专利名称：新的dna序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含内含子序列并编码根据作用位点而称之为胆汁盐刺激的脂酶(BSSL)或羧酸酶脂酶(CEL)的人蛋白质的DNA分子。用该DNA分子有助于生产重组人BSSL/CEL，尤其是通过用转基因非人哺乳动物进行生产。可以将该重组人BSSL/CEL作为可取代人奶喂养婴幼儿的婴幼儿食品的组分，或将其用于生产抗如脂肪吸收障碍，囊性纤维性变和慢性胰炎的药物。
食物脂类的水解食物中的脂类是能量的一个重要来源。富含能量的三酰基甘油占这些脂类的95%以上。一些脂类，如特定的脂肪酸和脂溶性维生素是饮食中必需的成分。在胃肠道吸收前，三酰基甘油以及微量成分，即酯化的脂溶性维生素和胆固醇，以及二酰基磷脂酰甘油需要水解酯键以得到疏水性较低的可吸收产物，这些反应由称之为脂酶的一组特定酶催化。
在成人中，据认为涉及的必需脂酶是胃脂肪酶，胰辅脂酶依赖的脂酶(水解三和二酰基甘油)，胰磷脂酶A2(水解二酰基磷脂酰甘油)以及羧酸酯脂酶(CEL)(水解胆甾烯基和脂溶性维生素酯类)。在哺乳喂养的新生儿中，胆汁盐刺激的脂酶(BSSL)在上述几种脂类的水解中起必不可少的作用。脂类消化的产物与胆汁盐一起形成可开始吸收的混合微胶粒。
胆汁盐刺激的酯酶喂奶的人的乳腺合成并与奶一起分泌胆汁盐刺激的脂酶(BSSL)(Bl
ckberg et al.，1987)，在由一级胆汁盐特定激活后，该酶对哺乳喂养婴儿的内源性肠内脂肪消化能力产生影响。占全部奶蛋白质总量约1%的这种酶(Bl
ckberg ＆ Hernell，1981)在与奶一起通过胃时并不减少，在十二指肠的内含物中，经胰蛋白酶如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶失活成胆汁盐以保护该酶。但当奶经巴氏灭菌，如加热至62.5℃，30分钟可使其失活(Bj
rksten et al.，1980)。
体外模式实验表明，在BSSL存在的情况下，三酰基甘油消化的终产物不同(Bernb
ck et al.，1990;Hernell ＆ Bl
ckberg，1982)。这可能是由于新生儿期间，较低的管腔内胆汁盐浓度有利于产物吸收。
羧酸酯脂酶人胰液中的羧酸酯脂酶(CEL)(Lombardo et al，1978)似乎与BSSL功能相同，或者至少很相似(Bl
ckberg et al，1981)。它们具有共同的抗原决定簇，有相同的N末端氨基酸序列(Abouakilet al.，1988)，并由丝氨酸酯酶的抑制剂，如毒扁豆碱及二异丙基氟磷酸酯抑制。最近几个实验室的研究中对奶脂酶及胰脂酶的cDNA结构进行了定性(Baba et al.，1991;Hui et al.，1991;Nilsson et al.，1990;Reue et al.，1991)并且得出的结论是奶酶与胰酶是相同基因的产物(在本申请中涉及CEL基团，EC3.1.1.1)。在WO91/15234(Oklahoma Medical Research Foundation)和WO91/18923(Aktiebolaget Astra)中描述了CEL基因的cDNA序列及推断的氨基酸序列。
因此认为CEL与BSSL相同，且由CEL基因编码的多肽在本发明说明书中称为BSSL/CEL。
脂类吸收障碍脂类吸收障碍，并由此产生营养不良的普通原因是管腔内胰辅脂酶依赖的脂酶和/或胆汁盐水平降低。脂酶缺陷的典型例子是患有囊性纤维性变和慢性胰炎的患者，80%囊性纤维性变的患者是普通的遗传无序导致终身缺陷，慢性胰炎经常起因于慢性酒精中毒。
患有胰脂酶缺陷的患者目前的治疗是口服很大剂量的猪胰酶粗制剂。但是在胃中，低PH值使辅酶依赖性胰脂酶失活。而使用大剂量的酶并不能完全克服这种影响。因此，对于大多数患者来说，口服大剂量是不合适的，此外，该制剂不纯并且味道不好。
已经制成可通过胃酸区域并仅在空肠的相对碱环境中释放酶的特定片剂。然而，许多胰不正常的患者有一副不正常的酸性空肠，因而在这种情况下，片剂不可能释放出酶。
此外，由于目前市场上的制品不是来源于人，因而有免疫反应的危险，这种免疫反应可能对患者有不良影响或者导致治疗效果减弱。现有制剂的另一缺点是没有说明其内含物中除辅脂酶依赖性脂酶外其他脂解活性。事实上，这些制剂大多数包含有很低的BSSL/CEL活性水平。这可能是尽管进行补充治疗，但许多患囊性纤维性变的患者仍患有脂溶性维生素和必需的脂肪酸缺陷症的一个原因。
因此，很需要具有人脂酶特性及结构并具有广泛的底物特异性的产品，可以让患一种或几种胰脂解酶缺陷症的患者口服该产品。应用本发明得到的产品，其本身或与含其它脂酶的制剂一起满足这种需要。
婴儿食物在家都知道，对婴幼儿来说，人奶喂养是最好的喂养方式。人奶不仅提供了十分平衡的营养，而且很容易被婴儿消化。因此，在婴儿中已知有生理功能的几种生物学活性组分要么是人奶中的成分，要么就是在其消化期间产生的，包括抵抗感染的成分以及有利于从人奶中吸收营养的成分。
尽管在制备婴儿食品中已化费了巨大努力，还不可能生产在任何显著的范围内均有人奶优点的产品。因此，婴儿食品通常是在牛奶的基础上制备的，一般不能完全被婴儿消化，并且缺少对婴儿生理功能有影响的已知物质。为了得到营养价值与人奶相似的婴儿食品，将包括蛋白质片段，维生素、矿物质等(在婴儿消化人奶期间形成或吸收的)大量添加剂加到食品中，而这同时会造成增加重要器官如肝和肾脏的负担并可能长期损坏它们的危险。与使用以牛奶为基础食品有关的危害是会增加诱发婴儿抗牛蛋白质过敏反应的危险。
除了以牛奶为基础的婴儿食品外，也可使用从所谓奶库得到的人奶。然而，用来自奶库的人奶喂养新生儿在近几年内不会有广泛的增加，这是由于惧怕人奶中存在的传染因素如HIV和CMV。为了破坏人奶中的传染因素，在使用前，必需要进行巴氏灭菌。然而，经过巴氏灭菌，就会降低奶中的营养价值和生物学作用，例如，上文所述使BSSL失活。
将脂酶添加到婴儿食品中出生时，胰和肝的功能还未完成发育成熟，特别是足月前出生的婴儿。从生理学因素看，普遍发现脂肪吸收障碍，并且认为是由管腔内胰辅酶依赖性脂酶及胆汁盐浓度低引起的。但是，由于有BSSL，上述吸收障碍在哺乳喂养的婴儿中比用巴氏灭菌人奶或婴儿食品喂养的婴儿发生频率低(Bernb
ck et al.，1990)为了避免与经过巴氏灭菌奶及基于牛奶的婴儿食品有关的上述缺点，因此，需要制备其组分与人奶相近的婴儿食品，即含有人奶蛋白质的食品。
BSSL/CEL有几个独特的性质，使其较理想地适用于补充婴儿食品·它是按天然的方式设计用于口服。因此，它耐得住通过胃并由小肠的内含物激活。
·它特定的激活机制可防止在贮存及传递到其作用的部位期间食物或组织脂类有害的脂类分解作用。
·由于其广泛的底物特异性，它具有在其自身上介导大多数饮食中脂类，包括脂溶性维生素酯完全消化的潜力。
·在水解含长链聚未饱和脂肪酸的酯键方面，BSSL/CEL可能比胰辅脂酶依赖性脂酶好。
·在有胃脂酶和没有，或低水平辅脂酶依赖性脂酶的情况下，即使胆汁盐水平低，如在新生儿中，BSSL/CEL也能在体外完全消化三酰基甘油。在有BSSL/CEL的情况下，三酰基甘油消化的终产物是游离脂肪酸和游离甘油，而不是由其它两种脂酶产生的游离脂肪酸和单酰基甘油(Bernb
ck et al.，1990)。这可有利于产物吸收，特别是在管腔内的胆汁盐水平低的情况下。
利用BSSL/CEL补充婴儿代乳品需要利用大量的产物。虽然可以从人奶中直接纯化人奶蛋白质，但为了得到大量用于大规模代乳品生产所需的人奶蛋白质，这不是一条现实并且足够经济的途径，而且在制备含人奶蛋白质的婴儿代乳品前，必须因此发展其它方法。本发明提供大量制备BSSL/CEL的上述方法。
用基因突变动物的奶生产蛋白质分离出编码药物学活性蛋白质的基因使得可以在异源系统中较廉价地生产上述蛋白质。对于奶蛋白质有吸引力的表达系统是基因突变动物(参见Hennighausen et al.，1990的综述)。在EP317，355(Oklahoma-Medical Reasearch Foundation)中描述了用从如基因突变动物技术衍生得到的含有胆汁盐激活的脂酶的膳食组合物。
在基因突变动物中，可以将蛋白质编码序列作为cDNA或基因组序列导入。由于内含子对于被调节的基因在突变动物中表达时是必需的(Brinster et al.，1988;Whitelaw et al.，1991)，所以，在许多情形下，最好使用基因组形式而不是结构基因的cDNA形式。WO90/05188(Pharmaceutical Proteins Limited)描述了在基因突变动物中使用编码蛋白质的DNA，该DNA含有至少一个，但不是全部在一个编码蛋白质基因中天然存在的内含子。
本发明的目的是提供以高产率及现实的价格生产用于婴儿代乳品的重组人BSSL/CEL的方法，以避免巴氏灭菌奶及以牛蛋白质为基础的代乳品所存在的不足。
通过克隆并测定人CEL基因的序列达到本发明的目的。为了提高BSSL/CEL的产率，已经用得到的含人CEL基因内含子序列的DNA分子代替已知的cDNA序列，以在基因突变的非人哺乳动物中生产人BSSL/CEL。
相应地，本发明一方面涉及序列目录中SEQ ID NO1所示的DNA分子，或者在严紧杂交条件下，与序列目录中SEQ ID NO1所示的DNA分子杂交的所述DNA分子的类似物或其特定的部分。
在下列实施例中描述了分离人BSSL/CEL DNA分子的方法。
以其经典意思理解上文提到的严紧杂交条件，即按着普通实验室操作如Sambrook等人(1989)完成杂交。
本发明另一方面是提供含有编码人BSSL/CEL的DNA序列的哺乳动物表达系统，其中该DNA序列插入到非人哺乳动物的编码奶蛋白质的基因中以便形成杂交基因，该杂交基因可在含所述杂交基因的成年雌性哺乳动物的乳腺中表达，以便在表达杂交基因时，生产人BSSL/CEL。
另一方面，本发明涉及生产可表达人BSSL/CEL的基因突变的非人哺乳动物的方法，包括将上述哺乳动物表达系统注射到哺乳动物的受精卵或胚胎细胞中，以便将表达系统掺入哺乳动物的幼体中，并将得到的注射过的受精卵或胚胎发育成成年雌性哺乳动物。
在序列目录中列出了如全长为11531bp，作为SEQ ID NO1的DNA分子，它具有下列特征特征 起始碱基 终止碱基5'侧区域 1 1640TATA盒 1611 1617外显子1 1641 1727转译起始 1653 1653外显子2 4071 4221外显子3 4307 4429外显子4 4707 4904外显子5 6193 6323外显子6 6501 6608外显子7 6751 6868外显子8 8335 8521
外显子9 8719 8922外显子10 10124 10321外显子11 10650 114903'侧区域 11491 11531在本发明中，术语“基因”用于说明DNA序列，该DNA序列存在于生产多肽链并包括前导区域以及随后的编码区域(5′上游和3′下游序列)以及所谓内含子的中间序列，内含子位于两个单独的编码片段(所谓外显子)之间或在5′上游或3′下游区域。5′上游区域含有控制基因表达的调节序列，典型地指启动子。3′下游区域含有涉及基因转录终止的序列以及可能含有负责转录产物多聚腺苷酸化的序列以及3′非转译区。
本文所解释的本发明的DNA分子可包括天然的以及合成的DNA序列，该天然序列一般是直接从正常哺乳动物的基因组DNA得到的，如下文所述。可以按合成制备DNA分子的经典方法制备合成序列。DNA序列也可以是基因组与合成序列的混合物。
另一方面，本发明涉及可复制的表达载体，该载体可携带并能介导编码人BSSL/CEL的DNA序列的表达。
在本发明中，术语“可复制”的意思是指载体能够在其已导入到的所给的宿主细胞中复制。在确保分泌由含载体的宿主细胞所表达的人BSSL/CEL的情况下，紧接着人BSSL/CEL DNA序列的上游可能提供编码信号肽的序列。该信号序列可以是与人BSSL/CEL DNA序列有关的天然信号序列或其它来源的信号序列。
载体可以是任何可进行重组DNA操作的载体，载体的选择常取决于它所导入的宿主细胞。因此，载体可以是自我复制载体，即载体可作为染色体外的实体存在，其复制不依赖于染色体的复制，上述载体的举例是质粒，噬菌体，粘性质粒，小染色体或病毒。另外，载体可以是一种当导入宿主细胞后，整合到宿主细胞基因组中并与其所整合的染色体一起复制的载体。适宜的载体的例子是细菌表达载体和酵母表达载体。本发明的载体可携带任何上述所说的本发明DNA分子。
本发明还涉及含有上述定义的可复制的表达载体的细胞。理论上，该细胞可以是任何类型的细胞，即，原核细胞，单细胞的真核生物或从多细胞生物，如哺乳动物中得到的细胞。哺乳动物细胞特别适宜于本发明的目的，下文还将对其作进一步讨论。
在另一重要方面，本发明涉及生产重组人BSSL/CEL的方法，其中，将编码人BSSL/CEL的DNA序列插入到能够在特定宿主细胞中复制的载体中，将所得的重组载体导入能在合适的条件下合适的培养基中或表面生长的宿主细胞中，以表达人BSSL/CEL并回收人BSSL/CEL。
用于生长细胞的培养基可以是任何适于本发明目的的常规培养基。适宜的载体可以是任何上述的载体，适当的宿主细胞可以是任何上述列出的细胞类型。用于构建载体并将其有效地导入宿主细胞的方法，可以是任何重组DNA领域已知的可达到本发明目的方法。由细胞表达的重组人BSSL/CEL可以分泌，即通过细胞膜输出但这取决于细胞的类型以及载体的组成。
如果人BSSL/CEL是由重组细胞在细胞内生产的，即不能由细胞分泌，那么可能用标准方法回收它们，该方法包括由机械方法如声处理或均浆，或由酶或化学方法破碎细胞，然后纯化。
为了能被分泌，在编码人BSSL/CEL的DNA序列前应加上一个编码信号肽的序列;在确保从细胞分泌人BSSL/CEL的情况下，以便将所表达的至少显著比例的人BSSL/CEL分泌到培养基中并将其回收。
本发明生产重组人BSSL/CEL目前优选的方法是使用能将人BSSL/CEL分泌到其奶中的基因突变的非人哺乳动物。使用基因突变的非人哺乳动物的优点是，可以以合理的价格得到高产率的重组人BSSL/CEL，特别是当非人哺乳动物是母牛时，将重组人BSSL/CEL用作为基于牛奶的产品中的营养添加物时在作为如婴儿代乳品的正常组分的奶中生产重组人BSSL/CEL就不必进行进一步的纯化。此外，在较高级的生物如非人哺乳动物中生产时，一般会导致正确地加工哺乳动物蛋白质，如上述描述的相应的转译后加工以及恰当的折叠。也可以得到大量基本纯化的人BSSL/CEL。
相应地，在另一重要的方面，本发明还涉及哺乳动物表达系统，它含有插入到非人哺乳动物奶蛋白质编码基因中的编码人BSSL/CEL的DNA序列以便形成杂交基因，在含所述杂交基因的成年雌性哺乳动物的乳腺中可表达该杂交基因。
编码人BSSL/CEL的DNA序列较好地是在序列目录中以SEQ ID NO1所示的DNA序列或基因组的人BSSL/CEL基因或其类似物。
一般认为，作为表达组织的乳腺和编码奶蛋白质的基因是特别适用于在基因突变的非人哺乳动物中生产异源蛋白质，象在乳腺中以高表达水平天然生产奶蛋白质一样。另外，奶容易收集并可大量得到。在本发明中，在生产重组人BSSL/CEL中使用奶蛋白质基因还具有的优点是，按照表达的调节和生产场所(乳腺)，可以在与其天然生产条件相似的条件下生产重组人BSSL/CEL。
本文中的术语“杂交基因”一方面是指含有上文所定义编码人BSSL/CEL的DNA序列，另一方面指能介导表达杂交基因产物的奶蛋白质基因DNA序列的DNA序列。术语“编码奶蛋白质的基因”是指能介导并表达杂交基因到所需组织即乳腺中表达的完整基因和其亚序列。通常，所述的亚序列至少含一个或多个启动子区域，转录起始位点，3′和5′非编码区及结构序列。编码人BSSL/CEL的DNA序列最好基本上没有如与其克隆后的DNA序列有关的原核序列，如载体序列。
最好在体外，用本领域已知的技术，将编码人BSSL/CEL的DNA序列插入到奶蛋白质基因中，形成杂交基因。另外，可通过体内同源重组将编码人BSSL/CEL的DNA序列插入。
通常，将编码人BSSL/CEL的DNA序列插入到所选择奶蛋白质的第一种外显子之一中或含有第一外显子和优选的据认为有调节重要性的5′侧面序列的基本部分的其有效亚序列中。
杂交基因较好地是含有编码信号肽的序列以便能将杂交基因产物正确地分泌到乳腺中。信号肽一般是通常发现存在于所述奶蛋白质基因中的或与编码人BSSL/CEL的DNA序列有关的。然而，能促使杂交基因产物分泌到乳腺中的其它信号序列也是可以的。当然，也应以上述方法融合杂交基因的各种成分以便正确地表达和加工基因产物。因此，通常应将所选择的编码信号肽的DNA序列精确地融合到编码人BSSL/CEL的DNA序列的N末端部分。在杂交基因的酪蛋白基因，如牛αS1酪蛋白和鼠β酪蛋白。本发明优选的基因是鼠WAP基因，发现该基因在不同基因突变动物的奶中，能提供高水平表达的大量外源人蛋白质(Hennighausen et al.，1990)。
与本发明表达系统相关的较好的另一序列是所谓能介导高水平表达的表达稳定化序列。大量事实说明上述稳定化序列在奶蛋白质基因的附近和下游存在。
插入到本发明表达系统的编码人BSSL/CEL的DNA序列可以是基因组的或合成的或其任何方法结合。为了得到令人满意的表达，已经发现一些表达系统需要含有内含子和其它调节因子(Hennighausen et al.，1990)。在一些情况下，最好将基因组结构而不是cDNA元素作为多肽编码成分导入载体构建体(Brinster et al.)。当使用cDNA为基础的载体时，内含子及外显子结构可能会导致得到较高的稳定状态的mRNA水平。
另一方面，本发明涉及杂交基因，它含有插入到编码非人哺乳动物奶蛋白质基因中的编码人BSSL/CEL的DNA序列，以及以上述方式插入到奶蛋白质基因中的DNA序列，以便在含该杂交基因的成年雌性哺乳动物的乳腺中使其得到表达。在上文已详细讨论了杂交基因及其组成。在构建如上文所公开的本发明的表达系统中，杂交基因构成了一个重要的中间产物。
另一方面，本发明涉及含上文所定义的表达系统的非人哺乳动物细胞。哺乳动物细胞最好是胚胎细胞或原核。用下文解释并在下文实施例具体说明的方法，将表达系统适当地插入到哺乳动物细胞中。
在另一重要方面，本发明涉及生产能表达人BSSL/CEL的突变基因非人哺乳动物的方法，包括将上文定义的本发明表达系统注射到哺乳动物的受精卵或胚胎细胞中，以便将表达系统掺入哺乳动物的幼体中并使所得的注射过的受精卵或胚胎发育成成年雌性哺乳动物。
可以用任何适当的技术，如在“Manipulating the Mouse Embryo”;(A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Perss，1986)中的描述完成将表达系统掺入哺乳动物的幼殖体中。例如，可以直接将数非分子的表达系统注射到受精卵中，如一个受精的卵细胞或其原核，或所选择哺乳动物的一个胚胎，然后将微注射的卵转移到假孕抚育母亲的输卵管中，并使其发育。通常，并不是所有注射过的卵都能发育成表达人BSSL/CEL的成年雌性。因此，从令人乐观的观点看，从下列繁殖孕育雌性动物的方法中，将有一半的哺乳动物是雄性。
一旦整合到幼殖体中，就可以以高水平表达编码人BSSL/CEL的DNA序列以便在所述哺乳动物的稳定种系中生产正确加工过的并有功能的人BSSL/CEL。
另外所需的是生产基因突变的非人哺乳动物的方法，所述的突变非人哺乳动物能表达人BSSL/CEL，而基本不能表达其自身的BSSL/CEL，该方法包括(a)破坏哺乳动物表达其自身的BSSL/CEL能力以便基本上不表达该哺乳动物的BSSL/CEL并用上述方法将上述的本发明表达系统或编码人BSSL/CEL的DNA序列插入到该哺乳动物的幼殖体中以便在该哺乳动物中表达人BSSL/CEL;和/或(b)用上述的本发明的表达系统或编码人BSSL/CEL的DNA序列取代哺乳动物的BSSL/CEL或其部分。
通过将突变导入负责BSSL/CEL表达的DNA序列中可以很方便地破坏哺乳动物的BSSL/CEL表达能力。上述突变含有使DNA序列没有阅读框的突变，或导入终止密码子或缺失DNA序列的一个或多个核苷酸。
用已知的同源重组理论，用上述的表达系统或编码人BSSL/CEL的DNA序列取代哺乳动物的BSSL/CEL基因或其部分。
在另一方面，本发明涉及用上述描述的方法制备的基因突变非人哺乳动物。
在最广泛的方面，本发明的基因突变哺乳动物并不限于任何特定的哺乳动物，哺乳动物通常选自于含有小鼠、大鼠、兔、羊、猪、山羊和牛的组中。为了大规模生产人BSSL/CEL，较大的动物如羊，山羊、猪及特别是牛由于其高产量生产奶，所以通常是优选的。然而，由于小鼠、兔和大鼠的操作更简单，且比牛能更快地得到基因突变动物，所以这些动物也是令人感兴趣的。
能生产人BSSL/CEL的上述基因突变动物的子代也在本发明范围内。
本发明另一方面也包括含有重组人BSSL/CEL的非人哺乳动物的奶。
在本发明另一方面，本发明涉及含有重组人BSSL/CEL，特别是上述本发明多肽的婴儿代乳品。可以通过将重组人BSSL/CEL或多肽以纯化或部分纯化的形式加到婴儿代乳品的正常组分中来制备婴儿代乳品。然而，优选的是从本发明上述的奶，特别是来源于牛的奶制备婴儿代乳品可以用传统方法制备婴儿代乳品，并且可含有任何必需的添加剂如矿物质，维生素等。
中，编码人BSSL/CEL的DNA序列通常含有它自己的终止密码子，但不是它自己的信息劈开处，和多聚腺苷化位点。编码人BSSL/CEL的DNA序列下游，一般保留奶蛋白质的mRNA加工序列。
预计许多因子都会影响特定杂交基因的实际表达水平。启动子的能力以及上述的其它调节序列，表达系统在哺乳动物基因组中的整合位点，编码人BSSL/CEL的DNA序列在奶蛋白质编码基因中的整合位点，具有转录后调节的能力的成分以及其它类似因子均对所得的表达水平起极重要作用。在了解各种因子对杂交基因表达水平影响的基础上，本领域专业人员会知道如何设计适用于本发明目的的表达系统。
由乳腺分泌各种不同的奶蛋白质。主要存在两类奶蛋白质，即酪蛋白和乳清蛋白。来自不同种的奶的组分就这些蛋白质的质量和数量变化。大多数非人哺乳动物产生3种不同的酪蛋白，即α酪蛋白，β-酪蛋白和k酪蛋白。大多数普遍的牛乳清蛋白是α乳清蛋白和β乳清蛋白。Clark等人(1987)进一步描述了各种来源奶的组成。
可以使用的奶蛋白质基因来自于相同于要插入了该表达系统的种。或者也可以是从另一个种得到的。本文已显示将基因特定地表达到乳腺中的调节成分是种范围内功能交叉的，它们可能起因于共同的祖先(Hennighausen et al.，1990)。
在构建本发明表达系统时所用的编码奶蛋白质基因或其有效亚序列的适当例子一般是在各种哺乳动物的乳清蛋白中发现的，如乳清酸性蛋白(WAP)基因，最好来自鼠，以及β乳球蛋白基因，最好来自羊。也可以发现适于基因突变生产人BSSL/CEL的各种来源实施例实施例1CEL基因的基因组结构，序列分析及染色体定位如果没有另外提到，就使用标准分子生物学技术(Maniatis et al.，1982，Ausubel et al.，1987;Sambrook et al.，1989)。
分离基因组重组体用各种亚克隆的cDNA限制片段(Nilsson et al.，1990)作为探针，用[α-32P]dCTP经寡聚标记技术(Feinberg et al.，1983)标记，通过噬菌斑杂交筛选两种不同的人基因组噬菌体文库，λDASH(Clonentech Laboratories Inc.，Palo Alto，Ca，USA)和λEMBL-3SP6/T7(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。
基因组克隆的图谱，亚克隆和定序用各种限制酶消化阳性克隆，在1%琼脂糖凝胶上电泳，然后将其真空转移(Pharmacia LKB BTG，Uppsala，Sweden)到尼龙膜上。将膜与各种cDNA探针杂交。用等速电泳方法( fverstedt et al.，1984)分离与探针杂交的限制片段。将＜800bp的较小片段直接插入到M13mp18，M13mp19，M13BM20或M13BM21载体中并用大肠杆菌TG1作为宿主细胞将其定序，而用大肠杆菌DH5α作为宿主细菌，而将较大的片段亚克隆到pTZ18R或pTZ19R载体中，并将其进一步消化。(相应地生产在下面实施例2中所用的质粒pS309，pS310，和pS451)。在杂交中，将一些分离的片段也用作探针。用Klenow酶通过双脱氧链末端方法(Sanger et al.，1977)以及或者特定寡核苷酸M13通用定序引物确定全部核苷酸序列。用Sj
berg等人(1989)描述的软件MS-Edseq从放射自显影得到序列资料。用从UWGCG软件包装得到的程序(Devereux et al.，1984)分析该序列。
引物延伸用异硫氰酸盐鈲-CsCl方法(Chirgwin et al，1979)从人胰腺，哺乳乳腺和脂肪组织中分离总RNA。用总RNA和一个反义26-体寡核苷酸(5′-AGGTGAGGCCCAACACAACCAGTTGC-3′)，nt33-58位点，按照Ausubel等人(1987)所述完成引物延伸。在30μl的0.9M NaCl，0.15M Hepes PH7.5和0.3M EDTA中于30℃过夜完成引物与20μg总RNA的杂交。在用反转录酶的延伸反应后，通过6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析延伸产物。
体细胞杂交将从NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository(Coriell Institute for Medical Research Camden，NJ)得到的16个人-啮齿类体细胞杂交细胞系的DNA用于CEL基因的染色体测定。经由GM09940得到的人-小鼠体细胞杂交物GM09925是从人胎男性成纤维母细胞(IMR-91)与胸苷激酶缺陷型小鼠细胞系B-82(Taggart et al.，1985;Mohandas et al.，1986)融合得到的。GM10324与GM02860与HPRT和APRT缺陷型小鼠细胞系A9(Callen et al.，1986)杂交，而杂交物GM10611是从反转录载体SP-1感染的人淋巴母细胞细胞系GM07890与中国仓鼠卵巢细胞系UV-135(Warburton et al.，1990)微细胞融合得到的。杂交物GM10095是将带有平衡的46，x，t(x;9)(q13;34)核型的雌性淋巴细胞与中国仓鼠细胞系CHW1102(Mohandas et al.，1979)融合得到的。表1中列出了经细胞遗传学分析以及Southern印迹分析和原位杂交分析确定的杂交细胞系的人染色体内含物。用EcoRI消化从小鼠，中国仓鼠和人亲代细胞系以及16个杂交细胞系中分离的高分子量DNAs，在0.8%的琼脂糖凝胶中分馏并将其转移到尼龙滤膜上。经寡聚物标记(Feinberg and Vogelstein，1983)制备[α-32P]dCTP标记的CEL cDNA探针并将其与滤膜杂交。在65℃，分别于6×SSC/0.5%SDS和2×SSC/0.5%SDS中将滤膜各洗涤60分钟。
多聚酶链反应用从白细胞分离的全部人基因组DNA，来自体细胞杂交物和部分阳性基因组重组体的DNA以及来自哺乳期人乳腺和人胰腺的总RNA扩增其外显子10和外显子11。使用2μg的DNA，在表2中列出了所用的引物。在100μl体积[10mM Tris-HCl，PH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，各200μM的dNTP，100μg/ml明胶，各100pmol的引物，1.5U Taq DNA多聚酶(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，CT，USA)]及全部引物对的退火温度55℃完成了30个循环的PCR。用结合的互补DNA(cDNA)及PCR方法扩增RNA序列。在42℃，经30分钟，在含50mM Tris-HCl，PH8.3，50mM KCl，10mM MgCl2，10μg/ml BSA，各1mM dNTP，500ng寡(dt)12-18，40U核糖核酸酶抑制剂，及200U反转录酶(MoMuLV)，(BRL，Bethesda Research Laborataries，N.Y.，USA)的40μl溶液中，用共10μg RNA合成cDNA。将该cDNA沉淀并再悬浮于25μl H2O中;按上文所述扩增其中的2μl。在2%琼脂糖凝胶上分析扩增的片段。进一步亚克隆其中的一些片段，并将其定序。
人CEL基因的基因结构在每个基因组文库中，筛选106个重组体并且这些筛选物中产物数个阳性克隆，将它们全部分离出来并作图。进一步分析称作λBSSL1和λBSSL5A的两个克隆。用几种酶进行限制酶消化Southern印迹分析，接着用cDNA探针杂交，说明λBSSL5A克隆覆盖了全部CEL基因，λBSSL1克隆覆盖了5′-的一半和5′侧区域的10kb(图1)。这两个克隆一起共覆盖了约25kb的人基因组。
亚克隆及限制酶消化后，得到适宜定序的片段，并可以确定CEL基因的全部序列，包括1640bp的5′侧区域的41bp的3′侧区域。这些资料说明，人CEL基因(SEQ ID NO1)跨9850bp的区域，含由10个内含子间隔的11个外显子(图1)。这意味着外显子和特定的内含子是相当小的。事实上，外显子1-10的大小范围分别从87-204bp，外显子11是841bp长。内含子的大小范围分别从85-2343bp。在表3中可以注意到，所有的外显子/内含子界线都遵守AG/GT法则，并与Mount等人(1982)指出的一致序列符合得很好。将CEL基因的编码部分与cDNA(Nilsson et al.，1990)相比，仅发现核苷酸序列中有一个不同，在外显子1中第2nt是ac，在cDNA序列中是aT。由于该位置是在转译起始密码子ATG上游的10nt，所以这种差别并不影响氨基酸序列。重复DNA因子的7个Alu类成员居定序区，标记为Alu1-Alu7(5′-3′)(图1)，其中一个在5′侧区域，其它6个在CEL基因内。
转录起始位点和5′侧区域为了绘制人CEL基因转录起始位点的图谱，用来自人胰腺、哺乳期乳腺和脂肪组织的总RNA完成引物延伸分析。结果表明，主要的转录起始位点位于起始因子甲硫氨酸上游的12bp，而一个较小的起始位点位于8个碱基处。在胰腺和哺乳期乳腺中的转录起始位点相同，而在脂肪组织中未检测到信号(图2)。定序区包括5′侧DNA的1640nt。以序列相似性为基础，在转录起始位点的上游发现了一个TATA盒的类似序列，CATAAAT(图4)。在该区域既没有CAAT盒结构也没有GC盒。
计算机筛选两个链的5′侧序列作为其它乳腺-和胰腺特异性基因转录子结合序列的核苷酸序列，发现几个推测的识别序列，见图4。CEL基因的染色体定位在人对照DNA中，CEL cDNA探针检测到4个约13kb，10kb，2.2kb及2.0kb的EcoRⅠ片段，在小鼠及仓鼠对照DNA中，分别检测到约25kb和8.6kb的单一片段。在杂交克隆中，人CEL基因序列的存在仅与人第9染色体的存在有关(表1)。被分析的16个杂交物仅有1个是人CEL基因阳性;该杂交物含有仅作为人染色体的第9染色体。没有发现有关该染色体定位的不一致性，而有关其它任何染色体定位的不一致性至少有两个(表1)。为了进一步亚定位CEL基因，我们利用一个人-中国仓鼠杂交体(GM10095)，它保留一个作为唯一人DNA的der(9)易位染色体(9pter→9q34∶Xq13→Xqter)。在该杂交体中，用Southern印迹检测不到任何CEL基因序列，这说明，CEL基因保留在9q34-qter区域。
实施例2 构建表达载体为了构建用于在来自基因突变动物的奶中生产重组人CEL，使用下列方案(图5)。
用上文所述的方法得到三个含人CEL基因不同部分，以pTZ为基础的质粒，pS309，pS310，和pS311。质粒pS309含一个SphI片段，该片段覆盖从5′非转录区到部分第4内含子的CEL基因。质粒pS310含一个SacI片段，该片段含从部分第1内含子到部分第6内含子的CEL基因。第三，质粒pS311含一个BamHI片段，该片段含第5内含子主要部分及内含子/外显子结构剩余部分的CEL基因变异体。在该质粒中，将一般编码16个重复片段的外显子11的重复序列突变，以编码有9个重复的平截变异体。
另一个质粒pS283含有克隆到pUC 19HindⅢ和SacI位点的部分人CEL cDNA，用该质粒融合基因序列。用pS283也可得到一个很方便的限制酶位点，KpnI，该位点位于CEL5′非转译的前导序列。然后用NcoI和SacI消化质粒pS283，分离一个约2.7kb的片段。用NcoI和BspE1消化质粒pS309，分离出一个含CEL基因5′部分的约2.3kb的片段。用BspE I和SacI消化质粒pS310分离出一个含CEL基因部分中间区域的约2.7kb的片段。连接这3个片段，并将其转化到感受态大肠杆菌菌株TG2中，用氨苄青霉素选择分离转化体。从大量的转化体中制备质粒，含有所需的构建体的一个称为pS312的质粒(图6)用于进一步实验。
为了得到pS311的修饰物，其中将位于终止密码子下游的BamHI位点变成SalI位点以便于进一步克隆，使用下列方法。用部分BamHI消化，使pS311线性化。分离线性化的片段，并插入将BamHI转变成SalI位点(5′-GATCGTCGAC-3′)并由此破坏BamHI位点的一个合成DNA接头。由于有两个整合合成接头的潜在位置，所以用限制酶裂解分析所得的质粒。分离在外显子11下游所需位置插入有接头的质粒并命名为pS313。
为了得到含CEL基因组序列并编码平截CEL变异体的表达载体构建体，使用一个用于中间步骤并在定位期间在乳腺细胞中进行组织特异性表达的质粒pS314。质粒pS314含有一个作为NotI片段克隆的来自鼠乳清酸性蛋白质(WAP)基因(Campbell etal，1984)的基因组片段。该基因组片段有约4.5kb的上游调节序列(URS)，完整的可转录的外显子/内含子区域以及约3kb的最后一个外显子的下游序列。唯一的Kpn I位点位于天然WAP转译起始密码子上游的第一外显子24bp处。另一个唯一的限制酶位点是位于外显子3中的Sal I位点，在pS314中，通过消化破坏该Sal I位点，用klenow填平并再连接。代之以在外显子1中Kpn I位点的下游直接导入一个新的Sal I位点。通过Kpn I消化，并在该位置导入退火的合成寡聚物SYM2401 5′-CGTCGACGTAC-3′和SYM24025′-GTCGACGGTAC-3′完成上述方案(图8)。用下列方法将人CEL基因组序列插入这两个位点Kpn I和Sal I之间。首先，用Kpn I和Sal I消化pS314，并电泳分离代表裂解质粒的片段。第二步，用Kpn I和BamH I消化pS312并分离人CEL基因的5′部分的约4.7Kb片段。第三步，用BamH I和Sal I消化pS313并分离人CEL基团的3′部分。连接这三个片段，并转化到感受态大肠杆菌细菌中，在氨苄青霉素选择后分离转化体。从几个转化体制备质粒并用限制酶图谱和序列分析仔细分析。确定出代表所需表达载体的质粒并命名为pS317。
为了构建编码全长CEL的基因组CEL表达载体，按下列步骤修饰pS317(图5)。首先，用HindⅢ和Sac I消化含第5内含子到第11外显子下游人CEL基因的约5.2kb BamH I片段的pTZ18R质粒(Pharmacia)，pS451。该消化产生一个约1.7kb的片段，它包括从内含子9中的HindⅢ位点到外显子11中的Sac I位点。第二步，用SaCI和Sal I消化质粒pS313，分离含外显子113′部分和所产生的Sal I位点的71bp片段。第三步，从pS317中分离作为约20kb Sal I/HindⅢ片段的WAP/CEL重组体基因以及质粒序列的剩余部分。连接这3个片段并转化到细菌中。从几个转化体制备质粒。用各种限制酶消化质粒并进行序列分析。鉴定出一个含所需重组基因的质粒。将该最终的表达载体命名为pS452(图7)。
为了除去原核质粒序列，用Not I消化pS452。然后用琼脂糖电泳分离重组载体元素，该重组载体元素由位于人CEL基因组片段侧面的鼠WAP序列组成。在注射到小鼠胚胎中之前，用电洗脱进一步纯化分离的片段。
在图8中列出了用于在基因突变动物乳腺中表达的重组WAP/CEL基因。
寄存根据布达佩斯条约，已经将下列质粒寄存于DSM(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen)
<p>实施例3 基因突变动物的繁殖按照实施例2，从质粒pS452中分离Not I片段。该DNA片段含有与编码人BSSL/CEL的基因组序列相连的鼠WAP启动子。将分离的片段以3ng/μl的浓度注射到350C57B1/6JXCBA/2J-T2胚胎的前核中，该胚胎是从为了排卵过盛而用5IU怀孕母马的血清促性腺激素灌注的供体小鼠中得到的。C57B1/6JXCBA/2J-f1动物是从Bomholtgard Breeding和Research Ceutre LTD，Ry，Denmark得到的。从输卵管收集胚胎后，在M2培养基(Hogan et al.，1986)中从用透明质酸酶处理的一群细胞中分离它们。洗涤胚胎后，将其转移到培养基M16(Hogan et al.，1986)中，并保持在含5%CO2气体的孵育箱中。用Narishigi水压显微操作器和装配Nomarski镜片的Nikon倒转显微镜，在轻石蜡油下，M2微滴中完成注射。注射后，将看起来健康的胚胎植入腹腔给过0.37ml2.5%阿佛丁的假孕C57B1/6JXCBA/2J-f1受体中。用来自尾活体解剖标本DNA的PCR分析鉴别已整体转移基因的小鼠，该标本是从出生3个星期的动物得到的。用Southern印迹分析确认阳性结果。
实施例4在基因突变小鼠中表达BSSL/CEL通过分析从解剖尾样品制备的DNA，鉴别基因突变小鼠。将组织样品与蛋白酶k一起培养并用酚/氯仿提取。如果存在代表表达载体片段的异源导入DNA，测将分离的DNA用于带引物的多聚酶链反应以扩增特异性片段。再用DNA杂交试验分析动物以确定PCR数据并检测可能的重排，整合载体元素的结构，并获得关于整合载体元素拷贝数的资料。
在一组实验中，用两种方法分析18个小鼠所得的结果说明了1个小鼠携带来自pS452的异源DNA载体元素。PCR分析和杂交实验的结果是相同的(图9)。
然后将鉴别的携带载体DNA元素的小鼠(建立者动物)配对，并用同样方法分析F1仔的基因空变。
用2IU催产素腹腔注射雌性哺乳期动物，10分钟后，用0.40ml 2.5%阿佛丁腹腔麻醉。经一硅化管，将一个奶收集装置与奶头相连，缓缓按摩乳腺，将奶收集到1.5ml Eppendorf管中。每只小鼠的奶量在0.1和0.5之间变化，这取决于哺乳的天数。
经SDS-PAGE，转移到硝酸纤维素滤膜上，并与产生抗天然人BSSL/CEL的多克隆抗体一起培养来分析重组人BSSL/CEL的存在。得到的结果说明，在基因突变小鼠奶中表达有重组人BSSL/CEL。图10说明在基因突变小鼠奶中存在重组人BSSL/CEL该谱带在约116.5。
产生稳定的基因突变动物种系。
用相似的方法，也可以制备能表达人BSSL/CEL的其它基因突变动物如牛或羊。
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图1CEL基因位点。表示两个部分重叠的克隆λBSSL1和λBSSL5A的位置及限制酶图谱。在下面表示外显子-内含子结构以及所用的限制酶位点。编号1-11的盒表示外显子。Asp＝Asp700，B＝BamHI，E＝EcoRI，S＝SalI，Sd＝SalI，Sp＝SphI以及X＝XbaI。用粗箭头表示Alu重复元素的位置和方向。a-h表示不同的亚克隆片段。
图2来自人哺乳期乳腺，胰腺和脂肪组织的RNA的引物延伸分析。用一个末端放射标记的26聚体聚寡核苷酸(与CEL基因的33到58nt位置互补)引发RNA的反转录。A泳道是分子大小标记物(测序梯子)，B泳道是胰RNA，C泳道是脂肪组织RNA，D泳道是乳腺RNA。
图3人CEL及大鼠CEL基因5′侧区域的点标绘分析。将同源区标记为A-H，并写出了代表这些部分的序列，上面的是人的，下面是大鼠的。
图4人CEL基因5′侧序列的分析。推测的识别序列是代表互补链的重点画线或画线的。粗字表示与rCEL同源的位置(区域A-H)。用点画线表示TATA盒。
有两个与糖皮质激素受体结合位点一致序列，GGTACANNNTGTTCT有80%相似性的序列(Beato，M.，1989)，第一个在互补链上-231nt位(1A)，第2个在-811nt位(1B)。此外，在nt位-861(2)有一个与雌激素受体结合位点的一致序列AGGTCANNNTGACCT有87%相似性的序列(Beato，M.，1989)。Lubon和Henninghausen(1987)已经分析了乳清酸性蛋白质(WAP)基因的启动子和5′侧序列，并建立了有关哺乳乳腺细胞核蛋白质结合位点。其中之一，在所研究的大量奶蛋白质基因中，如大鼠α-乳清蛋白基因(Qasba et al.，1984)，及大鼠α-酪蛋白基因(Yu-Lee et al.，1986)，存在11bp的保守序列，AAGAAGGAAGT。在CEL基因的5′侧区域，在互补链nt位-1299(3)上有一个与该保守序列有82%相似性的序列。
在对β-酪蛋白基因调节的研究中，在怀孕或泌乳的小鼠核提取物中发现了一个组织特异性的乳腺因子(MGF)，并鉴定了它的识别序列(ANTTCTTGGNA)。在人CEL基因5′侧区域，有两个序列，一个在互补链nt位-368(4A)，另一个在nt位-1095(4B)，它们两者与MGF结合位点的一致序列均有82%的相似性。除了在5′侧区有这两个推测的MGF结合位点外，在内含子Int275的互补链上有一个与MGF结合位点的一致序列有100%同一性的序列，AGTTCTTGGCA。
此外，有四个与大鼠胰特异性增强子元素GTCACCTGTGCTTTTCCCTG有65%相似性的序列(Boulet et al.，1986)，一个在nt位-359(5A)，第二个在nt位-718(5B)，第3个在nt位-1140(5C)，最后一个在nt位-1277(5D)。
图5生产质粒pS452的方法。有关详细说明参见实施例2。
图6质粒pS312的图示结构。
图7质粒pS452的图示结构。
图8代表如在实施例2中所述，在WAP基因的第1外显子中自然导入人BSSL/CEL基因组结构的真实结构图。
图9A.图示说明用于鉴别基因突变动物的PCR引物的定位。5′引物位于WAP与BSSL/CEL之间融合的上游-148bp位开始的WAP序列内。3′引物位于融合点下游终点398bp的第1BSSL/CEL内含子中。
B.所用的PCR引物序列。
C.琼脂糖凝胶表明潜在建立者动物PCR分析的典型分析。M分子量标记物。泳道1从质粒pS452生产的对照PCR产物。泳道2-13用来自潜在建立者动物的DNA制品所进行的PCR反应。
图10免疫印迹分析来自基因突变小鼠种的奶中有关pS452重组鼠WAP/人CEL基因。在SDS-PAGE上分离蛋白质，转移到Immobilon膜(Millipor)上，用高纯度人天然CEL产生的多克隆兔抗体，接着用碱性磷酸酶标记的猪抗兔IgG(Dakopatts)反应，肉眼观察。泳道1低分子量标记物，分别106，80，49.5，32.5，27.5和18.5KDa。泳道2高分子量标记物分别205，116.5，80和49.5KDa。泳道325ng来自人奶的纯化非重组CEL。泳道4来自CEL基因组突变小鼠，以1∶10稀释的2μl奶样品。泳道5和6来自两个不同非CEL基因突变小鼠以1∶10稀释的2μl奶样品，它们作为对照样品。
序列目录(1)一般资料(ⅰ)申请人(A)名字ABASTRA(B)街道Kvarnbergagatan 16(C)城市Sodertalje(E)国家Sweden(F)邮政编码(ZIP)S-151 85
(G)电话+46-8-553 26000(H)传真+46-8-553 28820(I)电传19237 astra S(ⅱ)发明题目新的DNA序列(ⅲ)序列数1(ⅳ)计算机可读形式(A)介质类型Floppy盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作程序PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release＃1.0，Version ＃1.25(EPO)(ⅵ)在先申请资料(A)申请号SE 9201809-2(B)申请日1992，6，11(ⅵ)在先申请资料(A)申请号SE 9201826-6(B)申请日1992，6，12(ⅵ)在先申请资料(A)申请号SE 9202088-2(B)申请日1992，7，3(ⅵ)在先申请资料(A)申请号SE 9300902-5(B)申请日1992，3，19
(2)SEQ ID NO1的资料(ⅰ)序列特征(A)长度11531一个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅵ)来源(A)生物人类(F)组织种类乳腺(ⅸ)特征(A)名字/关键CDS(B)位置连接(1653..1727，4071..4221，4307..4429，4707..4904，6193..6323，6501..6608，6751..6868，8335..8521，8719..8922，10124..10321，10650..11394)(ⅸ)特征(A)名字/关键不光滑-肽(B)位置连接(1722..1727，4071..4221，4307..4429，4707..4904，6193..6323，6501..6608，6751..6868，8335..8521，8719..8922，10124..10321，10650..11391)(D)其它资料/EC－数＝3.1.1.1/产品＝“胆汁盐刺激的脂酶”
(ⅸ)特征(A)名称/关键5′UTR(B)位置1…1..640(ⅸ)特征(A)名称/关键TATA－信号(B)位置1611…1617(ⅸ)特征(A)名称/关键外显子(B)位置1641…1727(ⅸ)特征(A)名称/关键外显子(B)位置4071…4221(ⅸ)特征(A)名称/关键外显子(B)位置4307…4429(ⅸ)特征(A)名称/关键外显子(B)位置4707…4904(ⅸ)特征(A)名称/关键外显子(B)位置6193…6323(ⅸ)特征(A)名称/关键外显子(B)位置6501…6608
(ⅸ)特征(A)名称/关键外显子(B)位置6751…6868(ⅸ)特征(A)名称/关键外显子(B)位置8335…8521(ⅸ)特征(A)名称/关键外显子(B)位置8719…8922(ⅸ)特征(A)名称/关键外显子(B)位置10124…10321(ⅸ)特征(A)名称/关键外显子(B)位置10650…11490(ⅸ)特征(A)名称/关键3′UTR(B)位置11491…11531(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1
权利要求
1.编码具有生物学功能的BSSL/CEL并含有内含子序列的DNA分子。
2.根据权利要求1的DNA分子，其在序列目录中以SEQ ID NO∶1列出。
3.根据权利要求2的DNA分子的类似物，其含有内含子序列，并在严紧杂交条件下，与序列目录中以SEQ ID NO∶1所示的DNA序列或其特定部分杂交。
4.一个可复制的表达载体，它携带并能促进表达权利要求1-3任何一个DNA分子，并编码人BSSL/CEL。
5.根据权利要求4的载体，能编码有生物学功能的BSSL/CEL，并包含指导其在非人动物乳腺中表达的调节元素。
6.根据权利要求4的载体，它是载体pS452(DSM7499)。
7.从多细胞生物得到的并含有权利要求4-6任何一个载体的细胞。
8.生产人BSSL/CEL的方法，包括(a)将权利要求1-3所限定的任何一个DNA分子插入到能在特定宿主细胞中复制的载体中;(b)将所得的重组载体导入宿主细胞;(c)使所得的细胞在培养基中或其上生产，以表达多肽;及(d)回收多肽。
9.哺乳动物表达系统，包括可在含所述杂交基因的成年雌性非人哺乳动物乳腺中表达的杂交基因，在表达杂交基因时可生产人BSSL/CEL，所述杂交基因是通过将权利要求1-3的任何一个DNA分子插入到调节非人哺乳动物奶蛋白质基因的基因中生产的。
10.在权利要求9中限定的杂交基因。
11.含权利要求9所限定的表达系统的哺乳动物细胞。
12.权利要求11的非人哺乳动物细胞是胚胎细胞。
13.生产能表达人BSSL/CEL的基因突变非人哺乳动物的方法，包括(a)将如权利要求9所限定的表达系统导入非人哺乳动物的受精卵或胚胎细胞中以便将表达系统掺入到哺乳动物幼殖体中，(b)将所得的受精卵或胚胎导入成年雌性非人哺乳动物中发育。
14.生产能表达人BSSL/CEL并基本不表达哺乳动物自身BSSL/CEL的基因突变非人哺乳动物的方法，包括(a)破坏哺乳动物的哺乳动物BSSL/CEL表达能力以便基本上不表达哺乳动物的BSSL/CEL并将如权利要求9所限定的表达系统用所述方法插入哺乳动物幼殖体中以便在哺乳动物中表达人BSSL/CEL;和/或(b)取如权利要求9中所限定的表达系统代替哺乳动物的BSSL/CEL基因或其部分。
15.在其基因组中含有权利要求1-3任何一个DNA分子的基因突变非人哺乳动物。
16.根据权利要求15的基因突变非人哺乳动物，其中DNA分子存在于哺乳动物的幼殖体。
17.根据权利要求15或16的基因突变非人哺乳动物，其中DNA分子存在于哺乳动物的奶蛋白质基因中。
18.用权利要求13或14的方法制备基因突变非人哺乳动物。
19.权利要求15至18任何一个基因突变非人哺乳动物是选自小鼠、大鼠、兔、羊、猪和牛。
20.权利要求15-19任何一种基因突变非人哺乳动物的子代。
21.从权利要求15-20任何一种基因突变哺乳动物中得到的奶。
22.一种婴儿代乳品，含有权利要求21所定义的奶。
23.生产婴儿代乳品的方法，用权利要求1-3任何一个DNA分子编码的多肽补充婴儿食品配方。
24.用权利要求1-3任何一个DNA分子生产人BSSL/CEL。
25.根据权利要求24的用途，生产表达人BSSL/CEL的转基因非人哺乳动物。
26.根据权利要求24的用途，生产含人BSSL/CEL的奶，该奶是从基因突变的非人哺乳动物得到的。
27.根据权利要求24的用途，生产婴儿代乳品，包含有含人BSSL/CEL的奶，所述奶是从基因突变的非人哺乳动物得到的。
28.用权利要求1-3任何一个DNA分子制造治疗与外分泌胰不足有关的病理学状态的药物。
29.根据权利要求28的用途，制造治疗囊性纤维病变的药物。
30.根据权利要求28的用途，加工治疗慢性胰炎的药物。
31.根据权利要求28的用途，加工治疗吸收障碍的药物。
32.根据权利要求28的用途，加工治疗脂溶性维生素吸收障碍的药物。
33.根据权利要求28的用途，加工治疗由于生理学因素造成吸收障碍的药物。
全文摘要
本发明涉及包含内含子序列并编码根据作用位点称之为胆汁盐刺激脂酶(BSSL)或羧酸酯脂酶(CEL)人蛋白质的DNA分子。可以用该DNA分子生产重组人BSSL/CEL，尤其是用基因突变的非人哺乳动物生产。可以将该重组人BSSL/CEL作为取代人奶喂养婴儿的婴乳代乳品成分，或将其用于生产抗吸收障碍，囊性纤维性变及慢性胰炎的药物。
文档编号A23C9/20GK1086262SQ9310871
公开日1994年5月4日 申请日期1993年6月11日 优先权日1992年6月11日
发明者K·G·比约塞尔, P·N·I·卡尔森, C·S·M·恩纳贝克, S·L·汉森, U·F·P·里德堡, J·A·尼尔森, I·B·F·特奈尔 申请人:阿斯特拉公司