酸序列，并且能够合成产生编码此种氨基酸序列变体的核酸序列。还可以制备CDR氨基酸序列中的保守修饰。基于常见的侧链特征将天然存在的残基分为几类
(1)疏水的正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水的cys、ser、thr；(3)酸性的asp、glu；(4)碱性的asn、gln、his、lys、arg；(5)影响链取向的残基gly、pro；和(6)芳香族的trp、tyr、phe。
保守替换将使得必须将这些类之一的一个氨基酸互换为相同类的另一个氨基酸。本发明还提供了表1和2中所显示核酸序列的互补序列，以及在低、中和高度严格性条件下与这些核酸序列杂交的核酸序列。
本发明的CDR可以应用为具有任意类型的构架。优选地，CDR使用完整人构架或构架亚区。在特别优选的实施方案中，构架是人种系序列。完整人构架的例子显示于图4-5和8-9。还可以应用其它完整人构架或构架亚区。例如，NCBI网站包含目前已知的人构架区的序列。人VH序列的例子包括但不限于VH1-18，VH1-2，VH1-24，VH1-3，VH1-45，VH1-46，VH1-58，VH1-69，VH1-8，VH2-26，VH2-5，VH2-70，VH3-11，VH3-13，VH3-15，VH3-16，VH3-20，VH3-21，VH3-23，VH3-30，VH3-33，VH3-35，VH3-38，VH3-43，VH3-48，VH3-49，VH3-53，VH3-64，VH3-66，VH3-7，VH3-72，VH3-73，VH3-74，VH3-9，VH4-28，VH4-31，VH4-34，VH4-39，VH4-4，VH4-59，VH4-61，VH5-51，VH6-1和VH7-81，这些例子提供于Matsuda等，(1998)J.Exp.Med.1881973-1975，该文献包括人免疫球蛋白链可变区基因座的完整核苷酸序列，此处引用作为参考。人VK序列的例子包括但不限于A1，A10，A11，A14，A17，A18，A19，A2，A20，A23，A26，A27，A3，A30，A5，A7，B2，B3，L1，L10，L11，L12，L14，L15，L16，L18，L19，L2，L20，L22，L23，L24，L25，L4/18a，L5，L6，L8，L9，O1，O11，O12，O14，O18，O2，O4和O8，这些例子提供于Kawasaki等，(2001)Eu r.J.Immunol.311017-1028；Schable和Zachau，(1993)Biol.Chem.Hoppe Seyler3741001-1022；和Brensing-Kuppers等，(1997)Gene 191173-181，全部此处引用作为参考。人VL序列的例子包括但不限于V1-11，V1-13，V1-16，V1-17，V1-18，V1-19，V1-2，V1-20，V1-22，V1-3，V1-4，V1-5，V1-7，V1-9，V2-1，V2-11，V2-13，V2-14，V2-15，V2-17，V2-19，V2-6，V2-7，V2-8，V3-2，V3-3，V3-4，V4-1，V4-2，V4-3，V4-4，V4-6，V5-1，V5-2，V5-4和V5-6，这些例子提供于Kawasaki等，(1997)Genome Res.7250-261，此处引用作为参考。完整人构架能够选自任意这些功能性种系基因。一般而言，由于有限数量的氨基酸改变，这些构架彼此不同。这些构架可用于文中描述的CDR。可以用于本发明CDR的人构架的其它例子包括但不限于KOL，NEWM，REI，EU，TUR，TEI，LAY和POM(见，例如Kabat等，(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，US Department of Health and HumanServices，NIH，USA；和Wu等，(1970)，J.Exp.Med.132211-250，两篇文献此处引用作为参考)。
此外，虽然不必需实践或理解本发明，认为使用种系序列预期有助于在大多数个体中去除不利免疫反应的原因如下。作为在正常免疫反应过程中发生的亲和力成熟步骤的结果，在免疫球蛋白可变区内经常发生体细胞突变。尽管这些突变主要聚集于高变的CDR周围，它们也影响构架区内的残基。这些构架突变不存在于种系基因并且在患者中较小可能成为免疫原性的。相反，一般种群已经暴露于绝大多数表达于种系基因的构架序列并且，作为免疫耐受的结果，预期这些种系构架在患者体内是较低或非免疫原性的。为了最大化耐受的可能性，编码可变区的基因可以选自通常存在的、功能性种系基因的集合体，并且编码VH和VL区的基因能够进一步选择以匹配免疫球蛋白分子特异重链和轻链之间已知的联合。
II.产生CD20结合分子在优选的实施方案中，本发明的CD20结合分子包含抗体或抗体片段(例如包含文中所述的一个或多个CDR)。例如，通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链和重链基因能够制备本发明的抗体或抗体片段。例如，为了重组表达抗体，可以用一个或多个携带编码抗体免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞，从而使轻链和重链在宿主细胞中表达，并且优选地分泌入培养宿主细胞的培养基中，从该培养基中能够回收抗体。标准的重组DNA方法可以用于获得抗体重链和轻链基因、将这些基因整合入重组表达载体并将载体导入宿主细胞，例如描述于Sambrook，Fritsch和Maniatis(编著)，Molecular Cloning；A LaboratoryManual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，Ausubel，F.M.等(编著)Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssociates，(1989)和Boss等的美国专利号4,816,397中的方法，全部文献此处引用作为参考。
为了表达具有一个或多个本发明CDR的抗体，首先获得编码轻链可变区和重链可变区的DNA片段。使用聚合酶链反应(PCR)通过扩增并修饰种系轻链和重链可变序列能够获得这些DNA。人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列在本领域中是已知的(见上)。
一旦获得了种系VH和VL片段，可以将这些序列进行突变以编码一个或多个文中所公开的CDR氨基酸序列(见，例如表1-2)。可以将由种系VH和VL DNA序列所编码的氨基酸序列与CDR序列进行比较以鉴定与种系序列不同的氨基酸残基。然后突变种系DNA序列的适当核苷酸，从而使突变的种系序列编码所选择的CDR(例如选自表1-2的6个CDR)，使用遗传密码确定应改变哪个核苷酸。通过标准方法如PCR介导的诱变(其中将突变核苷酸整合入PCR引物从而使PCR产物包含突变)或定点诱变，可以进行种系序列的诱变。在其它实施方案中，可变区是从头合成的(例如使用核酸合成仪)。
一旦获得了编码预期VH和VL片段的DNA片段(例如如上所述通过种系VH和VL基因的扩增和诱变，或者人工合成)，通过标准重组DNA技术能够进一步对这些DNA片段进行操作，例如将可变区基因转换成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段有效连接至编码另一条多肽如抗体恒定区或可弯曲接头的另一个DNA片段上。通过将编码VH的DNA有效连接至另一个编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3，见例如图10-11)的DNA分子上，能够将分离的编码VH区的DNA转换成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(见例如Kabat，E.A.，等，(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department ofHealth and Human Services，NIH Publication No.91-3242)并且通过标准PCR扩增能够获得包括这些区域的DNA片段。例如，重链恒定区可以是IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，IgE，IgM或IgD恒定区，但最优选地是IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，VH-编码DNA能够有效连接至另一个仅编码重链CH1恒定区的DNA分子上。在优选的实施方案中，重链恒定区相似或相同于图11中所显示的恒定区。
通过将编码VL的DNA有效连接至另一个编码轻链恒定区CL的DNA分子上能够将分离的编码VL区的DNA转换成全长轻链基因(和Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(见例如Kabat，E.A.，等，(1991)Sequences of Proteins of immunological Interest，FifthEdition，U.S.Department of Health and Human Services.NIH PublicationNo.91-3242)并且通过标准PCR扩增能够获得包括这些区域的DNA片段。该轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但最优选地是κ恒定区。在优选的实施方案中，轻链恒定区相似或相同于图10中所显示的恒定区。
为了产生scFv基因，可以将编码VH和VL的DNA片段有效连接至另一个编码可弯曲接头(flexible linker)如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的片段上，从而使VH和VL序列能够作为连续的单链蛋白表达，其中所述单链蛋白通过可弯曲接头连接有VL和VH区(见例如Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883；和McCafferty等，(1990)Nature348552-554)，全部文献此处引用作为参考)。
为了表达本发明的抗体或抗体片段，可将编码部分或全长轻链和重链的DNA(例如如上述所获得的)插入表达载体，从而使基因有效连接至转录和翻译控制序列。在该上下文中，术语“有效连接”意思是指将抗体基因连接入载体，从而使载体内的转录和翻译控制序列行使其预期的调节抗体基因转录和翻译的功能。通常选择与所使用的表达细胞相容的表达载体和表达调控序列。可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入各自的载体或者，更一般地是，将两个基因插入到相同的表达载体。通过标准方法可以将抗体基因插入表达载体(例如通过将抗体基因片段和载体上互补的限制性位点相连接，或者如果不存在限制性位点则平端连接)。插入轻或重链序列之前，表达载体可以已经携带抗体恒定区序列。例如，将VH和VL序列转换成全长抗体基因的一种方法是将它们分别插入已经编码重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，从而使VH片段有效连接至载体内的CH片段而VL片段有效连接至载体内的CL片段。另外或备选地，重组表达载体可编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可将抗体链基因克隆入载体从而使信号肽框内(in-frame)连接至抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。
除了抗体链基因，本发明的重组表达载体可以携带控制宿主细胞中抗体链基因表达的调控序列。术语“调控序列”包括控制抗体链基因转录或翻译的启动子、增强子和其它表达控制元件(例如多聚腺苷酸化信号)。例如，此类调控序列描述于Goeddel；Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)，此处引用作为参考。本领域的技术人员了解表达载体的设计，其包括调控序列的选择取决于于这样的因素如对进行转染的宿主细胞的选择、预期蛋白质表达水平等等。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选的调控序列包括指导哺乳动物中蛋白质高水平表达的病毒元件，例如来源于巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒。病毒调控元件的进一步详细描述及其序列见例如Stinski的美国专利号5,168,062、Bell等的美国专利号4,510,245和Schaffner等的美国专利号4,968,615，此处全部引用作为参考。
除了抗体链基因和调控序列，本发明的重组表达载体还可以携带另外的序列，如在宿主细胞中调控载体复制的序列(例如复制起始序列)和可选择标记基因。可选择标记基因有助于筛选其中已导入载体的宿主细胞(见例如美国专利号4,399,216，4,634.665和5,179,017，全部由Axel等申请)。例如，可选择标记基因一般赋予其中已经导入载体的宿主细胞对药物如G418、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性。优选的可选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于用氨甲蝶呤筛选/扩增dhfr-宿主细胞)和新霉素基因(用于G418筛选)。
为了表达轻链和重链，可以通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染入宿主细胞。术语“转染”的多种形式包括通常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。
在某些实施方案中，用于表达本发明CD20结合分子的表达载体是病毒载体，例如逆转录病毒载体。此类病毒载体可以用于产生稳定转染的细胞系(例如用于CD20结合分子的持续来源)。在一些实施方案中，应用GPEX基因产物表达技术(来自Gala Design，Inc.，Middleton，WI)产生CD20结合分子(和表达CD20结合分子的稳定细胞系)。在特定实施方案中，应用了描述于Bleck等人的WO0202783和WO0202738(两篇专利此处全文引用作为参考)中的表达技术。
用于表达本发明重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括PER.C6TM细胞(Crucell，The Netherlands)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216-4220，使用DHFR筛选标记，例如描述于R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159601-621)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。在其它优选的实施方案中，如描述于WO9954342和美国专利公开20030003097(两者此处引用作为参考)，宿主细胞表达GnT III，从而使所表达的CD20结合分子具有增加的ADCC活性。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞后，通常通过将宿主细胞培养一段时间足以允许在宿主细胞中表达抗体，更加优选地，将抗体分泌入宿主细胞生长的培养基中来产生抗体。可使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
宿主细胞也能够用于产生完整抗体的部分，如Fab片段或scFv分子。应该理解对上述方法的变更处于本发明范围之内。例如，可以期望用编码本发明抗体轻链或重链的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术还可以用于去除一些或全部编码对于结合至hCD20非必需的轻连和重链之一或两者的DNA。本发明的抗体也包括从此类截短的DNA分子表达的分子。此外，可以产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本发明的抗体而另一条重链和轻链是对非hCD20的抗原特异的(例如通过标准化学交联方法将本发明抗体交联至第二抗体)。
在重组表达抗体或其片段的一个优选的系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体导入dhfr-CHO细胞。在重组表达载体中，抗体重链和轻链基因各自有效连接至增强子/启动子调控元件(例如来自SV40、CMV、腺病毒等等，如CMV增强子/AdMLP启动子调控元件或SV40增强子/AdMLP启动子调控元件)以驱动基因高水平转录。重组表达载体还可以携带DHFR基因，该基因允许使用氨甲蝶呤筛选/扩增来筛选已经用载体转染的CHO细胞。培养所筛选到的经转化宿主细胞以允许表达抗体重链和轻链，并从培养基中回收完整抗体。使用标准分子生物学技术制备重组表达载体、转染宿主细胞、筛选转化体、培养宿主细胞和从培养基中回收抗体。
在特定实施方案中，本发明的抗体和抗体片段产生自转基因动物。例如，转基因绵羊和奶牛可以进行工程化以在其奶中产生抗体或抗体片段(见例如Pollock DP等，(1999)Transgenic milk as a method for the productionof recombinant antibodies.J.Immunol.Methods 231147-157，此处引用作为参考)。本发明的抗体和抗体片段还可以在植物中产生(见，例如Larrick等，(2001)Production of secretory IgA antibodies in plants.Biomol.Eng.1887-94，此处引用作为参考)。另外的方法和纯化步骤提供于Humphreys等，(2001)Therapeutic antibody production technologiesmoleculesapplications，expression and purification，Curr.Opin.Drug Discov.Devel.4172-185，此处引用作为参考。在某些实施方案中，由转基因小鸡产生本发明的抗体抗体片段(见，例如美国专利公开号20020108132和20020028488，两者此处引用作为参考)。
III.治疗制剂和用途本发明的CD20结合分子(例如抗体和抗体片段)用于治疗患有疾病的受试者。CD20结合分子还可以用于诊断操作(例如使用标记的CD20结合分子用于组织影像)。在优选的实施方案中，将CD20结合分子施用于患有B细胞淋巴瘤的患者，该病通常具有持续B细胞增殖的特征。
在一些实施方案中，将CD20结合分子结合至多种放射性标记物以用于诊断和治疗目的。放射性标记物允许肿瘤和其它组织“成像”，并且有助于直接辐照治疗肿瘤。作为例子的放射性标记物包括但不限于131I、125I、123I、99Tc、67Ga、111In、188Re、186Re，并且优选地为90Y。
在某些实施方案中，所治疗的疾病是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在一些实施方案中，疾病选自复发的霍奇金病、高度抗性霍奇金病、低度和中度非霍奇金淋巴瘤(NHL)、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)、淋巴浆细胞淋巴瘤(LPL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡淋巴瘤(FL)、弥散性大细胞淋巴瘤(DLCL)、伯基特氏淋巴瘤(BL)、AIDS相关的淋巴瘤、单核B细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞淋巴腺病；小淋巴细胞、滤泡、弥散性大细胞、弥散性小卵裂细胞、大细胞成免疫细胞淋巴母细胞瘤；小的、非卵裂的伯基特氏和非伯基特氏淋巴瘤；滤泡、主要是大细胞的淋巴瘤；滤泡、主要是小卵裂细胞的淋巴瘤；和滤泡、小卵裂和大细胞淋巴瘤；以及系统性红斑狼疮(SLE)。在特定实施方案中，所治疗的疾病是瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)或慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
在一些实施方案中，本发明的CD20结合分子用于治疗这样的疾病，其中去除CD20+细胞在治疗上是有利的，例如瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、浆细胞不调症、慢性淋巴细胞性白血病、移植治疗、毛状细胞性白血病、ITP、干细胞移植和肾移植后EB病毒淋巴瘤，见美国专利公开20020128448，此处引用作为参考。在其它实施方案中，本发明的CD20结合分子用于选自B细胞淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、自身免疫疾病、移植、移植物抗宿主疾病、涉及B细胞的感染性疾病、淋巴组织增生疾病在内的疾病的治疗，并用于其中B细胞活性和/或体液免疫的抑制是期望被抑制的任意疾病或症状的治疗。在某些实施方案中，本发明的CD20结合分子用于治疗选自B细胞淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、移植、移植物抗宿主疾病、自身免疫疾病、淋巴组织增生疾病的疾病、以及其中对体液免疫、B细胞功能和/或增殖的抑制是治疗有益的其它疾病和症状。在另外的实施方案中，本发明的CD20结合分子用于治疗B-ALL、毛状细胞白血病、多发性骨髓瘤、Richter综合征、获得性因子VIII抑制症、抗磷脂综合征、自身免疫溶血性贫血、自身免疫血小板减少症、大疱性类天疱疮、冷血凝素疾病、Evan’s综合征、肺出血肾炎综合症、特发性膜性肾病、特发性血小板减少性紫癜、IgM相关多发性神经病、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)相关多中心Castleman’s疾病(MCD)、重症肌无力、寻常天疱疮、原发性胆汁性肝硬变、单纯红细胞再生障碍、类风湿性关节炎、Sjogren’s综合征、系统性免疫复合物脉管炎、系统性红斑狼疮、II型混合性冷球蛋白血症、Wegener’s肉芽肿病、异体移植物排异反应、移植后淋巴组织增生疾病或用于骨髓移植的干细胞清除。
在优选的实施方案中，所治疗的受试者不为免疫抑制的(例如SLE患者)。不限于任何机制，认为本发明的CD20结合分子比先前已知的抗CD20抗体更小可能引起HACA反应，尤其是在非免疫抑制性患者中。照这样，能够治疗非免疫抑制性患者，而无需过多考虑有害的HACA反应。并且，由于本发明CD20结合分子结合能力得到提高，可以将较低剂量施用于患者(进一步避免引起HACA反应的危险)，或者可以以较高剂量进行施用，而不引起有生命危险的HACA反应。在其它优选的实施方案中，受试者患有类风湿性关节炎或其它自身免疫疾病(见，例如Edwards等，Rheumatology(Oxford)2001 Feb；40(2)205-11，此处引用作为参考)。
本发明的CD20结合分子还可以与其它治疗性分子组合施用。例如，CD20结合分子可以作为化学疗法方案的一部分进行施用(例如CHOP)。CD20结合分子还可以与细胞因子、G-CSF或IL-2一起施用(见，美国专利6,455,043，此处引用作为参考)。
本发明CD20结合分子可以通过任意适当的方式施用，包括胃肠外、非胃肠外、皮下、局部、腹膜内、肺内、鼻内和损伤内(intralesional)施用(例如施用于局部免疫抑制治疗)。肠胃外输液包括但不限于肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。另外，CD20结合分子适于通过脉冲输注施用，特别是以逐渐降低的剂量。优选地，通过注射，最优选地通过静脉内或皮下注射给药的剂量部分取决于施用是暂时的还是长期的。
给药方案可以调整至提供最佳预期反应(例如治疗性或预防性反应)。例如，可以施用单次大丸剂，可以随着时间以几个分份剂量进行施用或者根据治疗情况的紧急状况按比例降低或增加剂量。有利的是制剂成单位剂量胃肠外组合物以易于施用和剂量均一化。本发明CD20结合分子的剂量通常取决于(a)活性化合物的独特特性和待获得的特定治疗或预防效果，和(b)本领域使用此种活性化合物对于治疗个体敏感性的固有局限性。
对于治疗性或预防性有效量抗体或抗体片段(或本发明的其它CD20结合分子)的作为例证的、非限制性范围是0.1-20mg/kg，更加优选地为1-10mg/kg。在一些实施方案中，剂量从50-600mg/m2(例如375mg/m2)。值得注意的是剂量值可以随待缓解的疾病的类型和严重性而改变。另外应该理解对于任意特定受试者，根据个体需要和个人施用或监督组合物施用的职业判断，将随着时间调整特定给药方案，并且此处提出的剂量范围仅作为例证并无意限制本发明。
当然，所施用的剂量根据已知因素而改变，例如特定试剂的药效学特性、其给药模式和途径、受者的年龄、健康状况以及体重、症状的性质和程度、同时进行的治疗的类型、治疗的频率和预期效果。例如活性成分的每日剂量可以是大约每公斤体重0.01-100毫克。通常为每天每公斤体重1.0-5毫克，并且优选地为每天每公斤体重1-10毫克，每天1-6次分份剂量给药或者以持续释放形式给药，可以有效获得预期结果。
可将本发明的CD20结合分子掺入适于施用于受试者的药物组合物中。例如，药物组合物可以包含CD20结合分子(例如抗体或抗体片段)和可药用载体。如文中所使用，“可药用载体”包括生理学上相容的溶剂、分散剂、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等等。可药用载体的例子包括以下一种或多种水、盐水、磷酸盐缓冲生理盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等等，以及其组合物。在许多情况下，可药用载体优选地包括等渗剂(例如糖)、诸如组合物中的甘露醇、山梨醇在内的多元醇或氯化钠。可药用载体可以进一步包含最小量诸如湿化剂或乳化剂的辅助物质、防腐剂或缓冲剂，它们可增强CD20结合分子的贮藏期或功效。
本发明的组合物可以是多种形式的。例如，它们包括液体、半固体和固体剂量形式，例如液体溶液(例如可注射和可输注溶液)、分散液或悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选的形式取决于施用和治疗性应用的预期模式。一般的优选组合物是可注射或可输注溶液形式的，例如与那些使用其它抗体被动免疫人的组合物类似的组合物。
治疗性组合物一般是无菌的，并且在制造和贮存条件下是稳定的。组合物可以制剂成溶液、微乳剂、分散剂、脂质体或其它适于高药物浓度的有序结构。通过将适当溶剂中所需量的活性化合物(即抗体或抗体片段)与一种上面列出的成份或上面列出的成份的组合相混合，能够制备无菌注射溶液，如果需要，随后进行无菌过滤。通常，通过将活性化合物混合入包含基本分散介质和其它来自上面列出的成份的无菌载体，能够制备分散剂。关于用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，以产生活性成分加任意添加的来自其预先无菌过滤溶液的预期成分的粉末。例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣、通过在分散情况下保持预期颗粒大小和通过使用表面活性剂，能够维持溶液的适当流动性。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，能够引起注射组合物的延长吸收。
在某些实施方案中，可以将活性化合物与防止化合物快速释放的载体例如可控释放制剂(包括埋植剂、透皮贴剂和微囊递药系统)一起制备。可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。许多用于制备此类制剂的方法是具有专利的或者通常是本领域技术人员所已知的(见，例如Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson编著，MarcelDekker，Inc.，New York，1978)。
在某些实施方案中，本发明的CD20结合分子可以口服施用，例如与惰性稀释剂或可同化食用载体一起。化合物(和其它成分，如果期望的话)也可以包封于硬的或软的明胶胶囊内、压制成片剂或者直接掺入受试者饮食中。对于口服治疗施用，可以将化合物与赋形剂混合并以可吸收片剂、含片剂、含片、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等等形式使用。对于通过除了胃肠外施用以外的其它方式施用本发明化合物，用阻止化合物失活的物质包被化合物或者将其与化合物共施用可能是必需的。
本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明抗体或抗体片段。“治疗有效量”指对于达到目的治疗结果在剂量上和所需时间期间是有效的量。抗体或抗体片段的治疗有效量可以随诸如疾病状态、年龄、性别和个体体重，以及抗体或抗体片段在个体中引起预期反应的能力而不同。治疗有效量也是其中治疗有利效应比抗体或抗体片段的任意毒性或有害效应更重要的量。“预防有效量”指对于达到目的预防结果在剂量上和所需时间期间是有效的量。一般地，由于预防剂量是在疾病早期或之前用于受试者，预防有效量将小于治疗有效量。
IV.CD20结合分子的其它用途本发明的CD20结合分子，例如抗CD20肽和/或抗体在检测或定量样品或含有CD20的B细胞中CD20的免疫测定中是有用的。CD20的免疫测定一般包括在存在能够选择性结合CD20的本发明可检测标记的高亲和力抗CD20肽和/或抗体时孵育生物样品，以及检测样品中结合的标记肽或抗体。多种临床测定方法在本领域中是众所周知的。
因此，可将一种抗CD20肽或抗体捕获于硝酸纤维素上或者任意其它能够固定可溶蛋白质的固体支持物上。然后将含CD20的样品加到支持物上，随后用适当的缓冲液洗涤支持物以去除未结合蛋白质。将第二种可检测标记的CD20特异肽或抗体加到固相支持物上，然后可以第二次用缓冲液洗涤固相支持物以去除未结合的可检测标记的肽或抗体。然后通过已知的方法能够测定固体支持物上所结合的标记物的量。
“固相支持物”或“载体”意思是指任意能够结合肽、抗原或抗体的支持物。众所周知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和变性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁石。对于本发明的目的，载体的性质可以是某种程度上可溶的或者是不溶的。支持物材料实际上可以具有任意可能的结构构型，只要偶联的分子仍保留其结合CD20的能力。因此，支持物的构型可以是球形的如珠或者圆筒状的如在试管的内侧面或者柱子的外表面。备选地，表面可以是平坦的，例如片层、培养皿、试验条、微量滴定板等等。优选的支持物包括聚苯乙烯珠子。本领域技术人员知道一些其它合适的用于结合抗体、肽或抗原的载体，或者能够通过常规试验确定载体。可使用已知的方法用于确定给定批次的抗CD20肽和/或抗体的结合活性。本领域技术人员通过常规试验能够确定有效且最适的测定条件。
通过偶联至用于酶免疫测定(EIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)的酶，能够获得可检测标记的CD20结合分子，如CD20特异性肽和/或抗体。所连接的酶与所暴露的底物反应产生能够检测的化学分子，例如通过分光光度计测量、荧光计测量或者通过视觉方法检测。能够用于本发明CD20结合分子可检测标记的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、磷酸甘油醛异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
通过放射性标记CD20结合分子，有可能通过使用放射性免疫测定(RIA)检测CD20(见，例如，Work等(1978)Laboratory Techniques andBiochemistry in Molecular Biology，North Holland Publishing Company，N.Y.)。通过诸如γ计数器或闪烁计数器或者通过放射自显影方法能够检测放射性同位素。
使用荧光化合物标记CD20结合分子也是可能的。当荧光标记的分子暴露于适当波长的光时，可根据荧光检测其存在。最常使用的荧光标记化合物是异硫氰酸荧光素、若丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、异藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。
利用发射荧光的金属如125Eu或者镧系的其它金属元素也能够可检测标记CD20结合分子。使用诸如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的金属螯合基能够将这些金属连接于CD20结合分子。
通过偶联于化学发光化合物也能够可检测地标记CD20结合分子。然后通过检测在化学反应过程中产生的荧光的存在确定化学发光标记分子的存在。特别有用的化学发光标记化合物的例子是氨基苯二酰肼、异氨基苯二酰肼、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶盐和乙二酸酯。
同样，生物发光化合物能够用于标记本发明的CD20结合分子。生物发光是生物系统中发现的一类化学发光，其中催化蛋白质增加化学发光反应的效率。通过检测荧光的存在确定生物发光蛋白质的存在。用于标记目的的重要生物发光化合物是萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白。
例如如果可检测标记物是放射性γ发射体通过闪烁计数器能够进行CD20结合分子的检测，或者例如如果标记物是荧光物质通过荧光计能够进行CD20结合分子的检测。在为酶标记物的情况时，通过应用酶底物的比色方法能够进行检测。通过将底物的酶反应程度与同样制备的标准品进行视觉比较也能够进行检测。
在本发明的一些实施方案中，通过上述测定法检测到的CD20可存在于生物样品中。可以使用包含CD20的任意样品。优选地，样品是生物体液例如血液、血清、淋巴液、尿液、脑脊液、羊水、滑膜液、组织提取液或组织匀浆液等等。然而，本发明不限于仅使用这些样品的测定法，因为本领域的普通技术人员可确定使用其它样品的适当条件。
通过从患者取出组织学样本，并提供本发明标记的CD20结合分子的组合至此种样本，能够实现原位检测。优选地通过将标记的CD20结合分子应用或覆盖于生物样本而提供CD20结合分子。通过使用此种操作，不仅可确定CD20的存在，还可确定在所检验组织中CD20的分布。利用本发明，本领域技术人员易于理解为了完成此种原位检测可以对多种组织学方法中的任意一种进行改良。
本发明的CD20结合分子能够调整为适合用于免疫测定，也就是已知的“双位点”或“夹心”测定法。在典型的免疫测定中，将大量未标记CD20结合分子(例如抗CD20抗体)结合至在进行测试的液体中是不溶的固体支持物上，并且加入大量可检测标记的可溶性抗体以允许检测和/或定量在固相抗体、抗原和标记抗体之间形成的三元复合物。
一般的且优选的免疫测定包括“正向”测定，其中首先将结合于固相的CD20结合分子(例如抗体)与受测试的样品相接触，以通过形成双元固相抗体-CD20复合体而从样品中提取CD20。经适当孵育期之后，如果需要，洗涤固体支持物以去除液体样品的残余物，包括未反应的CD20，并且然后将其与包含已知量标记抗体(其行使“报告分子”的功能)的溶液相接触。在允许标记抗体与通过未标记抗体结合于固体支持物上的CD20形成复合体的第二次孵育期之后，第二次洗涤固体支持物以去除未反应的标记抗体。该类型正向夹心测定可以是简单的“是/否”测定，以确定CD20是否存在或者能够通过将标记抗体测量值与从包含已知量CD20的标准样品所获得的测量值相比较而进行定量。
也可用于CD20测量的其它类型“夹心”测定法是所谓的“同时”和“反向”测定。同时测定涉及单一孵育步骤，其中结合至固体支持物的抗体和标记抗体同时都加入到受测试的样品中。孵育完成之后，洗涤固体支持物以去除液体样品和未复合的标记抗体的残余物。然后如常规“正向”夹心测定中一样测定与固体支持物相连的标记抗体的存在。在“反向”测定中，使用首先将标记抗体溶液加入到液体样品中，随后经适当孵育期之后加入结合于固体支持物的未标记抗体的分步加入。第二次孵育之后，以常规方式洗涤固相以去除受测试的样品残余物和未反应的标记抗体溶液。然后如“同时”和“正向”测定法进行与固体支持物相连的标记抗体的测定。
在一些实施方案中，附着于固体支持物上的本发明CD20结合分子能够用于从体液或组织或细胞提取物中去除CD20(或含CD20的B细胞)。在一个优选的实施方案中，它们用于从血液或血浆制品中去除CD20。在另一个优选的实施方案中，CD20结合分子有利地用于体外免疫吸附方法，这在本领域中是已知的(见，例如Seminars in Hematology，26(2Suppl.1)(1989))。将患者血液或其它体液暴露于吸附的CD20结合分子，导致循环的CD20(游离的或免疫复合物形式的)部分或全部去除，随后将体液重新输回体内。该种免疫吸附能够以恒流方式进行，中间插入或不插入细胞离心步骤。见，例如Terman，等，(1976)J.Immunol.1171971-1975。
实施例为了证明并进一步阐述本发明某些优选的实施方案和方面，提供了以下实施例，并且不构成对本发明范围的限制。
在以下试验公开中，应用以下缩略语M(摩尔)；mM(毫摩尔)；nM(纳摩尔)；pM(皮摩尔)；mg(毫克)；μg(微克)；pg(皮克)；ml(毫升)；μl(微升)；℃(摄氏度)；OD(光密度)；nm(纳米)；BSA(牛血清白蛋白)和PBS(磷酸盐缓冲盐溶液)实施例1CD20结合分子该实施例描述如何构建某些作为例证的CD20结合分子。具体而言，该实施例描述如何构建11种不同的CD20结合分子(AME 21E1 Hum、AME 6F1、AME 2C2、AME 1D10、AME 15、AME 18、AME 33、AME5-3、AME 1C2、AME 4H5和AME 5)，并进行表达，例如表达为Fab或完整IgG。
可以如下构建11种不同CD20结合分子的轻链和重链可变区。表3中显示了每种CD20结合分子的6个CDR的集合，首先列出氨基酸序列的序列ID号并且第二列出了核酸序列的序列ID号。
表3作为例证的CD20结合分子的轻链和重链CDR
表3中的CDR可以与任意构架如人种系构架组合，以产生可变区(例如其可以表达为Fv)。例如，为了产生该实施例中命名的11种抗CD20分子的可变区，将表3中的CDR与人种系构架组合，如表4中所示。
表4用于产生所命名的CD20结合分子的人种系构架
在图2-3和6-7中提供了11种CD20结合分子中两种分子的完整轻链和重链可变区的序列。具体而言，图2和3显示AME 33轻链和重链可变区的氨基酸和核酸序列(同时提供了AME 33的完整Fv序列)。图6和7显示了AME 5轻链和重链可变区的氨基酸和核酸序列。
该实施例中所讨论的11种CD20结合分子的轻链和重链可变区可以与轻链和重链恒定区相组合并表达为Fab或完整抗体(例如IgG)。这些序列优选地连接至前导序列(例如在轻链序列起始处的前导序列)。可以应用的前导序列的一个例子是METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ IDNO105)。也可以应用其它前导序列。同样，可以应用任意人恒定区同种异型链。例如，图10和11显示了AME 33的完整轻链和重链，其包括轻链和重链恒定区。这些图同样可以是恒定区的来源，用于制备该实施例中命名的其它CD20结合分子的Fab和IgG。值得注意的是在图10A和11A中划下划线的部分为恒定区。同样，该实施例中的抗CD20分子可以备选地应用图10和11中所示的重链恒定区，除了在Fc区具有氨基酸替换。具体而言，图11中所显示的重链恒定区可以包含D280H突变或K290S突变(图11A以粗体显示位置280和290，不具有突变)。图11B显示粗体和下划线的“GAC”。该“GAC”可以改变为“CAT”以编码D280H突变。
为了表达本实施例中的抗CD20结合分子(表达为Fab或IgG)，可以使用本领域已知的方法。例如，可使用单一载体或双载体系统在哺乳动物表达系统(或者细菌、真菌和植物表达系统)中将该实施例中的11种CD20结合分子表达为Fab或IgG。在单一载体系统中，产生或克隆重链和轻链两者于一个表达盒内，所述表达盒含有表达所需的全部调控元件。双载体系统只是在分别的质粒中具有两个表达盒。单一质粒或者在双载体系统中的组合质粒可以转染入宿主细胞细胞系如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或视网膜细胞系PerC6，如本领域中已知，选择这两株细胞扩增和培养用于表达Fab或IgG蛋白(见Antibody Expression and EngineeringDeveloped from a Symposium Sponsored by the Division of BiochemicalTechnology at the 207th National Meeting of the American ChemicalSociety，San Die[Acs Symposium Series，604])。
Fab还可以表达于细菌表达系统中，因为该系统比哺乳动物系统具有更少的时间消耗和更少的成本。这里可将Fab插入并表达于M13病毒表达系统。细菌表达的Fab是分泌型的并且还积累于细菌细胞壁及其细胞膜之间的周质间隙内。通过大量技术包括本领域常用的低渗休克和冻融方法能够从该周质间隙释放Fab。Fab还能够通过使用蛋白酶如木瓜蛋白酶进行蛋白裂解从完整IgG产生。然后将分解产物的Fab部分自分解产物的Fc部分纯化分离。使用本领域已知的多种层析和特定吸附技术能够纯化Fab和IgG(见AntibodiesA LaboratoryManual，Ed Harlow(编者)，David Lane(编者)，Cold Spring Harbor Press)。例如使用rProtein A亲和层析并随后进行Mono S阳离子交换层析能够容易地通过特异性结合从细胞上清中纯化出IgG。
实施例2固定的Ramos细胞ELISA本实施例描述使用CD20结合分子进行固定的Ramos细胞ELISA结合测定法。具体而言，本实施例测定表达为Fab和IgG的AME 4H5、AME15、AME 18、AME 33和AME 1D10以确定总体结合、解离速率和结合速率。为了比较目的，本实施例还以相同测定法测试了马C2B8 Fab和完整抗体以及商业化的RITUXAN(Oncology Supply Co.)。C2B8抗体保藏于ATCC，保藏号为69119。
Ramos细胞(ATCC)生长于包含10％热灭活胎牛血清的RPMI 1640中。将50微升Ramos细胞(2-4×106/ml)加入96孔多聚-D-赖氨酸包被板(BIOCAT Becton Dickinson Labware)每个孔中并在37℃，5％CO2孵育18小时。轻轻吸出培养基并将100μl锌福尔马林缓冲液(Anatech，Ltd.)加入到每个孔中室温固定15分钟。去除Z-固定液并用含0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤板子。用PBS中的1％小牛血清白蛋白(BSA)封闭板子1小时。将固定的且封闭的Ramos细胞在Fab或IgG稀释液中室温孵育1小时。用PBS 0.05％Tween 20洗涤板子3次，并将50μl 1∶500稀释的抗His6过氧物酶小鼠单克隆抗体(Roche Diagnostics Corporation)加入各孔并在室温孵育1小时。如上洗涤板子并用四甲基联苯胺显色，并且用5N H2SO4终止反应。在OD 450nm处读取板子吸光度。Fab和结合物的稀释在1％BSA/PBS中进行。
同样进行IgG测定，除了使用山羊抗人IgG-HRP检测IgG结合外。为了比较抗体解离速率，在用Fab或IgG孵育之后，开始第二抗体步骤之前，将板子在PBS/BSA中孵育过夜。为了比较抗体结合速率，Fab/IgG结合和使用第二抗体的孵育步骤都进行5分钟孵育时间。
来自本实施例的结果显示于图12和13。如这些图中所示，Fab AME4H5，15，18，33和1D10的总体结合比C2B8 Fab更有效。AME抗体的剂量反应曲线移至相对C2B8抗体和商业化RITUXAN的左侧，并且所获得的最大OD是使用C2B8抗体所显示OD的大约1.5倍。关于解离速率，AME 4H5，15，18，33和1D10的Fab显示相对C2B8 Fab解离速率显著降低(图12B)。表达为完整IgG的AME抗体的解离速率与C2B8抗体和商业化RITUXAN的解离速率相似(图13A)。关于结合速率，AME 4H5，15，18，33和1D10的Fab显示与C2B8Fab相似的结合速率，具有增加的总体结合(所达到的最大OD)(图12C)。表达为完整IgG的AME抗体的剂量反应曲线移至完整C2B8抗体的剂量反应曲线的左侧(图13B)。
实施例3活B淋巴瘤免疫荧光结合测定本实施例描述活B淋巴瘤免疫荧光结合测定。具体而言，如下所述测定了AME 33、AME 5和C2B8的Fab。
Fab染色PBMC用于CD20FACS分析通过在Ficol-Hypaque(Sigma-1077)上浮选从正常人血液分离外周血单核细胞(PBMC)。将细胞计数并重悬于PBS+1％BSA以得到2-5×106细胞/ml。将100微升稀释的细胞分散于聚苯乙烯管(Falcon#2058)并加入稀释于PBS+1％BSA中的抗CD20Fab抗体。将管子在室温孵育1小时。在每个管中加入4毫升PBS+1％BSA并且以300xG离心10分钟。去除上清液并将细胞重悬于100μl PBS+1％BSA。以2μl每管加入Anti-Penta-His AlexaFluor 488结合物(Qiagen#35310)，在管中混合并在黑暗处室温孵育1小时。如先前所述洗涤样品。去除上清液并将细胞重悬于PBS+1％BSA+2μg/ml碘化丙锭。在Becton Dickinson FACScan或FACSort流式细胞仪上分析荧光并使用Cell Quest(Becton Dickinson)或WinMDI软件分析数据。
结果显示于图14。Daudi细胞的数据显示于图14A，Wi12-S细胞的数据显示于图14B，并且Ramos细胞的数据显示于图14C。如该图中所示，AME 5和33的Fab比C2B8的Fab更有效地结合至活B淋巴瘤细胞系。值得注意的是AME 5和AME 33的剂量反应曲线移至C2B8的左侧。
实施例4通过KinExA测定IgG结合该实施例描述测量多种CD20 IgG的Kd、Kon和Koff的测定法。具体而言，该测定法测试AME 33、AME 5、AME 6F1和C2B8抗体对SKW6.4B淋巴瘤细胞的结合，并借助KinExa平衡软件确定了这些分子中每一种分子的Kd、Kon和Koff。另外，测定了AME 33和C2B8与原代人外周B血细胞的结合。
Kd测量SKW 6.4细胞生长于添加了10％FCS的DMEM培养基中并以每ml5-10×105细胞收获。用5倍体积的PBS洗涤细胞并以大约每ml 1×108细胞重悬于含1％BSA的PBS。对于人外周血B细胞，从全细胞获得新鲜的CD19阳性分选的B细胞。用含1％BSA的PBS洗涤这些细胞2次并以8×107/ml浓度重悬。
然后制备十二份3倍系列稀释液并将100μl每种稀释液放置于96孔板中。在每份稀释液中加入100μl 100ng/ml的抗体并将板子在37℃，5％CO2孵育4小时。然后将每个样品用96孔1微米滤膜(Millipore)过滤以去除细胞和结合的抗体。然后利用ELISA定量溶液中的游离抗体。简而言之，将游离IgG俘获于用1mg/ml抗人κ抗体(Southern Biotechnology)包被的96孔板并且利用HRP偶联的抗人Fc抗体(Southern Biotechnology)进行检测。使用Fast TMB底物(Pierce)将板显色并在450nm处读数。
然后使用用于未知抗原浓度的KinExA平衡软件确定抗体的Kd。使用估计的抗原浓度和实际的抗体浓度拟合每份系列稀释液的OD450值。然后计算Kd和实际的抗原浓度。SKW 6.4细胞测定的结果显示于表5。这些结果显示AME 33和AME 5具有的Kd相比于C2B8抗体增强了10-倍。原代人外周血B细胞的结果显示AME 33的Kd为113pM和C2B8的Kd为1500pM。此外，显示AME 33的Kd大于C2B8抗体的Kd 10倍(几乎15倍)。
表5
动力学测量SKW 6.4细胞生长于添加了10％FCS的DMEM培养基中并以每ml5-10×105细胞收获。用5倍体积的PBS洗涤细胞并以大约每ml l×107细胞重悬于含1％BSA的PBS中，并在37℃水浴。然后向细胞中加入等体积的37℃于含1％BSA的PBS中的100ng/ml抗体，并且定时为实验开始时间。以时间间隔从60秒至10800秒抽取抗体细胞溶液样品并过滤以去除细胞和结合的抗体。然后利用上述的ELISA方法定量每个时间点所剩余的游离抗体。
利用直接动力学KinExA软件计算抗体细胞反应的动力学。使用先前计算的Kd和抗原浓度及所计算的反应Kon和Koff拟合每个时间点的OD450值。结果显示于表5。
实施例5
使用CD20结合分子进行ADCC测定在本实施例中，使用人外周血单核细胞作为效应细胞并用B淋巴瘤细胞作为靶细胞，测试了AME 5、AME 33和AME 6F1 IgG以及C2B8抗体介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)的能力。如下所述进行这些测定。
PBMC(外周血单核细胞)分离用磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)，pH 7.0，以1∶2稀释来自健康供体的外周血。小心地将12mL Histopaque-1077(Sigma目录号1077-1)置于稀释样品下面，然后通过在具有闸门开关的浮桶式转头Sorvall RT6000B离心机中以1000转/分离心10分钟。收集含PBMC的界面相并用Hanks平衡盐溶液(Gibco)洗涤3次。将洗涤后的细胞沉淀悬于含10％胎牛血清(FBS)(Omega Scientific)的20mL RPMI 1640培养基(ATCC)中。将重悬的PBMC分入2个T-175培养瓶中并在每个瓶中加入30mL RPMI/10％FBS。将培养瓶在37℃/5％CO2孵箱中孵育过夜。接下来的一天收集非粘附的PBMC，如上述离心，重悬于含1％FBS的RPMI中并使用血细胞计数器计数。
靶细胞系B淋巴瘤细胞系获得自ATCC并如推荐进行生长。实验前一天将细胞1∶2传代。第二天将浓度调整至0.5至1×106细胞/mL并取50μL的一份(25,000-50,000细胞/孔)加入Becton Dickinson 96-孔U形底组织培养板中。
IgG滴定通过将样品稀释于含1％FBS的RPMI中制备IgG稀释液。将50微升一份IgG加入到96-孔微量滴定板的靶细胞中并通过轻轻吹吸混合。将IgG与靶细胞一起在37℃/5％CO2孵育15分钟，然后加入效应细胞。
效应细胞将100微升重悬的PBMC加入到靶细胞/IgG板的每个孔中。调整PBMC的浓度从而使效应细胞∶靶细胞比率在10-20∶1范围内。将板在37℃/5％CO2孵育3-4小时。
LDH-释放检测孵育之后，将板以1-2000转/分离心5-10分钟。小心去除50μL上清液并避免碰到沉淀的细胞。将上清液直接加入到每孔包含50μL PBS的Dynex Immulon 2HB平底板中。将100μl LDH检测试剂(Roche)加入该板中。然后将板子孵育大约15-30分钟并使用Molecular Devices VmaxKinetic Microplate Reader读取490nm处的OD值。
数据分析将数据绘制成log IgG浓度对A490曲线(见图15)。使用以下方程式将A490转换成％细胞毒性％细胞毒性＝(实验A490-基础A490)/(最大A490-基础A490)×100，其中最大A490通过将2％Triton X-100加入靶细胞测定并且当无致敏IgG时测定效应细胞和靶细胞的混合物的基础释放。基于图15中所显示的数据，表明具有Fc突变D280H和K290S的AME 33的EC50始终低于C2B8的1.5-2.0倍。并且该数据显示于下面表6。
表6估计的EC50s，μg/ml(Wil-2细胞作为靶细胞)C2B8 0.0042+/-.0008AME330.0063+/-.0031AME33D280H 0.0031+/-.0009AME33K290S 0.0021+/-.0005实施例6CD20结合分子的糖工程(glycoengineering)本实施例描述应用于某些CD20结合分子的糖工程方法。具体而言，具有野生型或突变(D280H或K290S)Fc区的AME 1C2 IgG与酶β(1-4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III共表达于CHO细胞，以增加Fc区中分成两段的寡糖的表达。相对未修饰的1C2或商业化RITUXAN抗体，糖工程和突变Fc区的联合降低了ADCC测定的1C2的EC50。如下所述进行该方法。
从大鼠肾cDNA(Clontech，Palo Alto，CA)PCR扩增(β(1-4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III基因。PCR引物在基因的5′-末端导入了NheI位点并在基因的3′-末端导入了EcoRI位点(正向引物是5′-GGCGGCTAGCATGAGACGCTACAAGCTTTTTCTCATGTTCTG-3′，SEQ ID NO103，并且反向引物是5′-GGCGGAATTCCTAGCCCTCCGTTGTATCCAACTTGC-3′，SEQ IDNO104)。限制性消化和PCR产物纯化之后，将其连接入同样酶切的pcDNA3.1NEO(Invitrogen，Carlsbad，CA)。连接后的质粒DNA用于通过电穿孔转化大肠杆菌(E.coli)。使用菌落PCR筛选氨苄青霉素抗性大肠杆菌菌落中是否存在大鼠(β(1-4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III基因。从阳性克隆分离质粒DNA并测序。使用BspHI将确认序列的质粒DNA线性化并将大约10微克线性化DNA用于转染CHO K1细胞，按照制造商的方法使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行转染。G418筛选之后，在组织培养液中扩增所分离的抗性集落。分离mRNA并鉴定大鼠β(1-4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III信使RNA的定性产生。这些细胞系的每一种均产生的预期大小的PCR产物，而未转染的CHOK1细胞未获得产物。编码抗CD20IgG的DNA用于转染稳定的细胞系。转染后大约三天，收集细胞培养上清并使用蛋白A层析法纯化IgG亲和力。从蛋白A柱洗脱IgG之后，透析样品并通过测量其在280nm处的吸光度定量蛋白质浓度。
使用实施例5中描述的方法测试了从不同CHOK1细胞系表达的IgG样品引发抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)的能力。在这些实验中从新鲜人全血分离的外周血淋巴细胞用作效应细胞并且WIL.2s B细胞用作靶细胞。使用标准乳酸脱氢酶释放测定法测量靶细胞裂解的量。将从工程化CHOK1细胞系表达的IgG直接与从非工程化CHOK1细胞系表达的IgG和商业化RITUXAN抗体比较引发ADCC的能力。另外通过直接糖基化分析证实二分的N-乙酰葡糖胺糖部分的存在。AME 1C2的ADCC测定结果显示于图16。
实施例7体外程序化细胞死亡测定本实施例描述了用多种CD20结合分子进行的某些体外程序化细胞死亡测定。具体而言，测试了AME 5、AME 33和AME 6F1(全部为完整抗体)以及C2B8抗体与抗人IgG交联后诱导Ramos B淋巴瘤细胞系凋亡的能力。如下所述进行这些测定。
膜联蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)染色使用前24小时将Ramos B淋巴瘤细胞系(ATCC)1∶2传代。测定当天，离心Ramos细胞(1,000转/分5分钟)，用PBS洗涤，并以5×105细胞/ml的细胞密度重悬于加入10％热灭活FBS的RPMI(培养基)中。在6孔组织培养板的每个孔中加入一百万个细胞。以所标明的浓度加入初级抗体，轻轻振荡板子15分钟并且然后放回37℃另外放置45分钟。将2ml预温的山羊抗人IgG(10μg/ml)或培养基加入到特定的孔中并将板子在37℃孵育6小时。
通过离心(1,000转/分5分钟)收获细胞并重悬于100μl冷1X结合缓冲液(于水中自10X贮存液稀释而来)和10μl Annexin V-FITC(SouthernBiotech)中。将样品转移至聚苯乙烯圆底管(Falcon 2058)中并室温黑暗孵育15分钟。加入含2μg/ml碘化丙锭的结合缓冲液，并在Becton DickinsonFacscan流式细胞仪上分析，使用CellQuest或WinMDI软件进行数据分析。通过测量由膜联蛋白V染色的细胞百分数确定细胞死亡(％凋亡细胞+坏死细胞)。该测定的结果显示AME 5，33和6F1在与用C2B8抗体处理所观察到的水平相似的水平诱导细胞死亡。
实施例8补体介导的细胞毒性测定本实施例描述如何使用人补体并用Wil-2B淋巴瘤细胞系作为靶细胞测试C2B8抗体、Synagis(对照)和AME抗体6F1、2C2、1D10、15、18和33的介导补体依赖细胞毒性的能力。
将Wil-2B淋巴瘤细胞(ATCC)以5×105/ml重悬于RPMI+10％热灭活FBS。在96孔板(Costar 3917)中混合50微升Wil2-S细胞悬液、50μl IgG(浓度范围从1ng/ml-75μg/ml)和50μl稀释的[1∶5]人补体。将抗体和补体稀释于RPMI+10％FBS。将细胞在37℃5％CO2孵育90分钟。以每孔15μl加入Alamar Blue并将板子在37℃5％CO2孵育过夜。使用560nm激发光并检测590nm发射光记录荧光(反映活细胞数)。这些测定的结果显示所测试的全部AME抗体的EC50与C2B8抗体的EC50相似。
实施例9CD20结合分子的体内施用本实施例描述用于测试体内CD20结合分子的测定法。
如下在小鼠中测定了抗体AME 45H、1C2、5-3和C2B8抗体。雄性6-8周龄C.B.17-SCID小鼠(Taconic)在右和左两侧用5×106Raji细胞(ATCC)皮下注射。大约2-3小时后(第0天)以0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg和0.5mg/kg向腹膜内注射抗体。每个星期一、星期三和星期五通过测径器测量瘤的长度、宽度和高度并计算瘤体积。从剂量反应曲线确定EC50值。AME 4H5、1C2和5-3的EC50不是始终不同于C2B8抗体的EC50。
在已经注射了5×106Raji细胞的小鼠中还测定了抗体AME 33和C2B8抗体。在第三天时用0.5mg/kg AME 33或C2B8处理小鼠。对照小鼠接受盐水注射。结果(显示于图17)显示AME 33和C2B8以相似的方式抑制Raji瘤的生长，与C2B8相比AME 33允许较小瘤随着时间生长。
实施例10CD20结合分子在人类中治疗疾病的用途本实施例描述CD20结合分子用于治疗性和预防性治疗人患者中某些疾病的用途，疾病包括但不限于选自非霍奇金淋巴瘤(NHL)和系统性红斑狼疮(SLE)的疾病。
例如，患有上面列出的一种疾病的患者可以施用CD20结合分子如AME 21E1 Hum、AME 6F1、AME 2C2、AME 1D10、AME 15、AME 18、AME 33、AME 5-3、AME 1C2、AME 4H5或AME 5，以0.4-20.0mg/kg体重静脉注射。一般的疗程剂量可以是例如以每周375mg/m2抗体缓慢静脉内输注4或8剂量。在Anderson的美国专利6,399,061种提供了其它剂量方案，此处整体引用以备参考。用于治疗和/或体内成像操作的抗体或Fab片段也可以是放射性标记的(例如使用钇-[90])(见美国专利6,399,061)。可以监测治疗反应以确定是否需要增加或降低剂量和需要重复治疗。其它关于治疗反应和疗程方案的指导见于美国专利6,399,061。
在上面说明书中所提到的全部出版物和专利此处引用作为参考。所描述方法和本发明系统的各种修饰和变更对本领域技术人员将是明显的，未脱离本发明的范围和精髓。尽管本发明已经描述了特别优选的相关实施方案，但应该理解所要求的本发明将不过分限于此类特定实施方案。的确，对所述的实施本发明的方式的多种改变对于化学、医学和分子生物学或相关领域的技术人员是明显的，并且认为包含于以下权利要求的范围之内。
权利要求
1.包含CD20结合分子的组合物，其中所述CD20结合分子对人CD20具有的结合亲和力(Kd)为5.0×10-10M或更小，对人CD20具有的解离速率(koff)为5.0×10-4s-1或更小。
2.权利要求1的组合物，其中所述CD20结合分子对人CD20具有的结合亲和力(Kd)为1.5×10-10M或更小。
3.权利要求1的组合物，其中所述CD20结合分子对人CD20具有的解离速率(koff)为2.5×10-4s-1或更小。
4.权利要求1的组合物，其中所述CD20结合分子对人CD20具有的结合速率(kon)为5.0×105M-1s-1或更大。
5.权利要求1的组合物，其中所述CD20结合分子包含轻链可变区和重链可变区。
6.权利要求5的组合物，其中所述轻链可变区包含完整的人构架。
7.权利要求5的组合物，其中所述轻链可变区包含人种系构架。
8.权利要求5的组合物，其中所述重链可变区包含完整的人构架。
9.权利要求5的组合物，其中所述重链可变区包含人种系构架。
10.权利要求1的组合物，其中所述CD20结合分子包含抗体或抗体片段。
11.包含CD20结合分子的组合物，其中所述CD20结合分子包含a)轻链可变区，其中所述轻链可变区包含i)选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5的CDRL1氨基酸序列；ii)选自SEQ 1D NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11和SEQ IDNO13的CDRL2氨基酸序列；和iii)选自SEQ ID NO17、SEQ ID NO19和SEQ ID NO21的CDRL3氨基酸序列；以及b)重链可变区，其中所述重链可变区包含i)选自SEQ ID NO23和SEQ ID NO25的CDRH1氨基酸序列；ii)选自SEQ ID NO27、SEQ 1D NO29、SEQ ID NO31、SEQ IDNO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37和SEQ ID NO39的CDRH2氨基酸序列；和iii)选自SEQ ID NO43、SEQ ID NO45、SEQ ID NO47、SEQ IDNO49、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55和SEQ ID NO57的CDRH3氨基酸序列。
12.权利要求11的组合物，其中所述轻链可变区包含完整的人构架。
13.权利要求11的组合物，其中所述轻链可变区包含人种系构架。
14.权利要求11的组合物，其中所述重链可变区包含完整的人构架。
15.权利要求11的组合物，其中所述重链可变区包含人种系构架。
16.权利要求11的组合物，其中所述CD20结合分子包含抗体或抗体片段。
17.权利要求11的组合物，其中所述CD20结合分子包含AME 33Fab。
18.组合物，其包含a)编码轻链可变区的第一核酸序列，其中所述轻链可变区包含i)选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5的CDRL1氨基酸序列；ii)选自SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11和SEQ IDNO13的CDRL2氨基酸序列；和iii)选自SEQ ID NO17、SEQ ID NO19和SEQ ID NO21的CDRL3氨基酸序列；以及b)编码重链可变区的第二核酸序列，其中所述重链可变区包含i)选自SEQ ID NO23和SEQ ID NO25的CDRH1氨基酸序列；ii)选自SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ ID NO31、SEQ IDNO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37和SEQ ID NO39的CDRH2氨基酸序列；和iii)选自SEQ ID NO43、SEQ ID NO45、SEQ ID NO47、SEQ IDNO49、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55和SEQ ID NO57的CDRH3氨基酸序列。
19.权利要求18的组合物，其中所述轻链可变区包含完整的人构架。
20.权利要求18的组合物，其中所述轻链可变区包含人种系构架。
21.权利要求18的组合物，其中所述重链可变区包含完整的人构架。
22.权利要求18的组合物，其中所述重链可变区包含人种系构架。
23.权利要求18的组合物，其中所述CD20结合分子包含抗体或抗体片段。
24.权利要求18的组合物，其中所述CD20结合分子包含AME 33Fab。
25.治疗B细胞淋巴瘤的方法，其包括a)提供i)受试者和ii)组合物，其中所述组合物包含对人CD20具有的结合亲和力(Kd)为5.0×10-10M或更小、对人CD20具有的解离速率(koff)为5.0×10-4s-1或更小的CD20结合分子；以及b)将所述组合物施与所述受试者。
26.权利要求25的组合物，其中所述CD20结合分子包含轻链可变区和重链可变区。
27.权利要求26的组合物，其中所述轻链可变区包含完整的人构架。
28.权利要求26的组合物，其中所述轻链可变区包含人种系构架。
29.权利要求26的组合物，其中所述重链可变区包含完整的人构架。
30.权利要求26的组合物，其中所述重链可变区包含人种系构架。
31.权利要求25的组合物，其中所述CD20结合分子包含抗体或抗体片段。
32.权利要求25的组合物，其中所述CD20结合分子包含AME 33Fab。
33.对人CD20具有的结合亲和力(Kd)为5.0×10-10M或更小、对人CD20具有的解离速率(koff)为5.0×10-4s-1或更小的CD20结合分子的用途，用于制备治疗B细胞淋巴瘤的组合物。
全文摘要
本发明涉及CD20结合分子和编码CD20结合分子的核酸序列。具体而言，本发明涉及对于人CD20具有高结合亲和力和低解离速率的CD20结合分子。优选地，本发明CD20结合分子包含具有完整人构架(例如人种系构架)的轻链可变区和/或重链可变区。
文档编号C07K16/28GK1874788SQ200480013643
公开日2006年12月6日 申请日期2004年5月20日 优先权日2003年5月20日
发明者J·D·沃特金斯, J·戴维斯, D·M·马奎斯, B·W·艾伦, B·翁代克 申请人:应用分子进化公司