Il-6结合分子的制作方法
【专利摘要】本发明提供了结合分子(例如抗体或其抗原结合片段)，其特异性结合于IL-6(例如人类，小鼠或非人灵长类IL-6)并抑制其生物活性。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段结合于IL-6并抑制其对IL-6受体的结合。此类抗体或抗原结合片段对于治疗IL-6相关的疾病或病症(例如炎性疾病和癌症)特别有用。
【专利说明】IL-6结合分子
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2012年5月23日提交的美国临时申请系列号61/650，883、2012年10月30日提交的美国临时申请系列号61/720，102和2012年11月14日提交的PCT/IB2012/056424的优先权，均通过全文提述并入本文。
[0003]发明背景
[0004]白介素-6 (IL-6)是主要的促炎症细胞因子。其导致免疫活性细胞和造血细胞的增殖和分化。人IL-6是由212个氨基酸组成的单一糖蛋白，其具有两个N-连接的糖基化位点，并具有约26kDa的分子量。IL-6的结构包含四个α-螺旋域，所述域具有四个半胱氨酸残基的基序，这对于IL-6的三级结构是必需的。IL-6信号传导由IL-6对于可溶性或表面结合的IL-6受体α链(IL-6Ra)的结合介导，所述结合使得该复合物能够与细胞表面跨膜gpl30亚基相互作用，所述亚基介导胞内信号传导。
[0005]IL-6涉及炎性疾病的疾病发生，所述炎性疾病包括炎性自身免疫病如类风湿性关节炎(RA)，脊椎强直性关节病，系统性红斑狼疮(SLE)，炎性肠病(IBD)，和Castleman病。IL-6亦涉及癌症的疾病发生，所述癌包括前列腺癌，弥散性大细胞淋巴瘤，多发性骨髓瘤，和肾细胞癌。亦报道了 IL-6在促进癌症相关的食欲缺乏(anorexia)，口腔黏膜炎和恶病质中的作用。
[0006]尽管本领域中已知来源于对非人动物的免疫接种的IL-6结合分子，但这些分子通常需要大量的抗体工程(例如CDR移植和人源化)以减少其免疫原性。而且，所得的人源化变体通常受对IL-6靶的不理想的结合亲和力困扰，并需要大量的抗体工程和亲和力成熟以试图恢复IL-6结合亲和力。其最终结果是大多数IL-6抗体呈现对IL-6靶的不理想的结合亲和力。
[0007]因此，考虑到IL-6在疾病发生中的重要性和已知的IL-6抗体的缺点，显然在本领域中有对于改善的(例如几乎未经工程改造的)IL-6药剂的需要，所述药剂可抑制IL-6的生物活性，并因此治疗与IL-6活性相关的疾病。
[0008]发明概述
[0009]本发明通过提供结合分子(例如抗体或其抗原结合片段)来改善现有技术，所述结合分子具有改善的结合概貌，即以高结合亲和力(例如皮摩尔结合亲和力)特异性结合于IL-6(例如人或非人灵长类IL-6)并强力地抑制其生物活性(例如结合于IL-6受体)。在某些示例性实施方案中，本发明的IL-6结合分子来源于经受用IL-6抗原的主动免疫接种的驼类物种(例如美洲驼)的常规抗体全集。例如，本发明的驼类来源的IL-6结合分子可包含成对的VH/VL域或其它备选框架，其中VH或VL域的一个或多个超变环(hypervariable loop)(例如H1,H2,H3,L1,L2和/或L3)来源于所述骑类物种。而且,在某些实施方案中，至少所述超变环之一采取规范折叠(或规范折叠的组合)，其与人类抗体的折叠相同或实质上相同。此类结合分子呈现高的人类同源性(序列和结构)并因此由于其低免疫原性而特别有用于治疗IL-6相关的疾病或病症(例如炎性疾病和癌症)。令人惊讶的是，本发明的IL-6抗体呈现高结合亲和力，可制造性(manufacturability)和热稳定性，而无需已知IL-6抗体通常所需的大量和耗时的抗体工程和亲和力成熟。
[0010]因此，在一个方面，本发明提供特异性结合于IL-6的结合分子，所述结合分子包含至少一个抗体⑶R，其中所述⑶R包含至少一个当所述结合分子结合于IL-6时埋在IL-6的F229空穴或F279空穴中的氨基酸残基。在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域，所述VH域具有根据Kabat在98位的氨基酸，其当所述抗体或片段结合于IL-6时，埋在IL-6的F229空穴中。在一个具体实施方案中，在98位的氨基酸是色氨酸。在某些实施方案中，所述结合分子包含VL域，所述VL域具有根据Kabat在30位的氨基酸，其当所述抗体或片段结合于IL-6时，埋在IL-6的F229空穴中。在一个具体实施方案中，在30位的氨基酸是酪氨酸，在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域，所述VH域具有根据Kabat在99位的氨基酸，其当所述抗体或片段结合于IL-6时，埋在IL-6的F279空穴中。在一个具体实施方案中，在99位的氨基酸是缬氨酸。
[0011 ] 在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域和VL域，所述VH域包含超变环Hl，H2和H3，其中所述VH域多肽与VL域配对，所述VL域包含超变环LI，L2和L3，其中超变环H1-H3和L1-L3至少之一通过用IL-6抗原对羊驼属(Lama)物种进行免疫接种而从该羊驼属物种的常规抗体获得。在一个具体实施方案中，超变环Hl，H2，LI，L2和L3的至少之一呈现预测的或实际的相应规范折叠结构，其与人抗体中出现的Hl，H2，LI，L2或L3超变环的规范折叠结构相同或实质上相同。在一个具体实施方案中，超变环Hl和H2的至少之一各呈现预测的或实际的规范折叠结构，其与相应的人类规范折叠结构相同或实质上相同。在一个具体实施方案中，超变环LI，L2和L3的至少之一各呈现预测的或实际的规范折叠结构，其与相应的人类规范折叠结构相同或实质上相同。在一个具体实施方案中，超变环Hl和H2的至少之一形成预测的或实际的规范折叠结构的组合，其与已知出现于人类种系VH域的规范折叠结构的相应的组合相同或实质上相同。在一个具体实施方案中，超变环Hl和H2的至少之一形成规范折叠结构的组合，其对应于选自下组的人类规范折叠结构的组合:1-1，1-2，1-3，1-4 ，1-6，2-1，3-1和3_5。在一个具体实施方案中，超变环LI和L2的至少之一形成预测的或实际的规范折叠结构的组合，其与已知出现于人类种系VL域的规范折叠结构的相应的组合相同或实质上相同。在一个具体实施方案中，超变环LI和L2的至少之一形成规范折叠结构的组合，其对应于选自下组的人类规范折叠结构的组合:11_7，13-7 (A, B, C)，14-7(A, B),12-11,14-11,12-12,2-1,3-1，4-1和 6-1。
[0012]在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域和VL域，其中所述结合分子的VH域和/或VL域与一个或多个对应人类VH或VL域在框架区FR1，FR2，FR3和FR4内具有90%或更高的序列同一性。在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域和VL域，且为亲本结合分子的种系化变体，其中所述结合分子的VH域和VL域之一或两者与亲本非人类抗体的对应VH域和VL域相比，在框架区内包含总共I至10个氨基酸取代。在一个具体实施方案中，所述亲本结合分子是常规的驼类抗体。在某些实施方案中，所述结合分子是抗体或其抗原结合片段。
[0013]在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域，所述VH域包含SEQ IDno:500[X1PdvvtgfhydX2]中列出的hcdr3氨基酸序列，或其序列变体，其中:
[0014]X1是任何氨基酸，优选D或Y ;
[0015]X2是任何氨基酸，优选Y或N ;和[0016]其中所述序列变体在所述序列中包含一个，两个或三个氨基酸取代。在一个具体实施方案中，HCDR3氨基酸序列选自下组:SEQ ID N0:497_499。
[0017]在某些实施方案中，所述VH域进一步包含SEQ ID NO: 507 [VIXJXADTYYSPSUQS]中列出的HCDR2氨基酸序列或其序列变体，其中:
[0018]Xl是任何氨基酸，优选D，Y或N ;
[0019]X2是任何氨基酸，优选D或E ;
[0020]X3是任何氨基酸，优选A或G ;
[0021 ] X4是任何氨基酸，优选E或K ;和
[0022]其中所述序列变体在所述序列中包含一个，两个或三个氨基酸取代。在一个具体实施方案中，HCDR2氨基酸序列选自下组:SEQ ID NO: 501-506。
[0023]在某些实施方案中，所述VH域进一步包含在SEQ ID NO: 512 [X1X2YYX3WX4]中列出的HCDRl氨基酸序列，或其序列变体，其中:
[0024]Xl是任何氨基酸，优选T，S或P ;
[0025]X2是任何氨基酸，优选R或S ;
[0026]X3是任何氨基酸，优选A或V ;
[0027]X4是任何氨基酸，优`选S或T ;和
[0028]其中所述序列变体在所述序列中包含一个，两个或三个氨基酸取代。在一个具体实施方案中，所述HCDRl氨基酸序列选自下组:SEQ ID N0:508_511。
[0029]在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域，所述VH域包含SEQ ID NO: 497，501和508中分别列出的HCDR3，HCDR2和HCDRl氨基酸序列。
[0030]在某些实施方案中，所述结合分子进一步包含VL域，其中所述VL域包含SEQ IDNO: 524 [ASYX1X2X3X4X5X6X7]中列出的IXDR3氨基酸序列，或其序列变体，其中:
[0031]Xl是任何氨基酸，优选R或K ;
[0032]X2是任何氨基酸，优选N，H，R，S，D，T或Y ;
[0033]X3是任何氨基酸，优选F，Y，T，S或R ;
[0034]X4是任何氨基酸，优选N或I ;
[0035]X5是任何氨基酸，优选N或D ;
[0036]X6是任何氨基酸，优选V，N，G或A ;
[0037]X7是任何氨基酸，优选V或I ;和
[0038]其中所述序列变体包含所述序列的一个，两个或三个氨基酸取代。在一个具体实施方案中，所述LCDR3氨基酸序列选自下组:SEQ ID NO: 513-523.[0039]在某些实施方案中，所述VL域进一步包含SEQ ID NO:535[X1VX2X3RX4S]中列出的LCDR2氨基酸序列，或其序列变体，其中:
[0040]Xl是任何氨基酸，优选R，K，D，A或E ;
[0041]X2是任何氨基酸，优选S，N或T ;
[0042]X3是任何氨基酸，优选T，K或Y ;
[0043]X4是任何氨基酸，优选A，T或V ;和
[0044]其中所述序列变体包含所述序列的一个，两个或三个氨基酸取代。在一个具体实施方案中，所述LCDR2氨基酸序列选自下组:SEQ ID N0:525_534。[0045]在某些实施方案中，所述VL域进一步包含SEQ ID NO: 542 [AGX1X2X3DX4GX5X6X7YVs]中列出的LCDRl氨基酸序列，或其序列变体，
[0046]其中
[0047]Xl是任何氨基酸，优选A或T ;
[0048]X2是任何氨基酸，优选S或N ;
[0049]X3是任何氨基酸，优选S，E或N ;
[0050]X4是任何氨基酸，优选V或I ;
[0051]X5是任何氨基酸，优选G，Y，T或F ;
[0052]X6是任何氨基酸，优选G或Y ;
[0053]X7是任何氨基酸，优选N，D或A ;和
[0054]其中所述序列变体包含所述序列的一个，两个或三个氨基酸取代。在一个具体实施方案中，所述IXDRl氨基酸序列选自下组:SEQ ID N0:538_541。在某些实施方案中，所述结合分子包含VL域，所述VL域包含SEQ ID NO: 513，525和536中分别列出的LCDR3，IXDR2和IXDRl氨基酸序列。在某些实施方案中，所述结合分子包含:VH域，其具有SEQ IDNO: 497，501和508中分别列出的HCDR3，HCDR2和HCDRl氨基酸序列；和VL域，其具有SEQID N0:513,525和536中分别列出的LCDR3，LCDR2和LCDRl氨基酸序列。在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域，其与SEQ ID NO: 152中列出的氨基酸序列具有至少85%序列同一性。在 某些实施方案中，所述结合分子包含VH域，其氨基酸序列选自下组:SEQ IDNO: 127-232和569-571。在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域，其氨基酸序列为SEQID NO: 152。在某些实施方案中，所述结合分子包含VL域，其与SEQ ID N0:416中列出的氨基酸序列具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中，所述结合分子包含VL域，其氨基酸序列选自下组:SEQ ID N0:391-496。在某些实施方案中，所述结合分子包含VL域，其氨基酸序列为SEQ ID N0:416。在某些实施方案中，所述结合分子包含:VH域，其具有SEQ IDNO: 152中列出的氨基酸序列；和VL域，其具有SEQ ID NO:中416列出的氨基酸序列。
[0055]在某些实施方案中，所述结合分子包含所述Hl和H2环，其形成规范折叠结构的组合，所述组合对应于见于人类IACY抗体结构中的人类规范折叠结构的组合3-1。在某些实施方案中，所述结合分子包含所述LI和L2环，其形成规范折叠结构的组合，所述组合对应于见于人类3MUG抗体结构中的人类规范折叠结构的组合6 λ -1。在某些实施方案中，所述结合分子包含所述LI，L2和L3环，其形成规范折叠结构的组合，所述组合对应于见于人类3MUG抗体结构中的人类规范折叠结构的组合6 λ -1-5。
[0056]在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域，所述VH域包含SEQ IDNO:544[RAGX1GX2G]中列出的HCDR3氨基酸序列，或其序列变体，其中:
[0057]X1是任何氨基酸，优选W ；
[0058]X2是任何氨基酸，优选M，A，L，S或N ;和
[0059]其中所述序列变体包含所述序列的一个，两个或三个氨基酸取代。在一个具体实施方案中，所述HCDR3氨基酸序列选自下组:SEQ ID NO:543, SEQ ID NO:566, SEQ IDNO:567 和 SEQ ID NO:568。
[0060]在某些实施方案中，所述VH域进一步包含SEQ IDNO:554[X1Isx2X3Gx4SX5X6YX7DSVKG]中列出的HCDR2氨基酸序列，或其序列变体，其中:[0061]Xl是任何氨基酸，优选A，P或R ;
[0062]X2是任何氨基酸，优选A或S ;
[0063]X3是任何氨基酸，优选S或G ;
[0064]X4是任何氨基酸，优选G或V ;
[0065]X5是任何氨基酸，优选A或T ;
[0066]X6是任何氨基酸，优选Y，N或S ;
[0067]X7是任何氨基酸，优选G，A或T ;和
[0068]其中所述序列变体包含所述序列的一个，两个或三个氨基酸取代。在一个具体实施方案中，所述HCDR2氨基酸序列选自下组:SEQ ID N0:545_553。
[0069]在某些实施方案中，所述VH域进一步包含SEQ ID NO:562[X1X2X3X4X5]中列出的HCDRl氨基酸序列，或其序列变体，其中:
[0070]Xl是任何氨基酸，优选S或T ;
[0071]X2是任何氨基酸，优选H或Y ;
[0072]X3是任何氨基酸，优选A或R ;
[0073]X4是任何氨基酸，优`选M或L ;
[0074]X5是任何氨基酸，优选S或Y ;和
[0075]其中所述序列变体包含所述序列的一个，两个或三个氨基酸取代。在一个具体实施方案中，所述HCDRl氨基酸序列选自下组:SEQ ID N0:555_561。
[0076]在某些实施方案中，所述VH域包含HCDR3，其具有选自下组的氨基酸序列:SEQ IDNO: 543，566，567和568，和包含分别在SEQ ID NO: 545和555中列出的HCDR2和HCDRl氨基酸序列。在某些实施方案中，所述结合分子进一步包含VL域，其中所述VL域包含SEQ IDNO: 563中列出的LCDR3氨基酸序列，或其序列变体，其中所述序列变体包含所述序列的一个，两个或三个氨基酸取代。在某些实施方案中，所述VL域进一步包含SEQ ID N0:564中列出的LCDR2氨基酸序列，或其序列变体，其中所述序列变体包含所述序列的一个，两个或三个氨基酸取代。在某些实施方案中，所述VL域进一步包含SEQ ID NO:565中列出的IXDRl氨基酸序列，或其序列变体，其中所述序列变体包含所述序列的一个，两个或三个氨基酸取代。在某些实施方案中，所述VL域包含分别在SEQ ID NO: 563，564和565中列出的LCDR3，IXDR2和IXDRl氨基酸序列。在某些实施方案中，所述结合分子包含:VH域，其具有分别在SEQ ID NO: 544，545和555中列出的HCDR3，HCDR2和HCDRl氨基酸序列；和VL域，其具有分别在SEQ ID勵:563，564和565中列出的1^0?3，1^0)1?2和1^0)1?1氨基酸序列。在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域，其与SEQ ID N0:86中列出的氨基酸序列具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域，其具有的氨基酸序列选自下组:SEQ ID NO: 39-126和569-571。在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域，其具有的氨基酸序列选自 SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:569，SEQ ID NO:570 和 SEQ ID NO:571。在某些实施方案中，所述结合分子包含VL域，其与SEQ ID NO:350中列出的氨基酸序列具有至少85%序列同一'丨生。在某些实施方案中,所述结合分子包含VL域,其具有的氨基酸序列选自下组:SEQ ID NO:303-390。在某些实施方案中，所述结合分子包含VL域，其具有的氨基酸序列为SEQ ID NO: 350。在某些实施方案中，所述结合分子包含:VH域，其具有SEQ ID N0:86,SEQ ID NO:569, SEQ ID NO:570或SEQ ID NO:571中列出的氨基酸序列JPVL域，其具有SEQ ID NO:350中列出的氨基酸序列。
[0077]在某些实施方案中，所述结合分子包含Hl和H2环，其形成规范折叠结构的组合，所述组合对应于见于人类IDFB抗体结构中的人类规范折叠结构的组合1-3。在某些实施方案中，所述结合分子包含LI和L2环，其形成规范折叠结构的组合，所述组合对应于见于人类IMFA抗体结构中的人类规范折叠结构的组合7 λ-1。在某些实施方案中，所述结合分子包含L1，L2和L3环，其形成规范折叠结构的组合，所述组合对应于见于人类3MUG抗体结构中的人类规范折叠结构的组合7 λ -1-4。 [0078]在某些实施方案中，所述结合分子是Fab片段，其以低于2110_5^的解离速率(0ff-rate)(通过表面等离子共振测量的kf)结合于人类IL-6。在某些实施方案中，所述结合分子以亚皮摩尔结合亲和力结合于人类IL-6抗原。在某些实施方案中，所述结合分子以单数位飞摩尔的结合亲和力结合于人类IL-6抗原。在某些实施方案中，所述结合分子包含超变环，其从羊驼属的常规抗体无需后续亲和力成熟而获得。在某些实施方案中，所述结合分子以少于0.1pM的IC50抑制IL-6诱导的B9杂交瘤细胞的增殖。
[0079]在某些实施方案中，所述结合分子呈现大于65°C的熔解温度(Tm)。在某些实施方案中，所述结合分子是亲本驼类抗体的种系化变体，所述种系化变体与所述亲本驼类抗体相比具有更高的熔解温度。在某些实施方案中，所述结合分子在HEK293细胞中瞬时表达后以至少20mg/ml的水平表达。在某些实施方案中，所述结合分子表征为低于约10.0，例如低
于约6.0的EpiBase?评分。在某些实施方案中，所述结合分子抑制IL-6对IL-6受体的
结合。在某些实施方案中，所述结合分子抑制gpl30对IL-6受体的结合。在某些实施方案中，所述结合分子特异性结合于人类和食蟹猴IL-6。在某些实施方案中，所述结合分子包含至少一个来自特异性结合于IL-6的驼类抗体的⑶R。
[0080]在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含任何前述权利要求的结合分子，和一种或多种药学上可接受的载体。
[0081]在另一个方面，本发明提供了治疗IL-6相关疾病或病症的方法，其包括向需要该治疗的受试者施用有效量的本发明的药物组合物。
[0082]在另一个方面，本发明提供了分离的核酸，其编码本文中公开的结合分子。
[0083]在另一个方面，本发明提供了重组表达载体，其包含本发明的核酸分子。
[0084]在另一个方面，本发明提供了宿主细胞，其包含本发明的重组表达载体。
[0085]附图简述
[0086]图1描述了测量本发明的抗体的体外IL-6中和活性的细胞增殖测定的结果。
[0087]图2描述了测量本发明的抗体的体内效力的上皮卵巢癌小鼠肿瘤异种移植实验的结果。
[0088]图3A-B显示本发明的61H7抗体的驼类来源的超变环(L1_L3，H1和H2)采用预测的人类抗体的规范折叠和规范折叠组合。
[0089]图4A-B显示本发明的68F2抗体及其种系化变体(129D3)的驼类来源的超变环(L1-L3，Hl和H2)采用预测的人类抗体的规范折叠和规范折叠组合。
[0090]图5描述了 IL-6的空间填充模型，其分别与以下叠合(overlay): (A) IL-受体的F229 ； (B) IL-6 受体的 F229 和 61H7VH 的 W98, (C) IL-6 受体的 F229 和 68F2VL 的 Y30 ;和(D)IL-6 受体的 F229，61H7VH 的 W98 和 68F2VH 的 V99，均按照 Kabat 编号。[0091]图6描述了对于IL-6受体结合重要的IL-6上的两个表面结合空穴的空间填充模型，其与下述叠合:IL_6受体的残基F229和F279，以及68F2VL的残基Y30和68F2VH的V99，均根据Kabat编号(在该结构中为Y32和V104)。
[0092]图7A-B描述68F2及其种系化变体129D3的热稳定性，其在Biacore中用固定化的糖基化人类IL-6针对下述进行测量:(A)本发明的其它种系化变体IL-6抗体和(B)其它参照抗体。每个图的上部描述了熔解曲线，而下部列出了对于每个抗体的Tm值。
[0093]图8描述抗体克隆68F2，129D3 (68F2的种系化变体)和103A1 (61H7的变体)的血清稳定性。亦包括了参照抗体GL18。
[0094]图9描述对于本发明的IL-6抗体，相对于参照抗体(以粗体显示)(包括完全的人类抗体阿达木单抗(adalimumab) (Humira))的低免疫原性(Epibase)评分。
[0095]图1OA-B描述(A) 68F2和(B) 61H7的VH和VL的比对，描述与其相应的种系化变体129D3和111A7的框架区的高水平的序列同源性。亦显示了导入每个分子的框架改变的最小数目(总共为13)。
[0096]图1lA-B 显示(A)CNT0328 和⑶ VH_rabbit (ALD518)的 VH 和 VK 的比对，描述与其相应的种系化变体CNT0136和VH_human(ALD518)的框架区的高水平的序列同源性。亦显示了导入每个分子的框架改变的最小数目(总共为36和46)。
[0097]图12显示129D3IgGl抗体及其变体在食蟹猴中的药代动力学概貌。
[0098]图13描述测量本发明的抗体的体内效力的血清淀粉状蛋白A(SAA)小鼠模型实验的结果。
[0099]图14描述测量本发`明的抗体的体内效力的小鼠银屑病异种移植物实验的结果。
[0100]图15描述在肾细胞癌小鼠肿瘤异种移植物模型中测量本发明的抗体的体内效力的实验中观察到的肿瘤生长数据。
[0101]图16描述在肾细胞癌小鼠肿瘤异种移植物模型中测量本发明的抗体的体内效力的实验中观察到的存活数据的Kaplan-Meier图。
[0102]图17描述在肾细胞癌小鼠肿瘤异种移植物模型中测量本发明的抗体的体内效力的实验中观察到的肿瘤生长数据，所有药剂以3mg/kg给药。
[0103]图18描述在肾细胞癌小鼠肿瘤异种移植物模型中测量本发明的抗体的体内效力的实验中观察到的存活数据的Kaplan-Meier图,所有药剂以3mg/kg给药。
[0104]发明详述
[0105]1.定义
[0106]为了使得本发明可更容易理解，首先定义了某些术语。
[0107]如用于本文中，术语“IL-6”指白介素-6。IL-6核苷酸和多肽序列在本领域中是公知的。例示性人类IL-6氨基酸序列列于GenBank保藏G1: 10834984，而例示性的小鼠IL-6氨基酸序列列于GenBank保藏G1: 13624311。
[0108]如用于本文中，术语“抗体”指免疫球蛋白分子，其包含四个多肽链，即通过二硫键相互连接的两个重(H)链和两个轻(L)链，以及其多聚物(例如IgM)。每条重链包含重链可变区(缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个域:CH1，CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个域(CLl)。VH和VL区可进一步细分为具有超变性的区，称为互补决定区(CDR)，散布于称为框架区(FR)的更保守的区中。
[0109]如用于本文中，术语抗体的“抗原结合片段”包括任何天然存在的，酶法可获得的，合成的，或遗传工程的多肽或糖蛋白，其特异性结合抗原以形成复合物。抗体的抗原结合片段可例如从完整抗体分子使用任何合适的标准技术如蛋白分解消化或重组遗传工程技术(涉及对编码抗体可变域和任选地恒定域的DNA的操作和表达)来衍生。抗原结合部分的非限定性实例包括:(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(V)单链Fv(scFv)分子；(vi) dAb片段；和(vii)由模仿抗体的超变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如，分离的互补决定区(⑶R))。其它工程改造的分子，如二价抗体(diabody)，三价抗体(triabody),四价抗体(tetrabody)和微抗体(minibody),亦涵盖于表述“抗原结合部分”之内。
[0110]如用于本文中，术语“可变区”或“可变域”指下述事实:可变域VH和VL的某些部分在序列方面在抗体之间广泛不同，并用于每种特定抗体对其靶抗原的结合和特异性。然而，所述差异在抗体的可变域中并非平均分布。其聚集在每个VL域和VH域中称为“超变环”的三个区段，其形成抗原结合位点的一部分。V拉姆达轻链域的第一、第二和第三个超变环在本文中称作LI ( λ )，L2 ( λ )和L3 ( λ )，并可定义为包含VL域中的残基24-33 (Ll(A),由9，10或11个氨基酸残基组成)，49-53 (L2 ( λ )，由3个残基组成)和90-96 (L3 ( λ )，由5个残基组成)(Morea等，Methods20:267-279 (2000))。V卡帕轻链域的第一，第二和第三个超变环在本文中称作LI U)，L2(k)和L3(k)，并可定义为包含VL域中的残基25-33 (LI (O，由6，7，8，11，12或13个残基组成)，49-53 (L2( O，由3个残基组成)和90-97 (L3 ( K )，由 6 个残基组成)(Morea 等，Methods20:267-279 (2000))。VH 域的第一，第二和第三个超变环在本文中称作Hl，H2和H3并可定义为包含VH域中的残基25-33 (H1，由7，8或9个残基组成)，52-56 (H2，由3或4个残基组成)和91-105 (H3，长度高度可变)(Morea 等，Methods20:267-279 (2000))。
[0111]除非另行指明，术语LI，L2和L3分别指VL域的第一，第二和第三个超变环，并涵盖从V卡帕和V拉姆达同种型获得的超变环。术语Hl，H2和H3分别指VH域的第一，第二和第三个超变环,并涵盖从任何已知的重链同种型(包括Y, ε，δ，α或μ)获得的超变环。
[0112]超变环LI，L2，L3，HI, Η2和Η3可各包含如下所定义的“互补决定区”或“⑶R”的部分。术语“超变环”和“互补决定区”并不是严格同义的，因为超变环(HV)基于结构而定义，而互补决定区(Q)R)基于序列变异性而定义(Kabat等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD.，1983)，且对HV和CDR的限制在一些VH和VL域中可为不同的。
[0113]VL和VH域的⑶R通常可定义为包含下述氨基酸:轻链可变域的残基 24-34(CDRLl)，50-56(CDRL2)和 89-97(CDRL3)和重链可变域的残基 31-35 或3l-35b(CDRHl)，50-65(CDRH2)和 95-102(CDRH3)(Kabat 等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD.(1991))。因此，HV可包含于相应的CDR中，且本文中提及VH和VL域的“超变环”可解释为亦涵盖对应的CDR，反之亦然，除非另行指明。
[0114]可变域的更高度保守的部分称作框架区(FR)，如下文所定义。天然重链和轻链的可变域各包含四个FR (分别为FRl，FR2，FR3和FR4)，其主要呈β -层叠构型，由三个超变环连接。每个链中的超变环通过FR紧密结合在一起，与来自其它链的超变环一起参与抗体的抗原结合位点的形成。对抗体的结构分析揭示了由互补决定区形成的结合位点的形状和序列之间的关系(Chothia 等，J.Mol.Biol.227:799-817 (1992) ；Tramontano 等，J.Mol.Biol，215:175-182(1990))。尽管其具有高度序列差异性，但六个环中的五个仅采用主链构象的一个小全集，这称为“规范结构”。这些构象首先由环的长度决定，其次由在环中和框架区中的某些位置上关键残基的存在决定，其通过填充(packing)，氢键键合，或呈现不常见的主链构象的能力而决定构象。
[0115]如用于本文中，术语“互补决定区”或“CDR”指见于重链和轻链多肽的可变区内的非连续性抗原结合位点。这些特定区由Kabat等，J.Biol.Chem.252,6609-6616 (1977)和Kabat Sequences of protein of immunological interest.(1991),和由 Chothia 等，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)和由 MacCallum 等，J.Mol.Biol.262:732-745 (1996)描述，其中该定义包括相互比较时氨基酸残基的重叠或一部分。将涵盖如上述每一个引用的参考文献中定义的CDR的氨基酸残基列出以供比较。优选地，术语“CDR”是基于序列比较由Kabat定义的Q)R。
[0116]表1:CDR 定义
[0117]
【权利要求】
1.一种结合分子，其特异性结合于IL-6，所述结合分子包含至少一种抗体⑶R，其中所述CDR包含至少一个氨基酸残基，当所述结合分子结合于IL-6时，所述氨基酸残基埋于IL-6上的F229空穴或F279空穴中。
2.权利要求1的结合分子，其包含VL域，所述VL域在根据Kabat的位置30具有氨基酸，当所述结合分子结合于IL-6时，所述氨基酸埋于IL-6上的F229空穴中。
3.权利要求2的结合分子，其中在位置30的氨基酸是酪氨酸。
4.前述任一项权利要求的结合分子，其包含VH域，所述VH域在根据Kabat的位置99具有氨基酸，当所述结合分子结合于IL-6时，所述氨基酸埋于IL-6上的F279空穴中。
5.权利要求4的结合分子，其中在位置99的氨基酸是缬氨酸。
6.前述任一项权利要求的结合分子，其为抗体或其抗原结合片段。
7.前述任一项权利要求的结合分子，其包含VH域，所述VH域包含选自下组的HCDR3氨基酸序列:SEQ ID NO: 497-500，543，544，566，567 和 568。
8.权利要求7的结合分子，其中所述VH进一步包含选自下组的HCDR2氨基酸序列:SEQID NO:501-507 和 545-554。
9.权利要求7或8的结合分子，其中所述VH进一步包含选自下组的HCDRl氨基酸序列:SEQ ID NO:508-512 和 555-562。
10.权利要求7-9任一项的结合分子，其进一步包含VL域，其中所述VL域包含选自下组的 LCDR3 氨基酸序列:S EQ ID NO:513-524 和 563。
11.权利要求10的结合分子，其中所述VL域进一步包含选自下组的IXDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:525-535 和 564。
12.权利要求10或11的结合分子，其中所述VL域进一步包含选自下组的IXDRl氨基酸序列:SEQ ID NO:536-542 和 565。
13.权利要求6的结合分子，其包含VH域，所述VH域具有选自下组的氨基酸序列:SEQID NO:1-232 和 569-571。
14.权利要求6的结合分子，其包含VL域，所述VL域具有选自下组的氨基酸序列:SEQID NO:233-496 ο
15.权利要求6的结合分子，其包含:VH域，所述VH域具有选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO: 1-232和569-571 ;和VL域，所述VL域具有选自下组的氨基酸序列:SEQ IDNO:233-496。
16.前述任一项权利要求的结合分子，其包含VH域和VL域，所述VH域包含超变环Hl，H2和H3，其中所述VH域多肽与VL域配对，所述VL域包含超变环LI，L2和L3，其中超变环H1-H3和L1-L3至少之一是从通过用IL-6抗原主动免疫接种羊驼属(Lama)物种得到的羊驼属物种常规抗体获得的。
17.权利要求16的结合分子，其中: a)超变环Hl，H2，LI，L2和L3至少之一呈现预测或实际的规范折叠结构，其与人抗体中出现的Hl，H2，LI，L2或L3超变环的相应规范折叠结构相同或实质上相同； b)超变环Hl和H2各呈现预测的或实际的规范折叠结构，其与相应的人类规范折叠结构相同或实质上相同； c)超变环LI，L2和L3各呈现预测的或实际的规范折叠结构，其与相应的人类规范折叠结构相同或实质上相同； d)超变环Hl和H2形成预测的或实际的规范折叠结构的组合，其与已知出现于人类种系VH域的规范折叠结构的相应的组合相同或实质上相同； e)超变环Hl和H2形成规范折叠结构的组合，其对应于选自下组的人类规范折叠结构的组合:1-1，1-2，1-3，1-4，1-6，2-1，3-1 和 3-5 ； f)超变环LI和L2形成预测的或实际的规范折叠结构的组合，其与已知出现于人类种系VL域的规范折叠结构的相应的组合相同或实质上相同； g)超变环LI和L2形成规范折叠结构的组合，其对应于选自下组的人类规范折叠结构的组合:11_7，13-7 (A, B, C)，14-7 (A, B)，12-11，14-11，12-12，2-1，3-1，4-1 和 6-1 ； h)超变环Hl和H2形成规范折叠结构的组合，其对应于如见于人类IACY抗体结构中的人类规范折叠结构的3-1组合； i)超变环LI和L2形成规范折叠结构的组合，其对应于如见于人类3MUG抗体结构中的人类规范折叠结构的6 λ -1组合；和/或 j)超变环L1，L2和L3形成规范折叠结构的组合，其对应于如见于人类3MUG抗体结构中的人类规范折叠结构的6 λ -1-5组合。
18.前述任一项权利要求的结合分子，其 a)抑制IL-6对IL-6受体的结合； b)抑制gpl30对IL-6受体的结合；
c)特异性结合于人类和食蟹猴(cynomolgusmonkey) IL-6 ； d)包含至少一个来自特异性结合于IL-6的马它类(camelid)抗体的Q)R； e)特征为具有少于约10.0的EpiBase?-评分； f)在HEK293细胞中通过瞬时表达以至少20mg/ml表达； g)呈现大于65°C 的熔解温度(melting temperature, Tm)； h)以少于0.1pM的IC50抑制IL-6诱导的B9杂交瘤细胞的增殖； i)以少于ZxKT5iT1的解离速率(通过表面等离子共振测得的kj结合于人类IL-6； j)是亲本驼类抗体的种系化变体，所述种系化变体与亲本驼类抗体相比具有更高的熔解温度； k)包含至少一个来自羊驼属常规抗体而无后续亲和力成熟的⑶R ； I)当以天然的IgGlFc格式静脉内施用于食蟹猴时，具有至少9日，优选至少15日的血清半衰期；或 m)是亲本结合分子的种系化变体，其中所述结合分子包含VH和VL域，且其中所述结合分子的VH和VL域之一或两者与亲本非人类抗体的相应VH和VL域相比，在框架区中包含总共I至10个氨基酸取代；和/或包含VH和VL域，其中所述结合分子的VH和VL域之一或两者在框架区FR1，FR2，FR3和FR4中与一个或多个相应的人类VH或VL域具有90%或更高的序列同一性。
19.前述任一项权利要求的结合分子，其包含VH域，所述VH域具有选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO: 1-232和569-571，其中至少一个谷氨酰胺变成谷氨酸。
20.前述任一项权利要求的结合分子，其包含人Fe域，所述Fe域具有双重突变H433K/N434F。
21.一种药物组合物，其包含前述任一项权利要求的结合分子和一种或多种药学上可接受的载体。
22.—种处理IL-6相关的疾病或病症的方法,其包括向需要此处理的受试者施用有效量的权利要求21的药物组合物。
23.一种分离的核酸，其编码权利要求1-20任一项的结合分子。
24.一种重组表达载体，其包含权利要求23的核酸。
25.—种宿主细胞，其包含权利要求24的重组表达载体。
【文档编号】A61P35/00GK103601806SQ201310193693
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年5月23日 优先权日:2012年5月23日
【发明者】C.布兰切托特, J.德哈德, T.德赖尔, N.A.德琼格, S.P.范德沃宁, N.G.H.翁奇内 申请人:亚根-X公司