含有新的美登素类的改进的细胞毒剂的制作方法

专利名称：含有新的美登素类的改进的细胞毒剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及制备含有美登素类(maytansinoids)和细胞结合剂(cell-binding agents)的改良的细胞毒性偶联物(conjugates)的方法。这些偶联物在以靶向方式被传送至特定的细胞群时，具有治疗作用。本发明也涉及制备具有硫醇部分(thiol moiety)的美登素类的方法，其可以被用于制备细胞毒性偶联物。本发明进一步涉及新的美登素类，以及新的美登素类的合成中的新的中间产物。
背景技术：
有许多报道试图于用单克隆抗体-药物偶联物特异性地靶向于肿瘤细胞(Sela et al.，Immunoconjugates 189-216(C.Vogel，ed.1987)；Ghose et al，Targeted Drugs 1-22(E.Goldberg，ed.1983)；Diener et al，Antibody Mediated Delivery Systems 1-23(J.Rodwell，ed.1988)；Pieterszet al，Antibody Mediated Delivery Systems 25-53(J.Rodwell，ed.1988)；Bumol et al，Antibody Mediated Delivery Systems 55-79(J.Rodwell，ed.1988)。细胞毒性药物诸如甲氨蝶呤、柔红霉素、阿霉素、长春新碱、长春花碱、美法仑、丝裂霉素C和苯丁酸氮芥已被连接于各种鼠科单克隆抗体。在一些情形下，药物分子通过中间载体分子被连接于抗体分子，所述的中间载体分子如血清白蛋白(Garnett et al.Cancer Res.462407-2412(1986)；Ohkawa et al.Cancer Immunol.Immunother.2381-86(1986)；Endo et al.Cancer Res.471076-1080(1980))、右旋糖苷(Hurwitz et al.Appl.Biochem.225-35(1980)；Manabi et al.Biochem.Pharmacol.34289-291(1985)；Dillman et al.Cancer Res.464886-4891(1986)；Shoval et al.Proc.Natl.Acad.Sci.858276-8280(1988))，或聚谷氨酸(Tsukada et al.J Natl.Canc.Inst.73721-729(1984)；Kato et al.J.Med.Chem.271602-1607(1984)；Tsukada et al.Br.J.Cancer 52111-116(1985))。
各种接头(linker)技术已被用于制备这样的免疫偶联物，并研究了可切割的接头和不可切割的接头。然而，在大多数情况下，仅在药物分子可以在靶位点以未被修饰的方式从偶联物上被释放时，才观察到药物的完整的细胞毒性潜能。
已被用于制备抗体-药物偶联物的可切割接头中的一种是，基于顺乌头酸的酸不稳定性接头，其利用了不同的细胞内区室的酸性环境，例如在受体介导的胞吞作用期间遇到的内体和溶酶体。Shen和Ryser将此方法引入以制备柔红霉素和大分子载体的偶联物(Biochem.Biophys.Res.Commun.1021048-1054(1981))。Yang和Reisfeld用同样的技术将柔红霉素连接于抗黑素瘤抗体(J.Natl.Canc.Inst.801154-1159(1988))。最近，Dillman等人也以相似的方式应用酸不稳定性接头来制备柔红霉素和抗T细胞抗体的偶联物(Cancer Res.486097-6102(1988))。
由Trouet等人开发的一种替代方法，涉及通过肽间隔臂(peptidespacer arm)将柔红霉素连接于抗体(Proc.Natl.Acad.Sci.79626-629(1982))。这是在游离药物可以经溶酶体肽酶的作用从这样的偶联物上被释放出来的前提下进行的。
然而，体外细胞毒性实验揭示了，抗体-药物偶联物极少达到与游离的非连接药物相同的细胞毒性能力。这提示了，药物分子从抗体被释放的机制是非常低效率的。在免疫毒剂的领域中，已显示，通过单克隆抗体和有催化活性的蛋白毒素之间的二硫键形成的偶联物，比含其它接头的偶联物更具细胞毒性。参见，Lambert et al.J.Biol.Chem.26012035-12041(1985)；Lambert et al.Immunotoxins 175-209(A.Frankel，ed.1988)；Ghetie et al.Cancer Res.482610-2617(1988)。这被归因于细胞内的高谷胱甘肽浓度，其可以有效切割抗体分子和毒素之间的二硫键。尽管如此，仅有少数的被报道的例子，是有关于将二硫键桥应用于制备药物和大分子之间的偶联物。Shen等人描述了通过二硫键与聚-D-赖氨酸连接之后，甲氨蝶呤转化为巯基乙酰胺衍生物(J.Biol.Chem.26010905-10908(1985))。此外，一些报道描述了制备含三硫的毒性药物加里刹霉素(calicheamicin)与抗体的偶联物(Hinman et al，53 Cancer Res.3336-3342(1993)，Hamann et al.，Bioconjugate Chem.，13，40-46(2002)，Hamann et al.，Bioconjugate Chem.，13，47-58(2002))。
造成二硫键连接的抗体-药物偶联物的缺乏的一个原因是，具有含硫原子的部分的细胞毒性药物并不总是可以获得的，而所述含硫原子部分是被需要以用来方便地将该药物经二硫键连接于抗体的。而且，对现存药物进行化学修饰而不减少它们的细胞毒性潜能，是困难的。
美登素类是高度细胞毒性的药物。美登素(maytansine)首先由Kupchan等人从东非灌木Maytenus serrata中分离出来，它比传统的癌症化疗剂如甲氨碟呤、柔红霉素和长春新碱的细胞毒性强100至1000倍(美国专利3,896,111号)。随后，发现一些微生物也产生美登素类，如美登醇(maytansinol)和美登醇的C-3酯(美国专利4,151,042号)。也报道了合成的美登醇C-3酯及美登醇的类似物(Kupchan et al.J.Med.Chem.2131-37(1978)；Higashide et al.Nature 270721-722(1977)；Kawai et al.Chem.Pharm.Bull.323441-3451(1984))。C-3酯由美登醇制备得来，这样的美登醇类似物的例子包括，在芳环上有修饰的美登醇(例如，脱氯)或在C-9、C-14有修饰的美登醇(例如，羟化的甲基)、在C-15、C-18、C-20和C-4，5处带有修饰的美登醇。
天然发生的美登醇C-3酯和合成的美登醇C-3酯可以被分为两组(a)带有简单羧酸的C-3酯(美国专利4,248,870；4,265,814；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,317,821；4,322,348和4,331,598号)和(b)带有N-甲基-L-丙氨酸的衍生物的C-3酯(美国专利4,137,230；4,260,608；5,208,020号和Chem.Pharm.Bull.123441(1984))。
发现组(b)的酯比组(a)的酯更有细胞毒性。
美登素是有丝分裂抑制剂。已报道，用美登素在体处理L1210细胞，导致细胞的67％积累在有丝分裂期。据报道，未被处理的对照细胞显示了范围在3.2％至5.8％之间的有丝分裂指数(Sieber et al.43Comparative Leukemia Research 1975，Bibl.Haemat.495-500(1976))。用海胆卵和蛤卵进行的实验提示，美登素通过抑制微管蛋白质(microtubule)——微管蛋白(tubulin)的多聚化而干扰微管的形成，从而抑制有丝分裂(Remillard et al.Science 1891002-1005(1975))。
在体外，已发现P388、L1210和LY5178鼠白血病细胞悬液被美登素抑制，美登素的剂量是10-3至10-1μg/μl，其中P388细胞系最为敏感。也已显示，美登素是人鼻咽癌细胞的体外生长的活性抑制剂，并且据报道，人急性成淋巴细胞性白血病系CEM被低至10-7mg/ml的浓度所抑制(Wolpert-DeFillippes et al.Biochem.Pharmacol.241735-1738(1975))。
在体内，也已显示，美登素是活性的。在50倍至100倍的剂量范围内，P388淋巴细胞白血病系统中的肿瘤生长被抑制，这表明了高的治疗指数；对于L1210鼠白血病系统、人Lewis肺癌系统和人B-16黑素癌系统，也可以显示出显著的抑制活性(Kupchan，Ped.Proc.332288-2295(1974))。在美国专利5,208,020和5,416,064以及Chari et al.，Cancer Res.，52127-131(1992)和Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，938618-8623(1996)中描述了，用来与细胞结合剂进行结合的美登素类。在这些偶联物中，细胞结合剂是通过二硫键被连接于美登素类DM1[N2’-脱乙酰-N-2’(3-巯基-1-氧丙基)-美登素，1，CAS号139504-50-0，

图1]。
在上述的专利中，具有酰化的N-甲基-L-丙氨酸侧链的美登素类药物具有式2a，b 在式2a中，l代表从1至10的整数。因此，式2a的美登素类具有连接于未取代的亚甲基的硫原子(-CH2-S-)。据称，这种美登素类化合物中的巯基或者带有这样的美登素类的通过二硫键连接的细胞结合剂-美登素类偶联物中的二硫基团，是“非位阻的(non-hindered)”，原因是，在相邻于巯基或二硫基团的α-碳上没有引起位阻现象的大体积的取代基。在式2b中，m代表0、1、2或3。因此，式2b的美登素类也有连接于未取代的亚甲基基团的硫原子，m＝0并且R2＝CH3或CH2CH3的情况除外。如果m＝0，那么美登素类在通过二硫键与细胞结合剂连接后，在带有硫醇功能基(thiol functionality)或二硫功能基(disulfidefunctionality)的碳上具有一个取代基。然而，由于在此情形下，硫原子相对于羰基是处于β位，发现这些美登素类以及这些美登素类与细胞结合剂经二硫键形成的偶联物是不稳定的，这归因于它们有遭受β-消除的倾向。
发明概述[15]本发明是基于下面的出乎意料的发现带有空间上有位阻的硫醇基团的美登素类(在带有硫醇功能基的α-碳上具有一个或两个取代基)与细胞结合剂的连接，获得了具有大大改进的体内抗肿瘤活性的偶联物，这是与用以前描述的美登素类制备的偶联物相比而言的，以前描述的美登素类在带有二硫键的α-碳原子上不具有取代基。另一个出乎意料的发现是，要得到改善的生物学活性，空间位阻最佳地是发生在偶联物中的二硫键的美登素类一侧上。此外，带有巯基的美登素类的酰化的氨基酸侧链中的酰基，在酰胺的羰基和硫原子之间，必须具有至少3个碳原子的线性链长度。
这些发现表明，可以构建二硫化物连接的(disulfide-linked)细胞结合剂-美登素类偶联物，这样，带有二硫键的两个α-碳原子上的取代可以导致二硫键任一侧上的不同程度的空间位阻。
因此，本发明描述了合成新的含空间位阻的硫醇和二硫化物的美登素类，其在带有硫原子的α-碳上具有一个或两个烷基取代基。此外，酰化的氨基酸侧链的酰基，在酰胺的羰基和硫原子之间，具有至少3个碳原子的线性链长度。
也描述了这些新的美登素类的细胞结合剂偶联物的制备和生物学评价。
在本发明的一种实施方案中，描述了新的含硫醇和二硫化物的美登素类，其在带有硫原子的碳原子上具有单烷基取代或双烷基取代。
在第二种实施方案中，本发明公开了用于合成这些新的美登素类的方法。
在第三种实施方案中，描述了用于将这些新的美登素类与细胞结合剂相连接的方法。这些偶联物作为治疗剂是有用的，其被特异性地传送至靶细胞，并且是细胞毒性的。与以前描述的制剂相比，这些偶联物在动物肿瘤模型中显示出大大改进的治疗效应。
更具体地，本发明提供了[23]美登素类，其在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基(desmethyl)处，具有酰化的氨基酸侧链，该侧链带有酰基，该酰基具有位阻的巯基，其中带有硫醇功能的酰基碳原子具有一个或两个取代基，所述取代基是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性或分支的烷基或烯基、具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基、苯基、取代的苯基、或者杂环芳基或杂环烷基基团，此外，取代基之一可以是H，并且其中酰基在羰基功能基(carbonyl functionality)和硫原子之间，具有至少3个碳原子的线性链长度；[24]表示为式4’的化合物 其中Y’代表(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2SZ,
其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或线性烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基基团，此外，R2可以是H；A、B、D是具有3-10个碳原子的环烷基或环烯基，单纯的芳基或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基基团；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基基团；l、m、n、o、p、q、r、s和t的每一个独立地是0或1至5的整数，只要l、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少2个不同时为0。
Z是H、SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的芳基或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基基团。
表示为式4’的化合物，其中R1是H，R2是甲基和Z是H。
表示为式4’的化合物，其中R1和R2是甲基和Z是H。
表示为式4’的化合物，其中R1是H，R2是甲基，Z是-SCH3。
表示为式4’的化合物，其中R1和R2是甲基，Z是-SCH3。
表示为式(I-L)、(I-D)或(I-D，L)的化合物 其中Y代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基，或杂环芳基或杂环烷基基团，并且此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基，或杂环芳基或杂环烷基基团；l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，并且此外n可以是0；Z是H、SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性或分支的烷基或烯基、具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基、或单纯的芳基或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基基团；和May代表在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处带有侧链的美登素类；[30]上述的化合物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，n是0，Z是H；[31]上述的化合物，其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，n是0，Z是H；[32]上述的化合物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，n是0，Z是-SCH3；[33]上述的化合物，其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，n是0，Z是-SCH3；[34]表示为式4的化合物
其中Y代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基基团，并且此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基，或杂环芳基或杂环烷基基团；l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，并且此外n可以是0；和Z是H、SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的芳基或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基基团；[35]式4的化合物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一个是H；l和m的每一个是1；n是0；Z是H；[36]式4的化合物，其中R1和R2是甲基；R5、R6、R7、R8的每一个是H；l和m是1；n是0；Z是H；[37]式4的化合物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，n是0，Z是-SCH3； 式4的化合物，其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，n是0，Z是-SCH3；[39]美登素类-细胞结合剂偶联物，包括至少一种连接于细胞结合剂的美登素类，其中所述美登素类是上述化合物中的任意一种；[40]上述的美登素类-细胞结合剂偶联物中的任意一种，其中所述的细胞结合剂包含至少一个抗体结合位点，其优选地是人源化的(humanized)MY9或表面重构的(resurfaced)MY9、人源化的抗-B4或表面重构的抗-B4，或人源化的C242或表面重构的C242；[41]药物组合物，包含有效量的任何上述的美登素类-细胞结合剂偶联物、其药学上可接受的盐或溶剂化物(solvate)，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂；[42]在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处酯化美登素类的方法，得到的美登素类带有酰化的氨基酸侧链，在该处的酰基具有被保护的巯基功能基，其中带有被保护的硫醇功能基的酰基碳原子有一个或两个取代基，所述取代基是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基基团，并且此外所述的取代基之一可以是H，并且其中该酰基在羰基功能基和硫原子之间有至少3个碳原子的线性链长度，所述方法包括使美登素类在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处与酰化的氨基酸发生反应，所述酰化的氨基酸中的酰基带有被保护的巯基；[43]酯化美登素类以生成美登素类酯(maytansinoid ester)的方法，所述美登素类酯可以表示为式(IV-L)、(IV-D)或(IV-D，L) 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基基团，并且此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性环状烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基基团；l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，并且此外n可以是0；Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的芳基或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基基团；和May是美登素类；所述方法包括使所述May在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处，与式(III-L)、(III-D)或(III-D，L)的化合物反应； 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基基团，并且此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性或分支的烷基或烯基、具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基基团；l、m和n的每一个独立地是1至5的整数，此外n可以是0；和
Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的芳基或取代的芳基或杂环芳香基团或杂环烷基基团；[44]上述方法，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一个是H；l和m的每一个是1；n是0；[45]上述方法，其中式(III)化合物是如(III-L)所表示；[46]上述方法，其中式(III-L)化合物是化合物15a(S，S)、15b(S，R)或15a(S，S)和15b(S，R)的混合物；[47]上述方法，其中式(III-D)化合物是化合物15(R，S)、15(R，R)或15(R，S)和15(R，R)的混合物；[48]上述方法，其中式(III-D，L)化合物是用带有被保护的硫醇功能基的羧基基团酰化的外消旋N-甲基丙氨酸，其中带有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，从而得到结构15的化合物；[49]上述的方法，其中15a(S，S)和15b(S，R)的混合物是经下列过程制成的，包括(1)使4-巯基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反应，得到化合物13；(2)将化合物13转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯14；(3)使化合物14与N-甲基-L-丙氨酸反应，得到所述的化合物15a(S，S)和15b(S，R)的混合物；[50]上述的方法，其中化合物15a(S，S)是由下列方法制成的，包括(1)转变(R)-1，3-丁二醇为(S)-4-(甲基二硫代)戊酸19；(2)转变化合物19为其N-羟基琥珀酰亚胺酯(20)；和(3)使化合物20与N-甲基-L-丙氨酸反应，得到所述的化合物15a(S，S)。
上述的方法，其中化合物15b(S，R)是由下列方法制成的，包括(1)转变(S)-1，3-丁二醇为(R)-4-(甲基二硫代)戊酸；(2)转变化合物24为其N-羟基琥珀酰亚胺酯(25)；和(3)使化合物25与N-甲基-L-丙氨酸反应，得到所述的化合物15b(S，R)。
上述的方法，其中15(R，S)和15(R，R)的混合物是经下列过程制成的，包括
(1)使4-巯基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反应，得到化合物13；(2)将化合物13转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯14；(3)使化合物14与N-甲基-D-丙氨酸反应，得到所述的化合物15(R，S)和15(R，R)的混合物。
上述的方法，其中用带有被保护的硫醇功能基的羧基基团酰化外消旋的N-甲基丙氨酸，其中带有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R或S手性的，从而得到结构15的化合物，其是经下列过程制成的，包括(1)使4-巯基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反应，得到化合物13；(2)将化合物13转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯14；(3)使化合物14与外消旋的N-甲基丙氨酸反应，得到用具有被保护的硫醇功能基的羧基基团酰化的外消旋的N-甲基丙氨酸，其中带有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，从而得到结构15的化合物。
上述方法，其中R1和R2是甲基；R5、R6、R7和R8的每一个是H；l和m的每一个是1；n是0；[55]上述方法，其中式(III-L)化合物是含有N-甲基-L-丙氨酸的化合物10(S)；[56]上述方法，其中式(III-D)化合物是含有N-甲基-D-丙氨酸的化合物10(R)；[57]上述方法，其中式(III-D，L)化合物是含有外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10(S，R)；[58]上述方法，其中含有N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10是经下列过程制造的，包括(1)使异丁烯基硫醚(5)与乙腈阴离子反应，得到化合物6；(2)水解化合物6，得到4-巯基-4-甲基戊酸(7)；(3)通过与甲基甲硫醇磺酸酯反应，转变化合物7为二硫化物8；(4)转变化合物8为其N-羟基琥珀酰亚胺酯9；和(5)使化合物9与N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸反应，得到所述的含有N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10； 通过上述任一方法来制造美登素类的方法，如果存在非对映异构体的话，还可包括分离非对映异构体，以及通过在氰键合的二氧化硅上的HPLC来进行纯化；[60]制造美登素类-细胞结合剂偶联物的方法，包括通过上述的任意方法来制造纯化的美登素类，以及使纯化的美登素类与含有活性二硫基或巯基的细胞结合剂反应；[61]上述的制造美登素类-细胞结合剂偶联物的方法，其中所述的活性二硫基是二硫代吡啶基团或取代的二硫代吡啶基团；[62]制造美登素类-细胞结合剂偶联物的方法，包括通过上述的任意方法制造纯化的美登素类，以及使纯化的美登素类与含有马来酰亚胺基团(maleimido group)或卤代乙酰基团(haloacetyl group)的细胞结合剂反应；[63]酯化美登醇以得到式42’的美登素类的方法 其中Y2’代表(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性分支的或烷基或烯基、具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；
A、B和D的每一个独立地是具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基、单纯的芳基或取代的芳基，或杂环芳基或杂环烷基基团；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m、n、o、p、q、r、s和t的每一个独立地是0或从1至5的整数，只要l、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少2个不同时为0；和Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的芳基或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基，所述方法包括使结构11的美登醇在C-3 与式(III’-L)、(III’-D)、或(III’-D，L)的化合物反应 其中Y2’代表(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中
R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；A、B和D的每一个独立地是具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基、单纯的芳基或取代的芳基，或杂环芳基或杂环烷基；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m、n、o、p、q、r、s和t的每一个独立地是0或从1至5的整数，只要l、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少2个不同时为0；和Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的芳基或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基。
酯化美登醇以得到式42’的美登素类的方法，其中式(I)的化合物表示为式(I-L)。
酯化美登醇以得到式42’的美登素类的方法，其中R1是H，R2是甲基。
酯化美登醇以得到式42的美登素类的方法 其中
Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的环烷基或烯基、苯基、取代的苯基，或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，另外n可以是0；Z2是SR或COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的芳基或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基，其中所述方法包括使式11的美登醇 在C-3位置上与式(III-L)、(III-D)或(III-D，L)的化合物反应 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或线性烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，另外n可以是0；Z2是SR或COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或线性烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基；[67]上述酯化美登醇以得到式4a的美登素类的方法，其中式(III)的化合物表示为式(III-L)；[68]上述酯化美登醇以得到式4a的美登素类的方法，其中所述式(III-L)化合物是15a(S，S)、15b(S，R)或15a(S，S)和15b(S，R)的混合物；[69]上述酯化美登醇以得到式4a的美登素类的方法，其中所述式(III-D)化合物是15(R，S)，15(R，R)或15(R，S)和15(R，R)的混合物；[70]上述酯化美登醇以得到式4a的美登素类的方法，其中所述式(III-D，L)化合物是用带有被保护的硫醇功能基的羧基基团酰化的外消旋N-甲基丙氨酸，其中带有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，从而得到结构15的化合物；[71]上述酯化美登醇以得到式4a的美登素类的方法，其中15a(S，S)和15b(S，R)的混合物是经下列过程被产生的，包括(1)使4-巯基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反应，得到化合物13；(2)将化合物13转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯14；(3)使化合物14与N-甲基-L-丙氨酸反应，得到所述的化合物15a(S，S)和15b(S，R)的混合物；[72]上述酯化美登醇的方法，其中所述化合物15a(S，S)是由下列方法产生的，包括(1)转变(R)-1，3-丁二醇为(S)-4-(甲基二硫代)戊酸19；(2)转变化合物19为其N-羟基琥珀酰亚胺酯(20)；和
(3)使化合物20与N-甲基-L-丙氨酸反应，得到化合物15a(S，S)。
上述酯化美登醇的方法，其中所述化合物15b(S，R)是由下列方法产生的，包括(1)转变(S)-1，3-丁二醇为(R)-4-(甲基二硫代)戊酸24；(4)转变化合物24为其N-羟基琥珀酰亚胺酯(25)；和(5)使化合物25与N-甲基-L-丙氨酸反应，得到所述的化合物15b(S，R)；[74]上述酯化美登醇以得到式4a的美登素类的方法，其中化合物15(R，S)和15(R，R)的混合物是经下列过程被产生的，包括(1)使4-巯基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反应，得到化合物13；(2)将化合物13转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯14；(3)使化合物14与N-甲基-D-丙氨酸反应，得到所述的化合物15(R，S)和15(R，R)的混合物。
上述酯化美登醇以得到式4a的美登素类的方法，其中用带有被保护的硫醇功能基的羧基基团酰化外消旋的N-甲基丙氨酸，其中带有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，从而得到结构15的化合物，其是经下列过程产生的，包括(1)使4-巯基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反应，得到化合物13；(2)将化合物13转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯14；(3)使化合物14与外消旋的N-甲基丙氨酸反应，得到用具有被保护的硫醇功能基的羧基基团酰化的外消旋N-甲基丙氨酸，其中带有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，从而得到结构15的化合物。
上述酯化美登醇以得到式4b的美登素类的方法，其中R1和R2是甲基；R5、R6、R7、R8的每一个是H；l和m是1；和n是0；[77]上述酯化美登醇以得到式4b的美登素类的方法，其中所述式(III-L)化合物是含有N-甲基-L-丙氨酸的化合物10；[78]上述酯化美登醇以得到式4b的美登素类的方法，其中所述式(III-D)化合物是含有N-甲基-D-丙氨酸的化合物10；[79]上述酯化美登醇以得到式4b的美登素类的方法，其中所述式(III-D，L)化合物是含有外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10； 上述酯化美登醇以得到式4b的美登素类的方法，其中含有N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10是通过下列过程产生的，包括(1)使异丁烯基硫醚(5)与乙腈阴离子反应，得到化合物6；(2)水解化合物6，得到4-巯基-4-甲基戊酸(7)；(3)通过与甲基甲硫醇磺酸酯反应，转变化合物7为二硫化物8；(4)转变化合物8为其N-羟基琥珀酰亚胺酯9；和(5)使化合物9与N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸反应，得到含有N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10；[81]上述用10酯化美登醇——如果存在非对映异构体，则随后分离非对映异构体，并经在氰键合的二氧化硅上的HPLC纯化美登素类——的方法，进一步包括还原二硫键，以得到式4b的美登素类；[82]制造美登素类-细胞结合剂偶联物的方法，包括通过上述任意的酯化美登醇以得到式4b的美登素类的方法，来制造纯化的美登素类，并使该美登素类与含有巯基或活性二硫基团——优选地是二硫代吡啶基或取代的二硫代吡啶基——的细胞结合剂反应；[83]制造美登素类-细胞结合剂偶联物的方法，包括通过上述任意的酯化美登醇以得到式4b的美登素类的方法，来制造纯化的美登素类，并使该美登素类与含有马来酰亚胺基或卤代乙酰基的细胞结合剂反应。
应用上述偶联物的治疗方法。
式(III)的化合物 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中
R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基、或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，另外n可以是0；和Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的芳基或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基。
化合物10(S)、10(R)或外消旋的10；[87]制造含有N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10的方法，包括(1)使异丁烯基硫醚(5)与乙腈的阴离子反应，得到化合物6；(2)水解化合物6，得到4-巯基-4-甲基戊酸(7)；(3)通过与甲基甲硫醇磺酸酯反应，转变化合物7为二硫化物8；(4)转变化合物8为其N-羟基琥珀酰亚胺酯9；和(5)使化合物9与N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸反应，得到所述的含有N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10。
化合物15a(S，S)和15b(S，R)的混合物；[89]制造化合物15a(S，S)和15b(S，R)的混合物的方法，包括(1)使4-巯基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反应，得到化合物13；(2)将化合物13转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯14；和(3)使化合物14与N-甲基-L-丙氨酸反应，得到所述的化合物15a(S，S)和15b(S，R)的混合物；[90]化合物15(R，S)和15(R，R)的混合物。
制造化合物15(R，S)和15(R，R)的混合物的方法，包括(1)使4-巯基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反应，得到化合物13；(2)将化合物13转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯14；
(3)使化合物14与N-甲基-D-丙氨酸反应，得到所述的化合物15(R，S)和15(R，R)的混合物；[92]用带有被保护的硫醇功能基的羧基基团酰化的外消旋的N-甲基丙氨酸，其中带有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，以得到结构15的化合物。
制造用具有被保护的硫醇功能基的羧基基团酰化的外消旋的N-甲基丙氨酸的方法，其中带有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，从而得到结构15的化合物，该方法包括(1)使4-巯基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反应，得到化合物13；(2)将化合物13转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯14；(3)使化合物14与外消旋的N-甲基丙氨酸反应，得到用具有被保护的硫醇功能基的羧基基团酰化的外消旋的N-甲基丙氨酸，其中带有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，以得到结构15的化合物。
化合物15a(S，S)；[95]化合物15b(S，R)；[96]制造化合物15a(S，S)的方法，包括(1)转变(R)-1，3-丁二醇为(S)-4-(甲基二硫代)戊酸19；(2)转变化合物19为其N-羟基琥珀酰亚胺酯(20)；和(3)使化合物20与N-甲基-L-丙氨酸反应，得到所述化合物15a(S，S)；[97]制造化合物15b(S，R)的方法，包括(1)转变(S)-1，3-丁二醇为(R)-4-(甲基二硫代)戊酸24；(2)转变化合物24为其N-羟基琥珀酰亚胺酯(25)；和(3)使化合物25与N-甲基-L-丙氨酸反应，得到所述化合物15b(S，R)。
药物组合物，包含有效量的上述任意的美登素类化合物、其药学上可接受的盐或溶剂化物，和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂；[99]上述的包含美登素类化合物的药物组合物，进一步包含抗体。
在所选择的细胞群中诱导细胞死亡的方法，包括用有效量的上述任意的美登素类-细胞结合剂、其盐或其溶剂化物接触靶细胞或含靶细胞的组织。
附图简述[101]图1显示了以前描述的美登素类的结构。
图2显示了本发明的一些美登素类的结构。
图3a-3d显示了合成本发明的代表性的美登素类的流程。
图4a、4b是显示本发明的新的美登素类的体外效力(potency)的曲线图。
图4c、4d是比较本发明的新的美登素类和那些以前描述的美登素类的体外效力的绘图。
图5a-5d显示了制备细胞结合剂和本发明美登素类的偶联物的流程。
图6是显示本发明的细胞结合剂-美登素类偶联物的体外效应的绘图。
图7是比较本发明的huC242-美登素类与以前描述的美登素类的huC242偶联物的对抗HT-29人结肠肿瘤异种移植物的体内抗肿瘤效应的绘图。
图8是比较本发明的huC242-美登素类与以前描述的美登素类的huC242偶联物的对抗COLO 205人结肠肿瘤异种移植物的体内抗肿瘤效应的绘图。
图9是比较本发明的MY9-6-美登素类与以前被描述的美登素类的MY9-6偶联物的对抗HL60前髓细胞性髓样白血病异种移植物的体内抗肿瘤效应的绘图。
图10显示了偶联物huMy9-6-DM4对靶细胞HL-60和非靶细胞Namalwa细胞的体外细胞毒性的评价结果。
图11显示了在SCID鼠中，偶联物huMy9-6-DM4抵抗人HL-60异种移植肿瘤的体内效应评价，并将其与以前描述的美登素类的huMy9-6偶联物(huMy9-6-DM1)的效应相比较。
图12显示了偶联物huB4-DM4对Ramos靶细胞和Colo 205非靶细胞的体外细胞毒性评价的结果。
图13a显示了在SCID鼠中，偶联物huB4-DM4对抗人Ramos异种移植肿瘤的体内效应评价，图13b显示了该实验期间，动物体重的变化。
发明详述[115]本发明公开了新的、含有受空间位阻的硫醇(thiol)和二硫化物(disulfide)的美登素类，其中带有硫原子的α-碳带有一个或两个烷基取代基。本发明也公开了用于合成这些新的美登素类的方法。进一步公开了在这些新的美登素类的合成中作为中间产物的有用的新的化合物。此外，本发明公开了制备这些新的美登素类和细胞结合剂的偶联物(conjugates)。
本领域揭示了，修饰现有药物而不减少它们的细胞毒性潜能，是极其困难的。本公开的发明通过教导用于合成新的美登素类分子的方法，克服了此难题，所述分子含有具空间位阻的硫醇或二硫化物部分(moiety)。本公开的发明保留了——在一些情况下甚至增强了——以前描述的美登素类的细胞毒性潜力。
美登素类-细胞结合剂偶联物允许欲以靶向方式应用的美登素类仅对不需要的细胞发挥充分的细胞毒作用，因此，避免了由于损害非靶向的健康细胞所带来的副作用。因此，本发明提供了有用的药剂，和用于制备这些药剂的新方法，以用于消除欲被杀死或裂解的疾病细胞或异常细胞，而显示最小的副作用，这些细胞例如肿瘤细胞(特别是实体瘤细胞)、病毒感染细胞、微生物感染细胞、寄生虫感染细胞、自身免疫细胞(产生自身抗体的细胞)、活化的细胞(参与移植排斥或移植物抗宿主病的那些细胞)、或任意其它类型的疾病细胞或异常细胞。
因此，本发明教导了用于产生改良的细胞毒性偶联物的方法，所述偶联物包括新的美登素类和细胞结合剂，这与以前描述的美登素类和细胞结合剂相比，生物学活性大大改善。本发明进一步教导了用于合成美登素类衍生物的方法，所述衍生物具有受空间位阻的硫醇或二硫化物部分，该部分允许和细胞结合剂进行化学连接，所述衍生物在结合形式或在释放形式或在两种状态下，显示出高的细胞毒性。本发明的细胞毒性偶联物包含一个或多个连接于细胞结合剂的美登素类。为了将美登素类连接于细胞结合剂，美登素类必须先被修饰。
可以被用于本发明以产生能够被连接于细胞结合剂的美登素类的美登素类，是本领域中已知的，并且可以根据已知方法从天然来源分离出来或根据已知方法合成制备出来。
合适的美登素类的例子包括美登醇和美登醇类似物(analogues)。合适的美登醇类似物的例子包括那些具有修饰的芳环和那些在其它位置带有修饰的化合物。
具有修饰的芳环的合适的美登素类类似物的具体例子包括(1)C-19-脱氯(美国专利4,256,746号)(经安丝菌素P2的LAH还原而制备)；(2)C-20-羟基(或C-20-去甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利4,361,650和4,307,016号)(用链霉菌(Streptomyces)或放线菌(Actinomyces)经去甲基化，或用LAH经脱氯化而制备)；和(3)C-20-脱甲氧基，C-20-酰氧基(-OCOR)，+/-脱氯(美国专利4,294,757号)(用酰基氯经酰化作用而制备)。
在其它位置有修饰的合适的美登醇类似物的具体例子包括(1)C-9-SH(美国专利4,424,219号)(通过美登醇与H2S或P2S5反应而制备)；(2)C-14-烷氧甲基(去甲氧/CH2OR)(美国专利4,331,598号)；(3)C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利4,450,254号)(从诺卡氏菌属(Nocardia)制备)；(4)C-15-羟基/酰氧基(美国专利4,364,866号)(由链霉菌经美登醇的转化而制备)；(5)C-15-甲氧基(美国专利4,313,946和4,315,929号)(从Trewianudiflora分离)；(6)C-18-N-去甲基(美国专利4,362,663和4,322,348号)(由链霉菌进行美登醇去甲基化而制备)；和(7)4，5-脱氧(美国专利4,371,533号)(经美登醇的三氯化肽/LAH还原而制备)。
为了将美登素类连接于细胞结合剂，美登素类包含连接部分(linking moiety)。连接部分含有化学键，其允许完整活性的美登素类在特定位点被释放出来。合适的化学键在本领域中是已知的，包括二硫键、酸不稳定键、光不稳定键、肽酶不稳定键和酯酶不稳定键。优选的是二硫键。
美国专利5,208,020的公开内容教导了产生带有这些键的美登素类，其在此并入，作为参考。
根据本发明，连接部分包括具空间位阻的硫醇或二硫化物部分。
特别优选的包含含活性化学基团的连接部分的美登素类，是美登醇的C-3酯及其类似物，其中所述连接部分包含具空间位阻的硫醇或二硫键。
美登素类上的许多位置可以用作化学地连接所述连接部分的位置。例如，具有羟基的C-3位、用羟甲基修饰的C-14位、用羟基修饰的C-15位和具有羟基的C-20位，都被预期是有用的。然而，C-3位是优选的，并且美登醇的C-3位是特别优选的。
进一步地，尽管在下面是基于在C-3位的含二硫键的连接部分，描述了具有连接部分的美登醇的酯的合成，但本领域的技术人员将理解，带有其它化学键的连接部分，如上面所描述的，也可以被用于本发明，同样地，其它美登素类和其它连接位置，如上面所描述的，也可以被用于本发明。
图2显示了本发明的各种美登素类的结构。具有空间位阻的硫醇或二硫化物部分的美登素类的合成，参考图3的描述。下列代表性方法中的许多是应用了含硫醇的美登素类N2’-脱乙酰-N2’-(4-巯基-1-氧戊基)-美登素(被称为DM3)和N2’-脱乙酰-N2’-(4-甲基-4-巯基-1-氧戊基)-美登素(被称为DM4)。DM3(4a)和DM4(4b)被表示为下列结构式 [130]本发明的含空间位阻的硫醇和二硫化物的新的美登素类的体外细胞毒性，可以用它们在体外抑制各种不需要的细胞系的增殖的能力来评价(图4)。例如，可以用细胞系如人乳腺癌细胞系SK-Br-3，或人表皮样癌细胞系KB，来评价这些新的美登素类的细胞毒性。可以将欲被评价的细胞暴露于化合物72小时，并用已知方法用直接测定法来测定细胞的存活部分。然后，从分析结果可以计算出IC50值。
具有受空间位阻的硫醇或二硫化物部分的美登素类的生成[131]本发明的新的美登素类是那些在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处具有酰化的氨基酸侧链的物质，所述侧链带有酰基，该酰基具有位阻的巯基，其中具有硫醇功能基的酰基碳原子具有一个或两个取代基，所述取代基是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，取代基之一可以是H，并且其中该酰基在羰基功能基和硫原子之间具有至少三个碳原子的线性链长度。
优选地，美登素类化合物被表示为式4’ 其中Y’代表(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2SZ，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；A、B、D是具有3-10个碳原子的环烷基或环烯基、单纯的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m、n、o、p、q、r、s和t的每一个独立地是0或从1至5的整数，只要l、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少2个不同时为0；Z是H、SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基。
在表示为4’的化合物的优选实施方案中，R1是H，R2是甲基和Z是H；R1和R2是甲基和Z是H；R1是H，R2是甲基和Z是-SCH3；或R1和R2是甲基和Z是-SCH3。
更优选地，美登素类是表示为式(I-L)、(I-D)或(I-D，L)的化合物 其中Y代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或线性烯基、具有3至10个碳原子的环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基，或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或线性烯基、具有从3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，此外，n可以是0；Z是H、SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基；和May代表在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处有侧链的美登素类。
更优选的是C-3酯，它是被表示为式4的化合物 其中的取代基如上面所定义。
特别优选的是任意的上述化合物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，n是0，和Z是H；上述那些化合物，其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m是1，n是0，和Z是H；那些化合物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，n是0，和Z是-SCH3；那些化合物，R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，n是0，和Z是-SCH3。进一步地，L-丙氨酰立体异构体是优选的，原因是，对本发明的偶联物来说，它是最有用的。
式4的优选实施方案包括DM3和DM4，即，式4的美登素类，其中Z是H，R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m是1，和n是0(DM3，化合物4a)；式4的美登素类，其中Z是H，R1和R2都是甲基，R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m是1，和n是0(DM4，化合物4b)；式4的美登素类，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，n是0，和Z是-SCH3；和式4的美登素类，其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，n是0，和Z是-SCH3。
具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基的例子包括但不限于，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、丙烯基、丁烯基和己烯基。
具有3至10个碳原子的分支烷基或烯基的例子包括但不限于，异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、1-乙基丙基、异丁烯基和异戊烯基。
具有3至10个碳原子的环状烷基或烯基的例子包括但不限于，环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基和环己烯基。
单纯的芳基包括具有6至10个碳原子的芳基，取代的芳基包括具有6至10个碳原子的芳基，其带有至少一个含1至4个碳原子的烷基取代基，或烷氧基取代基如甲氧基、乙氧基，或卤素取代基或硝基取代基。
含有6至10个碳原子的单纯的芳基的例子包括苯基和萘基。
取代的芳基的例子包括硝基苯基、二硝基苯基。
杂环芳基包括具有3至10元环的基团，其含有一个或两个选自N、O或S的杂原子。
杂环烷基包括环状化合物，其包括3至10元环体系，其中包含一个或两个选自N、O或S的杂原子。
杂环芳基的例子包括吡啶基、硝基吡啶基、pyrollyl、唑基、噻吩基、噻唑基和呋喃基。
杂环烷基的例子包括二氢呋喃、四氢呋喃、tetrahydropyrollyl、哌啶基、哌嗪基和吗啉基(morpholino)。
具有受空间位阻的硫醇或二硫化物部分的新的美登素类，可以通过下列新公开的方法来制备美登素类的合成[148]图3a显示了合成美登素类DM4(4b)中的步骤。将异丁烯基硫醚(5)与乙腈的阴离子反应，得到巯基化合物6。用碱水解6得到4-巯基-4-甲基戊酸(7)。通过与甲基甲硫醇磺酸酯(MeSSO2Me)反应，完成7向二硫化物8的转变。8转变为N-羟基琥珀酰亚胺酯9，随后与N-甲基-L-丙氨酸反应，得到羧酸10，其通过硅胶柱层析被纯化。在N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)和氯化锌存在的条件下，10和美登醇(11)反应，得到N-酰基-N-甲基-L-丙氨酰美登素类L-DM4Sme，(4e)和N-酰基-N-甲基-D-丙氨酰美登素类D-DM4Sme(4f)的混合物。用氰键合的柱，通过HPLC分离非对映异构体的混合物。收集所需的含L-氨基酸的异构体4e并用二硫苏糖醇还原，得到含硫醇的L-氨酰基美登素类DM4(4b)，再次用氰键合的柱，通过HPLC纯化它。
图3b显示了合成美登素类DM3(4a)中的步骤。
通过与甲基甲硫醇磺酸酯反应，4-巯基戊酸(12)转变为甲基二硫化物，得到13。化合物13转变为N-羟基琥珀酰亚胺酯14，随后与N-甲基-L-丙氨酸反应，得到羧酸15，其通过硅胶柱层析被纯化。在N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)和氯化锌存在的条件下，15和美登醇(11)反应，得到N-酰基-N-甲基-L-丙氨酰美登素类L-DM3SSMe，(4c)和N-酰基-N-甲基-D-丙氨酰美登素类D-DM3SSMe(4d)的混合物。用氰键合的柱，通过HPLC分离非对映异构体的混合物。收集所需的含L-氨基酸的异构体并用二硫苏糖醇还原，得到含巯基-L-氨基酸的美登素类DM3(4a)，再次用氰键合的柱，通过HPLC纯化它。
图3c和3d显示了具有或者(S)-4-甲基二硫代-1-氧代戊基部分或者(R)-4-甲基二硫代-1-氧代戊基部分的DM3的合成。转变(R)-1，3-丁二醇(16)为其二甲苯磺酸酯(ditosylate)17，随后与氰化钠和黄原酸乙酯钾(potassium ethyl xanthate)连续反应，得到腈18(图3c)。碱水解，随后经二硫化物交换，得到(S)-4-甲基二硫代-戊酸19。19转变为琥珀酰亚胺酯20，随后与N-甲基-L-丙氨酸反应，得到N-甲基-N-[4-(S)-甲基二硫代-1-氧代-戊基]-S-丙氨酸(15a)。如上面对化合物15的描述，与美登醇反应，得到L-DM3SMe的两种非对映异构体4g和4h。类似地，(S)-1，3-丁二醇(21)被转变为(R)-4-甲基二硫代-戊酸24，然后转变为15b。如上面所描述，与美登醇反应，得到DM3SMe的两种非对映异构体，4k和4l。
因此，本发明提供了在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处用酰化的氨基酸侧链酯化美登素类的方法，其中的酰基基团具有被保护的巯基功能基，其中带有被保护的硫醇功能基的酰基碳原子具有一个或两个取代基，所述取代基是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外取代基之一可以是H，其中酰基基团在羰基功能基和硫原子之间有至少3个碳原子的线性链长度，所述方法包括使美登素类在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处与酰化的氨基酸反应，所述酰化的氨基酸中的酰基带有被保护的巯基。
在一种优选的实施方案中，本发明提供了酯化美登醇以得到式42’的美登素类的方法 其中Y2’代表(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性分支的或烷基或烯基、具有3至10个碳原子的环烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；A、B和D的每一个独立地是具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基、单纯的芳基或取代的芳基，或杂环芳基或杂环烷基；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m、n、o、p、q、r、s和t的每一个独立地是0或从1至5的整数，只要l、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少2个不同时为0；和Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基，所述方法包括使结构11的美登醇在C-3位 与式(III’-L)、(III’-D)或(III’-D，L)的化合物反应 其中Y2’代表(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或线性烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；A、B和D的每一个独立地是具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基、单纯的芳基或取代的芳基，或杂环芳基或杂环烷基；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m、n、o、p、q、r、s和t的每一个独立地是0或从1至5的整数，只要l、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少2个不同时为0；和Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或线性烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基。
优选地，式(I)的化合物被表示为式(I-L)，并且，还优选地，R1是H和R2是甲基。
在一种更优选的实施方案中，本发明提供了酯化美登醇以得到式42的美登素类的方法 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10碳原子的线性分支的或烷基或烯基、具有3至10个碳原子的环烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m和n的每一个独立地是1至5的整数，另外n可以是0；
Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基，所述方法包括使式11的美登醇在C-3位 与式(III-L)、(III-D)或(III-D，L)的化合物反应 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或线性烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或线性烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，另外n可以是0；和Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或线性烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基。
可以在氰键合的二氧化硅上，通过HPLC分离非对映异构体。
在一种更优选的实施方案中，本发明提供了酯化美登素类以产生式(IV-L)、(IV-D)或(IV-D，L)所表示的美登素类酯的方法 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基、或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，另外n可以是0；Z2是SR或COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基；和May是美登素类，所述方法包括使所述may在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基，与式(III-L)、(III-D)或(III-D，L)的化合物反应 其中
Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，另外n可以是0；和Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基。
在一种甚至更优选的实施方案中，本发明提供了酯化美登醇以得到式42的美登素类的方法 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，另外n可以是0；
Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基，所述方法包括使美登醇在C-3位上与式(III-L)、(III-D)或(III-D，L)的化合物反应 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，另外n可以是0；Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基。
优选地，表示为式(I)的化合物是L立体异构体。
对于上述的方法，优选的是，R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，和n是0；或R1和R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m是1，和n是0。
制备DM3时，式(III-L)的化合物是15a(S，S)、15b(S，R)或15a(S，S)和15b(S，R)的混合物；式(III-D)的化合物是被外消旋的酰基基团或具有R或S手性的酰基基团酰化的N-甲基-D-丙氨酸，从而得到化合物15；式(III-D，L)的化合物是用带有被保护的硫醇功能基的羧基基团酰化的外消旋的N-甲基丙氨酸，其中带有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，从而得到结构15的化合物。
15a(S，S)和15b(S，R)的混合物可以通过下面的过程产生，包括(1)使4-巯基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反应，得到化合物13；(2)将化合物13转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯14；(3)使化合物14与N-甲基-L-丙氨酸反应，得到所述的化合物15a(S，S)和15b(S，R)的混合物。
相似地，15(R，S)和15(R，R)的混合物可以通过下列过程产生，包括(1)使4-巯基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反应，得到化合物13；(2)将化合物13转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯14；(3)使化合物14与N-甲基-D-丙氨酸反应，得到所述的化合物15(R，S)和15(R，R)的混合物。
用带有被保护的硫醇功能基的羧基基团酰化的外消旋的N-甲基丙氨酸，其中带有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，以得到结构15的化合物，其可以经下列过程产生，包括(1)使4-巯基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反应，得到化合物13；(2)将化合物13转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯14；(3)使化合物14与外消旋的N-甲基丙氨酸反应，得到所述的用带有被保护的硫醇功能基的羧基基团酰化的外消旋的N-甲基丙氨酸，其中带有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，从而得到结构15的化合物。
化合物15a(S，S)可以经下列方法制成，包括(1)转变(R)-1，3-丁二醇为(S)-4-(甲基二硫代)戊酸19；(2)转变化合物19为其N-羟基琥珀酰亚胺酯(20)；和(3)使化合物20与N-甲基-L-丙氨酸反应，得到所述化合物15a(S，S)。
化合物15b(S，R)可以经下列方法制成，包括(1)转变(S)-1，3-丁二醇为(R)-4-(甲基二硫代)戊酸24；(2)转变化合物24为其N-羟基琥珀酰亚胺酯(25)；和(3)使化合物25与N-甲基-L-丙氨酸反应，得到所述的化合物15b(S，R)；[166]制造DM4时，式(III-L)的化合物是含有N-甲基-L-丙氨酸的化合物10；式(III-D)的化合物是含有N-甲基-D-丙氨酸的化合物10，式(III-D，L)的化合物是含有外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10。
含有N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10是通过下列过程被制造的，包括(1)使异丁烯基硫醚(5)与乙腈阴离子反应，得到化合物6；(2)水解化合物6，得到4-巯基-4-甲基戊酸(7)；(3)通过与甲基甲硫醇磺酸酯反应，转变化合物7为二硫化物8；(4)转变化合物8为其N-羟基琥珀酰亚胺酯9；和(5)使化合物9与N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸反应，得到含有N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10。
根据本发明，式III的化合物也是新的 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，另外n可以是0；Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基、分支烷基或环烷基、或单纯的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基。
用类似于本文所公开的那些用于制造化合物10和15的方法，本领域的技术人员可以容易地制造出式III的化合物。
美登素类的体外细胞毒性[170]图4显示了本发明的美登素类的体外细胞毒性。具有受位阻的二硫键的新的美登素类(4c，4e)对被测试的细胞系是高度有效的。因此，4c杀死A-375细胞和SK-Br-3细胞，IC50值分别是1.5×10-11M和7.0×10-12M。相似地，美登素类4e也是高度有效的，它对A-375细胞和SK-Br-3细胞的IC50值分别是3.2×10-11M和9.0×10-12M。比较本发明的含位阻硫醇的美登素类4a和以前描述的美登素类1的体外效力(图4c、d)，结果表明，新的美登素类比以前描述的美登素类的效力大20至50倍。
细胞结合剂的制备[171]本发明的化合物作为治疗剂的有效性取决于对合适的细胞结合剂的仔细选择。细胞结合剂可以是目前已知的，或是正在成为已知的的任意种类，包括肽和非肽物质。通常地，它们可以是抗体(特别是单克隆抗体)、淋巴因子、激素、生长因子、维生素、营养输送分子(如转铁蛋白)、或任意其它的细胞结合分子或物质。
可以被应用的细胞结合剂的更具体的例子包括多克隆抗体；单克隆抗体；抗体片段如Fab、Fab′和F(ab′)2、Fv(Parham，J.Immunol.1312895-2902(1983)；Spring et al.J.Immunol.113470-478(1974)；Nisonoffet al.Arch.Biochem.Biophys.89230-244(1960))；干扰素(例如，α、β、γ)；淋巴因子如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6；激素如胰岛素、TRH(促甲状腺激素释放激素)、MSH(黑素细胞刺激素)、类固醇激素如雄激素和雌激素；生长因子和集落刺激因子如EGF、TGF-α、FGF、VEGF、G-CSF、M-CSF和GM-CSF(Burgess，Immunology Today 5155-158(1984))；转铁蛋白(O′Keefe et al.J.Biol.Chem.260932-937(1985))；和维生素，如叶酸。
单克隆抗体技术允许极度特异的细胞结合剂以特异的单克隆抗体的形式产生。在本领域中，用于制备单克隆抗体的技术是公知的，所述抗体是通过用感兴趣的抗原免疫小鼠、大鼠、仓鼠或任意其它的哺乳动物而产生的，所述抗原例如完整的靶细胞、从靶细胞分离的抗原、全病毒、减毒的全病毒和病毒蛋白如病毒衣壳蛋白。也可以应用致敏的人细胞。制备单克隆抗体的另一种方法是应用scFv(单链可变区)噬菌体文库，特别是人scFv噬菌体文库(参见，Griffiths等，美国专利5,885,793和5,969,108号；McCafferty等，WO 92/01047；Liming等，WO 99/06587)。此外，也可以应用美国专利5,639,641号中公开的表面重构抗体，也可以应用人源化的抗体。
对合适的细胞结合剂的选择，取决于欲靶向的特定细胞群，但通常地，如果可以得到合适的人单克隆抗体，则优选人单克隆抗体。
例如，单克隆抗体MY9是鼠IgG1抗体，其特异性结合于CD33抗原{J.D.Griffin et al 8 Leukemia Res.，521(1984)}，如果靶细胞表达CD33，例如在急性骨髓性白血病(AML)中，可以应用该抗体。类似地，单克隆抗体抗B4是鼠IgG1，其结合于B细胞上的CD19抗原{Nadleret al，131 J.Immunol.244-250(1983)}，如果靶细胞是表达此抗原的B细胞或患病细胞，例如在非霍奇金淋巴瘤或慢性成淋巴细胞白血病中，可以应用该抗体。类似地，单克隆抗体C242，结合于CanAg抗原(美国专利5,552,293号)，它可以被用于治疗表达CanAg的肿瘤，如直肠癌、胰腺癌和胃癌。
另外，结合于骨髓细胞的GM-CSF，可以被用作细胞结合剂，针对来自急性骨髓性白血病的患病细胞。结合于活化的T细胞的IL-2，可以被用于预防移植排斥、用于治疗和预防移植物抗宿主病，和用于治疗急性T细胞白血病。结合于黑素细胞的MSH，可以被用于治疗黑素瘤。叶酸可以被用于靶向表达在卵巢肿瘤和其它肿瘤的上叶酸受体。表皮生长因子可以被用于靶向鳞状癌如肺部鳞状癌和头部鳞状癌和颈部状鳞癌。生长激素释放抑制因子可以被用于靶向神经母细胞瘤和其它肿瘤类型。
可以分别用雌激素(或雌激素类似物)或雄激素(或雄激素类似物)作为细胞结合剂，成功地靶向乳腺癌和睾丸癌。
细胞毒性偶联物的生成[178]本发明也提供了美登素类-细胞结合剂偶联物，其包括至少一种连接于细胞结合剂的美登素类，其中所述细胞结合剂是用硫醇或二硫功能基被连接于美登素类的，硫醇或二硫功能基存在于酰化的氨基酸侧链的酰基基团上，酰化的氨基酸侧链存在于美登素类的C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处，其中，酰化的氨基酸侧链的酰基基团具有其硫醇或二硫功能基，它们位于带有一个或两个取代基的碳原子上，所述取代基是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性或烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，取代基之一可以是H，和其中酰基基团在羰基功能基和硫原子之间具有至少3个碳原子的线性链长度。
优选的细胞结合剂偶联物包括至少一种连接于细胞结合剂的美登素类，其中美登素类由式41’表示 其中Y1’代表(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2S-，其中A、B和D的每一个独立地是具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基、单纯的芳基或取代的芳基、或杂环芳基或杂环烷基；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；和l、m、n、o、p、q、r、s和t的每一个独立地是0或从1至5的整数，只要1、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少2个不同时为0。
优选地，R1是H和R2是甲基，或R1和R2是甲基。
一种更优选的细胞结合剂偶联物包括至少一种连接于细胞结合剂的美登素类，其中美登素类由式(II-L)、(II-D)或(II-D，L)表示 其中Y1代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2S-，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基、杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，此外n可以是0；和May代表在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处带有侧链的美登醇；[182]更优选的是这样的美登素类-细胞结合剂偶联物，其中美登素类由式41表示
其中取代基如对上面的式(II)所定义。
特别优选的是任意的上述化合物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，和n是0；和那些任意的上述化合物，其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m是1，和n是0。
进一步地，优选L-氨基酰立体异构体。
本发明的代表性的细胞毒性偶联物是抗体/美登素类，抗体片段/美登素类，表皮生长因子(EGF)/美登素类，黑素细胞刺激素(MSH)/美登素类，促甲状腺素(TSH)/美登素类，生长激素释放抑制因子/美登素类，叶酸/美登素类，雌激素/美登素类，雌激素类似物/美登素类，雄激素/美登素类，和雄激素类似物/美登素类。
使含硫醇的美登素类与合适地被修饰的细胞结合剂反应，产生细胞毒性偶联物。通过凝胶过滤、离子交换层析或通过HPLC，可以纯化这些偶联物。
图5中显示了用于从含巯基的美登素类制备偶联物的方案。更具体地(图5a，b)，可以将抗体在含水缓冲液中的溶液与过量摩尔数的抗体修饰剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(SPDP，3a)温育，以导入二硫吡啶基(图5a)，或与N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-丁酸酯(SPDB，3b)温育，以导入二硫吡啶基(图5b)。然后，将修饰的抗体和含硫醇的美登素类(如4a或4b)反应，生成二硫化物连接的抗体-美登素类偶联物。然后，通过凝胶过滤，美登素类-抗体偶联物可以被纯化出来。
可选择地，可以将抗体与过量摩尔数的抗体修饰剂例如2-iminothiolane温育，以导入巯基。然后，将修饰的抗体与合适的含二硫化物的美登素类反应，生成二硫化物连接的抗体-美登素类偶联物。然后，通过凝胶过滤，美登素类-抗体偶联物可以被纯化出来。
通过分光光度法测定252nm和280nm处的吸光度的比值，可以确定每个抗体分子结合的美登素类分子的数目(在图5a至5d中，用w表示)。通过本方法，可以连接平均1-10个美登素类分子/抗体分子。每个抗体连接的美登素类的优选平均数是2-5，最优选的是3-4.5。
可选择地，可以将抗体在含水缓冲液中的溶液与过量摩尔数的抗体修饰剂如N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC，26)温育，以导入马来酰亚胺基(图5c)，或与N-琥珀酰亚胺基-4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB，27)温育，以导入碘乙酰基(图5d)。然后，将修饰的抗体和含硫醇的美登素类(如4a或4b)反应，生成硫醚-连接的抗体-美登素类偶联物。然后，通过凝胶过滤，美登素类-抗体偶联物可以被纯化出来。
通过如上描述的分光光度分析，可以测定每个抗体分子结合的美登素类分子的数目。
因此，本发明提供了制造美登素类-细胞结合剂偶联物的方法，包括经上述方法之一制造纯化的美登素类，和使纯化的美登素类与细胞结合剂反应，所述细胞结合剂含有活性的二硫基或巯基。优选地，活性的二硫基是二硫吡啶基或取代的二硫吡啶基。特别优选地，活性的二硫基包括硝基吡啶二硫基或二硝基吡啶二硫基。
在另一种方法中，将纯化的美登素类与含有马来酰亚胺基或卤代乙酰基的细胞结合剂反应。
可以评价本发明的细胞结合剂与美登素类药物的偶联物，评价它们在体外抑制各种不需要的细胞系的增殖的能力(图6)。例如，可以用细胞系如人结肠癌细胞系COLO 205、人黑素瘤细胞系A-375、人骨髓白血病细胞系HL 60，评价这些偶联物的细胞毒性。可以将欲被评价的细胞暴露于化合物24小时，并通过已知方法用直接测定法来测定细胞的存活部分。然后，从分析结果可以计算出IC50值。
图6、10和12显示了本发明的抗体-美登素类偶联物的体外效力和靶特异性。因此，图6显示，huC242-DM3和huC242-DM4在杀死抗原阳性的COLO 205细胞中，均是高度有效的，IC50值分别是1.3×10-11M和1.1×10-11M。与之对照，抗原阴性的A-375细胞的敏感度低于大约500倍，这说明本发明的美登素类偶联物是高度有效的和高度特异的。类似地，图10和12分别说明，本发明的美登素类与抗体MY9-6和抗-B4的偶联物的高效力和靶特异性。
在几种不同的人肿瘤小鼠模型中，将本发明的含位阻硫醇的美登素类与抗体的偶联物在体内的抗肿瘤效应和以前描述的美登素类偶联物在体内的抗肿瘤效应进行比较。在第一个模型中(图7)，用以前描述的美登素类DM1的抗体偶联物(huC242-DM1)或用两种新的美登素类偶联物(huC242-DM3，huC242-DM4)，处理带有已建立的人结肠肿瘤HT-29的皮下异种移植物的SCID鼠。用huC242-DM1进行处理，导致肿瘤生长延迟18天。与之相比，新药剂显著地更加有效，对于huC242-DM3，肿瘤生长延迟28天，对于huC242-DM4，肿瘤生长延迟36天。
在第二个模型中(图8)，用以前描述的美登素类DM1的抗体偶联物(huC242-DM1)或用两种新的美登素类偶联物(huC242-DM3，huC242-DM4)，处理带有已建立的人结肠肿瘤COLO 205的皮下异种移植物的小鼠。用huC242-DM1处理，没有导致肿瘤消退，使肿瘤生长延迟20天。与之对照，新药剂显著地更加有效。在huC242-DM3处理组中，肿瘤完全消退，持续了45天。huC242-DM4更加有效，导致所有被处理的小鼠痊愈。
在第三个模型中(图9)，用以前描述的美登素类DM1的抗体偶联物(MY-9-6-DM1)或用两种新的美登素类偶联物(MY-9-6-DM3，MY-9-6-DM4)，处理带有已建立的人骨髓性白血病HL60的皮下异种移植物的小鼠。用MY-9-6-DM1处理没有导致肿瘤消退，使肿瘤生长延迟5天。与之对照，新药剂显著地更加有效。导致肿瘤消退。MY-9-6-DM3和MY-9-6-DM4均使肿瘤生长延迟大于20天。
在第四个模型中(图11)，在用HL-60细胞建立的皮下异种移植模型中，直接比较了本发明的美登素类(huMY9-6-DM4)和以前描述的美登素类的偶联物(huMY9-6-DM1)的效应。按照等同的剂量，用本发明的偶联物MY9-6-DM4处理，导致完全的肿瘤消退，持续85天。与之相比，以前描述的美登素类的偶联物的活性小得多，肿瘤生长延迟仅为大约48天。
在第五个模型中(图13a)，在皮下Ramos肿瘤模型中，本发明的美登素类与huB4抗体的偶联物以剂量依赖的方式，显示出了高的抗肿瘤活性。在非毒性的剂量下，获得了完全的肿瘤消退和痊愈(图13a，b)。
上面五个效应实验的结果说明，用本发明的含受到空间位阻的硫醇的美登素类得到的细胞结合剂偶联物，与以前描述的美登素类-细胞结合剂偶联物相比，抗肿瘤活性大大改进。
组合物及应用方法[202]本发明提供了药物组合物，其包括有效量的本发明的任何美登素类-细胞结合剂、其药学上可接受的盐或溶剂化物，和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明也提供了治疗方法，其包括向需要治疗的对象给予有效量的上述的任意偶联物。
类似地，本发明提供了用于在所选择的细胞群中诱导细胞死亡的方法，所述方法包括，用有效量的细胞毒性药剂接触靶细胞或含靶细胞的组织，所述细胞毒性药剂含有本发明的任何美登素类-细胞结合剂、其盐或溶剂化物。靶细胞是细胞结合剂可以与之结合的细胞。
如果需要，可以随所述偶联物给予其它的活性药剂，如其它的抗肿瘤剂。
合适的药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂是已知的，并且本领域的普通技术人员可以确定其临床可用性。
合适的载体、稀释剂和/或赋形剂的例子包括(1)Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水，pH大约是7.4，包含或不包含大约1mg/ml至25mg/ml的人血清白蛋白，(2)0.9％生理盐水(0.9％w/v NaCl)，和(3)5％(w/v)葡萄糖；并且也可以包括抗氧化剂如色胺和稳定剂如吐温20。
用于在所选择的细胞群中诱导细胞死亡的方法，可以在体外(invitro)、体内(in vivo)或离体(ex vivo)实施。
体外应用的例子包括，为了杀死的病态或恶性的细胞，在向同一患者移植自体骨髓之前，处理自体骨髓；为了杀死感受性T细胞和预防移植物抗宿主病(GVDH)，在移植骨髓之前，处理骨髓；为了杀死除了不表达靶抗原的所需变异体之外的所有细胞，或为了杀死表达不期望的抗原的变异体，处理细胞培养物。
非临床的体外应用的条件，可以容易地由本领域的普通技术人员确定。
临床离体应用的例子是，在癌症治疗或自身免疫病治疗中，在自体移植前，从骨髓中去除肿瘤细胞或淋巴细胞，或为了预防GXDH，在移植前从自体或同种异体的骨髓或组织中去除T细胞和其它淋巴细胞。处理可以如下地进行。从患者或其它个体采集骨髓，然后在含血清的培养基中温育，培养基中加入本发明的细胞毒剂，浓度范围是大约10μM至1pM，在大约37℃，温育大约30分钟至大约48小时。本领域的普通技术人员可以容易地确定确切的浓度条件和温育时间，即剂量。温育之后，用含血清的培养基洗涤骨髓细胞，并按照已知的方法经静脉输回患者体内。在采集骨髓和再输入处理细胞的时期之间，如果患者接受其它治疗如消融化疗(ablative chemotherapy)或全身放疗，则标准的医疗设备，在液氮中冷冻保存处理的骨髓细胞。
对于临床的体内用途，本发明的细胞毒剂将以溶液或冻干粉末被提供，它们经过无菌性和内毒素水平的检测。给予偶联物的合适的方案的例子如下。每周以静脉弹丸的形式给予偶联物，每周一次，持续4周。弹丸剂量是以50至1000ml的正常生理盐水被给予的，其中可以加入5至10ml的人血清白蛋白。每次给予的剂量是10μg至2000mg，静脉给予(每日剂量范围是100ng至20mg/kg)。治疗4周后，患者可以以周为单位继续接受治疗。本领域的技术人员可以确定临床上允许的关于给予途径、赋形剂、稀释剂、剂量、时间等的具体临床方案。
根据在所选择的细胞群中诱导细胞死亡的体内或离体方法，可以被治疗的医学状态的例子包括任何类型的恶性肿瘤，这包括，例如，肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌和淋巴器官癌；自身免疫病，如系统性红斑狼疮、风湿性关节炎和多发性硬化；移植排斥，如肾移植排斥、肝移植排斥、肺移植排斥、心脏移植排斥和骨髓移植排斥；移植物抗宿主病(graft versus host disease)；病毒感染，如CMV感染、HIV感染、AIDS等；和寄生虫感染，如贾第鞭毛虫病、阿米巴病、血吸虫病，和本领域的普通技术人员所确定的其它疾病。
实施例[214]现在，将参考非限制性的实施例来阐释本发明。除非另有指明，所有的百分数、比率、部分(parts)等等，都是按重量计。下面描述的实施例是针对R1是H或CH3，R2是CH3，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m的每一个是1和n是0的化合物而言的。对于本发明的其它化合物，可以进行类似的合成，在所述其它化合物中，R1和R2的每一个独立地是H、CH3、C2H5、或具有1至10个碳原子的更高级的烷基、烯基、或者苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；其中l、m和n的每一个是从1至5的整数，此外n也可以是0。
所有的试剂购自新泽西州的Aldrich Chemical Co.，或来自其它商业来源。美登醇(11)是如以前所描述地制备的(美国专利6,333,410)。核磁共振(1H NMR)谱是在Bruker 400MHz设备上获得的，质谱是在Bruker Daltonics Esquire 3000设备上用电喷雾离子化获得的。
实施例1美登素类4b的合成[216]4-巯基-4-甲基戊酸(7)将搅拌棒和150ml的添加漏斗装配于500ml的烧瓶。将该体系放置在氮气氛下。经导管加入150ml无水四氢呋喃(THF)和75ml含2.5M n-BuLi的己烷(18.7mmol)，并在-78℃的干冰/丙酮浴中将溶液冷却。在大约5分钟的时间内，经注射器滴加乙腈(7.3g，9.4ml，18mmol)。当白色的乙腈锂沉淀形成时，搅拌反应液30分钟。将异丁烯基硫醚(15g，17mmol)溶于100ml无水THF中，并在大约30分钟内，经添加漏斗滴加。移走冷却浴，搅拌反应液3小时。滴加38ml 0.5M HCl，同时在冰/水浴中冷却烧瓶。保留THF层，用75ml乙酸乙酯洗涤水层两次。合并THF层和乙酸乙酯层，用大约20g无水硫酸钠进行干燥，并转移至250ml的烧瓶中。在真空下经旋转蒸发去除溶剂，得到粗产物6。加入乙醇(30ml)和搅拌棒。当缓慢加入含8.0g NaOH的30ml去离子水溶液时，搅拌内容物。将回流冷凝器装配于烧瓶并置于氩气氛中。使反应回流过夜，然后冷却至室温。加入去离子水(60ml)，用25mL的乙酸乙酯和己烷的2∶1混合物萃取混合物两次。用浓HCl酸化水层至pH为2，之后用75ml的乙酸乙酯萃取三次。用无水Na2SO4干燥有机层，并在真空下经旋转蒸发去除溶剂，得到10g产物7(产率为39％)。应用得到的物质而无需进一步纯化。1H NMR(CDCl3)δ1.38(6H，s)，1.87-1.93(2H，m)，2.08(1H，s)，2.51-2.57(2H，m)。
4-甲基-4-(甲基二硫代)戊酸(8)在250ml烧瓶中，将巯基戊酸7的溶液(6.0ml，40mmol)溶于50ml去离子水中。以不引起过度起泡的速度向酸中加入碳酸钠(6.4g，60mmol)，并磁力搅拌。将100ml的添加漏斗装配于烧瓶，漏斗中装有甲基甲硫醇磺酸酯(7.5g，60mmol)的溶液，甲基甲硫醇磺酸酯溶于30ml的玻璃蒸馏(glass-distilled)的100％乙醇中。在冰/水浴中冷却烧瓶，并在氩气氛中维持该体系。尽可能快地将甲基甲硫醇磺酸酯溶液滴加至烧瓶中，但不引起过度的起泡。移除冷却浴，再搅拌反应混合物3小时。在真空下经旋转蒸发去除溶剂，直至保留大约20ml。随后，加入10ml的饱和碳酸氢钠和30ml的去离子水。在分液漏斗中，用25ml的乙酸乙酯洗涤混合物三次。用5MHCl调节水层至pH大约为2，并用120ml的乙酸乙酯萃取两次。合并有机层并用20ml的溶液洗涤两次，所述溶液由饱和NaCl和1M HCl以4∶1的比率组成。然后，用14g无水硫酸钠干燥有机层，在真空下经旋转蒸发去除溶剂，得到5.4g产物8(产率是70％)。可以将该物质带入下一步反应，而无需进一步纯化。1H NMR(CDCl3)δ1.54(6H，s)，2.5-2.21(2H，m)，2.64(3H，s)，2.69-2.72(2H，m)。MS(M+Na+)计算值217.0，实测值217.1。
N-羟基琥珀酰亚胺基4-甲基-4-(甲基二硫代)戊酸(9)将甲基二硫代戊酸8(3g，15mmol)溶于20ml的二氯甲烷中，并在加入N-羟基琥珀酰亚胺(2.65g，23mmol)时磁力搅拌，随后加入盐酸1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳亚二胺(EDC，4.4g，23mmol)。在氩气氛下搅拌混合物2小时。将反应混合物倒入125ml的分液漏斗中，加入40ml乙酸乙酯，用20ml的pH6.0的50mM磷酸钾缓冲液洗涤溶液两次，用12ml饱和氯化钠洗涤溶液一次。用14g无水Na2SO4干燥有机层，并在真空下经旋转蒸发去除溶剂，得到4.0g产物9(产率为90％)，应用产物9而无需进一步纯化。1H NMR(CDCl3)δ1.30(6H，s)，2.00-2.05(2H，m)，2.39(3H，s)，2.68-2.72(2H，m)，2.73-2.83(4H，m)。MS(M+Na+)计算值314.0，实测值314.1。
N-甲基-N-(4-甲基-4-甲基二硫代-1-氧代戊基)-L-丙氨酸(10)在配备有磁力搅拌棒的125ml烧瓶中，将N-甲基-L-丙氨酸(2.85g，18.0mmol)溶于二甲氧基乙烷和去离子水的1∶1溶液50ml中。加入三乙胺(6.9g，36mmol)，并滴加溶于40ml相同溶剂混合物的9(5.44g，18mmol)，同时剧烈搅拌该溶液，此过程为大约5分钟。2小时之后，在真空下经旋转蒸发，浓缩反应混合物至大约40ml，然后加入10ml去离子水和1M HCl，得到大约2的pH值。将混合物倒入分液漏斗中，用50ml的乙酸乙酯萃取两次。合并有机层，随后用7ml饱和氯化钠溶液洗涤。用8.0g无水Na2SO4干燥有机层，并在真空下经旋转蒸发去除溶剂。使残余物保留在最小体积的乙酸乙酯中，并通过二氧化硅上的层析纯化(二氧化硅40微米规格(flash grade)，二氧化硅床24×3.0cm，流动相己烷∶乙酸乙酯∶乙酸为50∶48∶2)。合并含有所需产物的部分，在真空下去除溶剂。通过将残余物溶解在最小体积的乙酸乙酯中并通过快速滴加己烷并同时搅拌来沉淀产物，去除残留的乙酸。加入己烷，直至经TLC分析，上清液中检测不到产物。真空干燥沉淀物4小时，得到2.2g产物10(产率是51％)。1HNMR(CDCl3)δ1.32(6H，s)，1.42(3H，d，J＝7Hz)，1.90-97(2H，m)，2.40(3H，s)，2.42-2.49(2H，m)，2.9(3H，s)，5.15(1H，q，J＝7Hz)。MS(M+Na+)计算值302.1，实测值302.0。
N2’-脱乙酰-N2’-(4-甲基-4-甲基二硫代-1-氧代戊基)-美登素(L-DM4-SMe，4e)。在氩气氛下，磁力搅拌含有美登醇(11，25mg，0.44mmol)和N-甲基-N-(4-甲基-4-甲基二硫代-1-氧代戊基)-L-丙氨酸(10，42.0mg，0.177mmol)的3mL二氯甲烷溶液，同时加入含有二环己基碳二亚胺(DCC，57.1g，0.277mmol)的0.67ml二氯甲烷溶液。1分钟之后，加入含有1M ZnCl2的二乙醚(0.03ml，0.03mmol)溶液。在室温下搅拌混合物2小时，随后加入5ml乙酸乙酯，经course滤纸真空过滤混合物。用2ml饱和碳酸氢钠溶液洗涤滤过物，随后用1ml饱和氯化钠溶液洗涤。用2g无水硫酸钠干燥有机层。在真空下去除溶剂，并用二氯甲烷和乙醇的混合物经二氧化硅层析纯化残余物，以去除未反应的美登醇。合并含有所需产物的部分，并在真空下去除溶剂，以得到非对映异构体4e和4f的混合物。将残余物吸收到最小体积的乙酸乙酯中，并用比率为68∶8∶24的己烷、2-丙醇和乙酸乙酯的混合物作为流动相，在50cm乘250cm、10微米DiazemTMCN柱上纯化。流速是118mL/min。在这些条件下，所需产物4e在保留时间11分钟时被洗脱出来，不需要的对映异构体4f的保留时间是19分钟。合并含有所需产物的部分，在真空下去除溶剂，得到12.0mg产物4e(产率是36％)。1H NMR(CDCl3)δ0.80(3H，s)，1.28-1.36(13H，m)，1.42-1.46(2H，m)，1.53-1.63(2H，m)，1.64(3H，s)，1.75-1.85(1H，m)，1.90-2.10(1H，m)，2.18(1H，dd，J＝3Hz和14Hz)，2.31(3H，s)，2.40-2.49(1H，m)，2.50-2.65(1H，m)，2.85(3H，s)，3.04(1H，d，J＝9Hz)，3.11(1H，d，J＝11Hz)，3.23(3H，s)，3.35(3H，s)，3.49(1H，d，J＝9Hz)，3.63(1H，d，J＝12Hz)，3.98(3H，s)，4.27(1H，t，J＝10Hz)，4.79(1H，dd，J＝3Hz和12Hz)，5.41(1H，q，J＝7Hz)，5.66(1H，dd J＝9Hz和15Hz)，6.21(1H，s)，6.42(1H，dd，J＝11Hz和15Hz)，6.65(1H，d，J＝1.5Hz)，6.73(1H，d，J＝11Hz)，6.81(1H，d，J＝1.5Hz)。高分辨率MS(M+H+)计算值826.3174，实测值826.3150。
N2’-脱乙酰-N2’-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素(L-DM4，4b)将上面得到的二硫化物4e(12mg，0.015mmol)溶解在1.0ml的1∶1乙酸乙酯∶甲醇中。然后，加入溶于0.50mL 50mM磷酸缓冲液pH7.5的二硫苏糖醇(18mg，0.117mmol)溶液。在氩气氛下磁力搅拌溶液3小时，然后加入1mL 200mM磷酸缓冲液，pH 6.0，用2mL的乙酸乙酯萃取该混合物三次。合并有机层并用1mL饱和氯化钠溶液洗涤，随后用1g无水硫酸钠干燥。在真空下去除溶剂，将残余物吸收到最小体积的乙酸乙酯中，并用比率为70∶8∶22的己烷、2-丙醇和乙酸乙酯混合物作为流动相，在50cm×250cm、10微米DiazemTMCN柱上纯化。流速是22mL/min。所需产物4b在保留时间10分钟时被洗脱出来。合并含有纯化的4b的部分，在真空下去除溶剂，得到11mg 4b(产率是97％)。1H NMR(CDCl3)δ0.80(3H，s)，1.19-1.23(1H，m)，1.28-1.36(12H，m)，1.42-1.46(2H，m)，1.53-1.63(2H，m)，1.64(3H，s)，1.75-1.85(1H，m)，1.90-2.10(1H，m)，2.18(1H，dd，J＝3Hz和14Hz)，2.40-2.49(1H，m)，2.50-2.65(2H，m)，2.88(3H，s)，3.04(1H，d，J＝9Hz)，3.11(1H，d，J＝11Hz)，3.23(3H，s)，3.35(3H，s)，3.49(1H，d，J＝9Hz)，3.63(1H，d，J＝12Hz)，3.98(3H，s)，4.27(1H，t，J＝10Hz)，4.79(1H，dd，J＝3Hz和12Hz)，5.41(1H，q，J＝7Hz)，5.66(1H，dd J＝9Hz和15Hz)，6.21(1H，s)，6.42(1H，dd，J＝11Hz和15Hz)，6.65(1H，d，J＝1.5Hz)，6.73(1H，d，J＝11Hz)，6.81(1H，d，J＝1.5Hz)。高分辨率MS(M+Na+)计算值802.3101，实测值802.3116。
实施例2美登素类4a的合成[222]4-甲基二硫代-戊酸(13)在500mL的烧瓶中，将4-巯基戊酸(12，16.6mg，124mmol)溶液溶于350mL去离子水中。磁力搅拌该溶液，同时向该酸中加入碳酸钠(19.7g，186mmol)，碳酸钠加入的速度不引起过度起泡。将250ml的添加漏斗装配于烧瓶，漏斗中装有甲基甲硫醇磺酸酯(23.4g，186mmol)溶液，其溶于220ml玻璃蒸馏的100％乙醇中。在冰/水浴中冷却烧瓶，并在氩气氛中维持该体系。尽可能快地将甲基甲硫醇磺酸酯溶液滴加至烧瓶中，但滴加速度不致于引起过度的起泡。移走冷却浴，再搅拌反应混合物2小时。在真空下经旋转蒸发去除溶剂，直至留下大约250ml。随后，加入30ml饱和碳酸氢钠溶液和50ml去离子水。在分液漏斗中，用200ml的乙酸乙酯洗涤该混合物三次。用5M HCl调节水层至pH大约为2，并用400ml的乙酸乙酯萃取两次。合并有机层，再用60ml的饱和NaCl溶液和1M HCl的4∶1混合物洗涤，然后，用50g无水硫酸钠干燥，最后，在真空下旋转蒸发去除溶剂，得到10.2g的产物13(产率是45％)。在下一反应中应用该物质，而不需进一步纯化。1H NMR(CDCl3)δ1.36(3H，d，J＝7Hz)，1.84-1.95(H，m)，1.85-2.56(1H，m)，2.42(3H，s)，2.53(2H，t，J＝7Hz)，2.85-2.95(1H，m)，MS(M+Na+)计算值203.3，实测值203.2。
N-羟基琥珀酰亚胺基4-甲基二硫代-戊酸酯(14)将甲基二硫代-戊酸(13，0.75g，4.16mmol)溶于7.0ml二氯甲烷中，磁力搅拌，同时加入N-羟基琥珀酰亚胺(0.526g，4.57mmol)，随后加入盐酸1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳亚二胺氢氯化物(0.877g，4.57mmol)。在氩气氛下搅拌混合物2.5小时，然后将混合物倒入60ml的分液漏斗中，分液漏斗中含有20mL的乙酸乙酯。用15ml的pH6.0的50mM磷酸钾缓冲液洗涤得到的溶液两次，用5ml饱和氯化钠洗涤一次。用8g无水Na2SO4干燥有机层，在真空下旋转蒸发去除溶剂，得到1.15g产物14(产率为87％)，其可以被用于下一反应而无需进一步纯化。1HNMRδ1.48(3H，d，J＝7)，2.06(1H，m)，2.17(1H，m)，2.55(3H，s)，2.93(2H，t，J＝7)，2.98(4H，s)，3.15(1H，m)。MS(M+Na+)计算值304.1，实测值304.0。
N-甲基-N-(4-甲基二硫代-1-氧代戊基)-L-丙氨酸(15)在配备有磁力搅拌棒的125ml烧瓶中，将N-甲基-L-丙氨酸(0.64g，6.2mmol)溶于二甲氧基乙烷和去离子水的1∶1混合液8ml中。加入三乙胺(0.841g，8.3mmol)，剧烈搅拌该烧瓶，同时滴加溶于8ml相同溶剂混合物的14(1.0g，3.6mmol)的溶液，此过程大约5分钟。2小时之后，在真空下旋转蒸发，浓缩反应混合物至大约3ml，然后加入15ml去离子水和1M HCl，得到大约2的pH值。将混合物倒入60mL的分液漏斗中，用15ml的乙酸乙酯萃取两次。合并有机层，用3ml饱和氯化钠溶液洗涤，随后用8.0g无水Na2SO4干燥，最后，在真空下旋转蒸发去除溶剂。将残余物吸收到最小体积的乙酸乙酯中，并经二氧化硅层析纯化(二氧化硅40微米flash grade，二氧化硅床24×3.0cm，流动相己烷∶乙酸乙酯∶乙酸为50∶48∶2)。合并含所需产物15的部分，在真空下去除溶剂。通过将残余物溶解在最小体积的乙酸乙酯中并沉淀产物，去除残留乙酸，沉淀产物是通过快速滴加己烷并同时搅拌而实施的。加入己烷，直至经TLC分析上清液中检测不到产物。真空干燥沉淀物，得到0.60g产物15(产率是62％)。1H NMR(CDCl3)δ1.35(3H，d，J＝7)，1.41(3H，d，J＝7)，1.94-2.03(2H，m)，2.43(3H，s)，2.50-2.55(2H，m)，2.83-2.93(1H，m)，2.98(3H，s)，5.14(1H，q，J＝7)。MS(M+Na+)计算值288.1，实测值288.1。
N2’-脱乙酰-N2’-(4-甲基二硫代-1-氧代戊基)-美登素(L-DM3-SMe，4c)在氩气氛下，磁力搅拌含有美登醇(25mg，0.44mmol)和15(42.0mg，0.177mmol)的3mL二氯甲烷溶液，同时加入二环己基碳二亚胺(DCC，57.1g，0.277mmol)在0.67ml二氯甲烷中的溶液。1分钟之后，加入含有1M ZnCl2的二乙醚(0.03ml，0.03mmol)溶液。在室温下搅拌混合物2小时，随后加入5ml乙酸乙酯，经course滤纸真空过滤混合物。用2ml饱和碳酸氢钠溶液洗涤滤过物，随后用1ml饱和氯化钠溶液洗涤。用2g无水硫酸钠干燥有机层，然后在真空下去除溶剂。用二氯甲烷和甲醇的混合物经二氧化硅层析纯化残余物，以去除未反应的美登醇。合并含有所需产物的部分，并在真空下去除溶剂，得到非对映异构体4c和4d的混合物。将残余物吸收到最小体积的乙酸乙酯中，并用比率为68∶8∶24的己烷、2-丙醇和乙酸乙酯混合物作为流动相，在50cm乘250cm、10微米DiazemTMCN柱上纯化。流速是118mL/min。所需产物4c在保留时间11分钟时被洗脱出来，不需要的对映异构体4d的保留时间是19分钟。合并含有所需产物的部分，在真空下去除溶剂，得到12.0mg产物4c(产率是36％)。1H NMR(CDCl3)δ0.80(3H，s)，1.19-1.23(1H，m)，1.28-1.36(9H，m)，1.42-1.46(1H，m)，1.53-1.63(2H，m)，1.64(3H，s)，1.80-1.89(1H，m)，1.90-2.09(1H，m)，2.18(1H，dd，J＝3Hz和14Hz)，2.32(3H，s)，2.33-2.42(1H，m)，2.49-2.62(2H，m)，2.88(3H，s)，3.04(1H，d，J＝9Hz)，3.11(1H，d，J＝11Hz)，3.23(3H，s)，3.35(3H，s)，3.49(1H，d，J＝9Hz)，3.63(1H，d，J＝12Hz)，3.98(3H，s)，4.27(1H，t，J＝10Hz)，4.79(1H，dd，J＝3Hz和12Hz)，5.41(1H，q，J＝7Hz)，5.66(1H，dd J＝9Hz和15Hz)，6.21(1H，s)，6.42(1H，dd，J＝11Hz和15Hz)，6.65(1H，d，J＝1.5Hz)，6.73(1H，d，J＝11Hz)，6.81(1H，d，J＝1.5Hz)。MS(M+Na+)计算值834.3，实测值834.3。
N2’-脱乙酰-N2’-(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(L-DM3，4a)将L-DM3-SMe(4c，12mg，0.015mmol)溶解在1.0ml的1∶1乙酸乙酯∶甲醇混合物中。加入溶于pH 7.5的0.50ml 50mM磷酸缓冲液的二硫苏糖醇(18mg，0.117mmol)溶液。在氩气氛下磁力搅拌反应液3小时，然后加入1mL 200mM磷酸缓冲液，pH 6.0，用2mL的乙酸乙酯萃取混合物三次。合并有机层并用1mL饱和氯化钠溶液洗涤，随后用1g无水硫酸钠干燥。在真空下去除溶剂，将残余物吸收到最小体积的乙酸乙酯中，并用比率为70∶8∶22的己烷、2-丙醇和乙酸乙酯混合物作为流动相，在50cm×250cm、10微米DiazemTMCN柱上纯化。流速是22mL/min。所需产物在保留时间10分钟时被洗脱出来。合并含有纯化产物的部分，在真空下去除溶剂，得到11mg的产物4a(产率是97％)。1H NMR(CDCl3)δ0.80(3H，s)，1.19-1.23(1H，m)，1.28-1.36(9H，m)，1.42-1.46(1H，m)，1.53-1.63(2H，m)，1.64(3H，s)，1.80-1.89(1H，m)，1.90-2.09(1H，m)，2.18(1H，dd，J＝3Hz和14Hz)，2.33-2.42(1H，m)，2.49-2.62(2H，m)，2.88(3H，s)，3.04(1H，d，J＝9Hz)，3.11(1H，d，J＝11Hz)，3.23(3H，s)，3.35(3H，s)，3.49(1H，d，J＝9Hz)，3.63(1H，d，J＝12Hz)，3.98(3H，s)，4.27(1H，t，J＝10Hz)，4.79(1H，dd，J＝3Hz和12Hz)，5.41(1H，q，J＝7Hz)，5.66(1H，dd J＝9Hz和15Hz)，6.21(1H，s)，6.42(1H，dd，J＝11Hz和15Hz)，6.65(1H，d，J＝1.5Hz)，6.73(1H，d，J＝11Hz)，6.81(1H，d，J＝1.5Hz)。MS(M+Na+)计算值788.3，实测值788.3。
实施例3美登素类4g、4h的合成(图3c)[227]R-1，3-二-O-对甲苯磺酰-丁烷(17)在0℃，在氩气氛下，用对甲苯磺酰氯(12.70g，66.84mmol)处理溶于无水吡啶(40mL)和无水甲苯(60mL)的混合物的R-(-)-1，3-丁二醇(16，2.00g，22.22mmol)溶液。在0℃搅拌5分钟后，室温搅拌2小时，在真空下蒸发混合物，再溶解在乙酸乙酯中，并用0.1M含水NaHCO3洗涤，随后用饱和NaCl洗涤。用MgSO4干燥有机层，过滤，蒸发溶剂。在硅胶上经层析纯化，用1∶2(v/v)乙酸乙酯/己烷洗脱，得到6.51g(74％)的标题产物17。
Rf＝0.40(1∶1EtOAc/己烷)；1H NMR(CDCl3)7.76(dd，4H，J＝1.0，8.0Hz)，7.35(dt，4H，J＝0.4，8.0+8.0Hz)，4.70(m，1H)，4.03(m，1H)，3.94(m，1H)，2.46(s，6H)，1.92(m，2H)，1.26(d，3H，J＝6.3Hz)；13C NMR 145.17，133.00，130.11，128.12，127.91，76.28，66.21，36.08，21.86，21.06；MS420.99(M+Na)+，421.93(M+1+Na)+。
S-4-O-乙基黄原酸-戊腈(S-4-O-Ethylxanthic-pentanenitrile)(18)用NaCN(0.65)处理溶于无水DMSO(50mL)中的R-1，3-二-O-对甲苯磺酰-丁烷(17，4.80g，12.06mmol)的溶液。在氩气氛下，室温搅拌18小时后，用乙酸乙酯稀释反应混合物，连续用冷的pH 7.5的1.0M NaH2PO4、水和pH 4.0的1.0M NaH2PO4洗涤。分离有机层并用MgSO4干燥，过滤，然后蒸发，得到2.63g粗产物R-3-O-对甲苯磺酰-戊腈。MS 275.80(M+Na)+，276.75(M+1+Na)+。直接应用产物而不需进一步纯化。
向粗产物R-3-O-对甲苯磺酰-戊腈(2.63g)的乙醇(15ml)溶液中，加入含有O-黄原酸乙酯钾(potassium O-ethylxanthate)(4.55g)的乙醇(50ml)。在氩气氛下搅拌过夜之后，浓缩该混合物，用乙酸乙酯稀释，通过短的二氧化硅柱进行过滤。浓缩洗脱物并经硅胶层析而纯化，用1∶4(v/v)的EtOAc/己烷洗脱，得到1.54g标题产物18(63％，2步)。Rf＝0.40(1∶4EtOAc/己烷)。1H NMR(CDCl3)4.67(dd，2H，J＝7.1，14.2Hz)，3.86(ddd，1H，J＝7.0，14.0，21.9Hz)，2.50(t，2H J＝7.3+7.6Hz)，2.06(m，2H)，1.44(m，6H)；13C NMR 213.04，119.16，70.28，44.57，32.10，20.20，15.21，13.93；MS226.51(M+Na)+，242.51(M+K)+。
S-(+)-4-甲基二硫代-戊酸(19)向含有S-4-O-乙基黄原酸-戊腈(18，1.95g(9.61mmol))的乙醇(10ml)和水(150ml)的混合物的溶液中，加入5.0g NaOH。在氩气氛下，回流反应混合物过夜。冷却混合物至室温，用水(150ml)稀释，用1∶1的EtOAc/己烷(2×100ml)萃取。用H3PO4酸化水层至pH 2.5-3.0，并用EtOAc(6×75ml)萃取。合并有机层，用MgSO4干燥，过滤和蒸发至干燥，得到粗产物S-4-巯基戊酸。将粗产物直接用于下一步骤而不需进一步纯化。
在0℃，在45分钟的时间内，向粗提的S-4-巯基戊酸(1.2g)溶于乙醇(50ml)和0.5M NaH2PO3pH 7.0(75mL)的混合物的溶液中，滴加含有甲基甲硫醇磺酸酯(1.47g，11.65mmol)的5无水TNF(5ml)。在0℃，在氩气氛下搅拌30分钟之后，浓缩混合物并用二氯甲烷(2×50ml)萃取。用H3PO4酸化水层至pH 2.5-3.0，并用EtOAc(4×100ml)萃取。合并有机层，用MgSO4干燥，过滤和蒸发。经硅胶层析纯化残留物，用(1∶100∶400的HOAc/EtOAc/己烷)洗脱，得到1.43g(83％)的标题产物19。Rf＝0.32(1∶100∶400的HOAc/EtOAc/己烷)；1H NMR(CDCl3)2.91(ddd，1H，J＝6.8，13.7，20.5Hz)，2.53(t，2H，J＝7.7+7.4Hz)，2.42(s，3H)，1.94(m，2H)，1.36(d，3H，J＝6.8Hz)；13C NMR 179.18，45.35，31.58，30.73，24.70，21.05；MS202.92(M+Na)+，203.91(M+1+Na)+；[α]＝41.35(c＝2，CH3OH)。
N-甲基-N-[4-(S)-甲基二硫代-1-氧代戊基]-S-丙氨酸(15a)用上面针对化合物14而描述的方法，将S-(+)-4-(甲基二硫代)-戊酸(19)转变为N-羟基琥珀酰亚胺酯20。通过上面针对化合物15而描述的方法，与N-甲基-L-丙氨酸反应，得到15a，(产率是62％)。H1NMRδ1.36(3H，d，J＝7)，1.42(3H，d，J＝7)，1.93-1.98(2H，m)，2.40(3H，s)，2.50-2.53(2H，m)，2.90-2.95(1H，m)，2.99(3H，s)，5.14(1H，q，J＝7)，MS(M+Na)计算值288.1，实测值288.1。
N2’-脱乙酰-N2’-(4-(S)-甲基二硫代-1-氧代戊基)-美登素(DM3-SMe，4g，h)如上述的4c的合成，应用含有DCC和氯化锌的二氯甲烷，连接美登醇(11)和15a。获得带有N-甲基-S-丙氨酰部分(4g，S，S)和N-甲基-R-丙氨酰部分(4h，R，S)的2种非对映异构体的混合物。用己烷∶乙酸乙酯∶2-丙醇(68∶24∶8，v/v/v)进行等强度洗脱，流速是1mL/min，通过Kromasil氰柱(4.6mm×250mm)上的HPLC分离非对映异构体。在这些条件下，异构体4g(S，S)在24.5分钟时被洗脱出来。质谱m/z 834.2(M+Na)+。在34.6分钟时，另一异构体4H(R，S)的峰被很好地分离和洗脱出来。MSm/z 834.2(M+Na)+。
实施例4美登素类4k，l的合成(图3d)[234]S-1，3-二-O-对甲苯磺酰-丁烷22在0℃，在氩气氛下，用对甲苯磺酰氯(12.70g，66.84mmol)处理S-(-)-1，3-丁二醇(21，2.00g(22.22mmol))溶于无水吡啶(40ml)和无水甲苯(60ml)混合物的溶液。在0℃下搅拌5分钟后，室温搅拌2小时，在真空下蒸发混合物。将残留物在乙酸乙酯中再溶解，用0.1M含水NaHCO3和饱和NaCl洗涤。分离有机层，用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过硅胶层析纯化残余物，用1∶2乙酸乙酯/己烷洗脱，得到6.25g(71％)的标题产物22。Rf＝0.40(1∶1EtOAc/己烷)；1H NMR(CDCl3)7.76(dd，4H，J＝1.0，8.0Hz)，7.35(dt，4H，J＝0.4，8.0+8.0Hz)，4.70(m，1H)，4.03(m，1H)，3.94(m，1H)，2.46(s，6H)，1.92(m，2H)，1.26(d，3H，J＝6.3Hz)；13C NMR145.17，133.00，130.11，128.12，127.91，76.28，66.21，36.08，21.86，21.06；MS420.99(M+Na)+。
R-4-O-乙基黄原酸-戊腈(23)用NaCN(0.85g)处理S-1，3-二-O-对甲苯磺酰-丁烷(22，6.25g(15.70mmol))在60无水DMSO(50mL)中的溶液。在氩气氛下，室温搅拌反应混合物18小时。然后，用乙酸乙酯稀释反应混合物，连续用冷的pH 7.5的1.0M NaH2PO4、水和pH 4.0的1.0M NaH2PO4洗涤。用MgSO4干燥有机层，过滤，蒸发，得到3.62g粗产物S-3-O-对甲苯磺酰-戊腈。直接应用产物而不需进一步纯化。
向含有粗产物S-3-O-对甲苯磺酰-戊腈(3.62g)的乙醇(50ml)溶液中，加入含有O-黄原酸乙酯钾(5.72g)的乙醇(100ml)。在氩气氛下搅拌过夜之后，浓缩混合物，用乙酸乙酯稀释，并经过短的硅胶柱过滤。浓缩洗脱物并经硅胶层析纯化残余物，用1∶4的EtOAc/己烷洗脱，得到2.0g的标题产物23(62％，2步)。Rf＝0.40(1∶4EtOAc/己烷)。1H NMR(CDCl3)4.67(dd，2H，J＝7.1，14.2Hz)，3.86(ddd，1H，J＝7.0，14.0，21.9Hz)，2.50(t，2H J＝7.3+7.6Hz)，2.06(m，2H)，1.44(m，6H)；13C NMR 213.04，119.16，70.28，44.57，32.10，20.20，15.21，13.93；MS226.51(M+Na)+，242.51(M+K)+。
R-(-)-4-甲基二硫代-戊酸(24)用NaOH(6.0g)处理含有R-4-O-乙基黄原酸-戊腈(23，2.0g(9.85mmol))的乙醇(10ml)和水200ml的混合物的溶液。在氩气氛下，回流反应混合物过夜。用水(150ml)稀释混合物并用1∶1的EtOAc/己烷(2×100ml)萃取。用H3PO4酸化水层至pH 2.5-3.0，并用EtOAc(6×75ml)萃取。合并有机层，经MgSO4干燥，过滤和蒸发至干燥，得到粗产物R-4-巯基戊酸。将粗产物直接用于下一步骤而不需进一步纯化。
在0℃，在45分钟的时间内，向含有1.60g粗提的R-4-巯基戊酸的乙醇(50ml)和0.5M NaH2PO4pH 7.0(75mL)的混合物的溶液中，滴加含有甲基甲硫醇磺酸酯(1.96g，15.53mmol)的无水TNF(7ml)。在0℃，在氩气氛下搅拌反应混合物30分钟，然后在室温下搅拌反应混合物2小时。浓缩混合物并用二氯甲烷(2×50ml)萃取。用H3PO4酸化水层至pH 2.5-3.0，用EtOAc(4×100ml)萃取。合并有机层，经MgSO4干燥，过滤和蒸发。经硅胶层析纯化残留物，用(1∶100∶400的HOAc/EtOAc/己烷)洗脱，得到1.65g(93％)的标题产物24。Rf＝0.32(1∶100∶400的HOAc/EtOAc/己烷)；1H NMR(CDCl3)2.91(ddd，1H，J＝6.8，13.7，20.4Hz)，2.53(t，2H，J＝7.7+7.4Hz)，2.42(s，3H)，1.96(m，2H)，1.36(d，3H，J＝6.8Hz)；13C NMR 179.46，45.67，31.91，31.07，25.02，21.36；MS202.9(M+Na)+，203.9(M+1+Na)+；[α]＝-39.16(c＝2，CH3OH)。
N-甲基-N-[4-(R)-甲基二硫代-1-氧代戊基]-S-丙氨酸(15b)用上述的针对化合物14的方法，将R-(+)-4-(甲基二硫代)-戊酸(24)转变为N-羟基琥珀酰亚胺酯25。通过上述针对化合物15的方法，与N-甲基-L-丙氨酸反应，得到15b。MSm/z(M+Na)计算值288.1，实测值288.1。
N2’-脱乙酰-N2’-(4-(R)-甲基二硫代-1-氧代戊基)-美登素(DM3-SMe，4k，l)如上述的4c的合成，应用溶于二氯甲烷中的DCC和氯化锌，连接美登醇(11)和15b。获得带有N-甲基-S-丙氨酰部分(4k，S，R)和N-甲基-R-丙氨酰部分(4l，R，R)的2种非对映异构体的混合物。用己烷∶乙酸乙酯∶2-丙醇(68∶24∶8，v/v/v)等强度洗脱，在Kromasil氰柱(4.6mm×250mm)上经HPLC分离非对映异构体，流速是1mL/min。在这些条件下，异构体4k(S，R)在23.9分钟时被洗脱出来。质谱m/z 834.2(M+Na)+。在33.7分钟时，另一异构体4l(R，R)的峰被很好地分离和洗脱出来。MSm/z 834.2(M+Na)+。
实施例5a美登素类和抗体-美登素类偶联物的体外细胞毒性[241]KB(ATCC CCl-17)细胞系是人上皮来源。SK-BR-3(ATCCHTB-30)细胞系是由人乳腺腺癌建立的。人结肠肿瘤细胞系COLO 205(ATCC CCL-222)和HT-29(ATCC HTB 38)、人黑素瘤细胞系A-375(ATCC CRL 1619)、人伯基特淋巴瘤细胞系Ramos(ATCC CRL-1596)和人骨髓性白血病细胞系HL 60(ATCC CCL-240)均是从马里兰州的ATCC获得的。细胞系是在带有L-谷氨酰胺的Dulbecco′s modifiedEagles Medium(DMEM，Biowhittaker，Walkersville，MD)中生长的，培养基中补充有10％的胎牛血清(Hyclone，Logan，Utah)和50μg/ml的硫酸庆大霉素(Life Technologies，Rockville，MD)。在含有6％CO2的潮湿气氛中，于36-37.5℃保持细胞。
进行的细胞毒性研究应用的是克隆形成试验(clonogenic assay)。以每孔1000个细胞的固定数值，将测试细胞系铺在6孔培养皿中。用各种美登素类(游离的或者偶联于抗体的)的各种浓度(0至3nm)温育细胞72小时。然后，从板中吸出培养基并放置新鲜的培养基。让培养物生长并形成集落，铺板后，维持7-10天。然后，用溶于10％福尔马林/PBS的0.2％结晶紫固定并染色培养物，计集落数。用数出的集落数目除以被铺的细胞数目，确定出非处理细胞(单独的培养基)的铺板效率。用暴露于药物的孔中的集落数除以对照孔中的集落数，确定出暴露于药物的细胞的存活分数。
图4显示了本发明的新的美登素类的体外细胞毒性测定结果。对于被测试的细胞系，SK-BR-3和A-375，带有具有位阻的二硫键的新的美登素类4c，e均是高度细胞毒性的，IC50值的范围是从7×10-12M至2.5×10-11M。因此，在带有二硫化物部分的碳上引入烷基取代基，保持了高的细胞毒力。本发明的含具有空间位阻的硫醇的美登素类4a，比以前描述的相应的非位阻美登素类1的效力大30至50倍。因此，在带有硫醇部分的碳上引入烷基取代基大大增加了效力。
图4c和4d中显示了本发明的美登素类的抗体偶联物的体外测试结果。在针对人结肠肿瘤的huC242抗体上连接两种新的美登素类，4a或4b，导致对靶细胞的抗原特异性杀伤。因此，这些偶联物对于抗原阳性COLO 205细胞是高度有效的，IC50值的范围是从1.1×10-11M至1.3×10-11M。与之对照，这些偶联物对抗原阴性的A-375细胞的细胞毒性要小100至250倍，这说明，本发明的新的美登素类产生拥有具有空间位阻的二硫键的偶联物，它们显示出高度的靶向特异性的细胞毒性。
实施例5b用美登素类4a或4b制备huC242抗体的细胞毒性偶联物(方法A，图5a，b)[245]将huC242抗体(8mg/ml)在pH6.5的含水缓冲液(50mM磷酸钾、50mM氯化钠、2mM乙二胺四乙酸二钠盐)中的溶液，与7至10倍的过量摩尔数的SPDP[琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)-丙酸酯，3a]，或与N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫)-丁酸酯(SPDB，3b)温育。反应混合物通过Sephadex G25凝胶过滤柱而被纯化。应用抗体的已知的消光系数ε280nm＝217,560M-1cm-1，用分光光度法测定抗体浓度。
用pH 6.5的含水缓冲液(50mM磷酸钾、50mM氯化钠、2mM乙二胺四乙酸二钠盐)稀释修饰的抗体至2.5mg/ml，然后用二甲基乙胺中的1.5至2.5倍过量摩尔数的DM3或DM4处理(DMA的终浓度是3％v/v)。在室温下温育反应混合物18小时。经过Sephadex G25凝胶过滤柱纯化反应混合物。应用抗体的已知消光系数ε280nm＝217,560M-1cm-1和ε252nm＝80,062M-1cm-1；DM3或DM4的已知消光系数ε280nm＝5,700M-1cm-1和ε252nm＝26,790M-1cm-1用分光光度法测定偶联物的浓度。得到的偶联物是单体的，并且，平均每个抗体分子连接有3.2-3.5个DM3或DM4。
实施例5c用美登素类4a或4b制备huC242抗体的细胞毒性偶联物(方法B，图5c)[247]将huC242抗体(8mg/ml)在pH6.5的含水缓冲液(50mM磷酸钾、50mM氯化钠、2mM乙二胺四乙酸二钠盐)中的溶液，与7至10倍的过量摩尔数的SMCC[琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯，26]温育2小时。经过Sephadex G25凝胶过滤柱纯化反应混合物。用抗体的已知消光系数ε280nm＝217,560M-1cm-1，用分光光度法测定抗体浓度。
用pH 6.5的含水缓冲液(50mM磷酸钾、50mM氯化钠、2mM乙二胺四乙酸二钠盐)稀释修饰的抗体至2.5mg/ml，然后用二甲基乙胺中的1.5至2.5倍过量摩尔数的DM3或DM4处理(DMA的终浓度是3％v/v)。在室温下温育反应混合物18小时。经过Sephadex G25凝胶过滤柱纯化反应混合物。应用已知的消光系数(对于抗体，ε280nm＝217,560M-1cm-1和ε252nm＝80,062M-1cm-1；对于DM3或DM4，ε280nm＝5,700M-1cm-1和ε252nm＝26,790M-1cm-1)，用分光光度法测定偶联物的浓度。得到的偶联物是单体的，并且，平均每个抗体分子连接有3.2-3.5个DM3或DM4。
实施例5d用美登素类4a或4b制备huC242抗体的细胞毒性偶联物(方法C，图5d)[249]将huC242抗体(8mg/ml)在pH 6.5的含水缓冲液(50mM磷酸钾、50mM氯化钠、2mM乙二胺四乙酸二钠盐)中的溶液，与7至10倍的过量摩尔数的SIAB[N-琥珀酰亚胺基4-(碘乙酰)-氨基苯甲酸酯，27]温育2小时。经过Sephadex G25凝胶过滤柱纯化反应混合物。用抗体的已知消光系数ε280nm＝217,560M-1cm-1，用分光光度法测定抗体浓度。
实施例6huC242-美登素类偶联物在体内抵抗HT-29异种移植物的效率[250]五周龄的雌性SCID鼠(20只动物)右侧皮下接种HT-29人结肠癌细胞(1.5×106细胞/鼠)，所述细胞溶于0.1ml的无血清培养液中。让肿瘤生长11天至平均体积为100mm3。然后，将动物随机分为四组(每组五只动物)。第一组接受静脉给予的huC242-DM1偶联物(DM1的剂量是75μg/kg，qd×5)。第二组接受静脉给予的huC242-DM3偶联物(DM3的剂量是75μg/kg，qd×5)。第三组接受静脉给予的huC242-DM4偶联物(DM4的剂量是75μg/kg，qd×5)，第四组动物作为对照组并接受PBS，处理方案与组1-3中的方案相同。
每周两次测定肿瘤的体积，用公式肿瘤体积＝1/2(长×宽×高)计算肿瘤体积。动物的体重也是每周测定两次。结果显示在图7中。小鼠对照组的肿瘤在35天时生长至接近1000mm3的体积。用huC242-DM1处理，导致肿瘤生长延迟18天，而用本发明的美登素类4a和4b制成的偶联物显著地更有效，分别延迟肿瘤生长至28天和36天。
实施例7huC242-美登素类偶联物在体内抵抗COLO 205异种移植物的效率 五周龄的雌性SCID鼠(20只动物)右侧皮下接种COLO 205人结肠癌细胞(1.5×106细胞/鼠)，所述细胞溶于0.1ml的无血清培养基中。让肿瘤生长11天至平均体积为100mm3。然后，将动物随机分为四组(每组五只动物)。第一组接受静脉给予的huC242-DM1偶联物(DM1的剂量是75μg/kg，qd×5)。第二组接受静脉给予的huC242-DM3偶联物(DM3的剂量是75g/kg，qd×5)。第三组接受静脉给予的huC242-DM4偶联物(DM4的剂量是75μg/kg，qd×5)，而第四组动物作为对照组接受PBS，处理方案与组1-3中的方案相同。[253]每周两次测定肿瘤的体积，用公式肿瘤体积＝1/2(长×宽×高)计算肿瘤体积。动物的体重也是每周测定两次。结果显示在图8中。小鼠对照组的肿瘤在24天时生长至接近900mm3的体积。用huC242-DM1处理，导致肿瘤生长延迟20天，而用本发明的美登素类4a制成的偶联物显著地更有效，引起持续45天的完全肿瘤消退。用本发明的美登素类4b制成的偶联物甚至更有效，导致所有被治疗动物痊愈。
实施例8MY9-6-美登素类偶联物在体内抵抗HL-60异种移植物的效率[254]五周龄的雌性SCID鼠(20只动物)右侧皮下接种HL-60人骨髓性白血病细胞(1.5×106细胞/小鼠)，所述细胞溶于0.1ml的无血清培养基中。让肿瘤生长12天至平均体积为100mm3。然后，将动物随机分为四组(每组五只动物)。第一组接受静脉给予的MY9-6-DM1偶联物(DM1的剂量是200μg/kg，qd×5)。第二组接受静脉给予的MY9-6-DM3偶联物(DM3的剂量是200μg/kg，qd×5)。第三组接受静脉给予的MY9-6-DM4偶联物(DM4的剂量是200μg/kg，qd×5)，而第四组动物作为对照组接受PBS，处理方案与组1-3中的方案相同。
每周两次测定肿瘤的体积，用公式肿瘤体积＝1/2(长×宽×高)计算肿瘤体积。动物的体重也是每周测定两次。结果显示在图9中。小鼠对照组的肿瘤在21天快速生长至接近1600mm3的体积。用MY9-6-DM1处理，导致肿瘤生长延迟大约5天，而用本发明的美登素类4a和4b制成的偶联物显著地更有效，延迟肿瘤生长大于20天。
实施例9用美登素类DM4(4b)制备huMy9-6抗体的细胞毒性偶联物[256]在含有2mM乙二胺四乙酸(缓冲液A)和5％乙醇的pH 6.550mM磷酸钾溶液中，将浓度为8mg/ml的huMy9-6抗体溶液与6.5倍过量摩尔数的SSNPB[硫代琥珀酰亚胺4-(5′-硝基-2′-吡啶基二硫代)丁酸酯]温育。修饰的抗体通过用缓冲液A平衡的Sephadex G25凝胶过滤柱而被纯化，纯化抗体的浓度利用抗体在280nm处的消光系数，用分光光度法测定。用缓冲液A将修饰的抗体稀释至4.9mg/ml，并用1.7倍过量摩尔数的DM4室温温育18小时，DM4是以二甲基乙胺中的储存液形式被加入反应混合物中的(二甲基乙酰胺的终浓度是3％v/v)。经过用pH6.5的PBS平衡的Sephadex G25柱，纯化抗体-药物偶联物。用抗体和DM4的已知消光系数(对于抗体，ε280nm＝206,460M-1cm-1，ε252nm＝72,261M-1cm-1；对于DM4，ε280nm＝5,700M-1cm-1，ε252nm＝26,790M-1cm-1)，用分光光度法测定偶联物的浓度。得到的抗体-药物偶联物中，每个抗体分子平均有3.6个DM4分子。生物化学分析证明，抗体在偶联后维持有大于94％的单体并具有结合亲和性，这是与未被修饰的抗体相比较而言的，这可以利用流式细胞仪来测定。通过HPLC分析来测定没有共价地连接于抗体的药物(游离药物)的量，发现其不到所有连接药物的1％。
实施例10huMy9-6-DM4偶联物的体外选择性和效应[257]用集落形成分析来检测huMy9-6-DM4对CD33表达细胞(HL-60)和CD33阴性Namalwa细胞的细胞毒性，其中细胞杀伤活性是通过对处理后可以生长的集落数目进行定量而确定的。对于CD-33阳性HL-60人肿瘤细胞，huMy9-6-DM4显示了体外有效的细胞杀伤活性(图10)。对于CD33阴性人Namalwa细胞，没有观察到明显的细胞毒性，这提示，CD33-依赖性细胞毒性归因于偶联物的抗-CD33抗体huMy9-6的特异性靶向作用。
实施例11SCID鼠中，huMy9-6-DM4偶联物对抗HL60人肿瘤异种移植物的体内效应[258]在带有人HL-60肿瘤异种移植物的SCID鼠中，测定了huMy9-6-DM4的体内效应。皮下注射HL-60细胞，让肿瘤生长至平均体积为100mm3。经静脉输送huMy9-6-DM4，每日一次，持续5天，剂量是图11中指出的剂量。剂量是用偶联物中的DM4的微克数来表示的，对应地，每μgDM4有大约67μg的抗体剂量。测量肿瘤体积，将其作为治疗效果的指示物，并监测鼠的体重，以表示治疗造成的毒性。在几乎不引起毒性的剂量下，huMy9-6-DM4诱导人HL-60细胞异种移植物的肿瘤生长延迟时间延长(图11)。也比较了huMy9-6-DM4的效应和huMy9-6-DM1的效应。出乎意料的是，发现huMy9-6-DM4比huMy9-6-DM1更有效。huMy9-6-DM4维持动物的完全缓解(CR)几乎达60天，而用huMy9-6-DM1处理的动物在大约20天的CR之后复发。
实施例12用美登素类DM4(4b)制备huB4抗体的细胞毒性偶联物[259]在含有2mM乙二胺四乙酸(缓冲液A)和5％的二甲基乙酰胺的pH 6.5的50mM磷酸钾缓冲液中，将浓度为20mg/ml的huB4抗体溶液与8倍过量摩尔数的SSNPB[磺基琥珀酰亚胺4-(5′-硝基-2′-吡啶基二硫代)丁酸酯]温育。经过用缓冲液A平衡的Sephadex G25凝胶过滤柱，纯化修饰的抗体，并利用抗体在280nm处的消光系数(199,560M-1cm-1)，用分光光度法测定纯化的抗体的浓度。用缓冲液A将修饰的抗体稀释至8mg/ml，并用1.7倍过量摩尔数的DM4室温温育3小时，DM4是以二甲基乙酰胺中的储存液形式被加入反应混合物中的(二甲基乙酰胺的终浓度是3％v/v)。经过用pH 6.5的PBS缓冲液平衡的Sephadex G25柱和Sephadex S300柱，纯化抗体-药物偶联物。用抗体(ε280nm＝199,560M-1cm-1；ε252nm＝67,850M-1cm-1)和DM4(ε280nm＝5,700M-1cm-1，ε252nm＝26,790M-1cm-1)的已知消光系数，用分光光度法测定偶联物的浓度。在得到的抗体-药物偶联物中，每个抗体分子平均有4.0个DM4分子。生物化学分析证明，抗体在偶联之后多于98％的维持为单体并具有结合亲和性，这是与未被修饰的抗体相比较而言的，这可以利用流式细胞仪来测定。通过HPLC分析来测定没有共价连接于抗体的药物(游离药物)的量，其为总连接药物的大约2％。
实施例13huB4-DM4偶联物的体外选择性和效应[260]应用基于MTT的分析，检测huB4-DM4对CD-19表达细胞(Ramos)和CD-19阴性细胞系(Colo 205)的细胞毒性，其中细胞杀伤活性是通过对用偶联物处理后残留的存活细胞数目进行定量而确定的。存活细胞数目是用活体染料MTT温育细胞后，经分光光度法定量测定的。在体外HuB4-DM4显示了对CD-19阳性Ramos人肿瘤细胞的有效的细胞杀伤活性(图12)。对于CD-19阴性细胞，没有观察到明显的毒性，这提示，CD-19依赖性细胞毒性归因于抗CD-19抗体huB4的特异性靶向作用。
实施例14SCID鼠中，huB4-DM4偶联物对抗Ramos人肿瘤异种移植物的体内效应[261]使用带有已建立的人Ramos肿瘤异种移植物的SCID鼠，测定huB4-DM4的体内效应。皮下注射Ramos细胞，让肿瘤生长至平均体积为100mm3。经静脉输送huB4-DM4偶联物，单次注射，剂量是图13a中指出的剂量。剂量被表示为偶联物中的DM4微克数，其对应于每μg DM4大约44μg抗体的抗体剂量。测量肿瘤体积，将其作为治疗效果的指示物，并监测小鼠的体重，以提示治疗造成的毒性。在高于50μg/kg的剂量，huB4-DM4引起所有动物中肿瘤的完全消退。在100μg/kg处理组中，动物的没有可测到的疾病的状态维持了大约35天，在两个最高剂量组中，此状态维持了超过55天。如果是按照被处理的动物的体重变化来判定毒性的话，则这些处理几乎不造成这样的变化(图13b)。
权利要求
1.美登素类，其在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处，具有酰化的氨基酸侧链，该侧链带有酰基基团，该酰基基团带有具有位阻的巯基，其中带有硫醇功能基的酰基碳原子具有一个或两个取代基，所述取代基是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，取代基之一可以是H，并且其中所述酰基基团在羰基功能基和硫原子之间具有至少3个碳原子的线性链长度。
2.式4’所表示的化合物 其中Y’代表(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2SZ，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；A、B、D是具有3-10个碳原子的环烷基或环烯基、单纯的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m、n、o、p、q、r、s和t的每一个独立地是0或从1至5的整数，只要l、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少两个不同时为0；Z是H、SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基。
3.权利要求2所述的化合物，其中R1是H，R2是甲基，Z是H。
4.权利要求2所述的化合物，其中R1和R2是甲基，Z是H。
5.权利要求2所述的化合物，其中R1是H，R2是甲基，Z是-SCH3。
6.权利要求2所述的化合物，其中R1和R2是甲基，Z是-SCH3。
7.式(I-L)、(I-D)或(I-D，L)所表示的化合物 其中Y代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，此外n可以是0；Z是H、SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基、分支烷基或环烷基、或单纯的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基；和May代表在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处带有侧链的美登素类。
8.权利要求7所述的化合物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，n是0，Z是H。
9.权利要求7所述的化合物，其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，n是0，Z是H。
10.权利要求7所述的化合物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，n是0，Z是-SCH3。
11.权利要求7所述的化合物，其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，n是0，Z是-SCH3。
12.权利要求1至11或12中的任一项所述的化合物，其中该化合物为式(I-L)所表示。
13.由式4所表示的化合物 其中Y代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，此外n可以是0；和Z是H、SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基。
14.权利要求13所述的化合物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，n是0，Z是H。
15.权利要求13所述的化合物，其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，n是0，Z是H。
16.权利要求13所述的化合物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，n是0，Z是-SCH3。
17.权利要求13所述的化合物，其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一个是H，l和m是1，n是0，Z是-SCH3。
18.美登素类-细胞结合剂偶联物，其包括至少一个连接于细胞结合剂的美登素类，其中所述细胞结合剂是用硫醇或二硫功能基被连接于美登素类的，所述硫醇或二硫功能基存在于酰化的氨基酸侧链的酰基基团上，该酰化的氨基酸侧链存在于美登素类的C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基上，其中，所述的酰化的氨基酸侧链的酰基基团具有硫醇或二硫功能基，它们位于带有一个或两个取代基的碳原子上，所述取代基是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，取代基之一可以是H，其中所述酰基基团在羰基功能基和硫原子之间具有至少3个碳原子的线性链长度。
19.权利要求18所述的美登素类-细胞结合剂偶联物，其中所述细胞结合剂包括至少一个抗体结合位点。
20.权利要求19所述的美登素类-细胞结合剂偶联物，其中所述抗体是MY9、抗-B4或C242。
21.权利要求19所述的美登素类-细胞结合剂偶联物，其中所述抗体是人源化的或表面重构的MY9、人源化的或表面重构的抗-B4，或人源化的或表面重构的C242。
22.美登素类-细胞结合剂偶联物，其中美登素类由式41’表示 其中Y1’代表(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2S-，其中A、B和D的每一个独立地是具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基、单纯的或取代的芳基，或杂环芳基或杂环烷基；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；和l、m、n、o、p、q、r、s和t的每一个独立地是0或从1至5的整数，只要l、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少2个不同时为0。
23.权利要求22所述的美登素类-细胞结合剂偶联物，其中所述R1是H，R2是甲基。
24.权利要求22所述的美登素类-细胞结合剂偶联物，其中所述R1和R2是甲基。
25.权利要求22、23或24中的任一项所述的美登素类-细胞结合剂偶联物，其中所述细胞结合剂包括至少一个抗体结合位点。
26.权利要求25所述的美登素类-细胞结合剂偶联物，其中所述抗体是MY9、抗-B4或C242。
27.权利要求25所述的美登素类-细胞结合剂偶联物，其中所述抗体是人源化的或表面重构的MY9、人源化的或表面重构的抗-B4，或人源化的或表面重构的C242。
28.美登素类-细胞结合剂偶联物，其包括至少一个连接于细胞结合剂的美登素类，其中所述美登素类由式(II-L)、(II-D)或(II-D，L)表示 其中Y1代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2S-，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，此外n可以是0；和May代表在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处带有侧链的美登素类。
29.权利要求28所述的美登素类-细胞结合剂偶联物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，n是0。
30.权利要求28所述的美登素类-细胞结合剂偶联物，其中R1和R2是甲基；R5、R6、R7和R8的每一个是H；l和m是1；n是0。
31.权利要求28所述的美登素类-细胞结合剂偶联物，其中所述美登素类由式(II-L)表示。
32.权利要求29所述的美登素类-细胞结合剂偶联物，其中所述美登素类由式(II-L)表示。
33.权利要求30所述的美登素类-细胞结合剂偶联物，其中所述美登素类由式(II-L)表示。
34.权利要求28至32或33中的任一项所述的美登素类-细胞结合剂偶联物，其中所述细胞结合剂包括至少一个抗体结合位点。
35.权利要求34所述的美登素类-细胞结合剂偶联物，其中所述抗体是MY9、抗-B4或C242。
36.权利要求34所述的美登素类-细胞结合剂偶联物，其中所述抗体是人源化的或表面重构的MY9、人源化的或表面重构的抗-B4，或人源化的或表面重构的C242。
37.美登素类-细胞结合剂偶联物，其中所述美登素类由式41表示 其中Y1代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2S-，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，此外n可以是0。
38.权利要求37所述的美登素类-细胞结合剂偶联物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一个是H，l和m的每一个是1，n是0。
39.权利要求37所述的美登素类-细胞结合剂偶联物，其中R1和R2是甲基；R5、R6、R7和R8的每一个是H；l和m是1；n是0。
40.权利要求37、38或39中的任一项所述的美登素类-细胞结合剂偶联物，其中所述细胞结合剂包括至少一个抗体结合位点。
41.权利要求40所述的美登素类-细胞结合剂偶联物，其中所述抗体是MY9、抗-B4或C242。
42.权利要求40所述的美登素类-细胞结合剂偶联物，其中所述抗体是人源化的或表面重构的MY9、人源化的或表面重构的抗-B4，或人源化的或表面重构的C242。
43.药物组合物，其包括有效量的权利要求18至24、28至33、37、38或39中的任一项所述的美登素类-细胞结合剂、其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
44.药物组合物，其包括有效量的权利要求25所述的美登素类-细胞结合剂、其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
45.药物组合物，其包括有效量的权利要求26所述的美登素类-细胞结合剂、其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
46.药物组合物，其包括有效量的权利要求27所述的美登素类-细胞结合剂、其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
47.药物组合物，其包括有效量的权利要求34所述的美登素类-细胞结合剂、其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
48.药物组合物，其包括有效量的权利要求35所述的美登素类-细胞结合剂、其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
49.药物组合物，其包括有效量的权利要求36所述的美登素类-细胞结合剂、其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
50.药物组合物，其包括有效量的权利要求40所述的美登素类-细胞结合剂、其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
51.药物组合物，其包括有效量的权利要求41所述的美登素类-细胞结合剂、其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
52.药物组合物，其包括有效量的权利要求42所述的美登素类-细胞结合剂、其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
53.用酰化的氨基酸对美登素类在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处进行酯化的方法，所述的酰化的氨基酸的酰基基团带有被保护的巯基，其中带有被保护的巯基的酰基碳原子具有一个或两个取代基，所述取代基是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外取代基之一可以是H，而且其中所述酰基基团在羰基功能基和硫原子之间具有至少3个碳原子的线性链长度，所述方法包括使美登素类在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处与酰化的氨基酸反应，所述的酰化的氨基酸中的酰基基团带有被保护的巯基。
54.酯化美登醇从而得到式42’的美登素类的方法 其中Y2’代表(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性分支的或烷基或烯基、具有3至10个碳原子的环状烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；A、B和D的每一个独立地是具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基、单纯的或取代的芳基、或杂环芳基或杂环烷基；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m、n、o、p、q、r、s和t的每一个独立地是0或从1至5的整数，只要l、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少2个不同时为0；和Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基，所述方法包括使结构11的美登醇 在C-3处与式(III’-L)、(III’-D)或(III’-D，L)的化合物反应 其中Y2’代表(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；A、B和D的每一个独立地是具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基、单纯的或取代的芳基，或杂环芳基或杂环烷基；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m、n、o、p、q、r、s和t的每一个独立地是0或从1至5的整数，只要l、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少2个不同时为0；和Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基。
55.权利要求54所述的方法，其中式(I)的化合物表示为式(I-L)。
56.权利要求54所述的方法，其中R1是H，R2是甲基。
57.酯化美登素类从而生成式(IV-L)、(IV-D)或(IV-D，L)所表示的美登素类酯的方法 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，另外n可以是0；Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基；和May是美登素类；所述方法包括使所述美登素类在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处，与式(III-L)、(III-D)或(III-D，L)的化合物反应 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性分支的或烷基或烯基、具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，另外n可以是0；和Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基。
58.权利要求57所述的方法，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一个是H；l和m的每一个是1；n是0。
59.权利要求58的任一项所述的方法，其中式(I)的化合物表示为式(I-L)。
60.权利要求58所述的方法，其中所述式(III-L)的化合物是化合物15a(S，S)、15b(S，R)或15a(S，S)和15b(S，R)的混合物。
61.权利要求58所述的方法，其中所述式(III-D)的化合物是化合物15(R，S)、15(R，R)或15(R，S)和15(R，R)的混合物。
62.权利要求58所述的方法，其中所述式(III-D，L)的化合物是用带有被保护的硫醇功能基的羧基基团酰化的外消旋N-甲基丙氨酸，其中带有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，从而得到结构15的化合物。
63.权利要求60所述的方法，其中所述的15a(S，S)和15b(S，R)的混合物是通过下列过程制得的，包括(1)使4-巯基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反应，得到化合物13；(2)将化合物13转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯14；(3)使化合物14与N-甲基-L-丙氨酸反应，得到所述的化合物15a(S，S)和15b(S，R)的混合物。
64.权利要求60所述的方法，其中所述化合物15a(S，S)是通过下列过程制得的，包括(1)将(R)-1，3-丁二醇转变为(S)-4-(甲基二硫代)戊酸19；(2)将化合物19转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯(20)；和(3)使化合物20与N-甲基-L-丙氨酸反应，得到所述的化合物15a(S，S)。
65.权利要求60所述的方法，其中所述化合物15b(S，R)是通过下列过程制得的，包括(1)将(S)-1，3-丁二醇转变为(R)-4-(甲基二硫代)戊酸24；(2)将化合物24转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯(25)；和(3)使化合物25与N-甲基-L-丙氨酸反应，得到所述的化合物15b(S，R)。
66.权利要求61所述的方法，其中所述的15(R，S)和15(R，R)的混合物可以通过下列过程制得，包括(1)使4-巯基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反应，得到化合物13；(2)将化合物13转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯14；(3)使化合物14与N-甲基-D-丙氨酸反应，得到所述的化合物15(R，S)和15(R，R)的混合物。
67.权利要求62所述的方法，其中所述的用带有被保护的硫醇功能基的羧基基团酰化的外消旋N-甲基丙氨酸，其中带有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，以得到结构15的化合物，是通过下列过程制成的，包括(1)使4-巯基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反应，得到化合物13；(2)将化合物13转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯14；(3)使化合物14与外消旋的N-甲基丙氨酸反应，得到所述的用带有被保护的硫醇功能基的羧基基团酰化的外消旋N-甲基丙氨酸，其中带有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，从而得到结构15的化合物。
68.权利要求56所述的方法，其中R1和R2是甲基；R3、R4、R5和R6的每一个是H；l和m是1；n是0。
69.权利要求68所述的方法，其中所述的式(III-L)的化合物是含有N-甲基-L-丙氨酸的化合物10。
70.权利要求68所述的方法，其中所述的式(III-D)的化合物是含有N-甲基-D-丙氨酸的化合物10。
71.权利要求68所述的方法，其中所述的式(III-D，L)的化合物是含有外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10。
72.权利要求69、70或71中的任一项所述的方法，其中所述的含有N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10是通过下列过程制得的，包括(1)使异丁烯基硫醚(5)与乙腈的阴离子反应，得到化合物6；(2)水解化合物6，得到4-巯基-4-甲基戊酸(7)；(3)通过与甲基甲硫醇磺酸酯反应，将化合物7转变为二硫化物8；(4)将化合物8转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯9；和(5)使化合物9与N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸反应，得到所述的含N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10。
73.通过权利要求57、58、59或60中的任一项所述的方法来制备美登素类的方法，进一步包括，如果存在非对映异构体的话，分离非对映异构体，以及在氰键合的二氧化硅上经HPLC来纯化美登素类。
74.制备美登素类-细胞结合剂偶联物的方法，包括通过权利要求73的方法制备纯化的美登素类，和使纯化的美登素类与细胞结合剂反应，所述细胞结合剂包含活性二硫基团或巯基基团。
75.权利要求74所述的方法，其中所述的活性二硫基团是二硫吡啶基团或取代的二硫吡啶基团。
76.制备美登素类-细胞结合剂偶联物的方法，包括通过权利要求72的方法制备纯化的美登素类，和使纯化的美登素类与细胞结合剂反应，所述细胞结合剂包含马来酰亚胺基团或卤代乙酰基团。
77.酯化美登醇从而得到式42的美登素类的方法 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性分支的或烷基或烯基、具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，另外n可以是0；Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基；所述方法包括使结构11的美登醇 在C-3位置与式(III-L)、(III-D)或(III-D，L)的化合物反应 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，另外n可以是0；Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、或单纯的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基。
78.权利要求77所述的方法，其中式(I)的化合物表示为式(I-L)。
79.权利要求77所述的方法，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一个是H；l和m的每一个是1；n是0。
80.权利要求77所述的方法，其中所述式(III-L)的化合物是化合物15a(S，S)、15b(S，R)或15a(S，S)和15b(S，R)的混合物。
81.权利要求77所述的方法，其中所述式(III-D)的化合物是化合物15(R，S)、15(R，R)或15(R，S)和15(R，R)的混合物。
82.权利要求77所述的方法，其中所述式(III-D，L)的化合物是用带有被保护的硫醇功能基的羧基基团酰化的外消旋N-甲基丙氨酸，其中带有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，从而得到结构15的化合物。
83.权利要求80所述的方法，其中所述的15a(S，S)和15b(S，R)的混合物是通过下列过程制备的，包括(1)使4-巯基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反应，得到化合物13；(2)将化合物13转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯(14)；和(3)使化合物14与N-甲基-L-丙氨酸反应，得到所述的化合物15a(S，S)和15b(S，R)的混合物。
84.权利要求80所述的方法，其中所述的化合物15a(S，S)是经下列方法制得的，包括(1)将(R)-1，3-丁二醇转变为(S)-4-(甲基二硫代)戊酸19；(2)将化合物19转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯(20)；和(3)使化合物20与N-甲基-L-丙氨酸反应，得到所述的化合物15a(S，S)。
85.权利要求80所述的方法，其中所述的化合物15b(S，R)是经下列方法制得的，包括(1)将(S)-1，3-丁二醇转变为(R)-4-(甲基二硫代)戊酸24；(2)将化合物24转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯(25)；和(3)使化合物25与N-甲基-L-丙氨酸反应，得到所述的化合物15b(S，R)。
86.权利要求81所述的方法，其中所述的15(R，S)和15(R，R)的混合物可以经下列过程制得，包括(1)使4-巯基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反应，得到化合物13；(2)将化合物13转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯14；(3)使化合物14与N-甲基-D-丙氨酸反应，得到所述的化合物15(R，S)和15(R，R)的混合物。
87.权利要求82所述的方法，其中所述的用带有被保护的硫醇功能基的羧基基团酰化的外消旋N-甲基丙氨酸，其中带有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，以得到结构15的化合物，是通过下列过程制备的，包括(1)使4-巯基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反应，得到化合物13；(2)将化合物13转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯14；(3)使化合物14与外消旋的N-甲基丙氨酸反应，得到所述的用带有被保护的硫醇功能基的羧基基团酰化的外消旋N-甲基丙氨酸，其中带有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，从而得到结构15的化合物。
88.权利要求77所述的方法，其中R1和R2是甲基；R5、R6、R7和R8的每一个是H；l和m是1；n是0。
89.权利要求77所述的方法，其中所述的式(III-L)的化合物是含有N-甲基-L-丙氨酸的化合物10。
90.权利要求77所述的方法，其中所述的式(III-D)的化合物是含有N-甲基-D-丙氨酸的化合物10。
91.权利要求77所述的方法，其中所述的式(III-D，L)的化合物是含有外消旋N-甲基丙氨酸的化合物10。
92.权利要求89、90或91中的任一项所述的方法，其中所述的含有N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10是通过下列过程制得的，包括(1)使异丁烯基硫醚(5)与乙腈的阴离子反应，得到化合物6；(2)水解化合物6，得到4-巯基-4-甲基戊酸(7)；(3)通过与甲基甲硫醇磺酸酯反应，将化合物7转变为二硫化物8；(4)将化合物8转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯9；和(5)使化合物9与N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸反应，得到所述的含N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10。
93.权利要求77、79或88中的任一项所述的制造美登素类的方法，进一步包括，如果存在非对映异构体的话，分离非对映异构体，以及在氰键合的二氧化硅上经HPLC来纯化美登素类。
94.制造美登素类-细胞结合剂偶联物的方法，包括通过权利要求93的方法制造纯化的美登素类，和使纯化的美登素类与细胞结合剂反应，所述细胞结合剂包含活性二硫基团或活性巯基基团。
95.权利要求94所述的方法，其中所述的活性二硫基团是二硫吡啶基团或取代的二硫吡啶基团。
96.制造美登素类-细胞结合剂偶联物的方法，包括通过权利要求93的方法制造纯化的美登素类，和使纯化的美登素类与细胞结合剂反应，所述细胞结合剂包含马来酰亚胺基团或卤代乙酰基团。
97.治疗方法，其包括向需要治疗的对象给予有效量的权利要求18至24、28至33、37、38或39中的任一项所述的偶联物、或其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
98.治疗方法，其包括向需要治疗的对象给予有效量的权利要求25所述的偶联物、或其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
99.治疗方法，其包括向需要治疗的对象给予有效量的权利要求26所述的偶联物、或其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
100.治疗方法，其包括向需要治疗的对象给予有效量的权利要求27所述的偶联物、或其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
101.治疗方法，其包括向需要治疗的对象给予有效量的权利要求34所述的偶联物、或其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
102.治疗方法，其包括向需要治疗的对象给予有效量的权利要求35所述的偶联物、或其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
103.治疗方法，其包括向需要治疗的对象给予有效量的权利要求36所述的偶联物、或其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
104.治疗方法，其包括向需要治疗的对象给予有效量的权利要求40所述的偶联物、或其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
105.治疗方法，其包括向需要治疗的对象给予有效量的权利要求41所述的偶联物、或其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
106.治疗方法，其包括向需要治疗的对象给予有效量的权利要求42所述的偶联物、或其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
107.式III的化合物 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一个独立地是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一个独立地是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性分支的或烷基或烯基、具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；l、m和n的每一个独立地是从1至5的整数，另外n可以是0；和Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基、分支烷基或环烷基，或单纯的或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基。
108.化合物10(S)、10(R)或外消旋的10。
109.制造含N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10的方法，包括(1)使异丁烯基硫醚(5)与乙腈的阴离子反应，得到化合物6；(2)水解化合物6，得到4-巯基-4-甲基戊酸(7)；(3)通过与甲基甲硫醇磺酸酯反应，将化合物7转变为二硫化物8；(4)将化合物8转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯9；和(5)使化合物9与N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸反应，得到所述的含N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10。
110.化合物15a(S，S)和15b(S，R)的混合物。
111.制造化合物15a(S，S)和15b(S，R)的混合物的方法，包括(1)使4-巯基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反应，得到化合物13；(2)将化合物13转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯(14)；和(3)使化合物14与N-甲基-L-丙氨酸反应，得到所述的化合物15a(S，S)和15b(S，R)的混合物。
112.化合物15(R，S)和15(R，R)的混合物。
113.制造化合物15(R，S)和15(R，R)的混合物的方法，包括(1)使4-巯基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反应，得到化合物13；(2)将化合物13转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯14；和(3)使化合物14与N-甲基-D-丙氨酸反应，得到所述的化合物15(R，S)和15(R，R)的混合物。
114.用带有被保护的硫醇功能基的羧基基团酰化的外消旋的N-甲基丙氨酸，其中带有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，从而得到结构15的化合物。
115.制造用带有被保护的硫醇功能基的羧基基团酰化的外消旋N-甲基丙氨酸的方法，其中带有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，以得到结构15的化合物，该方法包括(1)使4-巯基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反应，得到化合物13；(2)将化合物13转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯14；(3)使化合物14与外消旋的N-甲基丙氨酸反应，得到所述的用带有被保护的硫醇功能基的羧基基团酰化的外消旋N-甲基丙氨酸，其中带有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，以得到结构15的化合物。
116.化合物15a(S，S)。
117.制造化合物15a(S，S)的方法，包括(1)将(R)-1，3-丁二醇转变为(S)-4-(甲基二硫代)戊酸19；(2)将化合物19转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯(20)；和(3)使化合物20与N-甲基-L-丙氨酸反应，得到所述的化合物15a(S，S)。
118.化合物15b(S，R)。
119.制造化合物15b(S，R)的方法，包括(1)将(S)-1，3-丁二醇转变为(R)-4-(甲基二硫代)戊酸24；(2)将化合物24转变为其N-羟基琥珀酰亚胺酯(25)；和(3)使化合物25与N-甲基-L-丙氨酸反应，得到所述的化合物15b(S，R)。
120.药物组合物，其包括有效量的权利要求2、8、13或108中的任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
121.权利要求120所述的药物组合物，进一步包括抗体。
122.在所选择的细胞群中诱导细胞死亡的方法，包括用有效量的权利要求18至24、28至33、37至40或41中的任一项所述的美登素类-细胞结合剂偶联物、其盐或其溶剂化物接触靶细胞或含有靶细胞的组织。
123.在所选择的细胞群中诱导细胞死亡的方法，包括用有效量的权利要求25所述的美登素类-细胞结合剂偶联物、其盐或其溶剂化物接触靶细胞或含有靶细胞的组织。
124.在所选择的细胞群中诱导细胞死亡的方法，包括用有效量的权利要求26所述的美登素类-细胞结合剂偶联物、其盐或其溶剂化物接触靶细胞或含有靶细胞的组织。
125.在所选择的细胞群中诱导细胞死亡的方法，包括用有效量的权利要求27所述的美登素类-细胞结合剂偶联物、其盐或其溶剂化物接触靶细胞或含有靶细胞的组织。
126.在所选择的细胞群中诱导细胞死亡的方法，包括用有效量的权利要求34所述的美登素类-细胞结合剂偶联物、其盐或其溶剂化物接触靶细胞或含有靶细胞的组织。
127.在所选择的细胞群中诱导细胞死亡的方法，包括用有效量的权利要求35所述的美登素类-细胞结合剂偶联物、其盐或其溶剂化物接触靶细胞或含有靶细胞的组织。
128.在所选择的细胞群中诱导细胞死亡的方法，包括用有效量的权利要求36所述的美登素类-细胞结合剂偶联物、其盐或其溶剂化物接触靶细胞或含有靶细胞的组织。
129.在所选择的细胞群中诱导细胞死亡的方法，包括用有效量的权利要求42所述的美登素类-细胞结合剂偶联物、其盐或其溶剂化物接触靶细胞或含有靶细胞的组织。
130.在所选择的细胞群中诱导细胞死亡的方法，包括用有效量的权利要求43所述的美登素类-细胞结合剂偶联物、其盐或其溶剂化物接触靶细胞或含有靶细胞的组织。
131.在所选择的细胞群中诱导细胞死亡的方法，包括用有效量的权利要求44所述的美登素类-细胞结合剂偶联物、其盐或其溶剂化物接触靶细胞或含有靶细胞的组织。
全文摘要
公开了含硫醇和二硫化物的新的美登素类，其在带有硫原子的α－碳原子上具有单烷基取代或双烷基取代。也公开了用于合成这些新的美登素类的方法以及用于将这些新的美登素类连接于细胞结合剂的方法。美登素类－细胞结合剂偶联物作为治疗剂是有用的，其被特异性地输送至靶细胞并且是细胞毒性的。与以前描述的药剂相比，这些偶联物在动物肿瘤模型中显示了大大改进的治疗效果。
文档编号C07D498/16GK1956722SQ200480013488
公开日2007年5月2日 申请日期2004年5月20日 优先权日2003年5月20日
发明者W·C·威迪逊, R·V·J·沙利 申请人:伊缪诺金公司