l,等人，ShortProtocolsinMolecularBiology，第 3版，Wiley&Sons 1995 和Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第 3 版，2001Cold SpringHarbor,N.Y.)。高度严格性条件的一个实例包括在约42°C下在50%甲酰胺、5X SSC、5XDenhardt氏溶液、0. 5%SDS和100yg/mL变性运载体DNA中杂交，随后在室温下在 2XSSC和0. 5%SDS中洗涤2次并在42°C下在0.IXSSC和0. 5%SDS中额外洗涤2次。
[0033] 本文所使用的术语"双链体（duplex) "或"双链化的（duplexed) "描述了两个碱 基配对（即，杂交在一起）的互补多核苷酸。
[0034] 本文所使用的术语"Tm"指的是寡核苷酸双链体中一半的双链体保持杂交且一半 的双链体解离成单链时的熔解温度。寡核苷酸双链体的！"可通过实验被测定或使用下式 预测：Tm= 81. 5+16. 6(log1Q [Na+]) +0? 41 (G+C部分）-(60/N)，其中N是链长，[Na+]小于 1M。 参见Sambrook和Russell(2001;MolecularCloning:ALaboratoryManual,第 3版，Cold SpringHarborPress，ColdSpringHarborN.Y?，第 10 章）。存在用于预测寡核昔酸双 链体的Tm的其它公式，一个公式可以或多或少地适合于给定的条件或条件集合。
[0035] 本文所使用的术语"游离于溶液（freeinsolution)"描述了不受另一分子束缚 或限制的分子，例如多核苷酸。
[0036] 本文所使用的术语"混合物"指的是散布且无任何特定顺序的要素的组合。混合 物是异质的且不可在空间上分离成其不同组分。要素混合物的实例包括大量不同的溶解于 相同水性溶液的要素，和大量不同的在随机位置（即，不以特定顺序）附着到固体支持物的 要素。混合物是无法寻址的。例如，如本领域中通常已知的，空间上分离的表面结合多核苷 酸的阵列不是表面结合多核苷酸的混合物，因为表面结合多核苷酸的种类在空间上不同且 所述阵列是可寻址（addressable)的。
[0037] 本文所使用的术语"连接"指的是酶促催化地结合第一DNA分子5'末端的末端核 苷酸与第二DNA分子3'末端的末端核苷酸。
[0038] 术语"共价联接"指的是两个分离的分子之间的共价键的形成，例如连接是共价联 接的一种类型。
[0039] 术语"集合"和"多个/种"可交换使用，其指的是含有至少2个成员的群体。在 某些情况下（并取决于语境），多个/种或集合可具有至少3、至少4、至少5、至少10、至少 100、至少100、至少10, 000、至少100, 000、至少106、至少107、至少IO8或至少10 9或更多个 /种成员。
[0040] 如果两种核酸"互补"，那么它们在高度严格性条件下相互杂交。术语"完美互补" 被用来描述下述双链体，其中一种核酸的每个碱基与另一种核酸中的互补核苷酸碱基配 对。在许多情况下，互补的两种序列具有至少10 (例如至少12或15)个互补的核苷酸。
[0041] 术语"消化"旨在表示下述过程，通过所述过程核酸被限制酶切割。为了消化核酸， 使限制酶与含有限制酶识别位点的核酸在适合限制酶起作用的条件下接触。适合市售可得 限制酶的活性的条件已知并且购买后随这些酶被提供。
[0042] "寡核苷酸结合位点"指的是靶多核苷酸中与寡核苷酸杂交的位点。如果寡核苷酸 "提供"引物的结合位点，那么引物可与该寡核苷酸或其互补物杂交。
[0043] 本文所使用的术语"链"指的是由通过共价键（例如磷酸二酯键）共价连接在一 起的核苷酸构成的核酸。
[0044] 在细胞中，DNA通常以双链形式存在，并因而具有两条互补的核酸链，在本文中被 称为"顶"和"底"链。在某些情况下，染色体区域的互补链可被称为"正"链和"负"链、"第 一"链和"第二"链、"编码"链和"非编码"链、"Watson"链和"Crick"链或者"正义"链和 "反义"链。链被分配成顶链或底链是任意的，并非暗示任何特定的方向、功能或结构。一些 示例性的哺乳动物染色体区域（例如BAC、组装体、染色体等）的第一链的核苷酸序列是已 知的，并且可在例如NCBI的Genebank数据库中找到。
[0045] 本文所使用的术语"延伸"指的是通过使用聚合酶添加核苷酸来延伸引物。如果 与核酸退火的引物被延伸，那么所述核酸担当延伸反应的模板。
[0046] 在相互不杂交的核酸的语境下，本文所使用的术语"相互不杂交"指的是下述序 列，所述序列已被设计以使它们在严格性条件下相互不退火。示例性的相互不杂交的序列 (在某些出版物中可被称为"象征序列（sequencetokens)"）在例如US20070259357和 Brenner等人（Proc.Natl.Acad.Sci. 1992 89:5381-3)中被描述，其通过引用被并入本文。
[0047] 在相互杂交的核酸的语境下，本文所使用的术语"相互杂交"指的是下述序列，所 述序列已被设计以使它们在严格性条件下相互退火。
[0048] 本文所使用的术语"瓣状切割反应（flapcleavagereaction) "指的是下述反 应，其中底物以重叠依赖性方式被瓣状核酸内切酶切割从而释放瓣。瓣状试验的原理众 所周知并在例如，Lyamichev等人（Nat.Biotechnol. 1999 17:292-296)、Ryan等人（Mol.Diagn. 1999 4:135-44)和Allawi等人（JClinMicrobiol. 2006 44:3443-3447)中被描 述。
[0049] 本文所使用的术语"瓣状核酸内切酶（flapendonuclease)"或简称"FEN"指的是 一类核苷酸分解酶，其作为结构特异性核酸内切酶作用于DNA结构，其中双链体的链之一 上包含单链5'突出或瓣，该条链被另一条核酸链取代，S卩，使得在单链和双链DNA之间的交 界处有重叠核苷酸。FEN催化单链和双链DNA交界处的磷酸二酯键水解切割，从而释放所述 突出或瓣。瓣状核酸内切酶被Ceska和Savers(TrendsBiochem.Sci. 1998 23:331-336) 及Liu等人（Annu.Rev.Biochem. 2004 73:589-615)综述。FEN可以是单独的酶、多亚基酶 或可作为另一酶或者蛋白复合体的活性存在，例如DNA聚合酶。瓣状核酸内切酶可以是热 稳定的。
[0050] 本文所使用的术语"瓣状核酸内切酶底物"指的是可被瓣状核酸内切酶切割从 而产生切割产物的核酸。这种复合物含有已被双链体中的另一条链取代的单链5'突出 ("瓣"）。
[0051]当在恰当语境中出现在构建体中时，术语"盒"指的是有功能的或编码有功能的产 物的双链DNA分子。启动子、终止子、复制起点和编码序列为盒的实例。当盒被移入一个或 多个不同构建体中的等价环境中时，它们有功能，从这种意义上而言，它们是模块化的。例 如，启动子（其是盒的一种类型）可从一种构建体被移入另一种构建体并能驱动不同编码 序列的表达。类似地，编码序列可通过多种上游启动子被转录。可通过PCR制造或通过任 何其它方法合成盒。在一些但并非所有情况下，盒可含有多于一个可操作性连接的功能元 件。例如，除了目的序列之外，启动子盒还可含有5'非翻译区、核糖体结合位点和终止子。
[0052] 术语"编码序列"指的是编码多肽的序列和编码功能RNA(例如调控RNA)的序列。
[0053] 在"盒集合"的语境中，术语"集合"指的是至少2个功能相关的盒（例如2、3、4、 5或6或更多个盒）的组。例如，一个盒集合可含有不同启动子，另一个盒集合可含有不同 终止子，另一个盒集合可含有不同可选择标记，另一个盒集合可含有不同复制起点，等等。
[0054] 术语"复制起点盒集合"指的是含有复制起点的盒，其中每个盒含有单个复制起点 且不同的复制起点盒含有不同的复制起点。在某些情况下，复制起点盒集合可含有一个或 多个细菌复制起点盒（其可导致高或低拷贝数目）、酵母复制起点盒和哺乳动物复制起点 盒。
[0055] 术语"可选择标记盒集合"指的是编码可选择标记（即蛋白质，其可被用于选择含 蛋白质的细胞）的盒，其中每个盒编码单个可选择标记且不同的选可择标记盒含有不同的 可选择标记。复制可选择标记盒可含有一个或多个细菌可选择标记盒、一个或多个酵母可 选择标记盒和/或一个或多个哺乳动物可选择标记盒。例如示例性的可选择标记编码提供 抗生素（例如氨苄青霉素）抗性的蛋白质。
[0056] 术语"靶标盒"指的是包含目的序列的盒。在一些情况下，靶标盒编码待在细胞中 表达的产物（例如蛋白质或RNA产物），例如通过将靶标盒与至少一个启动子可操作性连 接。在这种语境中，术语"目的序列"旨在包括一种或一系列目的序列。单个目的序列可编 码期望用于大规模表达和纯化的特定蛋白质。一系列序列可导致大量蛋白质的表达，在某 些情况下，所述蛋白质可将起始底物转变成最终的目的产物，例如精细化工中间体、抗生