分子制造
【专利说明】分子制造
[0001] 发明背景
[0002] 合成生物学是相对新的研宄领域，其应用生物化学和工程科学以设计和构建自然 中未发现的新的细胞功能和体系。为了实现这些宏伟目标，最重要的是简化分子克隆工具 的设计和使用。
[0003] 发明概沐
[0004] 本文提供了通过组装多种预制盒（pre-madecassette)来制造多种质粒的方法， 所述盒含有相互杂交的互补末端，从而产生能够被引入宿主细胞的分子的产生。因此，选择 由含盒的质粒分子构成的具有期望特性的宿主细胞代表了超越现存分子克隆工具的显著 改进。本文还提供了用于进行所述方法的试剂盒（kit)。
[0005] 附图简沐
[0006] 本领域技术人员将理解，下述附图仅用于阐释目的。附图不旨在以任何方式限制 本教导的范围。
[0007] 图1示意性阐释了方法中所使用组分的一些特征。
[0008] 图2示意性阐释了所述方法的一种实施。
[0009] 图3示意性阐释了可如何组装含5个盒的载体。
[0010] 图4展示了示例性蛋白表达载体构建试剂盒的一些可行组分（N-末端纯化标签）。
[0011] 图5展示了示例性蛋白表达载体构建试剂盒的一些可行组分（C-末端纯化标签）。
[0012] 图6展示了示例性蛋白表达载体构建试剂盒的一些可行组分（C-末端纯化标签和 N-末端纯化标签）。
[0013] 图7展示了可被用于制造双顺反载体的示例性试剂盒的一些可行组分。
[0014] 图8展示了可被用于制造蛋白相互作用筛选载体的示例性试剂盒的可行组分。
[0015] 图9展示了可被用于制造蛋白相互作用筛选载体的另一种试剂盒的可行组分。
[0016] 图10展示了可如何构建含有每种可能的被选择盒的组合的文库。
[0017] 图11展示了使用盒组装方法制造Pfu噬菌体pol基因。
[0018] 图12展示了随机挑选的克隆的菌落PCR结果。泳道M-Ikb标记；顶行，泳道1-16， 正确大小的pol基因（4个pol片段+载体；菌落太多无法计数）；底行，泳道1-8 (无pol 片段+载体，60个菌落）；底行，泳道9-16 (3个pol片段+载体，35个菌落）。
[0019] 图13是概念原理证明目标载体的示意性阐释。
[0020] 图14展示了用于原理证明的克隆A、B和C的限制消化。
[0021] 图15展示了用于原理证明的克隆A、B和C的序列比对。
[0022]
[0023] 在更详细描述示例性实施方式之前，给出下列定义以阐释和定义说明书中所用术 语的含义和范围。
[0024] 数值范围包括限定该范围的数值。除非另有说明，分别地，核酸是以5'到3'方向 从左往右书写，氨基酸序列是以氨基到羧基方向从左往右书写。
[0025] 除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属的领域的 普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton,等人，DICTIONARYOFMICROBIOLOGY ANDMOLECULARBIOLOGY,第 2 版，JohnWileyandSons,NewYork(1994)，和Hale& Markham,THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY,HarperPerennial,N.Y. (1991)向 技术人员提供了许多本文所用术语的一般含义。尽管如此，为了清楚和容易参考，下文对某 些术语进行定义。
[0026] 必须注意：当在本文和所附权利要求中使用时，除非上下文明确指相反情况出，否 则不使用数量词时涵盖复数的指代物。例如，术语"盒"指一个或两个或更多个盒，即单个盒 和多个（至少2个）盒。还应注意：权利要求可撰写成排除任何任选元素。因此，该陈述旨 在作为使用与权利要求元素的引述相联系的这些排他性术语如"仅仅"、"仅"等或使用"否 定性"限制的在先基础。
[0027] 术语"核苷酸"旨在包括那些不仅含有已知嘌呤和嘧啶碱基以及含有已被修饰的 其它杂环碱基的部分（moiety)。这些修饰包括甲基化的嗓呤或喃啶，酰基化的嗓呤或喃啶， 烷基化的核糖或其它杂环。此外，术语"核苷酸"包括那些包含半抗原或荧光标记以及可以 不仅包含常规核糖和脱氧核糖的糖，也可以包含其它糖的部分。经修饰的核苷或核苷酸也 包括对糖部分的修饰，例如，其中一个或多个羟基被卤素原子或脂肪族基团取代，官能化为 醚、胺等。
[0028] 术语"核酸"和"多核苷酸"在本文中可以互换使用，其用于描述任意长度的聚合 物，例如，多于约2个碱基，多于约10个碱基，多于约100个碱基，多于约500个碱基，多于 1000个碱基，高达约10, 000个或更多碱基构成的核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸或核糖核 苷酸，并可酶促地或合成地生产（例如，如美国专利号5, 948, 902和其中所引用的参考文献 中所述的PM)，其可以与天然存在的核酸以序列特异性的方式进行杂交，该方式与两种天 然存在的核酸杂交类似，例如，能够参与沃森-克里克碱基配对相互作用。天然存在的核苷 酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶（分别为G、C、A、T和U)。DNA和RNA分 别具有脱氧核糖和核糖骨架，但PNA的骨架由通过肽键相连的重复N-(2-氨乙基）-甘氨酸 单元构成。在PNA中，各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键连接到骨架上。锁核酸（LNA) (通常被称为无法接近的RNA)是经修饰的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分被连接2' 氧和4'碳的额外桥修饰。所述桥"封锁"了 3'-内（北（North))构象的核糖，这通常发现 于A-型双链体（duplex)中。只要期望，可将LNA核苷酸与寡核苷酸中的DNA或RNA残基 混合。术语"非结构化核酸"或"UNA"是含有相互之间结合的稳定性较低非天然核苷酸的 核酸。例如，非结构化核酸可含有G'残基和C'残基，其中这些残基分别对应于G和C的非 天然存在形式（即类似物），它们稳定性较低地相互碱基配对，但保留与天然存在的C和G 残基碱基配对的能力。US20050233340中描述了非结构化核酸，其中关于UNA的公开内容通 过引用被并入本文。
[0029] 本文所使用的术语"寡核苷酸"表示长度为约2-200个核苷酸，直至500个核苷酸 的单链核苷酸多聚体。寡核苷酸可以是合成的或者可通过酶法制成，在一些实施方式中， 其长度为4-150个核苷酸。寡核苷酸可含有核糖核苷酸单体（即，可以是寡核糖核苷酸） 或脱氧核糖核苷酸单体。例如，寡核苷酸的长度可以为10-20、11-30、31-40、41-50、51-60、 61-70、71-80、80-100、100-150 或 150-200 个核苷酸。
[0030] 本文所使用的术语"引物"指在纯化的限制消化物中天然存在的或者通过合成产 生的寡核苷酸，当被放置在与核酸链互补的引物延伸产物的合成被诱导的条件下时，即存 在核苷酸和诱导剂（例如DNA聚合酶）且处于合适的温度和pH时，其能够担当合成起始 点。引物可以是单链的或双链的，但必须足够长以在诱导剂存在时启动期望延伸产物的合 成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。例如，对于诊 断应用，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物典型地含有15-25个或更多核苷酸，但它也 可含有更少核苷酸。本文的引物被选择为与特定靶DNA序列的不同链基本上互补。这意味 着：引物必需足够互补以与它们各自的链杂交。因此，引物序列不需要反映模板的确切序 列。例如，非互补的核苷酸片段可被连接到引物的5'末端，而引物序列的其余部分与链互 补。或者，非互补碱基或更长序列可散布在引物中，条件是：引物序列与链序列足够互补以 与其杂交并从而形成合成延伸产物的模板。
[0031] 术语"杂交"指的是下述过程，其中核酸链在正常杂交条件下与第二互补核酸链退 火并形成稳定双链体（同源双链体或异源双链体），且在相同的正常杂交条件下不与无关 的核酸分子形成稳定双链体。在杂交反应中，通过使两条互补的核酸链退火来实现双链体 的形成。可通过调节杂交反应发生的杂交条件（通常被称为杂交严格性）使杂交反应高度 特异，从而两条核酸链之间的杂交将形成稳定双链体，例如在正常严格性条件下保留双链 性（double-strandedness)区域的双链体，除非两条核酸链含有基本上或完全互补的一定 数目的特定序列核苷酸。对于任何给出的杂交反应，"正常杂交或正常严格性条件"易于确 定。参加，例如，Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley& Sons,Inc.，NewYork，或Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,Cold SpringHarborLaboratoryPress。本文使用的术语"杂交"指的是任何下述过程，通过所 述过程核酸链通过碱基配对与互补链结合。
[0032] 如果核酸与参考核酸序列在中度至高度严格性杂交和洗涤条件下特异性相互杂 交，那么可认为这两种序列"选择性可杂交"。中度和高度严格性杂交条件是已知的（参见， 例如，Ausube