专利名称：一种快速检测水果中桔小实蝇卵的分子诊断方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术，特别涉及一种快速检测水果中桔小实蝇(Bactrocera dorsal is)卵的分子诊断方法。
背景技术：
桔小实蝇(Bactrocera dorsalis (Hendel))是一种直接危害果蔬生产并对出口贸 易形成重要影响的检疫性害虫，原产亚洲热带或亚热带地区，现已成为东南亚、印度次大陆 和夏威夷群岛一带的危险性果蔬害虫，是我国植物检疫的主要对象之一。目前桔小实蝇的 口岸检疫鉴定工作中，主要以成虫外部形态特征为依据，而口岸截获的往往是幼虫或卵，通 常做法是对其进行室内饲养获得成虫后再进行鉴定。 随着分子生物学的飞速发展，聚合酶链式反应(PCR)技术、核酸序列分析技术等 分子技术在分类学、系统学、遗传学、生态学等领域和学科得到广泛应用。以分子生物学 为实验手段，研究昆虫分类鉴定、类群遗传结构、系统发育和分子进化为主要内容的昆虫 分子系统学是近年来新兴学科之一。虽然上述技术已经在植物检验检疫病毒、真菌和线 虫等检疫性病害检测中得到应用，但用于检疫性昆虫的鉴定和区分则相对较少。在NCBI 上搜索发现，近年来美国、新西兰、澳大利亚等相继注册了有关桔小实蝇的基因序列，美国 Davis等(2000)注册了夏威夷桔小实蝇的无果基因(fruitless gene)BTB序列；新西兰 Armstrong (1997)测定了该虫两个品系的ITS1部分序列、rRNA5. 8S的全序列以及ITS2部 分序列；澳大利亚昆士兰大学Hoeben等(1997)测定了 Tabiti品系的mtDNA环区的全序列 以及核糖体基因18S的部分序列。我国运用分子生物学技术探讨桔小实蝇种类鉴定、种群 分化的研究报道较少。为了快速、准确地确认疫情并保护果蔬生产.开展对桔小实蝇的分 子鉴定研究是非常必要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速检测水果中桔小实蝇卵的分子诊断 方法。可快速、准确地确认疫情并保护果蔬生产. 本发明专利申请，使用的PCR方法用于快速鉴定果实中桔小实蝇卵。
本发明的技术方案是 —种利用嵌套式PCR扩增桔小实蝇rDNA中ITS间断序列快速检测水果中桔小实 蝇卵的分子诊断方法使用的PCR方法用于快速鉴定果实中桔小实蝇卵(l)PCR检测样品中 桔小实蝇卵 首先用通用的PCR程序去扩增三个样品中目的片段，既PCR扩增条件为94t:预变 性2min，共运行30个循环；每一循环包括95。C变性30s， 55。C退火30s， 72。C延伸30s，最后 一次循环后72t:延伸5min ;PCR产物点入1%琼脂糖凝胶，电泳检测结果；第一轮PCR产物 大小为637bp，从该PCR反应液中取出2微升稀释100倍，再从稀释样品中取1微升作为下 一轮PCR的模板，第二轮PCR产物大小为432bp ;普通的PCR程序能够检测出柑橘果实中桔小实蝇的rDNA基因片段，本试验设计的嵌套式PCR引物均正常工作；含不同数量桔小实蝇 卵的柑橘果实样品，通过PCR扩增实蝇rDNA片段，都得到很强的目的条带；
(2)PCR程序优化 鉴于通用PCR程序对3组果实样品中的桔小实蝇卵都扩增出很强的条带，我们 把PCR程序进一步优化，以达到縮短PCR运行时间，快速鉴定目的条带；PCR循环数设定为 5 (CI) 、 15 (C2) 、25 (C3)，对桔小实蝇卵含量最少的样品SI进行PCR鉴定;PCR产物电泳结 果，循环数降低对PCR产物量影响很大，基于有利于鉴定，我们选取循环数15(C2)为可识别 的标准值； (3)PCR片段序列对比 从电泳后的琼脂糖凝胶中分别回收两轮PCR产物，纯化后直接送样测序；序列对 比分析发现，本试验中第二轮PCR产物GS-F，片段大小为432bp，其全序列与第一轮PCR产 物GB-F，片段大小为637bp的部分序列完全相同，且被包含于其中；证明第二轮PCR产物是 第一轮PCR产物的特异扩增片段；二者DNA序列对比，可以确定，第二轮PCR产物GS-F是第 一轮PCR产物GB-F的一部分； 将PCR产物GB-F的DNA序列进行生物信息分析，PCR产物GB_F片段序列跨越桔 小实蝇rDNA间隔区ITS-1与ITS-2 ;通过将GB_F的DNA序列在NCBI上进行BLAST,所检测 的实蝇卵与桔小实蝇亲缘关系最近，序列对比二者间同源性百分之百，因此可确定本试验 所用虫源是桔小实蝇；生物信息分析结果进一步确证了本试验中设计的嵌套式PCR引物能 够精确、快速鉴定出果实样品中的桔小实蝇卵。
本发明效果是 该方法结果可靠，可快速检测出水果中桔小实蝇卵的存在，并经序列分析确定样 品的种属进化关系。 在桔小实蝇的分子检测方面，我们选择应用rDNA分子标记基因。rDNA特点是 成熟RNA的编码区具高度保守性，间隔区序列ITS(internal transcribedspacer)区被 5. 8SrRNA分成ITS-1和ITS-2两段，其进化速度比较快。间隔区序列由于不受选择压力的 影响，其变异较大，非编码区有高度的多态性，常用来区分姐妹种、同种不同种群或同一生 物群内部不同个体的差异。目前ITS-1和ITS-2主要被用于研究近缘种或低级分类阶元的 系统发育，如ITS用于鉴别寡鬃实蝇近缘种。ITS是分子系统发育研究中应用最多的标记基 因之一，因为ITS大小适中，全长约1.5kb，既能提供足够的信息，又便于实验室操作；其序 列在许多近缘种里是非保守的，有利于设计特异的引物用于序列扩增；基于rDNA的ITS也 具有一定的保守性，其全序列的分析结果可靠，基本上与传统形态学推断一致，目前生物各 类群在这一区域积累了庞大的基因数据库。因此，我们通过设计嵌套式特异性引物来扩增 桔小实蝇rDNA特定的ITS基因片段，达到准确、快速鉴定果实中桔小实蝇卵，并通过序列对 比确定其与近缘种的区分。 本试验设计的引物特点是，第一轮PCR正反向引物均设计在rDNA间隔区ITS内， 可精确鉴定桔小实蝇近缘种，第二轮PCR对检测结果给予了更精确、可靠的依据和保障。
图1是桔小实蝇rDNA基因片段结构图
图2是PCR检测柑橘果实中桔小实蝇卵 图3是不同循环数PCR检测柑橘果实中桔小实蝇卵 图4是PCR产物GS-F和GB_F序列对比
具体实施例方式
—种快速检测水果中桔小实蝇(Bactrocera dorsalis)卵的分子诊断方法。应用 分子生物学技术对于桔小实蝇的分子快速鉴定研究，尤其是针对果实中目测不到的桔小实 蝇卵的分子快速鉴定，其意义重大。 本试验基于快速检测出水果中桔小实蝇卵为目的，研究了一套嵌套式PCR扩增桔
小实蝇rDNA中ITS间断序列，试验结果表明，该方法结果可靠，可快速检测出水果中桔小实
蝇卵的存在，并经序列分析确定样品的种属进化关系。 —套嵌套式PCR扩增桔小实蝇rDNA中ITS间断序列，的制作 1.试验材料与方法 1. 1供试样品和虫源 将柑橘削去直径3-4厘米，厚度2毫米的外皮，放入培养箱，取经实验室饲养至成 虫的桔小实蝇雌、雄各一只放入培养箱中，待雌虫产卵，取柑橘提取总的基因组DNA。
1 2基因组DNA提取(CTAB法) 将柑橘削去外皮部分切割出长和宽为0. 5厘米、厚0. 2厘米的方块，用于基因 组DNA提取。DNA的提取和质量检测方法参照分子克隆手册。DNA样品放于-2(TC冰箱 保存。具体如下植物材料液氮冷冻(每个印pendorf管约0. 05g)磨棒捣碎(快速)， 然后加入500ul 2% CTAB，混匀，65t:保温30min以上，中间注意摇动，加入氯仿异戊醇 (24 : l)500ul震荡混匀，12000rpm，10min离心，取上清，加等体积的异丙醇，_20"放置 30min以上。再次10000rpm， 5min离心，弃上清，用70%乙醇洗一次，10000rpm， 5min离心， 弃上清，彻底晾干，加30ul TE溶解基因组DNA。1.3引物设计引物设计参照NCBI上公开的桔小实蝇rDNA基因序列，第一轮PCR引物，正向PF-1 :5，TGACCTAAGACATGCGCAGCTT 3，；反向引物PR-1 :5， GGGACTTAAGGTCTAGGTCACA :
第一轮PCR产物DNA序列tgacct aagacatgcg cagcttgcaa atgtttgggt^gatgtgttggaattttatttattctttcaaactcttgactttgaatcaaaaatttttactctaagcggtggatcactcggctcatgca3CgC3gC^3ctgtgcgtcatcgtgtgaactgC3gg3C3Catg^catcgacattttgaacgcatattgcggtccatgctgttatgtactttaaagtgctgcttggactacatatggttggactatggctcttattctttatattattggattgtattttccaatccataatatattcttgaatacctcatatttgaacgatcttagtatatttaaataaatacattacgtgtgacctagaccttaagtc
cc 第二轮PCR引物，正向引物PF-2 :5 ， tctaagcggtggatcact 3 ，;反向引物PR-2 : 5' tgctagactgtcctcgta 3'。引物合成由上海英骏生物技术有限公司合成。
第二轮PCR产物DNA序列 tct朋gcgg tggatcactc ggctcatgca tcgatg朋g3 3Cgcagc朋3
ctgtgcgtca tcgtgtgaac tgcaggacac atgaacatcg acattttgaa cgcatattgc
ggtccatgct gttatgtact ttaattaatt ttaaagtgct gcttggacta catatggttg
agggttgtaa gactatggct aaattagttg cttattcttt tagttaatta aaagaattta
agcatatggt atattattgg attgtatttt ccaatccata atattaatag cataaaaaga
朋tetetec3 atetettctt g朋tecctca tetttg朋cg 3朋ttttete ateaatgaga
atcttegtet tccc朋朋te朋33333朋t ttc朋tette ttt朋朋tet 3ttte朋t朋
atacattacg aggacagtct agca
1. 4PCR反应体系及反应条件的优化 PCR反应的扩增体积为20 ii L，包含1 X PCR缓冲液，2mmol/L Mg2+， 0. 2mmol/L dNTP，正反向引物各O. 2iimol/L，lU Taq酶(Takara)，模板DNA 20 40ng。 PCR扩增通用 条件为94。C预变性2min，共运行30个循环。每一循环包括95。C变性30s，55。C退火30s， 72t:延伸30s，最后一次循环后72t:延伸5min。样品在Biosystem Gene Amp PCR System 9700仪器上进行目的片段扩增。PCR产物在1%琼脂凝胶上电泳检测扩增效果。
1.5PCR产物纯化回收PCR产物用QIAquick PCR Purification试剂盒(德国，QIAGEN)纯化PCR产物。
具体操作按产品指南手册进行。
1. 6序列测定
PCR产物经纯化以后，送样直接测序，测序反应均在上海美季生物技术有限公司进
行。
1. 7DNA序列数据处理与对比
用DNAstar软件编辑获得的DNA测序的序列文件，在NCBI上进行BLAST,对比相近 种并进行分析。
2.结果与分析
2. 1样品基因组DNA提取 将不同产卵时期的柑橘样品切割成长和宽O. 5厘米、厚度0. 2厘米方块，本试验中
所用柑橘试验材料，肉眼无法分辨出是否带有实蝇卵，需要在体视显微镜下计卵数，按卵数 将样品分成3个等级，SI : (1-10)个卵/块，S2 : (10-100)个卵/块，S3 : (100-500)个卵/ 块。分别将样品加入液氮研磨，提取基因组DNA。将待测样品分级，目的是探测PCR技术在 鉴定含不同量桔小实蝇卵的柑橘果实的效率。供试样品基因组DNA提取是按照传统植物材 料基因组DNA提取方法进行，提取的DNA样品OD值测定只是对柑橘果实组织基因组DNA含 量及质量的测定，对实蝇卵基因组DNA含量及所占比例无法估计。
2. 2PCR引物设计 在NCBI上搜索到桔小实蝇的18S rRNA基因片段，登录号为AF276516,是一个未完 全的rDNA基因的部分片段，大小为1522bp，依据该序列，设计了两套PCR引物，第一轮PCR
6引物扩增目的片段大小为637bp，其中正向引物位于rDNA间隔区ITS-1内，该区是一个多 变区，可用以区分形态学方法难以鉴别的近缘种的关系。反向引物位于rDNA间隔区ITS-2 内，同样该区也是一个变异较大的区，可用于鉴定近缘关系。第二轮PCR引物扩增目的条带 大小为432bp，该片段被包含在第一轮PCR片段中。其正向引物位于5.8S rRNA基因内部， 这是一个非常保守的区域，可用来鉴别不同的物种。PCR引物在rDNA中的位置见图l所示。 第二轮PCR反向引物位于rDNA间隔区ITS-2内。本试验设计的引物特点是，第一轮PCR正 反向引物均设计在rDNA间隔区ITS内，可精确鉴定桔小实蝇近缘种，第二轮PCR对检测结 果给予了更精确、可靠的依据和保障。
参考图1.桔小实蝇rDNA基因片段结构图 Figurel. The construction of rDNA of Bactrocera dorsalis(Hendel)
2. 3PCR检测样品中桔小实蝇卵 首先用通用的PCR程序去扩增三个样品中目的片段，既PCR扩增条件为94t:预变 性2min，共运行30个循环。每一循环包括95。C变性30s， 55。C退火30s， 72。C延伸30s，最 后一次循环后72t:延伸5min。 PCR产物点入1 %琼脂糖凝胶，电泳检测结果见图2。第一轮 PCR产物大小为637bp，从该PCR反应液中取出2微升稀释100倍，再从稀释样品中取1微 升作为下一轮PCR的模板，第二轮PCR产物大小为432bp。从图2中可以看出，普通的PCR 程序能够检测出柑橘果实中桔小实蝇的rDNA基因片段，本试验设计的嵌套式PCR引物均正 常工作。从图2中可以看到，含不同桔小实蝇卵的柑橘果实样品，通过PCR扩增实蝇rDNA 片段，都得到很强的目的条带。 参考图2. PCR检测柑橘果实中桔小实蝇卵 Figure2. Identification of eggs of Bactrocera dorsalis(Hendel)withPCR
2. 4PCR程序优化 鉴于通用PCR程序对3组果实样品中的桔小实蝇卵都扩增出很强的条带，我们 把PCR程序进一步优化，以达到縮短PCR运行时间，快速鉴定目的条带。PCR循环数设定为 5(C1) 、15(C2) 、25(C3)，对桔小实蝇卵含量最少的样品SI进行PCR鉴定。PCR产物电泳结果 见图3。由图3可见，循环数降低对PCR产物量影响很大，基于有利于鉴定，我们选取循环数 15(C2)为可识别的标准值。参考图3.不同循环数PCR检测柑橘果实中桔小实蝇卵
Figure3. The amplification of ITS fragments with different PCR program
2. 5PCR片段序列对比 从电泳后的琼脂糖凝胶中分别回收两轮PCR产物，纯化后直接送样测序。序列对
比分析发现，本试验中第二轮PCR产物GS-F，片段大小为432bp，其全序列与第一轮PCR产
物GB-F，片段大小为637bp的部分序列完全相同，且被包含于其中。证明第二轮PCR产物是
第一轮PCR产物的特异扩增片段。二者DNA序列对比结果见图4，由图中可以确定，第二轮
PCR产物GS-F是第一轮PCR产物GB-F的一部分。 参考图4. PCR产物GS-F和GB_F序列对比 Figure4. The alignment of PCR products GS_F and GS_F将PCR产物GB-F的DNA序列进行生物信息分析，PCR产物GB_F片段序列跨越桔
小实蝇rDNA间隔区ITS-1与ITS_2。通过将GB_F的DNA序列在NCBI上进行BLAST,所检
测的实蝇卵与桔小实蝇亲缘关系最近，序列对比二者间同源性百分之百，因此可确定本试
7验所用虫源是桔小实蝇。生物信息分析结果进一步确证了本试验中设计的嵌套式PCR引物
能够精确、快速鉴定出果实样品中的桔小实蝇卵。
结论 桔小实蝇Bactrocera dorsalis (Hendel)是危害热带、亚热带水果的重要检疫性 害虫之一。实蝇种类鉴定主要以成虫形态特征为鉴定依据，形态学鉴定方法虽然简单、直 观，但要求鉴定者具有丰富的经验。在口岸检疫过程中，通常截获害虫幼虫或卵而非成虫， 常规方法是将幼虫或卵培养到成虫再进行鉴定，整个检疫鉴定过程有时长达数周。目前，利 用分子生物学技术对昆虫的近缘种进行分类鉴定的方法已越来越广泛地被采用。相对于形 态鉴定方法而言，其最大的优势就是不受昆虫虫态的制约，甚至不完整的虫体也能进行鉴 定。 由于生物基因组数量相当庞大，无法进行全面的序列分析，需要针对基因组中个 别特征基因片段进行重点研究。因此选择合适的分子标记片段是分子检测方法建立的关键 所在。分子检测选择的标记基因种类很多，目前线粒体DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)、核 糖体DNA(Ribosomal DNA，rDNA)、卫星DNA(Satel. lites Df)、微卫星DNA(MicrosateUites DNA)和核蛋白编码基因(Nuclear proteincoding genes)等特征基因作为分子标记被广泛 应用于昆虫的分类鉴定和系统发育研究中，其中rDNA和mtDNA中多个标记基因在昆虫的分 子系统研究中应用最广[9—15]。 rDNA是核基因组中的序列，同时具有多变区及保守区，能够反 映早期及近期进化关系，利用其保守区研究高级分类阶元关系。mtDNA属于细胞器基因组， 缺乏细胞核基因组中的保护机制，因而变异较为明显，能够反映较短时间内的进化事件，被 广泛应用于物种及种下关系的鉴别。 在桔小实蝇的分子检测方面，我们选择应用rDNA分子标记基因。rDNA特点是 成熟RNA的编码区具高度保守性，间隔区序列ITS(internal transcribedspacer)区被 5. 8SrRNA分成ITS-1和ITS-2两段，其进化速度比较快。间隔区序列由于不受选择压力的 影响，其变异较大，非编码区有高度的多态性，常用来区分姐妹种、同种不同种群或同一生 物群内部不同个体的差异。目前ITS-1和ITS-2主要被用于研究近缘种或低级分类阶元的 系统发育，如ITS用于鉴别寡鬃实蝇近缘种。ITS是分子系统发育研究中应用最多的标记基 因之一，因为ITS大小适中，全长约1.5kb，既能提供足够的信息，又便于实验室操作；其序 列在许多近缘种里是非保守的，有利于设计特异的引物用于序列扩增；基于rDNA的ITS也 具有一定的保守性，其全序列的分析结果可靠，基本上与传统形态学推断一致，目前生物各 类群在这一区域积累了庞大的基因数据库。因此，我们通过设计嵌套式特异性引物来扩增 桔小实蝇rDNA特定的ITS片段，达到准确、快速鉴定果实中桔小实蝇卵，并通过序列对比确 定其与近缘种的区分。
patent sup73X. WorkFile
Organization Applicant
Street :北翟路2901号 City :上海 State :
Country :中国PostalCode :201106 PhoneN咖ber :021-62201002 FaxNumber :021-37195193 EmailAddress :qiuliank@yahoo. com. cn 〈110>0rganizationName :上海市农业科学院 Application Project
〈120〉Title :—种快速检测水果中桔小实蝇卵的分子诊断方法 〈130〉AppFileReference :XQ12026978311 〈140〉CurrentAppNumber :200910228973X 〈141〉CurrentFilingDate :2009-12-07 Sequence
〈213>0rganismName :桔小实鹏(Bactrocera dorsalis (Hendel)) 〈400>PreSequenceString :
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〈308〉DBAccessionN咖ber :AF276516 〈309〉DBEntryDate :2001-07-02 〈313>From :1 〈313>To :43权利要求
一种快速检测水果中桔小实蝇卵的分子诊断方法使用的PCR方法用于快速鉴定果实中桔小实蝇卵，即利用嵌套式PCR扩增桔小实蝇rDNA中ITS间断序列进行快速鉴定果实中桔小实蝇卵(1)PCR检测样品中桔小实蝇卵首先用通用的PCR程序去扩增三个样品中目的片段，既PCR扩增条件为94℃预变性2min，共运行30个循环；每一循环包括95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，最后一次循环后72℃延伸5min；PCR产物点入1％琼脂糖凝胶，电泳检测结果；第一轮PCR产物大小为637bp，从该PCR反应液中取出2微升稀释100倍，再从稀释样品中取1微升作为下一轮PCR的模板，第二轮PCR产物大小为432bp；普通的PCR程序能够检测出柑橘果实中桔小实蝇的rDNA基因片段，本试验设计的嵌套式PCR引物均正常工作；含不同数量桔小实蝇卵的柑橘果实样品，通过PCR扩增实蝇rDNA片段，都得到很强的目的条带；(2)PCR程序优化鉴于通用PCR程序对3组果实样品中的桔小实蝇卵都扩增出很强的条带，我们把PCR程序进一步优化，以达到缩短PCR运行时间，快速鉴定目的条带；PCR循环数设定为5(C1)、15(C2)、25(C3)，对桔小实蝇卵含量最少的样品S1进行PCR鉴定；PCR产物电泳结果，循环数降低对PCR产物量影响很大，基于有利于鉴定，我们选取循环数15(C2)为可识别的标准值；(3)PCR片段序列对比从电泳后的琼脂糖凝胶中分别回收两轮PCR产物，纯化后直接送样测序；序列对比分析发现，本试验中第二轮PCR产物GS-F，片段大小为432bp，其全序列与第一轮PCR产物GB-F，片段大小为637bp的部分序列完全相同，且被包含于其中；证明第二轮PCR产物是第一轮PCR产物的特异扩增片段；二者DNA序列对比，可以确定，第二轮PCR产物GS-F是第一轮PCR产物GB-F的一部分；将PCR产物GB-F的DNA序列进行生物信息分析，PCR产物GB-F片段序列跨越桔小实蝇rDNA间隔区ITS-1与ITS-2；通过将GB-F的DNA序列在NCBI上进行BLAST，所检测的实蝇卵与桔小实蝇亲缘关系最近，序列对比二者间同源性百分之百，因此可确定本试验所用虫源是桔小实蝇；生物信息分析结果进一步确证了本试验中设计的嵌套式PCR引物能够精确、快速鉴定出果实样品中的桔小实蝇卵。
全文摘要
一种快速检测水果中桔小实蝇卵的分子诊断方法采用嵌套式PCR扩增桔小实蝇rDNA中ITS间断序列通过设计嵌套式特异性引物来扩增桔小实蝇rDNA特定的ITS片段，达到准确、快速鉴定果实中桔小实蝇卵，并通过序列对比确定其与近缘种的区分。该方法结果可靠，可快速检测出水果中桔小实蝇卵的存在，并经序列分析确定样品的种属进化关系。
文档编号C12Q1/68GK101792796SQ20091022897
公开日2010年8月4日 申请日期2009年12月4日 优先权日2009年12月4日
发明者叶军, 孔秋莲, 岳玲, 戚文元, 陈志军 申请人:上海市农业科学院