专利名称：使用键合有聚乙烯亚胺的树脂提纯紫杉醇和紫杉醇混合物的方法
技术领域：
本发明涉及一种从含有紫杉醇(taxane)的物质中分离或离析一种或多种紫杉醇化合物的方法和由该方法得到的组合物或复合物。本发明还涉及一种提纯包含一种或多种紫杉醇的生物提取物的方法。在一个实施方案中，该方法包括使用附着在基质(例如固体基质)上的含有一个或多个氨基的材料，所述材料包括但不局限于键合有聚乙烯亚胺的二氧化硅色谱树脂(PBS树脂)。这些树脂有利于高产率和高纯度地提纯紫杉醇。在一个实施方案中，所述色谱树脂包括键合到各种粒径或孔径的二氧化硅上的非官能化的和/或非衍生的聚乙烯亚胺(“PEI”)聚合物。在另一个实施方案中，聚乙烯亚胺被甲基化而形成键合有二乙基氨基甲基的二氧化硅(“DEAM”)。在本发明的一个备选实施方案中，DEAM和PEI都可以用在酸性pH下的正相色谱中。
背景技术：
本发明涉及使用例如PBS树脂等负载于固体基质上的含有氨基的材料从含有一种或多种紫杉醇的物质中离析或分离紫杉醇A(paclitaxel)或其它紫杉醇。本发明也涉及提纯含有紫杉醇的生物提取物。
众所周知，例如紫杉醇A等各种紫杉醇可以使用色谱技术提纯。在与该目的有关的文献中，已经报道了例如二氧化硅、氧化铝、例如C18和C8等键合有烷基的二氧化硅树脂和聚苯乙烯二乙烯基苯树脂等色谱介质。但是，由于提纯方法本身的特性，这些介质都有局限性。
已经发现，与用来离析和提纯紫杉醇的其它普通色谱树脂相比，附着在基质上的含有氨基的材料(例如PBS树脂)可以提供更优异的选择性和分辨率。因此，在紫杉醇提纯领域，可以利用附着在基质上的含有氨基的材料(例如PBS树脂)来比其它树脂更有效地进行分离。例如，据文献描述，紫杉醇A和三尖杉宁碱(cephalommanine，紫杉醇B)的分离是困难的。如本文所述，使用一种或多种PBS树脂能大大促进这些化合物的分离。此外，与例如C18、C8和聚苯乙烯二乙烯基苯等反相树脂相比，由于在使用PBS树脂时可以使用有机溶剂，所以可以更容易装填该树脂，并且样品的装填量更高。
PBS树脂主要用在离子交换色谱用途中。紫杉醇很少含有例如羧酸或氨基等可电离的基团，因此相互作用的方式不是传统的离子交换。令人惊讶的是，在离析或提纯紫杉醇时使用PBS树脂可以提供优异的选择性和分辨率。在本发明中，当在流动相中使用少量的酸性改性剂或盐时，PBS树脂将最好地发挥作用。
另外，我们发现PEI聚合物的氨基可以经烷基化、芳基化或酰化而官能化。我们还发现可以使用PBS树脂进行紫杉醇化合物的制备性和分析性分离。制备性分离可以按间歇、半连续或连续方式进行。半连续方式可以是模拟移动床(SMB)色谱的形式。
发明内容
本发明涉及使用附着(例如键合)在固体基质上的含有氨基的材料从含有一种或多种紫杉醇的物质中离析或分离紫杉醇A(paclitaxel)或其它紫杉醇，所述附着在固体基质上的含有氨基的材料包括但不局限于能离析或分离紫杉醇的聚乙烯亚胺基质，例如键合到二氧化硅上的聚乙烯亚胺。其它合适的附着在基质(例如固体基质)上的含有氨基的材料可以包括美国专利第5,085,779号和第5,092,992号中公开的那些材料。本文以参考的方式全文引入这两篇专利。
在一个备选实施方案中，本发明旨在使用PEIS树脂来辅助从含有紫杉醇的组合物中分离或提纯包括紫杉醇A在内的各种紫杉醇。据认为，与现有技术相比，用于该目的的这些树脂的用途是新颖和优异的。优选的树脂包括PEI和DEAM。
在一个备选实施方案中，本发明旨在提供一种从紫杉醇混合物中离析一种或多种紫杉醇及其类似物的方法。紫杉醇混合物可以包括生物提取物，或者紫杉醇混合物可以由半合成或全合成方法得到。所述离析方法包括以下步骤(a)用附着在基质上的含有氨基的材料(例如PBS树脂)处理紫杉醇混合物；(b)从色谱树脂上洗脱所述一种或多种紫杉醇及其类似物；和(c)回收一个或多个洗出液的级分中的所述一种或多种紫杉醇和其类似物。
在另一个备选实施方案中，本发明旨在提供一种从含紫杉醇的物质中提纯紫杉醇和/或增加含紫杉醇的物质中的紫杉醇浓度的方法，所述含紫杉醇的物质有例如红豆杉(Taxus)提取物或由半合成或全合成方法得到的紫杉醇混合物，所述含紫杉醇的物质源于选自名为紫杉(Yew)的一组植物中的植物材料。所述方法包括以下步骤(a)用附着在基质上的含有氨基的材料(例如PBS树脂)处理包含紫杉醇和其天然类似物的物质；(b)从色谱树脂上洗脱紫杉醇及其类似物；和(c)回收一个或多个洗出液的级分中的紫杉醇及其类似物。
参照下列详细说明和附图将可进一步理解本发明及其优点。
图1表示使用本发明的色谱树脂的示例性化学反应示意图。
图2表示使用本发明的色谱树脂的示例性化学反应示意图。
图3表示使用本发明的PEI树脂分离紫杉醇A与紫杉醇B、C和其它杂质。
图4表示使用本发明的DEAM树脂将半合成紫杉醇A与其它紫杉醇副产物分离。
图5表示非限定性的紫杉醇分子。
图6表示非限定性的示例性的化合物(“初级紫杉醇”)。
图7～9表示非限定性的示例性的紫杉醇分子。
图10表示紫杉醇标准物在各种介质上的保留时间的比较。
具体实施例方式
这里使用的“烷氧基”是指连接在氧原子上的直链、支链或环状饱和烃。优选地，烷氧基具有1～6个碳原子。烷氧基也可以指取代的烷氧基，该烷氧基可以包含以下取代基例如烷酰氧基、烯基、烷基、烷基甲硅烷基、烷基磺酰基、烷基磺氧基(alkylsulfoxy)、烷硫基；炔基；例如一烷基氨基、二烷基氨基和一芳基氨基、二芳基氨基等氨基；酰胺基、芳基、芳基烷基、羧基、羧基烷氧基、甲酰胺基、羧酸基、卤代烷基、卤素、羟基、腈基、硝基、磷酸基、甲硅烷氧基、硫酸基、磺酰胺基、磺酰氧基；以及它们的组合。其中，烷氧基的优选例子包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、环丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、环丁氧基、戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、环戊氧基、己氧基和环己氧基。
这里使用的“烷基”是指直链、支链或环状饱和烃。优选地，烷基具有1～6个碳原子。烷基也可以指取代的烷基，它可包含以下取代基例如烷酰氧基、烯基、烷基、烷基甲硅烷基、烷基磺酰基、烷基磺氧基、烷硫基；炔基；例如一烷基氨基、二烷基氨基和一芳基氨基、二芳基氨基等氨基；酰胺基、芳基、芳基烷基、羧基、羧基烷氧基、甲酰胺基、羧酸基、卤代烷基、卤素、羟基、腈基、硝基、磷酸基、甲硅烷氧基、硫酸基、磺酰胺基、磺酰氧基；以及它们的组合。优选的取代基为烷氧基、例如二烷基氨基、二芳基氨基等氨基、含有羧酸的基团、卤代烷基、卤素、羟基、腈基、硝基和硫酸基团。优选的烷基的例子包括但不局限于甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丁基、戊基、1-乙基丙基、环戊基、己基和环己基。
这里使用的“芳基”是指取代的或未取代的苯基或萘基。芳基上的取代基的例子包括但不局限于烷酰氧基、烯基、烷氧基、烷基甲硅烷基、烷基磺酰基、烷基磺氧基、烷硫基；炔基；例如一烷基氨基、二烷基氨基和一芳基氨基、二芳基氨基等氨基；酰胺基、芳基、芳基烷基、羧基、羧基烷氧基、羧基酰胺基、羧酸基、卤代烷基、卤素、羟基、腈基、硝基、磷酸基、甲硅烷氧基、硫酸基、磺酰胺基、磺酰氧基；以及它们的组合。优选的取代基为烷氧基、烷基、例如二烷基氨基和二芳基氨基等氨基、含有羧酸的基团、卤代烷基、卤素、羟基、腈基、硝基和磺酸基团。
这里使用的“芳基烷基”是指连接在芳基上的烷基。芳基烷基的例子为苯甲基。
这里使用的“碱性巴卡丁III(basic baccatin III)结构”是指具有图6所示结构式的化合物，其中R1、R2、R4、R7、R10和R13各自独立地为氢、烷基、酰基、芳基、芳基烷基、乙烯基、醚基、酯基、糖苷基、氧基或羟基保护基团。具有图7所示结构式的巴卡丁III和具有图8所示结构式的10-脱乙酰基巴卡丁III也包括在碱性巴卡丁III的定义内，在图8中Ac是乙酰基(CH3C(O)-)，Bz是苯甲酰基(PhC(O)-或C6H5C(O)-)。
这里使用的“酯基”是指具有酯官能团即-C(O)-OR的直链、支链或环状取代基。酯基的例子包括例如键合到羟基上的乙酰基和苯甲酰基等酰基。
这里使用的“醚基”是指具有醚官能团即-C-O-C-的直链、支链或环状取代基。醚基的例子包括但不局限于HOCH2CH2OC(CH2OH)H-。
这里使用的“糖苷基”或“糖基”是指多种糖衍生物中的任一种，这种糖衍生物含有键合到氧或氮原子上的非糖基团，并且在水解时生成例如葡萄糖等糖。优选的糖基的例子是木糖基。
这里使用的“卤素”是指氟、氯、溴和/或碘。
这里使用的“杂环基团”是指环中含有至少一个例如氧、氮或硫等非碳原子的饱和、不饱和或芳香环状化合物。杂环基团的例子包括例如2-呋喃基等呋喃基、吗啉基、哌啶子基(piperadino)、哌嗪基、N-甲基哌嗪基、吡咯啉基(pyrrollyl)、吡啶基和噻吩基。
这里使用的“氧代某基”是指由糖苷基氧化衍生的取代基，所述糖苷基为例如美国专利第5,356,928号中描述的木糖苷等。
这里使用的“紫杉醇或紫杉醇分子”包括但不局限于含有碱性巴卡丁III结构的分子，其中(2R，3S)-C6H5CH(Rx)CH(OH)C(O)-基团与位于碱性巴卡丁III结构的C-13位上的羟基形成酯。Rx表示的基团可以是氨基、氨基的盐(例如铵盐)、用氨基保护基团保护的氨基或可以转变成氨基的取代基。碱性巴卡丁III结构和(2R，3S)-C6H5CH(Rx)CH(OH)C(O)-基团的各种异构体、同系物和类似物也包括在紫杉醇分子的定义中。10-脱乙酰基巴卡丁III结构也认为在紫杉醇分子的范围内。包括在紫杉醇或紫杉醇分子的定义内的物质包括但不局限于例如紫杉醇A、紫杉醇B(三尖杉宁碱)、紫杉醇C、紫杉醇D、紫杉醇E、紫杉醇F和紫杉醇G等初级紫杉醇。此外，紫杉醇或紫杉醇分子的定义包括多烯紫杉醇(docetaxel)(TAXOTERE)。(例如见图5～6)。
这里使用的“乙烯基”是指具有碳-碳双键的直链或支链取代基。乙烯基的例子包括但不局限于1-甲基-1-丙烯基(CH3CH＝C(CH3)-)和2-甲基-1-丙烯基((CH3)2C＝CH-)。
紫杉是多种红豆杉树种的总称；红豆杉属是红豆杉(Taxaceae)科中的普通属。从1962年开始，紫杉醇最早从采自华盛顿州的短叶红豆杉(Taxus brevifolia)的树皮中离析出来，随后在1971年，有报道称另外两个红豆杉树种即欧洲红豆杉(Taxus baccata)和东北红豆杉(Taxuscuspidate)中也含有紫杉醇。经过深入研究，还报道大量的其它红豆杉种和栽培变种中也含有紫杉醇。这些树种包括但不局限于墨西哥红豆杉(Taxus globosa)、佛罗里达红豆杉(Taxus floridana)、加拿大红豆杉(Taxuscanadensis)、西藏红豆杉(Taxus wallichiana)、云南红豆杉(Taxusyunnanensis)、中国红豆杉(Taxus chinensis)，以及大量观赏性杂交种，例如曼地亚红豆杉(Taxus media)栽培变种和卡比塔东北红豆杉(T.cuspidata“Capitata”)，曼地亚红豆杉栽培变种有例如登斯夫米曼地亚红豆杉(T.media“Densiformis”)、西斯曼地亚红豆杉(T.media“Hichsii”)、布朗尼曼地亚红豆杉(T.media“Brownii”)、泛深绿曼地亚红豆杉(T.media“Dark Green Spreader”)、兰嫣曼地亚红豆杉(T.media“Runyan”)、瓦蒂曼地亚红豆杉(T.media“Wardii”)和道托尼曼地亚红豆杉(T.media“Tautonii”)等。在本发明中，可以从包括但不局限于上述种和栽培变种的任何红豆杉树种中获得提取物或半合成反应混合物。以下文献中指出了用于本发明的其它红豆杉树种Chadwick，L.C.和Keen，R.A.，1986年5月，“A study of the Genus Taxus”(红豆杉属的研究)，Res.Bull.(研究公报)，1086，Ohio Agricultural Research and Development Center(俄亥俄州农业研究和发展中心)；Appendino，G.，1995年，“The Phytochemistry of theYew Tree”(紫杉树的植物化学)Phytochemistry，Natural Products Reports(植物化学，自然产品报道)12(4)349-360；Convention On InternationalTrade in Endangered Species of Wild Fauna and FloraEleventh mooting ofthe Plants Committee(濒临灭绝的野生动植物国际贸易公约植物委员会第11次会议)，LangKawi(马来西亚)，2001年9月3-7日，Document PCllDOC.22-p.1，美国；和Greer，Schutzki，R.E.，Fernandez，A.和Hancock，T.F.，1993.10月/12月，“Electrophoretic Characterization of Taxus Cultivars”(红豆杉栽培变种的电泳表征)HortTechnology，3(4)430-433。这些参考文献在这里均以参考的方式全文引入。
现在令人惊讶地发现，采用填充PBS树脂的正相液相色谱柱，可以以高产率从红豆杉树种中离析和提纯紫杉醇化合物，该紫杉醇化合物包括紫杉醇和紫杉醇类似物和其同源物。用所述方法，可以从天然生物提取物和由半合成或全合成方法得到的物质中离析出大量的紫杉醇类似物。
本发明的原料可以是选自通常称为紫杉树的一类植物中的植物材料。该类植物中最合适的植物是红豆杉树种。在红豆杉树种中，特别优选曼地亚红豆杉栽培变种。例如，优选的栽培变种包括但不局限于西斯曼地亚红豆杉或泛深绿曼地亚红豆杉。尽管在本发明中使用紫杉树的某些部分是方便的，但是可以从整株植物或例如木材、树干、树根、树叶(针叶)、种子等单个部分或它们的任意组合中提取紫杉醇及其天然类似物。要提取的材料可以是新鲜的或干燥的。优选使用树皮或针叶。此外，使用本发明的方法可以从长成的植物细胞或使用离体培养技术得到的培养物上清液中提纯紫杉醇。另外，所述方法适用于从由色谱技术处理的混合物或没有用这些技术处理的混合物中分离和提纯紫杉醇。该方法还适用于由半合成或全合成方法得到的紫杉醇的分离和提纯。
在本发明的一个方面，使用附着在基质(例如二氧化硅)上的含有氨基的材料从含有紫杉醇的混合物中分离或离析一种或多种紫杉醇化合物。这类被分离或提纯的物质包括但不局限于紫杉醇A、B、C、D、E、F、G、多烯紫杉醇和诺纳紫杉醇(Nonataxel)。这类附着在基质上的含有氨基的材料的例子包括但不局限于PBS树脂。这些树脂通常用在离子交换用途中，因此不能用于分离例如一般不含有可电离基团的紫杉醇等中性分子。通过使用例如PBS树脂，令人惊讶地提高了分离紫杉醇混合物时的选择性和分辨率。例如，PBS树脂比例如C18、C8和聚苯乙烯二烯基苯等反相树脂等更容易装填到更高的水平。也可以与有机溶剂一起有利地使用例如PBS树脂。
PBS树脂可以由键合到各种孔径和/或粒径的二氧化硅上的聚乙烯亚胺聚合物得到。这种二氧化硅具有60～300范围内的平均孔径。优选地，二氧化硅具有约100～300的平均孔径，更优选约120。此外，二氧化硅具有约0.25至约500微米范围内的平均粒径。优选地，二氧化硅具有约10～120微米的平均粒径，更优选约20～60微米，最优选约40微米。
本发明的合适的PBS树脂可包括DEAM。该树脂可以从J.T.Baker购买，CAS注册号产品代码7317、7471、7472、7473，名称为“BAKERBOND DEAM Chromatography Packing”。另一种合适的PBS树脂可包括PEI。该树脂也可以从J.T.Baker购买，CAS注册号126850-07-5，产品代码7134、7180、7264、7368、7476和8179，名称为“Polyethyleneimine Bonded Silica Gel”。
在本发明的一个备选实施方案中，附着在基质上的含有氨基的材料(例如PBS树脂)可以是非衍生化的，例如PEI。本发明的色谱树脂可包括但不局限于衍生化的PBS树脂，在这种PBS树脂中，聚乙烯亚胺部分的伯氨基和/或仲氨基与反应性部分反应。本发明的PBS树脂可以用下列通式表示
PBS树脂的一般结构 二氧化硅表面PEIR＝HDEAMR＝CH3上述结构仅仅是为了说明性的、非限定性的目的。PBS树脂的结构可以有许多其它的分支形式，或包括一个或多个附着在二氧化硅颗粒表面上的部位。并且R基团可包括但不局限于H-、甲基、酰基、烷基、芳基、芳基烷基、磺酰基或它们的任何组合。
PEI聚合物的氨基可以通过烷基化、芳基化、酰基化或其它方法官能化。使氨基官能化将使树脂具有增加的选择性、分辨率或其它需要的性能。例如，DEAM是官能化的PEI的一个具体例子。
可以使用本发明的树脂从紫杉醇混合物中离析或提纯紫杉醇，所述紫杉醇混合物包括但不局限于例如红豆杉提取物等生物提取物。在一个备选实施方案中，可以使用本发明从通过溶剂分配、离心分离、过滤、沉淀或它们的任意组合所生产的紫杉醇混合物(例如生物提取物)中离析或提纯紫杉醇。也可以使用本发明的树脂从含有天然衍生的紫杉醇的混合物中离析和/或提纯紫杉醇，其中紫杉醇不是由合成或半合成方法形成的。此外，可以使用本发明的树脂从包含由半合成或全合成过程得到的紫杉醇的混合物中离析或提纯紫杉醇。
众所周知，例如二氧化硅、氧化铝、C8、C18、聚苯乙烯二乙烯基苯等各种形式的色谱可用于从红豆杉提取物中提纯紫杉醇A和其它紫杉醇。可以用本领域的技术人员知道的其它方法例如溶剂分配和结晶作为色谱法的补充。可以结合使用这类其它技术和PBS树脂，从而使得从红豆杉提取物中提纯紫杉醇A和其它紫杉醇得到简化。例如，我们发现PBS树脂在将紫杉醇A与紫杉醇B、N-甲基紫杉醇、紫杉醇肉桂酸酯等分离是特别有效的。也可以使用PBS树脂使例如初级紫杉醇(见图6)等相关类型的紫杉醇与红豆杉提取物中存在的其它紫杉醇分离。可以使用PBS树脂使紫杉醇与非目标成分分离，从而增加混合物中的紫杉醇浓度。
在一个备选实施方案中，原料可以包含选自通常称为紫杉的一类植物中的植物材料。该类植物中最合适的植物是红豆杉树种。本发明中使用的原料可包括但不局限于(1)由除半合成或全合成方法之外的方法制备的包含一种或多种紫杉醇的任何原料；(2)由色谱法制备的包含一种或多种紫杉醇的任何原料；(3)不是由色谱法制备的包含一种或多种紫杉醇的任何原料；(4)由溶剂分配、离心分离、过滤、沉淀或其任何组合所制备的包含一种或多种紫杉醇的任何原料；(5)来自红豆杉植物的包含一种或多种紫杉醇的任何原料；或(6)来自一种或多种红豆杉植物的包含一种或多种紫杉醇的任何原料，其中紫杉醇不仅仅衍生自短叶红豆杉。原料可以包括由上面列举出的参数的任意组合所制备的包含一种或多种紫杉醇的任何原料。制备含有紫杉醇的原料(例如生物提取物或半合成或全合成反应混合物)的方法在本领域是已知的。
在另一个备选实施方案中，本发明旨在提供一种从含有紫杉醇的混合物中离析一种或多种紫杉醇的方法，该方法包括以下步骤(a)用PBS树脂处理所述混合物；其中所述一种或多种紫杉醇来源于一种或多种红豆杉植物，其中所述一种或多种紫杉醇不仅仅来源于短叶红豆杉；(b)用洗脱液从PBS树脂中洗脱所述一种或多种紫杉醇；和(c)回收所洗脱的一种或多种紫杉醇。
在另一个备选实施方案中，本发明旨在提供一种从含有紫杉醇的混合物中离析一种或多种紫杉醇的方法，所述方法包括以下步骤(a)用PBS树脂处理所述混合物；其中所述混合物包含低于25重量％或大于40重量％的初级紫杉醇；(b)从PBS树脂中洗脱所述一种或多种紫杉醇；和(c)回收所洗脱的一种或多种紫杉醇。
在另一个实施方案中，本发明旨在提供一种离析一种或多种紫杉醇的方法，该方法包括以下步骤(a)用PBS树脂处理含有紫杉醇的混合物；其中所述混合物包含约25重量％～40重量％的初级紫杉醇；其中所述一种或多种紫杉醇不仅仅来源于短叶红豆杉；(b)从PBS树脂中洗脱所述一种或多种紫杉醇；和(c)回收所洗脱的一种或多种紫杉醇。
在本发明的一个备选实施方案中，原料可以包含低于约25重量％或大于约40重量％的初级紫杉醇，所述初级紫杉醇包括但不局限于紫杉醇A、B、C、D、E、F或G。提取物中的其余物质可以包含其它化合物，这些其它化合物包括但不局限于杂质。原料中初级紫杉醇的其它合适含量可包括约0.5％～1％、1％～10％、10％～15％、15％～20％、20％～25％、25％～30％、30％～35％或35％～40％。其它含量也可以包括约40％～50％、50％～60％、60％～70％、70％～80％、80％～90％或90％～100％。
在另一个备选实施方案中，生物提取物来源于红豆杉植物。在又一个备选实施方案中，生物提取物来源于任何红豆杉植物，但不包括短叶红豆杉。在又一个备选实施方案中，生物提取物来源于任何红豆杉植物，但不包括短叶红豆杉，并且包含约25重量％至约40重量％的初级紫杉醇，该初级紫杉醇包括但不局限于紫杉醇A、B、C、D、E、F或G。
在另一个实施方案中，本发明旨在提供一种从生物提取物中提纯一种或多种紫杉醇化合物的方法，其中生物提取物来源于一种或多种红豆杉植物。在一个实施方案中，生物提取物来自一种或多种红豆杉植物，但不包括短叶红豆杉。在另一个实施方案中，生物提取物包含低于25重量％或大于40重量％的初级紫杉醇。在又一个实施方案中，生物提取物包含约25％至约40％的初级紫杉醇，其中生物提取物来源于一种或多种红豆杉植物，但不包括短叶红豆杉。
另外，在一个备选实施方案中，生物提取物可以包含异丁醇，该异丁醇的含量低于约50％、40％、30％或20％，优选低于10％，更优选低于5％，最优选低于3％、2％、1％、0.5％或0.25％。
本发明的方法可以使生物提取物的纯度增加约10％～20％、20％～30％、30％～40％、40％～50％、50％～60％、60％～70％、70％～80％、80％～90％、90％～100％、100％～110％、110％～120％、120％～130％、130％～140％、140％～150％、150％～200％、200％～250％、250％～300％、300％～350％、350％～400％、400％～450％、450％～500％、500％～550％、550％～600％、600％～650％、650％～700％、700％～750％、750％～800％、800％～850％、850％～900％、900％～950％、950％～1000％。这里使用的术语“纯度”是指存在于干燥的原料或生物提取物中的一种或多种紫杉醇的重量百分比。
可以使用本发明的树脂从紫杉醇混合物中提纯一种或多种紫杉醇，所述紫杉醇混合物全部或部分地由半合成或全合成方法得到。在一个备选实施方案中，可以使用本发明的树脂从粗反应混合物中提纯半合成紫杉醇A或其它半合成紫杉醇。因为大多数合成反应都产生副产物或具有未反应的原料，在许多情况中它们在结构上接近目标产物，所以提纯这些产物的方法是很重要的。例如，已经发现，PBS树脂可以提高和促进由本文描述的方法生产的半合成紫杉醇A的提纯，使之与诸多相关杂质和例如图10所示的在结构上相关联的化合物分离。
在一个备选实施方案中，本发明涉及从由半合成或全合成方法制备的物质中提纯一种或多种紫杉醇化合物。图1和2显示了一种采用本发明的树脂的示例性的非限制性的半合成方法。这些方法描述在名称为“Conversion of Taxane Molecules”的第PCT/US03/10556号申请和2003年8月4日提交的名称为“Methods and Compositions for Converting TaxaneAmides to Paclitaxel or Other Taxanes”的第PCT/US03/24666号申请中。上述每个申请都以参考的方式全文引入本文。
在一个备选实施方案中，这些物质包含低于约10重量％的C-2’苯甲酰初级紫杉醇，优选低于约5％，更优选低于约3％，最优选低于约1％。在另一个备选实施方案中，含有紫杉醇的物质包含低于约9％、8％、7％、6％、4％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.01％。紫杉醇杂质包含但不局限于紫杉醇A、B、C、D、E、F或G的C-2’苯甲酸酯。紫杉醇杂质也包含低于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％的紫杉醇B、C、D、E、F或G的C-2’苯甲酸酯。这里使用的术语重量百分比是指存在于干燥固体形式的这些物质中的一种或多种化合物的百分比。
在一个备选实施方案中，本发明旨在提供一种从由半合成或全合成方法得到的包含紫杉醇化合物的物质中离析一种或多种紫杉醇的方法，所述离析方法包括以下步骤(a)用PBS树脂处理所述物质；其中在半合成或全合成方法中用作反应物的分子不仅仅来源于短叶红豆杉；(b)从PBS树脂中洗脱所述一种或多种紫杉醇；和(c)回收所洗脱的一种或多种紫杉醇。
在另一个实施方案中，本发明旨在提供一种从由半合成或全合成方法得到的包含紫杉醇化合物的物质中离析一种或多种紫杉醇的方法，所述离析方法包括以下步骤(a)用PBS树脂处理所述物质；其中所述物质包含总量低于约8重量％～3重量％的紫杉醇A、B、C、D、E、F或G的2’苯甲酸酯；(b)洗脱所述一种或多种紫杉醇；和(c)回收所洗脱的一种或多种紫杉醇。在另一个实施方案中，本发明旨在提供一种从包含紫杉醇化合物的物质中离析一种或多种紫杉醇的方法，得到所述物质的方法不包括对紫杉醇分子的C-2’羟基进行苯甲酰化的步骤。
在另一个实施方案中，本发明旨在提供一种从由半合成或全合成方法得到的包含紫杉醇化合物的物质中离析一种或多种紫杉醇的方法，所述离析方法包括以下步骤(a)用PBS树脂处理所述物质；其中所述物质包含总量低于0.5重量％的紫杉醇B、C、D、E、F或G的2’苯甲酸酯；(b)洗脱所述一种或多种紫杉醇；和(c)回收所洗脱的一种或多种紫杉醇。
在另一个备选实施方案中，本发明旨在提供一种制备紫杉醇混合物的方法。该方法包括以下步骤用PBS树脂处理由半合成或全合成方法得到的包含一种或多种紫杉醇的物质。半合成方法中所使用的紫杉醇或其它化合物来源于一种或多种红豆杉植物，或者来源于不包括短叶红豆杉的一种或多种红豆杉植物。在另一个实施方案中，含有紫杉醇的物质包含低于3重量％的紫杉醇A、B、C、D、E、F或G的2’苯甲酸酯。在另一个实施方案中，含有紫杉醇的物质包含低于0.5重量％的紫杉醇A、B、C、D、E、F或G的C-2’苯甲酸酯。
在另一个备选实施方案中，本发明所处理的物质可以包含苯甲酸酐、苯甲酸和苯甲酰氯，苯甲酸酐、苯甲酸和苯甲酰氯的量优选低于10％，优选低于5％，更优选低于1％，最优选低于0.3％。
关于由半合成或全合成方法得到的物质，当用本发明处理这些物质时，由其得到的目标产物的纯度至少为70％，优选至少约80％，更优选至少约90％，最优选至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在另一个备选实施方案中，本发明处理的物质可以包含分子量约为1104的紫杉醇杂质和/或分子量约为871的环氧丁烷环开环的紫杉醇等。
本发明的方法可以使原料中特定紫杉醇的纯度增加约10％～20％、20％～30％、30％～40％、40％～50％、50％～60％、60％～70％、70％～80％、80％～90％、90％～100％、100％～110％、110％～120％、120％～130％、130％～140％、140％～150％、150％～200％、200％～250％、250％～300％、300％～350％、350％～400％、400％～450％、450％～500％、500％～550％、550％～600％、600％～650％、650％～700％、700％～750％、750％～800％、800％～850％、850％～900％、900％～950％、950％～1000％。这里使用的术语纯度是指存在于干燥的原料或生物提取物中的一种或多种紫杉醇的重量百分比。
本发明的一个方案涉及使用PBS树脂以制备规模分离包括紫杉醇A在内的紫杉醇化合物。制备性的分离可以以间歇、半连续或连续模式进行。半连续和连续模式可以是模拟移动床(SMB)色谱的形式。
在另一个实施方案中，本发明包括使用PBS树脂通过液相色谱法进行分离。在一个这样的实施方案中，在液相色谱分离的流动相中使用少量的酸或盐改性剂。流动相中使用的酸或盐改性剂可包括但不局限于乙酸、甲酸、乙酸铵或甲酸铵。
PBS树脂可以以正相模式工作，并且对紫杉醇表现出独特的选择性。对于标准型色谱，在C-18和二氧化硅上，其它的紫杉醇都可在紫杉醇A之前和之后洗脱。在PBS树脂上的正相色谱中，大多数其它结构类似的紫杉醇都在紫杉醇A之前洗脱，这使得可以简化制备性分离。在大多数普通紫杉醇中，在PBS树脂上10-脱乙酰基紫杉醇在紫杉醇A之后洗脱。幸运的是，10-脱乙酰基紫杉醇的保留时间大大地延长，使得在制备性系统上容易分离。这是很重要的，因为10-脱乙酰基紫杉醇是半合成制备中的重要副产物，并且通常存在于红豆杉树种的天然提取物中。
图10表示紫杉醇标准物在各种介质上的保留时间的比较。在图10中，脚注1表示PhenomenexTMSynergiTMHydro-RP，4mm(250×4.6mm)HPLC柱乙腈/水梯度洗脱液(40％至60％的乙腈，45分钟)，1.5ml/min(毫升/分钟)。脚注2表示Amicon Si-100-10sp(250×4.6mm)HPLC柱Isocratic洗脱液，60％乙酸乙酯/40％己烷，1.0ml/min。脚注3表示J.T.Baker Wide-Pore PEI，5微米(250×4.6mm)HPLC柱Isocratic洗脱液，80％乙酸乙酯/20％己烷(含有0.5％的乙酸)，1.0ml/min。脚注4表示J.T.Baker Wide-Pore DEAM，5微米(250×4.6mm)HPLC柱Isocratic洗脱液，乙酸乙酯(含有0.5％的乙酸)，1.0ml/min。脚注5表示由单独注射紫杉醇标准物的混合物所得到的保留时间。脚注6表示相对于紫杉醇A的保留时间。脚注7表示单独注射紫杉醇标准物三次的平均时间。
键合有PET的树脂对紫杉醇表现出类似的选择性，但是一些紫杉醇仍然在紫杉醇A附近洗脱(例如10-脱乙酰基-7-表紫杉醇，见图10)。例如DEAM等化学改性形式的PEI保留了相同方式的选择性，并且表现出了较大的将紫杉醇A与其最接近的洗脱紫杉醇分离的能力。
PBS树脂对紫杉醇具有高的亲和力。如图10看到的，约60％乙酸乙酯和约40％己烷的混合物足以从二氧化硅上以合理的时间洗脱紫杉醇A。在一些情况中，PEI需要更强的混合溶剂，例如约79.75％乙酸乙酯、19.75％己烷和0.5％乙酸。DEAM对紫杉醇A的亲和力比PEI更强，需要约99.5％乙酸乙酯和约0.5％乙酸的混合物作为流动相。PEI和DEAM所使用的更强的溶剂体系能够更大程度地溶解紫杉醇，从而允许更高的装填量。
在一些变化方式中，使用键合有聚乙烯亚胺的二氧化硅树脂从例如红豆杉提取物等紫杉醇的混合物或半合成或全合成紫杉醇反应混合物中分离包括紫杉醇A在内的各种紫杉醇。生产包含紫杉醇A在内的半合成紫杉醇混合物的合适方法和组合物描述在2002年8月4日提交的第60/401191号申请(简称’191申请)、2003年4月5日提交的PCT/US03/10557和2003年2月4日提交的美国申请号为60/444847的名称为“Method and Compositions for Preparing a Pharmaceutical Compound(e.g.，Paclitaxel or other Taxanes)Using a Benzoylating Agent EssentiallyFree of Ring Chlorination”的临时申请。这些申请每个均以参考的方式整体地引入本文。
在一个备选实施方案中，本发明的方法包括下列一个或多个步骤(i)用合适量的PBS树脂填充柱子；(ii)用有机溶剂平衡柱子，所述有机溶剂优选含有乙酸的丙酮；(iii)将红豆杉提取物混合物或半合成或全合成反应混合物装填到柱子上；(iv)用有机溶剂洗脱所述混合物，所述有机溶剂优选丙酮/乙酸；(v)将洗脱液收集为一个或多个级分；(iv)确定目标紫杉醇出现在一个或多个级分中；和(v)通过结晶提纯目标紫杉醇。
根据一个备选实施方案，为了提纯包含在粗提取物或半提纯提取物中的紫杉醇和其它紫杉醇类物质，对含有紫杉醇的原料进行正相液相色谱(“NPLC”)处理。通常研究几个变量来用液相色谱实现分离和提纯，这些变量包括柱填充物(例如固定相或吸附剂)、洗脱液(例如流动相)的组成、柱尺寸和洗脱液流速。这些变量对本领域的技术人员是已知的或不需要大量的试验就可以容易地确定。
色谱柱尺寸以及温度、流速和色谱分离时间对实施本发明不是关键，它们主要基于高效色谱的要求，这些要求对本领域的技术人员是已知的或不需要大量的试验就可以容易地确定。
在一个备选实施方案中，使用含0.5％乙酸的乙酸乙酯作流动相，在DEAM树脂(20μm的球，100)上进行半合成紫杉醇A的色谱提纯。在合适的吸收波长处，该波长优选为254nm和280nm，用紫外吸收监测分离的进展。紫杉醇A峰被收集在级分中。峰的上升部分(从基线到峰顶)可被收集在多个级分中，通常为2或3个级分。这些级分中最早的那个级分含有大部分7-表紫杉醇和10-脱乙酰基-7-表紫杉醇杂质。峰的其余部分收集在一个或多个级分中。可使用甲醇和含0.5％乙酸的乙酸乙酯的50∶50混合物的阶梯梯度从该柱子中洗脱10-脱乙酰基紫杉醇。
在一个备选实施方案中，为了简短和易于操作，优选不使用线性梯度，而是采用阶梯梯度来洗脱其余的杂质。使用线性梯度需要更复杂的设备。使用预混合溶剂体系可以通过改变将流动相供应至泵中的单一阀门来实现阶梯梯度洗脱。在另一个备选实施方案中，优选将甲醇延迟引入到流动相体系中，因为少量的甲醇可加速洗脱较迟的杂质的洗脱，该杂质为例如2-脱苯甲酰基紫杉醇。
在一个备选实施方案中，优选以制备性模式(大于100mg的量)使用本发明的液相色谱系统。制备性柱子通常直径为7～300mm，长度为10～100cm。色谱领域的技术人员能容易地选择适合被提纯原料量的床尺寸的柱子。根据包括柱尺寸、树脂的粒径和孔径以及目标峰的分辨率等各种因素来调节流动相的流速。制备性柱子的典型流速可以在10ml/min到41/min的范围。
色谱运行需要的时间在约10分钟到约30小时的范围。尽管可以使用稍高的温度，但是色谱分离的温度通常为室温。
当根据本发明实施色谱分离时，柱子可以在低压(LPLC)至中压(MPLC)的模式下，通常为10～500p.s.i.g下工作。也可以在高压(HPLC)模式下运行，通常为500～2000p.s.i.g。
在另一个方案中，红豆杉提取物混合物或半合成或全合成反应混合物可以在溶解后装填到柱子上。例如使用有机溶剂或本领域技术人员知道的其它方法溶解所述混合物。优选的有机溶剂混合物包括丙酮/乙酸。然后将所溶解的混合物装填到填充有适量PBS树脂的柱子上。
可以参考色谱的标准操作规程来选择用于本发明的溶剂(洗脱剂)。通常可以使用例如丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃或乙腈等中等极性的有机溶剂作为洗脱剂。也可以使用含有1～5个碳原子的其它酮、醚和酯。如果混合物含有更高极性的紫杉醇，则洗脱剂的改性剂可包括更高极性的溶剂，例如低级醇、乙酸和水；而如果混合物含有更低极性的紫杉醇，则洗脱剂的改性剂包括更低极性的有机溶剂，例如烷和卤代烃。根据被提纯混合物的性质，改性剂的百分比可以为0％～100％。本领域的技术人员能容易地确定这个百分比。
在另一个实施方案中，红豆杉提取物混合物或粗反应混合物可以溶解在包含乙酸乙酯/THF(四氢呋喃)的有机溶剂中形成紫杉醇溶液。在温和加热下搅拌该紫杉醇溶液，然后真空过滤除去杂质和碎片。
粗紫杉醇溶液也可以稀释在有机溶剂中，所述有机溶剂优选乙酸乙酯/THF溶液。将该溶液注射和/或装载到含有合适量的PBS树脂的柱子上。该柱子可用有机溶剂预先进行平衡，所述有机溶剂优选乙酸乙酯/乙酸。在将紫杉醇溶液注射/装载到柱子上之后，可以将乙酸乙酯注射到柱子中。可以将所洗脱的物质收集在多个级分中。可以使用包含甲醇/乙酸乙酯混合溶剂的阶梯梯度。从柱子中洗脱需要的紫杉醇，然后收集在一个或多个级分中。可以使用洗涤步骤。
有时，使用阶梯梯度或连续梯度的梯度溶剂体系是有利的。梯度的浓度极值取决于(1)从吸附剂上洗脱紫杉醇所需要的有机溶剂的浓度；和(2)在洗脱紫杉醇所需要的浓度下有机溶剂完全互溶且存在于单一相中的要求。例如，开始使用100％的乙酸乙酯，然后以单一步骤、多步骤或连续梯度方式切换为1％～10％的甲醇。该系统对于分离各种极性差别很大的紫杉醇是必需的，本领域的技术人员容易确定该系统。
使用本领域知道的分析技术，例如薄层色谱(TLC)、红外光谱(IR)、核磁共振(NMR)谱、高效液相色谱(HPLC)、反相高效液相色谱和质谱(MS)，可以检测目标紫杉醇在一个或多个级分中的存在。
从柱子上收集目标紫杉醇之后，根据最终产物紫杉醇分子或紫杉醇混合物的所需纯度，可以使用其它的色谱方法或结晶和/或一次或多次重结晶对其进行进一步提纯。可以使用二元或三元溶剂体系(即至少一种增溶溶剂和至少一种逆溶剂(anti-solvent))进行结晶和重结晶。其中，增溶溶剂的例子包括丙酮、甲基叔丁基醚、二氯甲烷、THF、甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈。逆溶剂的例子包括例如己烷和庚烷等烃类溶剂和水。在大多数情况中，增溶溶剂和逆溶剂以所用的比例互溶。其中，对紫杉醇分子有用的溶剂体系的例子包括丙酮/己烷和甲醇/水。
图1和2表示本发明的使用PBS树脂(例如DEAM)的化学反应示意图。具体地，它表示将紫杉醇酰胺转化为紫杉醇A或其它紫杉醇并使用PBS树脂从反应产物中提纯紫杉醇的半合成方法。将紫杉醇酰胺转化为紫杉醇A或其它紫杉醇的方法表示在本文前述的专利申请中。
以上描述了适用本发明的具体色谱技术和条件，下面将描述根据本发明的离析、分离和提纯紫杉醇衍生物的优选实施方案。
实施例所提供的下列实施例仅仅是为了说明目的，而不是例如将本发明的范围限定为特定的步骤或成分。
实施例1本实施例显示了使用PEI树脂从半提纯的登斯夫米曼地亚红豆杉提取物中提纯紫杉醇A(paclitaxel)和紫杉醇B(三尖杉宁碱)。这里，给75升的柱子填充24.5kg的J.T.Baker PEI树脂(40微米粒径，275埃孔径，J.T.Baker Item #7264)。该树脂用流速为3.2L/min的2倍柱体积(即150升)的含有0.5％乙酸的丙酮进行平衡。然后将半提纯的红豆杉提取物进样装载到柱子上，该提取物在丙酮中的浓度约为250mg/mL，其流速为0.5L/min。紫杉醇的浓度为2.5重量％，或为每100g PEI树脂2.5g进样固体。进样固体中紫杉醇A和紫杉醇B的重量百分比为10.8重量％。该进样用含有0.5％乙酸的丙酮以3.2L/min(表观速度＝4.4cm/min)的流速洗脱。总共收集10个级分。级分1和级分10分别是75L(1倍柱子体积)，级分2～9分别为19L(1/4倍柱子体积)。产品级分2～5含有的紫杉醇A和B总量占进样的87.96％，组合产品级分的重量百分比是58.59％。该产品适合于通过结晶进一步进行提纯。
实施例2本实施例显示了使用PEI树脂将半提纯的短叶红豆杉提取物中存在的紫杉醇A(paclitaxel)、紫杉醇B(三尖杉宁碱)和紫杉醇C分离。在这里，将半提纯的短叶红豆杉提取物的固体进样溶解在含0.6％乙酸的丙酮中。该溶液装载到J.T.Baker PEI树脂(40微米粒径，275埃孔径，J.T.Baker Item#7264)上。进样的装载量是3％，或为每100g PEI树脂3g进样固体。洗脱溶剂是含0.6％乙酸的丙酮。当从柱子中洗脱进样组分时，大约每1/20的柱体积就收集为一个样品。用HPLC分析这些级分，用数据绘图，如图3所示。这次运行表明已经将紫杉醇A、紫杉醇B和紫杉醇C与杂质分离。
实施例3本实施例显示了使用DEAM树脂提纯粗半合成紫杉醇A(paclitaxel)。在这里，在半合成或全合成方法中用作反应物的分子来源于除短叶红豆杉之外的红豆杉植物。在本实施例中，使用的设备是NovaPrep 200 Preparative High Performance Liquid Chromatography System(NovaPrep 200制备性高效液相色谱系统)，该设备与波长设定为254nm的日立L-7400紫外线检测器结合使用。这两个设备都直接连接到运行2.11.V版LC ReSponder控制软件(R&S Technology，Inc.)的个人电脑界面上。
所述柱子为Load & Lock 2″Preparative LC column(R&STechnologies，Inc./Varian)，其尺寸如下内径＝5cm，长度＝25cm，体积＝490.87cm3。给该柱子填充以下键合有二乙基氨基甲基(DEAM)的二氧化硅凝胶球形，20微米的粒径，120埃的平均孔径。给该柱子填充270g压缩到800psi的树脂。
通过名称为“Conversion of Taxane Molecules”(紫杉醇分子的转化)的美国专利申请PCT/US03/10557中描述的伯胺转化化学方法，总共制备7.1g粗紫杉醇A。使用约35mL溶剂溶解该粗紫杉醇，该溶剂包含90体积％乙酸乙酯/10体积％四氢呋喃。温和加热(约35～40℃)下搅拌该溶液30分钟。在注射前，真空过滤澄清的溶液以除去小纤维或颗粒。过滤后，将溶液转移到量筒中，使用90∶10的乙酸乙酯/四氢呋喃溶液稀释到最终体积为42.5mL(稀释6倍)。取样前重新混合以保证均匀性。本次运行的装载量是2.625％，或为每100g DEAM树脂2.625g进样固体。流速设定为90mL/min。将该柱子用由乙酸乙酯+0.5体积％乙酸组成的标准流动相平衡20分钟。在20分钟的时刻，将全部体积的预先制备的样品溶液注射到柱子上，立即用20mL乙酸乙酯进行注射冲洗程序。以下列方式收集级分(所列出的所有时间都是从注射点——时间0开始计算)。
表2
在29分钟(即从注射点——时间0)时开始50％阶梯梯度，由50∶50甲醇/乙酸乙酯洗涤溶剂流动相组成。运行完成时总共运行20分钟。该洗涤步骤允许更快地洗脱在紫杉醇A之后洗脱的10-脱乙酰基紫杉醇A化合物。一旦紫外线检测器检测到吸收率迅速增加，这标志着10-脱乙酰基紫杉醇A的洗脱，立即关闭最后的级分收集阀(即级分5)。在上述条件下在10分钟内从柱子中冲洗出全部10-脱乙酰基紫杉醇A。但是，为了保证从柱子中清洗出所有残余物质，作为习惯做法，洗涤步骤总是进行整整20分钟。因此，从注射开始到完成柱子洗涤步骤的全部过程是49分钟。表示级分1～5的收集点的色谱轨迹表示在图4中。
将级分3、4和5合并在传递池中，以便进行随后的结晶工作。所传递的级分的级分分析(HPLC)总共给出5.835g紫杉醇A。除以所有级分中的紫杉醇的总质量，经计算回收率为98.18％。进到柱子中的粗原料的紫杉醇纯度是87.9重量％，经柱子提纯后，被传递的合并级分的紫杉醇A纯度为98.71面积％(HPLC)。
实施例4给44升的柱子填充10kg的J.T.Baker PEI树脂(40微米粒径，275埃孔径)。该树脂用3倍柱体积(即135升)的含0.5％乙酸的50体积％乙酸乙酯/50体积％庚烷以1.0L/min的流速平衡。其余级分的流速为1.0L/min。将半提纯的进样(来源于兰嫣曼地亚红豆杉)装载到柱子上，该进样在乙酸乙酯中的浓度为250mg/ml。进样中初级紫杉醇的纯度为57重量％。首先，第一个级分是170升的含0.5％乙酸的50体积％乙酸乙酯/50体积％庚烷。第二，收集到三个10升的含0.5％乙酸的50体积％乙酸乙酯/50体积％庚烷。第三，产品级分是90升的90体积％乙酸乙酯/10体积％甲醇。最后，该柱子用45升90体积％/10体积％的乙酸乙酯/甲醇洗涤。产品池含有93.5重量％的初级紫杉醇。紫杉醇A和B的回收百分比是95％。
在整个说明书中，当把本发明描述为具有、包括或包含特定组分时，或者，当把方法描述为具有、包括或包含特定处理步骤时，本发明还指基本上由所述的组分或处理步骤组成，或由所述的组分或处理步骤组成。此外，应该理解，只要本发明仍然可以实施，步骤的顺序或进行某些动作的顺序并不关键。而且，只要本发明仍然可以实施，可以同时进行两个或多个步骤。另外，只要本发明仍然可以实施，可以省略本发明的一个或多个步骤或要素，或者当本文没有明确公开的任何成分或步骤不存在时，也可合适地实施本文所描述的发明。
另外，在不脱离其精神或必要特征的情况下，本发明可以表现为其它的特定形式。因此，应当认为前述实施方案是说明性的，而不是限制本文所描述的发明。
本文以参考的方式明确地引入本文所提到的每篇专利和非专利文献的全部内容。
权利要求
1.一种从含有紫杉醇的混合物中离析一种或多种紫杉醇的方法，所述方法包括以下步骤(a)用PBS树脂处理所述混合物；其中所述一种或多种紫杉醇来源于一种或多种红豆杉植物，其中所述一种或多种紫杉醇不仅仅来源于短叶红豆杉；(b)用洗脱液从PBS树脂上洗脱所述一种或多种紫杉醇；和(c)回收所洗脱的一种或多种紫杉醇。
2.一种从含有紫杉醇的混合物中离析一种或多种紫杉醇的方法，所述方法包括以下步骤(a)用PBS树脂处理所述混合物；其中所述混合物包含低于25重量％或大于40重量％的初级紫杉醇；(b)用洗脱液从PBS树脂上洗脱所述一种或多种紫杉醇；和(c)回收所洗脱的一种或多种紫杉醇。
3.一种离析一种或多种紫杉醇的方法，该方法包括以下步骤(a)用PBS树脂处理含有紫杉醇的混合物；其中所述混合物包含约25重量％～40重量％的初级紫杉醇；其中所述一种或多种紫杉醇不仅仅来源于短叶红豆杉；(b)从PBS树脂上洗脱所述一种或多种紫杉醇；和(c)回收所洗脱的一种或多种紫杉醇。
4.一种从由半合成或全合成方法得到的包含紫杉醇化合物的物质中离析一种或多种紫杉醇的方法，所述离析方法包括以下步骤(a)用PBS树脂处理所述物质；其中在半合成或全合成方法中用作反应物的分子不仅仅来源于短叶红豆杉；(b)从PBS树脂中洗脱所述一种或多种紫杉醇；和(c)回收所洗脱的一种或多种紫杉醇。
5.一种从由半合成或全合成方法得到的包含紫杉醇化合物的物质中离析一种或多种紫杉醇的方法，所述离析方法包括以下步骤(a)用PBS树脂处理所述物质；其中所述物质包含总含量低于约8重量％的紫杉醇A、B、C、D、E、F或G的C-2’苯甲酸酯；(b)洗脱所述一种或多种紫杉醇；和(c)回收所洗脱的一种或多种紫杉醇。
6.一种从由半合成或全合成方法得到的包含紫杉醇化合物的物质中离析一种或多种紫杉醇的方法，所述方法包括以下步骤(a)用PBS树脂处理所述物质；其中所述物质包含总含量低于1.0重量％的紫杉醇B、C、D、E、F或G的C-2’苯甲酸酯；(b)洗脱所述一种或多种紫杉醇；和(c)回收所洗脱的一种或多种紫杉醇。
7.一种从含有天然衍生的紫杉醇的混合物中离析紫杉醇A的方法，所述方法包括以下步骤(a)用PBS树脂处理所述紫杉醇混合物；(b)从PBS树脂上洗脱紫杉醇A；和(c)回收所洗脱的紫杉醇A。
8.一种从生物提取物中提纯一种或多种紫杉醇的方法，所述方法包括以下步骤(a)用除色谱法以外的方法制备生物提取物；(b)用PBS树脂处理所述生物提取物；(c)从PBS树脂上洗脱所述一种或多种紫杉醇；和(d)回收所洗脱的一种或多种紫杉醇。
9.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中，所述含有紫杉醇的混合物包括来源于曼地亚红豆杉培养变种的生物提取物。
10.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中，所述含有紫杉醇的混合物包括来源于西斯曼地亚红豆杉的生物提取物。
11.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中，所述含有紫杉醇的混合物包括来源于泛深绿曼地亚红豆杉的生物提取物。
12.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中，所述含有紫杉醇的混合物包括来源于欧洲紫杉的生物提取物。
13.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中，所述含有紫杉醇的混合物包括来源于东北红豆杉的生物提取物。
14.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中，所述含有紫杉醇的混合物包括来源于佛罗里达红豆杉的生物提取物。
15.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中，所述含有紫杉醇的混合物包括来源于加拿大红豆杉的生物提取物。
16.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中，所述含有紫杉醇的混合物包括来源于西藏红豆杉的生物提取物。
17.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中，所述含有紫杉醇的混合物包括来源于云南红豆杉的生物提取物。
18.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中，所述含有紫杉醇的混合物包括来源于中国红豆杉的生物提取物。
19.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中，所述含有紫杉醇的混合物包括来源于登斯夫米曼地亚红豆杉的生物提取物。
20.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中，所述含有紫杉醇的混合物包括来源于布朗尼曼地亚红豆杉的生物提取物。
21.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中，所述含有紫杉醇的混合物包括来源于西斯曼地亚红豆杉的生物提取物。
22.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中，所述含有紫杉醇的混合物包括来源于兰嫣曼地亚红豆杉的生物提取物。
23.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中，所述含有紫杉醇的混合物包括来源于瓦蒂曼地亚红豆杉的生物提取物。
24.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中，所述含有紫杉醇的混合物包括来源于道托尼曼地亚红豆杉的生物提取物。
25.如权利要求4～6任一项所述的方法，其中，被离析的所述紫杉醇是紫杉醇A。
26.如权利要求4～6任一项所述的方法，其中，被离析的所述紫杉醇是紫杉醇B。
27.如权利要求4～6任一项所述的方法，其中，被离析的所述紫杉醇是紫杉醇C。
28.如权利要求4～6任一项所述的方法，其中，被离析的所述紫杉醇是紫杉醇D。
29.如权利要求4～6任一项所述的方法，其中，被离析的所述紫杉醇是紫杉醇E。
30.如权利要求4～6任一项所述的方法，其中，被离析的所述紫杉醇是紫杉醇F。
31.如权利要求4～6任一项所述的方法，其中，被离析的所述紫杉醇是紫杉醇G。
32.如权利要求4～6任一项所述的方法，其中，被离析的所述紫杉醇是多烯紫杉醇。
33.如权利要求1～8任一项所述的方法，其中所述PBS树脂具有约60至约300范围内的平均孔径。
34.如权利要求1～8任一项所述的方法，其中所述PBS树脂具有约100至约200范围内的平均孔径。
35.如权利要求1～8任一项所述的方法，其中所述PBS树脂具有约120的平均孔径。
36.如权利要求1～8任一项所述的方法，其中所述PBS树脂具有约0.25至约500μm范围内的平均粒径。
37.如权利要求1～8任一项所述的方法，其中所述PBS树脂具有1～100μm范围内的平均粒径。
38.如权利要求1～8任一项所述的方法，其中所述PBS树脂具有约10至约120μm范围内的平均粒径。
39.如权利要求1～8任一项所述的方法，其中所述PBS树脂具有约20至约60μm的平均粒径。
40.如权利要求1～8任一项所述的方法，其中所述PBS树脂具有约40μm的平均粒径。
41.如权利要求1～13任一项所述的方法，其中所述PBS树脂是DEAM。
42.如权利要求1～8任一项所述的方法，其中所述PBS树脂是PEI。
43.如权利要求1～8任一项所述的方法，其中所述PBS树脂具有约60至约800范围内的平均孔径。
44.如权利要求1～8任一项所述的方法，其中所述PBS树脂在聚乙烯亚胺部分上具有伯氨基或仲氨基。
45.如权利要求1～8任一项所述的方法，其中所述PEI聚合物的氨基被官能化。
46.如权利要求4～6任一项所述的方法，其中所洗脱的所述一种或多种紫杉醇具有至少约70％的纯度。
47.如权利要求4～6任一项所述的方法，其中所洗脱的所述一种或多种紫杉醇具有至少约80％的纯度。
48.如权利要求4～6任一项所述的方法，其中所洗脱的所述一种或多种紫杉醇具有至少约90％的纯度。
全文摘要
本发明旨在提供一种从包含紫杉醇的物质中离析和/或提纯一种或多种紫杉醇的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤(a)用附着在固体基质上的含有氨基的材料处理紫杉醇，所述材料为例如键合有聚乙烯亚胺的二氧化硅色谱树脂等；(b)从所述树脂上洗脱目标紫杉醇化合物；和(c)回收所洗脱的紫杉醇化合物。
文档编号C07D305/14GK1791590SQ200480013498
公开日2006年6月21日 申请日期2004年3月17日 优先权日2003年3月17日
发明者詹姆斯·H·约翰逊, T·G·桑班丹, 巴里·J·汉德, 克里斯多佛·D·豪, 罗兰·R·弗兰克斯, 布赖恩·A·布赫, 约翰·S·尤哈姆, 雷克斯·T·加拉格尔, 梅尔·A·普兰特, 爱德华·M·德西蒙三世, 东·S·杨 申请人:天然医药品公司