lgE分子的结合成员的制作方法

专利名称：：lgE分子的结合成员的制作方法
技术领域：
：本发明涉及IgE的结合成员，特别是抗体分子。结合成员尤其可用于治疗IgE介导的疾病，包括过敏症和译喘。IgE是免疫球蛋白家族的成员，能介导变态反应如哮喘、食物过敏、I型超敏反应和鼻窦炎。IgE由B细胞分泌和表达在其表面上。简言之，IgE通过跨膜结构域锚定在B细胞膜中，跨膜结构域通过短的膜结合区域与成熟IgE分子链接。IgE还可通过其Fc区，经由低亲和力IgE受体(FcsRII，也称CD23),与B细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和血小板结合。在暴露于过敏原时，能产生过敏原特异性IgE的B细胞被克隆扩增。过敏原特异性IgE然后被B细胞释放到循环中，它在循环中又通过FcsRII被B细胞结合，和通过高亲和力受体(FcsRI)被肥大细胞和嗜碱性粒细胞结合。这些肥大细胞和嗜碱性粒细胞因此变得对过敏原敏感。随后暴露于过敏原就会交联肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的FcsRI,从而激活这些细胞释放出造成临床超敏反应和过敏性反应的组胺和其他因子。能抑制与Fc五W的结合和通过Fc五^/发生的功能活性、并且有或没有同时抑制FcERII的作用的结合成员，可用于抑制IgE介导的疾病状况，如过敏症和哮喘。通常认为，FcsRI和FcsRII结合IgE恒定(Fc)结构域中的识别位点。已进行了各种鉴定这些识别位点的研究。例如，对应于IgE分子的特异性部分的肽已被用作IgE-受体结合的竟争性抑制剂(Burt等人，Eur.J.Immun,17:437-440[1987];Helm等人，Nature,331:180-183[1988];Helm等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，86:9465-9469[1989];5Vercelli等人,Nature,338:649-651[1989];Nio等人,PeptideChemistry,203-208[1990]),或者用来引发可阻断IgE-受体相互作用的抗IgE抗体(Burt等人，Molec.Immun.24:379-389[1987];Robertson等人，Molec.Immun.,25:103-113[1988];Baniyash等人，Molec.Immun.25:705-711[1988])。最近，Xolair⑧(奥马佐单抗)已生产并上市，用来治疗哮喘患者。Xolair⑧是人源化IgGlk单克隆抗体，它能选择性结合人IgE,从而降低IgE与至少肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面上的FcsRI的结合。通过降低带有FcsRI的细胞上的表面结合IgE，Xolair⑧能一定程度地降低变态反应介导物的释放程度。Xokir⑧在国际专利申请公开号WO93/04173和WO97/04807中公开。但是，还需要其他的IgE结合成员，例如那些亲和力和/或效价(potency)比Xolair⑧高的结合成员，来推进这个有前途的治疗策略。发明简述通过采用适当设计的选择技术和测定法，我们开发了能抑制与肥大细胞上存在的高亲和力IgE受体即FcsRI的结合的IgE结合成员。本发明的结合成员能抑制IgE与FcsRI的结合。对结合的抑制可以是通过直接抑制进行，例如通过中和IgE进行。由例如RBL-ER51钙信号转导测定法测出，本发明的结合成员通常以小于约10nM的ICso中和人IgE，在另一个实施方案中，由RBL-ER51钙信号转导测定法测出，以小于约3.0nM、或者小于约lnM、或者小于约0.5nM的IC50中和人IgE。本发明的另一个实施方案提供对免疫球蛋白E有特异性的分离结合成员，该结合成员对RBL-ER51细胞中25ng/mlIgE所诱导的钙信号转导的抑制的ICso几何平均值小于InM,或者小于0.6nM、小于0.5nM、小于0.4nM、小于0.3nM、小于0.25nM或小于0.2nM。本发明的结合成员还可结合和中和非人IgE,即在人类以外的物6种中天然存在的IgE直向同源物(ortholog)。本发明的结合成员对IgE的特异性通常高于对其他免疫球蛋白的特异性，因此能选择性结合igE。这种选择性可例如在标准的竟争测定中测出或显示出。结合成员可用于治疗和/或预防IgE介导的疾病，特别是过敏症和哞喘。和用于抑制过敏原引起的肥大细胞脱粒。结合成员进一步可在体内或体外用于抑制由FcsRl介导的生物反应，并且有或没有同时抑制FcERII的作用。本发明的结合成员还具有诊断用途，如用于检测目的样品如哮喘或过敏症患者样品中IgE的存在与否或数量，或者过敏原特异性IgE的存在与否或数量。本发明的结合成员所结合的IgE表位不同于Xolair⑧的。因此，当与Xolair⑧比较时，本发明的结合成员在它们与其他抗IgE抗体竟争与IgE的结合的能力方面不同。可用任何合适的方法测定被结合成员结合的残基的序列。例如，可使用肽结合扫描法，如本文别处详细描述的基于PEPSCAN的酶联免疫测定法(ELISA)。在肽结合扫描如PEPSCANSystems所提供的那种肽结合扫描中，对衍自抗原的短重叠肽进行系统筛选，确定是否能与结合成员结合。可将肽共价偶联到载体表面以形成肽阵列。肽可以处于线性构象或约束构象(constrainedconformation)。约束构象可用在肽序列的每一端具有末端Cys残基的肽产生。可将Cys残基直接或间接地共价偶联到载体表面，使得肽保持处于成环构象(loopedconformation^因此，该方法中使用的肽可在对应于抗原的片断的肽序列的每一端加上Cys残基。还可使用双环肽，其中另外有一个Cys残基位于肽序列中部或中部附近。可将Cys残基直接或间接地共价偶联到载体表面，使得肽形成双环构象，中央Cys残基的每一侧各有一个环。肽可以合成产生，因此可将Cys残基工程设计在期望的位置，尽管这在IgE序列中不天然出现。任选地，可在肽结合测定中同时筛选线性肽和约束肽。肽结合扫描可涉及到鉴定(例如使用ELISA)结合成员所结合的一组肽，其中这些肽具有对应于IgE的各片断的氨基酸序列(例如IgE的约5、10或15个连续残基的肽)，和将各肽进行比对以确定被结合成员结合的残基的足迹(footprint)，其中该足迹包含各重叠肽共有的残基。抑或或者另外，肽结合扫描方法可涉及鉴定结合成员以至少给定信噪比所结合的肽。用于测定结合情况的合适的肽结合扫描方法的细节是本领域知道的。其他本领域公知和可用来测定被抗体结合的残基和/或确认肽结合扫描结果的方法，包括定点诱变、氢氘交换、质谱、NMR和X射线结晶学。本发明的结合成员可以或可不结合和/或中和IgE变体。因此，本发明的结合成员可抑制或不抑制IgE变体与FcsRl的结合，并且有或没有同时抑制IgE变体与FcERII的结合的作用。可采用IgE的线性表位序列，例如是包含它们的分离肽片断或多肽，来鉴定、产生、分离和/或试验本发明的结合成员。如下文更详细地描述，已证实本发明的结合成员能以高效价中和IgE。中和是指IgE的生物活性的抑制。本发明的结合成员可中和IgE的一种或多种生物活性，但通常抑制IgE与FcsRl的结合。对IgE与FcsRl的结合的中和作用并且有或没有对IgE与FcERII的结合的同时中和作用，可任选作为受体的生物活性如过敏原引起的肥大细胞脱粒的函数进行测量。用于测量本发明结合成员对IgE的中和作用的合适测定法，包括配体受体生化测定法和表面等离振子共振(SPR)，例如BIACORE。生物活性的抑制可以是部分抑制或全部抑制。对于IgE生物活性、这种受体结合或肥大细胞脱粒，相比于结合成员不存在下的该活性，结合成员可抑制该活性达100%,或者达至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%或至少50%。结合成员的中和效价通常用ICso值(单位nM)表示，除非另有规定。在功能测定中，ICso是能使生物反应减少达其最大值的50%的结合成员浓度。在配体结合研究中，ICso是能使受体结合减少达其最大特异性结合水平的50%的浓度。ICso可如下计算将％最大生物反应作为结合成员浓度对数的函数进行作图，使用诸如Prism(GraphPad)的软件程序将sigmoidal函数与数据拟合，以得到IC5Ji。效价可用技术人员知道的和/或本文描述或提到的一种或多种测定法进行测定或测量。结合成员的中和效价可用几何平均值(geomean,也称geometricmean)表示。本文所用的几何平均值是指数据集的对数值的平均值，换算回底数10数字。这要求有至少两个测量值，例如至少2次、优选至少5次、更优选至少10次重复。本领域技术人员会认识到，重复次数越多，几何平均值将越可靠。重复次数的选择可由本领域技术人员决定。在本文描述的测定中结合成员对IgE活性的中和作用，表示结合成员能结合和中和IgE。其他可用来测定结合成员与IgE的结合的方法，包括ELISA、蛋白质印迹法、免疫沉淀法、亲和层析法和生化测定法。可将使用来自第一物种(例如人类)的IgE在某测定中计算出的结合成员中和效价，与使用来自第二物种(例如食蟹猴)的IgE在相似测定中在相似条件下得出的结合成员中和效价进行比较，以评估结合成员对两种物种的IgE的交叉反应性程度。或者，如本文别处更详细描述的，可在竟争性结合测定中评估交叉反应性。本发明的结合成员在人IgE结合或生物测定中的中和效价，可大于在使用来自人类以外的物种的IgE进行的相似测定中的中和效价。因此，结合成员在某测定中与人IgE的中和效价，可大于在相似测定中与人类以外的物种的IgE的中和效价。在人IgE结合或生物测定中的效价，可例如比采用食蟹猴IgE的相似测定中的效价高约10倍，或者在其他实施方案中，可高约25或约125倍。更具体的说，对于25ng/ml的人IgE的浓度，可测定在人RBL-ER51钙信号转导测定中的效价，并与用100ng/ml食蟹猴IgE在其他方面相似的条件下所得的效价进行比较。表5b显示了用人IgE和食蟹猴IgE在相似的RBL-ER514丐信号转导测定中获得的数据的实例。本发明的结合成员对人IgE的亲和力可比对其他物种IgE的亲和力强。结合成员对人IgE的亲和力可例如比对食蟹猴IgE的亲和力强约5倍，在其他实施方案中，可强约10倍。本发明的结合成员在25ng/ml的人IgE浓度下，可具有小于约10nM的IgE中和效价或IC5()。或者，IC5G小于约3nM。在其他实施方案中，IC5。小于约lnM,或者小于约0.5nM,或者小于约0.2nM。人IgE的IgE结合成员的结合动力学和亲和力(以平衡解离常数KD表示)，可例如用表面等离振子共振(BIACORE)进行测定。本发明的结合成员对人IgE的亲和力(KD)通常小于约80nM,在一些实施方案中KD小于约10nM,在其他实施方案中小于5nM,在其他实施方案中小于2nM，在其他实施方案中小于lnM。对食蟹猴IgE的亲和力通常小于约15nM。体内的内源IgE可被糖基化，因此糖基化人IgE是人类治疗的治疗靶标。虽然重组人IgE——其可能由细菌所衍生和没有糖基化~~~可用于本文描述的测定中，但本发明的结合成员可结合糖基化人IgE,例如由骨髓瘤细胞系如U266.B1产生的IgE。这代表着本发明结合成员的显著优点，因为对于人体内应用而言糖基化人IgE是靶标抗原。本发明的结合成员可包含抗体分子，优选人抗体分子或人源化抗体分子。在本发明的一个方面，抗体分子是单克隆抗体。抗原结合位点通常由可变重链(VH)和可变轻链(VL)免疫球蛋白结构域形成，其中抗原结合界面由六个称为互补决定区(CDR)的表面10多肽环形成。每个VH和每个VL都有三个CDR,分别为HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3，还有构架区(FR)。本发明的结合成员通常包含抗体VH和/或VL结构域。本发明的VH结构域包含一组HCDR，VL结构域包含一组LCDR。抗体分子可包含抗体VH结构域和构架，其中VH结构域包含VHCDR1、CDR2和CDR3。抑或或者另外，它可包含抗体VL结构域和构架，其中VL结构域包含VLCDR1、CDR2和CDR3。本发明的抗体VH结构域(SEQIDNO:2、298、338、318、328、118、309、28、68、8、48、288、158、268、168、38、128、78、138、188、198、98、18、88、58、108、218、248、228、238、178、208、278、148、426、278和258)和VL结构域(SEQIDNO:353、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、431和424)以及CDR(SEQIDNO:3-5、9-11、14-16、19-21、24-26、29-31、34-36、39-41、44-46、49-51、54-56、59-61、64-66、69-71、74-76、79-81、84-86、89-91、94-96、99-101、104-106、109-111、114-116、119-121、124-126、129-131、134-136、139-141、144-146、149-151、154-156、159-161、164-166、169-171、174-176、179-181、184-186、189-191、194-196、199-201、204-206、209-211、214-216、219-221、224-226、229-231、234-236、239-241、244-246、249-251、254-256、259-261、264-266、269-271、274-276、279-281、284-286、289-291、294-296、299-301、304-306、309-311、314-316、319-321、324-326、329-331、334-336、339-341、344-346、350-352、354-356和427-429)的实例，在构成本公开内容的一部分的所附序列表中列出。更多的CDR在下文和表1中公开。所有本文公开的VH和VL序列、CDR序列、各組CDR和各组HCDR和各组LCDR，代表了本发明的各个方面和各个实施方案。如本文所述，"一组CDR"包含CDR1、CDR2和CDR3。因此，一组HCDR是指HCDR1、HCDR2和HCDR3,—组LCDR是指LCDR1、LCDR2和LCDR3。除另有规定外，"一组CDR，，包括HCDR和LCDR。点，通常由非抗体蛋白质支架(scaffold)中的一个或多个CDR例如一组CDR提供，这在下文进一步讨论。如本文所述，分离了具有表1所示的那组CDR序列的亲本抗体分子(见表1的抗体1)。通过优化方法，我们产生了编号2-36的一批抗体克隆，其中CDR序列衍自亲本CDR序列，且在表l指出的位置处具有修饰。因此例如可从表1看出，抗体2具有亲本HCDR1、HCDR3和LCDR3序列，和具有其中Kabat残基56被R置换的亲本HCDR2序列；其中Kabat残基31被T置换的亲本LCDR1序列；和其中Kabat残基53被R置换的LCDR2序列。本文描述了包含表1所示的那组亲本CDR的结合成员(抗体1),其中HCDR1是SEQIDNO:3(Kabat残基31-35)，HCDR2是SEQIDNO:4(Kabat残基50-65)，HCDR3是SEQIDNO:5(Kabat残基95-102)，LCDRl是SEQIDNO:354(Kabat残基24-34)，LCDR2是SEQIDNO:355(Kabat残基50-56)和LCDR3是SEQIDNO:356(Kabat残基89-97)。本发明的结合成员还可以是表1所示的亲本结合成员，其中一个或多个CDR具有一个或多个氨基酸添加、置换、缺失和/或插入。在一个实施方案中，结合成员具有最多8个氨基酸添加、置换、缺失和/或插入。本发明的结合成员可包含本文所述的一个CDR或CDR的组合。被G置换，或者Kabat残基33被P置换、或者Kabat残基34被V置换的亲本HCDR1(参见表1)。本发明的结合成员或VH结构域可包含具有一个或多个以下修饰的亲本HCDR2:Kabat残基51被V置换；G在Kabat残基52B处；Kabat残基53被G置换；Kabat残基56被R置换；Kabat残基63被A置换。在某些实施方案中，结合成员在亲本HCDR2的Kabat残基52B处具有G和在Kabat残基56处具有R,这些结合成员趋向于显示较低的对IgE的KD和/或较高的抑制IgE介导生物活性的效价。参见表1，表中显示几个在亲本HCDR2的Kabat残基52B处具有G和在Kabat残基56处具有R的抗体。本发明的结合成员或VH结构域可包含具有一个或多个以下置换的亲本HCDR3:Kabat残基95被L或S置换；Kabat残基96被S、T、W或F置换；Kabat残基97被Y或F置换；Kabat残基98被P或F置换；Kabat残基99被Y置换；Kabat残基100被I或S置换。本发明的结合成员或VH结构域可包含具有一个或多个以下置换的亲本HCDR3(SEQIDNo.5):Kabat残基95#皮H、L或S置换；Kabat残基96被I、S、T、W或F置换；Kabat残基97被A、Y或F置换；Kabat残基98被V、P或F置换；Kabat残基99被A或Y置换；Kabat残基100被G、I或S置换。结合成员或其VL结构域可包含其中Kabat残基31和/或Kabat残基33被T置换的亲本LCDR1。例如，其中LCDR1中的Kabat残基31为T的结合成员，趋向于显示较高的对IgE的亲和力和/或较高的抑制IgE介导生物活性的效价。如表l中所示，抗体2-9、11-19、22-30和32-36在LCDR1中的Kabat残基31处都具有T。其他的抗体或LCDR1序列可例如用定点诱变工程改造成在这个残基处具有T。结合成员或其VL结构域可包含其中Kabat残基53被R置换和/或Kabat残基56被P置换的亲本LCDR2。结合成员或其VL结构域还可包含具有一个或多个氨基酸添加、置换、缺失和/或插入如1-5个置换的亲本LCDR3。在另一个实施方案中，本发明是这样的结合成员，其中HCDR1具有氨基酸序列SEQIDNO:279,HCDR2具有氨基酸序列SEQIDNO:280，HCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:281,LCDRl具有氨基酸序列SEQIDNO:284,LCDR2具有氨基酸序列SEQIDNO:285,和LCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:286。例如参见表1的抗体33。本发明的还其他的实施方案，是能够与表1的抗体33竟争与人IgE的结合的结合成员如抗体分子。本发明提供包含抗体1-36中任一个抗体的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3和/或抗体1-36中任一个抗体的LCDRl、LCDR2和/或LCDR3,例如表1所示抗体1-36中任一个抗体的一组CDR的结合成员。结合成员可包含这些抗体中的一个抗体的一组VHCDR。任选地，它还可包含这些抗体中的一个抗体的一組VLCDR,所述VLCDR可来自与VHCDR相同或不同的抗体。本发明还提供包含抗体1-36中任一个抗体的一组HCDR的VH结构域，和/或包含抗体1-36中任一个抗体的一组LCDR的VL结构域。不过如下文所进一步讨论，也可单独使用VH或VL结构域来结合抗原。可将抗体1VH结构域(见表3)与抗体1VL结构域(参见表2)配对，使得形成包含抗体lVH和VL结构域的抗体抗原结合位点。对于本文公开的其他VH和VL结构域，提供了类似的实施方案。在其他实施方案中，将抗体1VH与抗体1VL以外的VL结构域配对。轻链杂交(promiscuity)在本领域中已确立。同样，对于本文公开的其他VH和VL结构域，本发明提供了类似的实施方案。因此，可将亲本或抗体2-36中任一个抗体的VH与亲本或抗体2-36中任一个抗体的VL配对。结合成员可包含亲本抗体或抗体2-36中任一个抗体的一组H和/或LCDR，其中在所公开的该组H和/或LCDR当中具有多达20、16、10、9个或更少个例如1、2、3、4或5个氨基酸添加、置换、缺失和/或插入。或者，结合成员可包含亲本抗体或抗体2-36中任一个抗体的一组H和/或LCDR,其中在所公开的该组H和/或LCDR当中具有多达20、16、10、9个或更少个例如1、2、3、4或5个氨基酸置换。这种修饰可潜在地在该组CDR当中的任何残基处作出。例如，如表1所示，可在抗体2-36中的任一个抗体中被修饰的位置处作出修饰。因此，所述一个或多个修饰可包含在以下残基处的一个或多个置换HCDR中的Kabat残基31、33、34、51、52B、53、56、63、95、96、97、98、99和100;和LCDR中的Kabat残基31、33、53和56。结合成员可包含在抗体构架当中具有一个或多个CDR例如一组CDR的抗体分子。例如，可将抗体的一个或多个CDR或者一组CDR移植到构架(例如人构架)中，以提供抗体分子。构架区可以源于人种系基因序列，或者可以是非种系化的(non-germlined)。例如，构架可以是种系化的(germlined),其中构架当中的一个或多个残基被改变，以匹配大多数相似的人种系构架中的对等位置处的残基。因此，本发明的结合成员可以是具有包含人种系构架例如人种系IgGVH构架中的一组HCDR的VH结构域的分离人抗体分子。通常，结合成员还具有包含例如人种系IgGVL构架中的一組LCDR的VL结构域。VH和/或VL构架残基可如本文所讨i仑和例示进4li务饰，例如用定点诱变进行修饰。15本发明的VH结构域，或者包含这种VH结构域的结合成员，可具有表3的抗体1-36中的任何一个抗体的VH结构域。例如，本发明的VH结构域可包含具有一个或多个以下修饰的亲本构架(表3的抗体1):Kabat残基19被S置换；Kabat残基25被P置换；Kabat残基26被E置换；Kabat残基27被L置换；Kabat残基29被L置换；Kabat残基30被G置换；Kabat残基68被A置换；Kabat残基69被V置换；Kabat残基71被K置换；Kabat残基77被M置换；Kabat残基82B被G置换；Kabat残基82C被P置换；Kabat残基107#皮A置换；Kabat残基108被P置换；Kabat残基llO被A置换；Kabat残基111被I置换;和/或Kabat残基112被P置换。在某些实施方案中，Kabat残基19被S置换，Kabat残基25被P置换，Kabat残基52B被G置换，Kabat残基56被R置换，和Kabat残基71被K置换。一般地，本发明的结合成员或者VH结构域可含有表3的抗体1-36中的任何一个抗体的VH构架，其中VH构架区中有1-10个置换。在另一个实施方案中，本发明的结合成员或者VH结构域可含有表3的抗体1的VH构架，其中VH区中有l-7个置换。在另一个实施方案中，本发明的结合成员或者VH结构域可含有表3的抗体33的VH构架，其中VH区中有1-10个置换。本发明的VL结构域，或者包含这种VL结构域的结合成员，可具有表2的抗体1-36中的任何一个抗体的VL结构域序列。例如，抗体VL结构域可具有表2的抗体1的序列，其中在构架区中有一个或多个以下〗奮饰Kabat残基2被F置换；Kabat残基3被M或E置换；Kabat残基5被S置换；Kabat残基13被A置换；Kabat残基22被A置换；Kabat残基37被Q置换；Kabat残基39被K置换；Kabat残基40被P置换；Kabat残基42被L置换；Kabat残基45被A置换；Kabat残基58被V置换；Kabat残基69被D置换；Kabat残基70被A置换；Kabat残基76被G或R置换；Kabat残基77被R置换；Kabat残基79被Q或R置换；Kabat残基80被A置换；Kabat残基103被E置换；Kabat残基105被S置换；和/或Kabat残基106被A置换。在某些实施方案中，Kabat残基42被L置换，和Kabat残基45被A置换。一般地，本发明的结合成员或者VL结构域可含有表2的抗体l-36中的任何一个抗体的VL构架，其中VL构架区中有l-10个置换。一般地，本发明的结合成员或者VL结构域可含有表2的抗体1的VL构架，其中VL区中有l-9个置换。一般地，本发明的结合成员或者VL结构域可含有表2的抗体33的VL构架，其中VL区中有l-6个置换。非种系化的抗体分子与种系化的抗体分子相比，具有相同的CDR,但具有不同的构架。种系化的抗体可通过对本文所示的这些抗体的VH和VL结构域序列的构架区进行种系化来产生。本发明的结合成员可以是能与本发明的任何其他结合成员竟争与IgE的结合的结合成员。这种据说能竟争性结合IgE的结合成员是结合相同的表位。结合成员之间的竟争可容易地在体外测定，例如用ELISA和/或通过将特异性报道分子标记(tagging)到一个结合成员来测定，所述一个结合成员能在一个或多个其他未标记的(untagged)结合成员的存在下被检测，从而使得可以鉴定能结合相同表位的结合成员以及能结合重叠表位的结合成员。这些方法是本领域普通技术人员容易知道的，在本文中有更详细的描述。因此，本发明的一个进一步的方面提供包含这样的人抗体抗原结合位点的结合成员，该人抗体抗原结合位点能与抗体分子例如特别是包含亲本抗体或抗体1-36中任一个抗体的VH和/或VL结构域、CDR如HCDR3或者一组CDR的抗体分子竟争与IgE的结合。在一个实施方案中，本发明的结合成员与表2和3的抗体33竟争。在进一步的方面，本发明提供包含与抗体抗原结合位点竟争与IgE的结合的人抗体抗原结合位点的结合成员，其中所述抗体抗原结合位点由VH结构域和VL结构域组成，且其中所述VH和VL结构域包含本文所公开的亲本或者抗体1-36中任一个抗体的一组CDR。在进一步的方面，本发明提供包含编码本发明的结合成员、VH结构域和/或VL结构域的序列的分离核酸。编码本发明VH结构域的示例性核酸是所附序列表的SEQIDNO:1、7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237、247、257、267、277、287、297、307、317、327、337和425。编码本发明VL结构域的示例性核酸是所附序列表的SEQIDNO:6、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、430和423。本发明还包括制备本发明的结合成员、VH结构域和/或VL结构域的方法，所述方法包括在能导致产生所述结合成员、VH结构域和/或VL结构域的条件下表达所述核酸，和通过分离或纯化该结合成员进行回收。本发明的另一个方面提供编码本文所公开的VHCDR或VLCDR序列的核酸，通常是分离核酸。又一个方面提供含有或转化有本发明的核酸的宿主细胞。本发明的进一步的方面提供含有本发明的结合成员的组合物，和它们在抑制和/或中和IgE的方法中的用途，所述方法包括通过疗法治疗人或动物身体的方法。例如，本发明的结合成员可用于人或动物身体中(例如人患者中)或者体外的生物反应、疾病、病患或病症的治疗和/或预防的方法中，或者用于所述生物反应、疾病、病患或病症的"^断方法中。地中和IgE的量给予所述患者。可按本发明进行治疗的病症包括任何其中IgE起作用的病症，如过敏症和哮喘。本发明的这些和其他的方面在下文中作更详细的描述。在这里要顺便指出的是，本文所使用的"和/或"要认为是明确公开两个指定的特征(feature)或成分(component)中的每一个加上或不加上另一个。例如"A和/或B"要认为是明确公开(i)A、(ii)B及(iii)A和B中的每一个，犹如每一个都在本文中单独提出。IgE是免疫球蛋白E。人IgE恒定区的氨基S臾序列是可公开获得的。在一些实施方案中，IgE可以是人或食蟹猴IgE。如本文别处所述，IgE可以是重组的，和/或可以是糖基化的或非糖基化的。IgE在体内天然以糖基化形式表达。糖基化IgE还可在重组系统中表达，例如使用U266.B1细胞。结合成员通常指能互相结合的一对分子中的一个成员。结合对的各成员可以是天然衍生的，或者完全或部分合成产生的。该对分子的一个成员在其表面上具有能结合从而互补于该对分子的另一个成员的特定空间和极性构造(spatialandpolarorganization)的区域，或者说空穴(cavity)。结合对的类型的实例有抗原-抗体、生物素-亲和素、激素-激素受体、受体-S己体、酶-底物。本发明主要涉及抗原-抗体类型的反应。结合成员通常包含具有抗原结合位点的分子。例如，结合成员可以是包含抗原结合位点的抗体分子或非抗体蛋白质。抗原结合位点可通过将CDR安排在非抗体蛋白质支架如纤连蛋白或细胞色素B等之上来提供[参考文献1,2,3]，或者通过将蛋白质支架当中的环的氨基酸残基随机化或突变以赋予对期望靶标的结合特异性来提供。Nygren等人[参考文献3]已详细综述了用于将新的结合位点工程掺入(engineer)到蛋白质中的支架。用于抗体模拟物的蛋白质支架在WO/0034784中公开(该专利通过引用全文并入本文)，在该专利中发明人描述了包括具有至少一个随机化环的纤连蛋白III型结构域的蛋白质(抗体模拟物)。其中移植一个或多个CDR例如一组HCDR的合适支架，可由免疫球蛋白基因超家族的任何结构域成员提供。支架可以是人或非人蛋白质。非抗体蛋白质支架的优点是，它可在比至少一些抗体分子更小和/或更容易制造的支架分子中提供抗原结合位点。结合成员的小尺寸可赋予有用的生理特性，如能够进入细胞、深入渗透到组织中或到达其他结构当中的靶标，或者在靶标抗原[参考文献4]综述了抗原结合位点在非抗体蛋白质支架中的应用。典型的是具有稳定骨架和一个或多个可变环的蛋白质，其中该(一个或多个)环的氨基酸序列专门地或随机地进行突变，以产生能结合靶标抗原的抗原结合位点。这种蛋白质包括金黄色葡萄球菌(S.aureus)A蛋白的IgG结合结构域、转铁蛋白、四连蛋白、纤连蛋白(例如第IO个纤连蛋白III型结构域)、脂笼蛋白以及Y-晶体蛋白和其他AffilinTM支架(ScilProteins)。其他方法的实例包括基于环肽(cyclotide)(具有分子内二硫键的小蛋白质)的合成"微体"、微蛋白质(Versabodies,Amunix)和锚蛋白重复蛋白(DARPins,MolecularPartners)。除了抗体序列和/或抗原结合位点外，本发明的结合成员还可包含其他的氨基酸，例如形成肽或多肽如折叠结构域的氨基酸，或者赋予该分子除结合抗原的能力之外的另一功能特性的氨基酸。本发明的结合成员可带有可检测标记，或者可与毒素或靶向作用部分(targetingmoiety)或酶(例如通过肽键或接头)缀合。例如，结合成员可包含催化位点(例如在酶结构域中)以及抗原结合位点，其中抗原结合位点能结合抗原从而将催化位点耙向抗原。催化位点可例如通过切割作用抑制抗原的生物功能。虽然如所述，CDR可由非抗体支架携带，但携带本发明CDR或一组CDR的结构通常会是抗体重链或轻链序列或它们的实质部分(substantialportion),其中该CDR或该组CDR位于与由重排免疫球蛋白基因所编码的天然VH和VL抗体可变结构域的CDR或一组CDR对应的位置处。免疫球蛋白可变结构域的结构和位置可参考Kabat等人，1987[参考文献5](以及可用任何互联网搜索引擎以"Kabat"找到的更新内容)进行测定。所谓CDR区域或CDR是指由Kabat等人，1991[参考文献6]和之后的各版本所定义的免疫球蛋白重链和轻链超可变区。抗体通常含有3个重链CDR和3个轻链CDR。本文中使用术语CDR，目的是视情21况而定表示这些区域中的一个或者这些区域中的几个乃至全部，所述这些区域含有负责结合的氨基酸残基的大部分，所述结合是通过抗体对其识别的抗原或表位的亲和力进行。在六个短的CDR序列当中，重链的第三个CDR(HCDR3)具有较大的尺寸可变性(较大的多样性，基本上由产生它的基因的重排机制所致)。它可短至2个氨基酸，不过已知的最长尺寸为26个氨基酸。CDR长度还可根据可由特定的基础构架(underlyingframework)容纳的长度而变。在功能上，HCDR3在决定抗体的特异性方面起到部分作用[见参考文献7，8,9,10,11,12,13,14]。抗体分子指免疫球蛋白，不管是天然的还是部分或全部合成产生的。该术语还涵盖任何包含抗体抗原结合位点的多肽或蛋白质。这里必须理解的是，本发明不涉及天然形式的抗体，也就是说抗体不处在它们的天然环境中，而是已通过纯化从天然来源分离或获得，要不然就是通过遗传重组或通过化学合成获得，包括用非天然氨基酸修饰在内。包含抗体抗原结合位点的抗体片断，包括但不限于诸如Fab、Fab，、Fab，-SH、scFv、Fv、dAb和Fd的分子。已工程构建出各种其他的包含一个或多个抗体抗原结合位点的抗体分子，包括例如Fab2、Fab3、双抗体、三抗体、四抗体和微型抗体。抗体分子及它们的构建和使用方法在[参考文献15]中描述。有可能采取单克隆抗体和其他抗体，使用重组DNA技术的方法，来产生其他能结合耙标抗原的抗体或嵌合分子。这种方法可涉及到将编码抗体的免疫球蛋白可变区或CDR的DNA导入到另一免疫球蛋白的恒定区或恒定区加构架区。参见例如EP-A-184187、GB2188638A或EP-A-239400以及众多后续文献。可使产生抗体的杂交瘤或其他细胞经历遗传突变或其他变化，这可能改变或不改变所产生的抗体的结合特异性。由于抗体可用多种方式进行修饰，术语"抗体分子"应被解释为涵盖任何具有带有所需的抗原特异性和/或结合力的抗体抗原结合位点的结合成员或物质。因此，这个术语涵盖包含抗体抗原结合位点的抗体片断和衍生物，包括任何多肽在内，不管是天然的还是完全或部分合成的。因此，本发明包括包含与另一多肽(例如衍自另一物种或者属于另一抗体种类或亚类)融合的抗体抗原结合位点或等价物的嵌合分子。嵌合抗体的克隆和表达在EP-A-0120694和EP-A-0125023以及众多后续文献中描述。抗体工程领域中更多的可利用的技术使得有可能分离人抗体和人源化抗体。例如，可按Kontermann&Dubd[参考文献16]所述制备人杂交瘤。噬菌体展示^~"另一种确立的用以产生结合成员的技术，在许多出版物中有详细描述，如Kontermann&Dubel[参考文献16]和WO92/01047(下文进一步讨论)，以及美国专利US5,969,108、US5,565,332、US5,733,743、US5,858,657、US5,871,907、US5,872,215、US5,885,793、US5,962,255、US6,140,471、US6,172,197、US6,225,447、US6,291,650、US6,492,160、US6,521,404。其中小鼠抗体基因被失活而功能替换上人抗体基因、同时小鼠免疫系统的其他成分保持完整的转基因小鼠，可用于分离人抗体[参考文献n]。人源化抗体可用本领域熟知的技术产生，如在例如WO91/09967、US5,585,089、EP592106、US5,565,332和WO93/17105中公开的那些技术。此外，WO2004/006955描述了基于从人抗体基因选择可变区构架序列将抗体人源化的方法，所述选择是通过将非人抗体的可变区的CDR序列的规范CDR结构类型，与一文库的(alibraryof)人抗体序列例如种系抗体基因区段的相应CDR的规范CDR结构类型进行比较来选择。与非人CDR具有相似的规范CDR结构类亚组。亚组各成员可通过人和非人CDR序列之间的氨基酸相似性进行进一步的分等级(ranked)。在WO2004/006955的方法中，选择高等级的人序列来提供构架序列，用以构建采用选定的亚组成员人构架、以非人CDR对等序列功能性替换人CDR序列的嵌合抗体，从而提供高亲和力和低免疫原性的人源化抗体，而不需要比较非人抗体和人抗体之间的构架序列。还公开了按该方法制备的嵌合抗体。合成的抗体分子可例如按Knappik等人[参考文献18]或Krebs等人[参考文献19]所述，由通过在合适表达载体当中合成和装配的寡核苷酸所产生的基因表达生产。已证实完整抗体的片断能执行结合抗原的功能。结合片断的实例有(i)由VL结构域、VH结构域、CL结构域和CH1结构域组成的Fab片断；(ii)由VH结构域和CH1结构域组成的Fd片断；(iii)由单一抗体的VL结构域和VH结构域组成的Fv片断；(iv)由VH结构域和VL结构域组成的dAb片断[参考文献20,21,22];(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片断，由两个连接的Fab片断组成的二价片断；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，该接头能让这两个结构域发生締合而形成抗原结合位点[参考文献23，24];(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ix)"双抗体"，通过基因融合构建的多价或多特异性片断(WO94/13804;[参考文献25])。Fv分子、scFv分子或双抗体分子可通过一参入将VH结构域和VL结构域连接在一起的二硫键来稳定化[参考文献26]。还可制备出包含与CH3结构域连接的scFv的微型抗体[参考文献27]。结合片断的其他实例有Fab，和Fab，-SH，前者与Fab片断差别在于重链CH1结构域的羧基末端处添加有几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸，后者是其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基团的Fab，片断。个分子出发，通过诸如以下的方法来获得酶消化如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化，和/或通过化学还原进行的二硫键切割。按另一种方式，传重组的技术获得，要不然就是通过借助例如自动肽合成仪(如AppliedBiosystems等公司提供的合成仪)进行的肽合成来获得，或者通过核酸合成和表达来获得。本发明的功能抗体片断包括任何其半寿期通过化学修饰(特别是通过PEG化)或者通过掺入脂质体来延长的功能片断。dAb(结构域抗体)是抗体的小单聚抗原结合片断，即抗体重链或轻链的可变区[参考文献22]。VHdAb天然出现在骆驼科动物(camelid)(例如骆驼(camel)、美洲驼(llama)),可通过用耙标抗原免疫駱驼科动物、分离抗原特异性B细胞和从B细胞个体直接克隆dAb基因来产生。dAb也可在细胞培养中产生。它们的小尺寸、良好溶解性和温度稳定性使得它们特别在生理上有用和适合于选择和亲和力成熟。骆驼科动物VHdAb正以"nanobodiesTM"的商品名开发用于治疗用途。本发明的结合成员可以是包含基本上如本文所给出的VH结构域和VL结构域的dAb，或者是包含基本上如本文所给出的一組CDR的VH结构域或VL结构域。双特异性抗体或双功能抗体构成第二代单克隆抗体，其中两个不同的可变区结合在同一分子中[参考文献28]。它们的用途已在诊断领域和在治疗领域中，由它们募集新的效应子功能或者靶向肺瘤细胞表面上的几种分子的能力得到证明。在要使用双特异性抗体的情形中，从杂合杂交瘤制备的常规双特异性抗体，或者可以是任何上文提到的双特异性抗体片断。这些抗体可通过化学方法[参考文献30，31]或者体细胞方法(somaticmethod)[参考文献32，33]获得，但同样地和优先地通过能让异型二聚化(heterodimerization)被迫进行从而有助于所要的抗体的纯化过程的遗传工程技术获得[参考文献34]。双特异性抗体的实例包括BiTE技术获得的那些双特异性抗体，其中两个具有不同特异性的抗体的结合结构域可被使用并通过短的柔性肽直接连接在一起。这将两个抗体组合在一条短的单一多肽链上。可仅使用可变结构域构建出没有Fc区的双抗体和scFv，这能潜在地减少抗独特型反应的作用。25双特异性抗体可构建成完整IgG、双特异性Fab'2、Fab'PEG、双抗体或者双特异性scFv。此外，两个双特异性抗体可用本领域知道的常规方法连接在一起形成四价抗体。与双特异性的完整抗体不同，双特异性的双抗体还可因为它们能容易地在大肠杆菌(E.coli)中构建和表达而特别有用。具有适宜的结合特异性的双抗体(和许多其他多肽，如抗体片断)可容易地用噬菌体展示法(WO94/13804)从文库选择。如果双抗体的一个臂(arm)要保持恒定，例如对IgE的特异性，则可制备出其中另一个臂有变化的文库，并选出具有适宜特异性的抗体。双特异性的完整抗体可通过Ridgewayengineeringmethod)来制备。本领域有多种方法可用来获得抗IgE抗体。抗体可以是单克隆抗体，尤其是人来源、鼠来源、嵌合来源或人源化来源的单克隆抗体，它们可按照本领域技术人员熟知的标准方法获得。一^:来说，为制备单克隆抗体或者它们的功能片断，尤其是鼠来源的，可以参考在《抗体》手册[参考文献36]中具体描述的技术，或者参考K池ler和Milstein所描述的从杂交瘤的制备技术[参考文献37]。单克隆抗体可例如从针对IgE或其含有被所述单克隆抗体识別的表位的片断之一进行了免疫的动物细胞获得。合适的片断和包含它们的肽或多肽在本文中有描述，可用来免疫动物以产生抗IgE抗体。所述IgE或其片断之一尤其可按照通常的工作方法，通过从含在编码IgE或其片断的cDNA序列中的核酸序列开始进行的遗传重组，通过从包含在IgE和/或其片断的肽序列中的氨基酸的序列开始进行的肽合成，来产生。单克隆抗体可例如在之前已固定化了含有被所述单克隆抗体识别的表位的IgE或其片断之一的亲和柱上纯化。更具体的说，单克隆抗体可这样纯化在A蛋白和/或G蛋白上进行层析，接着进行或不进行旨在消除残余蛋白质污染物及DNA和LPS本身的离子交换层析，再接着进行或不进行旨在消除因二聚体或其他多聚体的存在所致的潜在聚集体的琼脂糖凝胶排阻层析。在一个实施方案中，全部这些技术可同时使用或者相续使用。抗原结合位点是分子中的能结合和互补于靶标抗原的全部或部分的那部分。在抗体分子中，它被称为抗体抗原结合位点，包含抗体中的能结合和互补于靶标抗原的全部或部分的那部分。抗原较大时，抗体可能只结合抗原的特定部分，该部分被称为表位。抗体抗原结合位点可由一个或多个抗原可变结构域提供。抗体抗原结合位点可包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。"分离的"是指本发明的结合成员或者编码这些结合成员的核酸一^t殳会符合本发明的这么一种状态。因此，本发明的结合成员、VH结构域和/或VL结构域及编码核酸分子和载体，可以例如从它们的天然环境分离和/或纯化而以基本上纯的或同质的(homogeneous)形式提供，或者在核酸的情形中，不含或基本上不含其来源不同于编码具有所需功能的多肽的序列的核酸或基因。分离的成员和分离的核酸将不含或基本上不含它们天然相伴的物质，如在它们的天然环境中或者制备它们的环境(例如细胞培养物)(当这种制备是通过体外或体内实施的重组DNA技术进行时)中与它们一起存在的其他多肽或核酸。成员和核酸可用稀释剂或佐剂配制，且出于实用目的仍是分离的，例如所述成员如果用来包被用于免疫测定的微量滴定板的话，通常会用明胶或其他载体混合，或者当用于诊断或治疗时，将与药物可接受的载体或稀释剂混合。结合成员可以天然糖基化或通过异源真核细胞(例如CHO或NS0(ECACC85110503)细胞)的系统糖基化，或者它们可以是(例如如果在原核细胞中表达产生的话)未糖基化的。包含抗IgE抗体分子的异质制品(heterogeneouspreparation)也构成本发明的一部分。例如，这种制品可以是具有全长重链和缺乏C末端赖氨酸的重链、具有不同程度的糖基化和/或具有衍生化氨基酸27(如N末端谷氨酸环化形成焦谷氨酸残基)的抗体的混合物。本文所用的词语"基本上如…所给出"是指本文所述结合成员的VH结构域或VL结构域的相关CDR的特性，将是相同于或高度类似于其序列在本文中给出的指定区域。本文针对一个或多个可变结构域的指定区域所述的词语"高度类似"，是设想到可在CDR和/或VH结构域或VL结构域中作出1至约5个，例如1-4个，包括1-3个或者1或2个或者3或4个氨基酸置换。发明详述如上所述，本发明的结合成员能调节和可中和IgE的生物活性。如本文所述，可对本发明的IgE结合成员优化中和效价。一般来说，效价优化涉及到将选定的结合成员的序列(通常是抗体的可变结构域序列)突变，以产生一文库的结合成员，然后测定它们的效价，选出效价更高的结合成员。这样选出的"效价优化的"结合成员趋向于具有比产生该文库的结合成员更高的效价。不过不进行优化也可获得高效价结合成员，例如可直接从初始筛选如生化中和测定直接获得高效价结合成员。"效价优化的"结合成员指具有经优化的对特定活性或下游功能的中和效价的结合成员。本文别处对测定法和效价有更详细的描述。本发明提供效价优化的结合成员和非效价优化的结合成员，以及用以从选定的结合成员进行效价优化的方法。本发明因此使得技术人员能产生具有高效价的结合成员。尽管可采用效价优化从给定的结合成员产生更高效价的结合成员，但还要指出的是甚至不用进行效价优化，也可获得高效价结合成贝。在又一个方面，本发明提供获得一个或多个能够结合抗原的结合成员的方法，所述方法包括使本发明的一文库结合成员与所述抗原接触，和选择该文库的一个或多个能够结合所述抗原的结合成员。可将文库展示在颗粒或分子复合物上，例如可复制的遗传组件(geneticpackage),如酵母、细菌或噬菌体(例如T7)颗粒、病毒、细胞或者共价的、核糖体的或其他的体外展示系统，每个颗粒或分子复合构域(如果存在的话)的核酸。噬菌体展示描述于WO92/01047和例如美国专利US5,969,108、US5,565,332、US5,733,743、US5,858,657、US5,871,907、US5,872,215、US5,885,793、US5,962,255、US6,140,471、US6,172,197、US6,225,447、US6,291,650、US6,492,160和US6,521,404(每个专利都通过引用全文并入本文)。选择了能够结合抗原且被展示在噬菌体或其他文库颗粒或分子复合物上的结合成员后，可从展示选定的结合成员的噬菌体或其他颗粒或分子复合物获取核酸。这种核酸可用于随后产生结合成员或抗体VH或VL可变结构域，产生的方式是用获自展示所述选定结合成员的噬菌体或其他颗粒或分子复合物的核酸的序列进行核酸表达。具有所述选定结合成员的抗体VH可变结构域的氨基酸序列的抗体VH可变结构域，如包含这种VH结构域的结合成员一样，可以以分离形式提供。可进一步试验IgE结合能力，还有与例如亲本抗体分子或抗体分子1-36(例如为scFv形式和/或IgG形式，例如IgGl)竟争与IgE的结合的能力。可试验IgE中和能力，这在本文别处进一步讨论。本发明的结合成员可以以亲本或其他抗体分子(例如scFv)或者抗体1-36中的一个(例如IgGl)的亲和力，或者以更好的亲和力，来结合IgE。本发明的结合成员可以以亲本或其他抗体分子或者抗体1-36中的一个(例如scFv或IgGl)的效价，或者以更好的效价，来中和IgE的生物活性。可将不同结合成员的结合亲和力和中和效价在适当条件下进行比较。本发明的VH结构域和VL结构域和CDR的变体，包括本文给出了氨基酸序列的那些变体和可应用于IgE结合成员的那些变体，可通过序列变化或突变方法及筛选具有期望特性的抗原结合成员的方法来获得。期望特性的实例包括但不限于'相对于对抗原有特异性的已知抗体，对该抗原的结合亲和力提高.如果活性已知的话，相对于对该抗原有特异性的已知抗体，对该抗原活性的中和作用提高.以特定的摩尔比与该抗原的已知抗体或配体的指定竟争能力.使复合物发生免疫沉淀的能力*结合指定表位的能力o线性表位，例如用本文所述的肽结合扫描所鉴定的肽序列，例如使用以线性构象和/或约束构象筛选的肽0由非连续残基形成的构象表位*调节IgE或下游分子的新的生物活性的能力。这些方法在本文中也提供。算化学将多元数据分析技术应用到结构/性质_活性相互关系[参考文献38]，采用公知的数学技术如统计回归、模式识别和分类，来得出抗体的定量活性-性质相互关系[参考文献39,40，41,42,43,44]。抗体的性质可从抗体序列、功能结构和三维结构的经验和理论模型(例如，可能接触残基的分析或者计算的理化性质)得出，且这些性质可单独考虑或组合考虑。由VH结构域和VL结构域组成的抗体抗原结合位点，通常由以下六个多肽环形成三个来自轻链可变结构域(VL)，三个来自重链可变结构域(VH)。对已知原子结构的抗体的分析，已揭示了抗体结合位点的序列和三维结构之间的关系[参考文献45,46]。这些关系暗示，除了VH结构域的三个区域(环)之外，结合位点环具有少数的主链构象之一规范结构(canonicalstructure)。已证实，在特定环中形成的规范结构是由其大小和在环和在构架区中关键位点处的某些残基的存在所决定[参考文献45，46]。序列-结构关系的这个研究，可用于预测序列已知但三维结构未知的抗体中，那些在维持其CDR环的三维结构方面重要从而能维持结合特异性的残基。这些预测可通过将预测结果与先导优化实验(leadoptimizationexperiment)的结果进行比较而得到支持。在结构方法中，可用任何自由获取的或商业的软件包如WAM[参考文献48]来产生抗体分子[参考文献47]的模型。接着可用蛋白质可视化和分析软件包如InsightII(Accdrys,Inc.)或DeepView[参考文献49]来评估CDR中每个位置处的可能置换。然后可用这个信息来作出可能对活性具有最低限度的影响或有利影响的置换。在CDR、抗体VH结构域或VL结构域和结合成员的氨基酸序列当中作出置换所需要的技术，一般是本领域可获得的。可作出具有可被或不被预测到对活性有最低限度影响或有利影响的置换的变体序列，并试验其结合和/或中和IgE的能力和/或试验任何其他期望的性质。如所讨论，任何其序列在本文中明确公开的VH结构域和VL结构域的可变结构域氨基酸序列变体，都可按本发明采用。本发明的又一个方面是包含与表3和所附序列表所示的抗体1-36中任一个抗体的VH结构域，或者与表1所示的HCDR(例如HCDR1、HCDR2或HCDR3)有至少60、70、80、85、90、95、98或99%氨基S吏序列同一性的VH结构域的抗体分子。该抗体分子任选还可包含与抗体1-36中任一个抗体的VL结构域或者与表2所示的LCDR(例如LCDR1、LCDR2或LCDR3)有至少60、70、80、85、90、95、98或99%氨基Si序列同一性的VL结构域。可用来计算两个氨基酸序列的％同一性的算法，包括例如BLAST[参考文献50]、FASTA[参考文献51]或Smith-Waterman算法[参考文献52],这些算法例如采用默认参数。具体的变体可包括一个或多个氨基酸序列变更(氨基酸残基的添加、缺失、置换和/或插入)。在某些实施方案中，变体具有不到约20个这些变更。可在一个或多个构架区和/或一个或多个CDR中作出变更。变更通常不导致功能的丧失，因此包含如此变更的氨基酸序列的结合成员可保持结合和/或中和IgE的能力。例如如在本文所述的测定中测出，能力。包含如此变更的氨基酸序列的结合成员可具有改进的结合和/或中和IgE的能力。变更可包括用非天然或非标准氨基酸置换一个或多个氨基酸残基，将一个或多个氨基酸残基修饰成非天然或非标准形式，或者将一个或多个非天然或非标准氨基酸插入到序列中。本发明的序列中的变更的数量和位置的实例，在本文别处描述。天然氨基酸包括20个"标准的"L-氨基酸，它们由其标准的单字母代号表示为G、A、V、L、I、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、E。非标准氨基酸包括任何其他可掺入到多肽骨架中或者可由现有氨基酸残基的修饰产生的残基。非标准氨基酸可以是天然的或非天然的。有几个天然的非标准氨基酸是本领域知道的，如4-鞋脯氨酸、5-羟赖氨酸、3-曱基组氨酸、N-乙酰丝氨酸等[参考文献53]。那些在其N-a位置被衍生化的氨基酸残基，将只位于氨基酸序列的N末端。通常在本发明中，氨基酸是L-氨基酸，但它也可以是D-氨基酸。因此变更包括将L-氨基酸修饰成D-氨基酸，或者用D-氨基酸置换L-氨基酸。甲基化、乙酰化和/或磷酸化形式的氨基酸也是为人所知的，本发明的氨基酸可进行这种》务饰。本发明的抗体结构域和结合成员中的氨基酸序列可包含上述的非天然或非标准氨基酸。非标准氨基酸(例如D-氨基酸)可在合成过程中掺入到氨基酸序列中，或者在氨基酸序列合成后通过修饰或置换"原始的"标准氨基酸来掺入。32非标准和/或非天然氨基酸的使用能增加结构和功能多样性，因此可提高在本发明的结合成员中实现期望的IgE结合和中和性质的潜在可能性。另外，已证实D-氨基酸和类似物具有比标准的L-氨基酸更好的药代动力学概况，因为具有L-氨基酸的多肽在给予动物如人之后会发生体内降解。携带本发明的CDR衍生序列的新型VH区或VL区，可采取对一个或多个选定的VH基因和/或VL基因进行随机诱变以在整个可变结构域当中产生突变来产生。这种技术由Gram等人描述[参考文献54]，他们使用了易错PCR。在一些实施方案中，在整个可变结构域或整组CDR当中作出一个或两个氨基酸置换。另一可使用的方法是将诱变导入VH基因或VL基因的CDR区。这种技术由Barbas等人[参考文献55]和Schier等人[参考文献56]公开。所有上述技术本身在本领域中是为人所知的，技术人员将能够采用本领域的常规方法，应用这些技术来提供本发明的结合成员。本发明的又一个方面提供获得针对IgE的抗体抗原结合位点的方法，所述方法包括通过在本文给出的VH结构域的氨基酸序列中添加、缺失、置换或插入一个或多个氨基酸，来提供属该VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域；任选将这样提供的VH结构域与一个或多个VL结构域结合；和对VH结构域或VH/VL组合(一个或多个组合)进行试验，以鉴定针对IgE和任选具有一个或多个期望性质(例如中和IgE活性的能力)的结合成员或抗体抗原结合位点。所述VL结构域可具有基本上如本文所给出的氨基酸序列。有类似的方法可使用，其中将本文公开的VL结构域的一个或多个序列变体与一个或多个VH结构域进ff组合。如上所述，基本上如本文所给出的CDR氨基酸序列，可在人抗体可变结构域或其实质部分中作为CDR携带。基本上如本文所给出的HCDR3序列是本发明的实施方案的代表，这些序列的每一个都可在人重链可变结构域或其实质部分中作为HCDR3携带。本发明中采用的可变结构域可获自或衍自任何种系或重排的人可变结构域，或者可以是基于已知的人可变结构域的共有序列或实际序列的合成可变结构域。可变结构域可衍自非人抗体。可使用重组DNA技术，将本发明的CDR序列(例如CDR3)导入到一整库(arepertoireof)缺乏CDR(例如CDR3)的可变结构域中。例如，Marks等人[参考文献57]描述了产生成整库的(repertoiresof)抗体可变结构域的方法，其中将定向在或邻近于可变结构域区域的5'末端的共有引物与人VH基因的第三构架区的共有引物联合使用，以提供一整库缺乏CDR3的VH可变结构域。Marks等人进一步描述了这整库如何可与特定抗体的CDR3进行组合。使用类似的技术，本发明的CDR3组(shuffle)，并将改组的完全VH结构域或VL结构域与同族的(cognate)VL结构域或VH结构域进行组合，以提供本发明的结合成员。该整库然后可在合适的宿主系统，如WO92/01047(通过引用全文并入本文)和后续大量文献中的任何一篇(包括Kay,Winter&McCafferty[58]在内)的噬菌体展示系统中展示，使得可选择出合适的结合成员。一整库可由104个以上的成员个体组成，例如至少105个、至少106个、至少107个、至少108个、至少i(f个或至少1(T个成员或更多。其他合适的宿主系统包括但不限于酵母展示、细菌展示、T7展示、病毒展示、细胞展示、核糖体展示和共价展示。本发明提供制备IgE抗原的结合成员的方法，所述方法包括(a)提供起始的一整库编码VH结构域的核酸，所述核酸包括要被置换的CDR3或者缺乏CDR3编码区；(b)将所述的整库与编码基本上如本文对VHCDR3所给出的氨基酸序列的供体核酸进行组合，使得所述供体核酸被插入到该整库中的CDR3区中，以4是供编码VH结构域的核酸产物整库(aproductrepertoireofnucleicacids)。34(C)表达所述产物整库的核酸；(d)选出针对IgE的结合成员；和(e)回收所述结合成员或编码它的核酸。同样有类似的方法可使用，其中将本发明的VLCDR3与一整库编码VL结构域的核酸进行组合，所述核酸包括要被置换的CDR3或者缺乏CDR3编码区。类似地，可将一个或多个或者所有三个CDR移植到一整库VH结构域或VL结构域中，然后筛选出IgE的结合成员(一个或多个)。例如，可采用亲本或抗体l-36HCDRl、HCDR2和HCDR3或者亲本或抗体1-36各组HCDR中的一个或多个，和/或采用亲本或抗体1-36LCDR1、LCDR2和LCDR3或者亲本或抗体1-36各组LCDR中的一个或多个。类似地，也可采用本文公开的其他VH结构域和VL结构域、各组CDR和各组HCDR和/或各组LCDR。免疫球蛋白可变结构域的实质部分可包含至少三个CDR区以及它们的间插构架区。该部分还可包括第一和第四构架区之一或两者的至少约50%，所述50%是第一构架区的C末端50%和第四构架区的N末端50%。可变结构域的实质部分的N末端或C末端处的另外残过重組DNA技术构建本发明的结合成员，可导致被$1入来促进克隆或其他操作步骤的接头所编码的N末端或C末端残基的引入。其他操作步骤包括引入接头来将本发明的可变结构域与更多的蛋白质序列连接，所述蛋白质序列包括抗体恒定区、其他可变结构域(例如在双抗体的生产中)或可4企测标记/功能标记，这在本文别处作更详细的讨论。在本发明的一些方面，结合成员包含一对VH结构域和VL结构域，不过基于VH结构域序列或VL结构域序列的单一结合结构域构成本发明的进一步的方面。已知单一免疫球蛋白结构域特别是VH结构域能够以特异性方式结合靶标抗原。例如参见上文对dAb的讨论。对于任一个单一结合结构域，这些结构域可用来筛选能够形成能结合IgE的两结构域结合成员的互补结构域。这可通过采用WO92/01047(通过引用全文并入本文)中公开的所谓的等级二元组合法(hierarchicaldualcombinatorialapproach)的喧菌体展示筛选方法来实现，在该等级二元組合法中，用含有H链克隆或L链克隆的单个菌落来感染一完整文库的(acompletelibraryof)编码另一链(L或H)的克隆，所得的两链结合成员按噬菌体展示技术(如在该专利文献中描述的那些技术)进行选择。这个技术在Marks等人(出处同上)中也有公开。本发明的结合成员可进一步包含抗体恒定区或其部分，例如人抗体恒定区或其部分。例如，VL结构域可在其C末端连接到抗体轻链恒定结构域，包括人Oc或C入链。同样，基于VH结构域的结合成员可在其C末端连接到衍自任何抗体同种型(例如IgG、IgA、IgE和IgM)及任何同种型亚类(特别是IgGl和IgG2)的免疫球蛋白重链的全部或部分(例如CH1结构域)。IgGl由于其制备容易和稳定性例如半寿期，是有利的。任何具有这些性质和能使可变区稳定化的合成的或其他的恒定区变体，也可用于本发明。本发明的结合成员可用可检测标记或功能标记进行标记。因此，结合成员或抗体分子可以以免疫缀合物的形式存在，以获得可检测信号和/或可定量信号。免疫缀合物可包含与可检测标记或功能标记缀合的本发明抗体分子。标记可以是任何能产生或者可被诱导产生信号的分子，包括但不限于荧光剂、放射标记、酶、化学发光剂或光敏剂。因此，可通过检测荧光或发光、放射性、酶活性或吸光度来检测和/或测量结合情况。合适的标记包括以下标记，它们是以举例方式给出，并非限制本发明-酶，例如碱性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氳酶("G6PDH")、a-D-酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶和过氧化物酶如-束^f艮过氧化物酶；-染料；-荧光标记或荧光剂，如荧光素及其衍生物、荧光染料(fluorochrome)、罗丹明化合物及其衍生物、GFP(GFP是指"绿色荧光蛋白，，)、丹磺酰、伞形酮、藻红蛋白、藻蓝蛋白、別藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺；荧光团如镧系元素穴状化合物和螯合物，例如铕等(PerkinElmer禾口CisBiointernational),-化学发光标记或化学发光物质(chemiluminescer)，如异鲁米诺、鲁米诺和二氧杂环丁烷；-生物发光标记，如萤光素酶和萤光素；-敏化剂；-辅酶；-酶底物；-放射性标记，包括但不限于溴77、碳14、钴57、氟8、镓67、镓68、氢3(氚)、铟lll、铟113m、硪123m、碘125、碟126、碘131、石典133、汞107、汞203、磷32、4来99m、铼101、铼105、钌95、钌97、钌103、釘105、钪47、硒75、硫35、锝99、锝99m、碲121m、碲122m、碲125m、铥165、铥167、铩168、钇199和本文提到的其他放射性标记；-颗粒物，如乳胶或碳颗粒；金属溶胶；微晶；脂质体；细胞，等等，颗粒物可进一步用染料、催化剂或其他可检测基团标记；-分子，如生物素、地高辛或5-溴脱氧尿苷；-毒素部分，例如选自以下的毒素部分假单胞杆菌属外毒素(Pseudomonasexotoxin)(PE或其细胞毒性片段或突变体)、白喉毒素或其细胞毒性片段或突变体、肉毒杆菌毒素A,B,C,D，E或F、蓖麻毒蛋白(ricin)或其细胞毒性片段如蓖麻毒蛋白A、相思豆毒蛋白(abrin)或其细胞毒性片段、肥皂草毒蛋白(saporin)或其细胞毒性片段、美洲商陆(pokeweed)抗病毒毒素或其细胞毒性片段及异株泻根毒蛋白(bryodin)1或其细胞毒性片段。合适的酶和辅酶公开于Litman,等人，US4,275,149和Boguslaski,等人,US4,318,980,每个专利通过引用全文并入本文。合适的荧光剂和化学发光物质公开于Litman,等人,US4275149，该专利通过引用全文并入本文。标记还包括化学部分，如可通过与特异性关联(cognate)可斥全测部分的结合来^f企测的生物素，例如经标记的亲和素或链霉亲和素。可检测标记可用本领域知道的常规化学法连接到本发明的抗体。免疫缀合物或其功能片段可通过本领域技术人员知道的方法来制备。它们可直接地，或者通过间隔基团或连接基团如聚醛(比如戊二醛)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DPTA)，或者在偶联剂(如上对治疗性缀合物所述的那些偶联剂)的存在下，偶联到酶或焚光标记。含有荧光素类型的标记的缀合物可通过与异硫氰酸反应来制备。本领域技术人员所知道的现有的将治疗性放射性同位素直接地或通过螯合剂(如以上提到的EDTA、DTPA)偶联到抗体的方法，可应用在可用于诊断的放射性元素上。同样可以通过氯胺T方法[参考文献59]用钠125进行标记，或者通过Crockford等人的技术(US4,424,200,通过引用全文并入本文)用锝99m进行标记，或者按Hnatowich(US4,479,930,通过引用全文并入本文)的描述通过DTPA进行连接。有多种方法可使标记能产生可通过外部手段检测的信号，例如通过肉目艮检验、电磁辐射、热和化学试剂来检测。也可使标记结合到另一种能结合本发明抗体的结合成员，或者结合到载体。标记可直接产生信号，因此不需要另外的成分以产生信号。有许多有机分子例如荧光剂能够吸收紫外光和可见光，吸收的光将能量转移到这些分子，从而使它们跃迁到激发能态。这个吸收的能量然后通过以第二波长进行的光发射而散发。这个第二波长发射也可将能量转移到经标记的接纳分子(acceptormolecule),结果接纳分子又通过光发射例如焚光共振能量转移(FRET)散发能量。其他能直接产生信号的标记包括放射性同位素和染料。或者，标记可能需要其他成分以产生信号，这样信号产生系统将包括所有为产生可测量信号所需的成分，这些成分可包括底物、辅酶、增强剂、另外的酶、能与酶制品反应的物质、催化剂、激活剂、辅因子、抑制剂、清除剂(scavenger)、金属离子及信号产生物质的结合所需的特定结合物质。有关合适的信号产生系统的详细讨论可见于Ullman,等人US5,185，243，该专利通过引用全文并入本文。本发明提供这样的方法，它包括引起或允许本文所提供的结合成员与IgE的结合。如所指出，这种结合可在体内发生，例如在将结合成员或编码核酸给予人或动物(例如哺乳动物)后发生，或者可在体外发生，例如在ELISA、蛋白质印迹法、免疫细胞化学、免疫沉淀法、亲和层析和生化测定或基于细胞的测定中发生。一般来说，本发明结合成员与IgE之间的复合物，可通过酶联免疫测定、放射测定、免疫沉淀法、荧光免疫测定、化学发光测定、免疫印迹测定、侧向流测定(lateralflowassay)、凝集测定和基于微粒的观'J定(particulate-basedassay)等测定法来4企测。本发明还提供通过例如在生物传感器系统中采用本发明的结合成员来直接测量抗原的水平。例如，本发明包括检测和/或测量与IgE的结合的方法，所述方法包括(i)将所述结合成员暴露于IgE，和(ii)检测所述结合成员与IgE的结合，其中结合是用本文描述的任何方法或可检测标记来检测。本文描述的这个和任何其他的结合检测方法，可由执行该方法的人员例如通过目测观察可检测标记来直接阐释。或者，本文描述的这个和任何其他的结合检测方法可以如下形式产生报告放射自显影图、照片、计算机打印输出、流式细胞术报告、图(graph)、图表(chart)、含有结果的试管或容器或孔(well)，或者该方法的结果的任何其他可视或物理表示法。可测定结合成员与IgE的结合的量。可将定量数量与试验样品中可能具有诊断意义的抗原的量关联起来。对IgE结合和/或其定量的筛选，可用于例如筛选患者是否有本文所指的疾病或病恙，和/或任何其他涉及异常IgE产生、表达和/或活性的疾病或病恙。本发明的诊断方法可包括(i)从受试者获得组织或流体样品，(ii)将所述组织或流体样品暴露于本发明的一个或多个结合成员，和(iii)与对照样品相比较检测结合的IgE，其中与对照样品相比较IgE结合的量的增加可表示IgE产生、表达或活性的异常水平。待测的组织或流体样品包括血液、血清、尿液、活组织检查材料、肿瘤或者任何怀疑含有异常IgE水平的组织。经试验发现异常IgE水平或活性阳性的受试者，也可受益于本文后面所公开的治疗方法。本发明的诊断方法还可包括通过固定化抗原捕捉结合成员与IgE的复合物。例如，可将抗原固定化在侧条带分析(lateralstripassay)上，来捕捉目的样品中的抗原特异性IgE。本领域技术人员能够按照本文公开的方法，根据他们的偏好和常识，来选择测定结合成员与抗原的结合的合适方式。样品中的结合成员的反应性可通过任何适当的方式来测定。放射免疫测定(RIA)是一种可能的方式。将放射性标记的抗原与未标记的抗原(试验样品)混合，让它们与结合成员结合。采用物理方式将结合的抗原与未结合的抗原分离开来，测定与结合成员结合的放射性抗原的量。试验样品中抗原越多，与结合成员结合的放射性抗原将越少。竟争性结合测定也可与非放射性抗原一起使用，使用的是与报道分子连接的抗原或类似物。报道分子可以是具有光谱上分离的(spectrallyisolated)吸收或发射特征的荧光染料、磚或激光染料。合适的荧光染料包括荧光素、罗丹明、藻红蛋白和德克萨斯红以及镧系元素螯合物或穴状化合物。合适的发色染料包括二氨基联苯胺。其他的报道分子包括有色的、磁性的或顺磁性的大分子胶体颗粒或微粒材料如胶乳珠(latexbead),和能直接或间接造成可检测信号被40目测观察到、以电子方式检测到或以别的方式记录到的生物活性或化学活性物质。这些分子可以是催化反应的酶，这些反应例如能显示颜色或改变颜色，或者引起电学性质的改变。它们可以是在分子上可激们可包括与生物传感器联用的化学实体(chemicalentity)。可采用生物素/亲和素或生物素/链霉亲和素和碱性磷酸酶检测系统。各个结合成员-报道分子缀合物所产生的信号，可用来导出样品(正常样品和试验样品)中相关结合成员的可定量绝对或相对数据。作为本发明的一个方面，还提供了包含根据本发明任何方面或实施方案的结合成员的试剂盒。在试剂盒中，可对结合成员进行标记以让其在样品中的反应性得以检测，例如如下文所进一步描述。此外，结合成员可连接或不连接到固相载体。试剂盒的各成分通常是无菌的，装在密闭小瓶或其他容器中。试剂盒可应用在诊断分析或者其他能用得上结合成员的方法中。试剂盒可包括关于各成分在方法例如本发明的方法中的使用的说明书。在本发明的试剂盒中可包括有助于或者使得能够执行这种方法的辅助材料。辅助材料包括能结合第一结合成员并与可4企测标记(例如荧光标记、放射性同位素或酶)缀合的不同的第二结合成员。基于抗体的试剂盒也可包含用于进行免疫沉淀法的珠粒(bead)。试剂盒的每个成分通常装在其自身合适的容器中。因此，这些试剂盒通常包括适合于每个结合成员的不同容器。此外，试剂盒可包括关于进行测定和进行用于阐释和分析从进行测定获得的数据的方法的说明书。本发明还提供如上所述的结合成员用于在竟争性测定中测量抗原水平的用途，也就是说通过在竟争性测定中采用本发明所提供的结合成员来测量样品中的抗原水平的方法。这可能是不需要将结合的抗原与未结合的抗原进行物理分离的情况。一种可能的做法是，将报道分子连接到结合成员，以使得在结合时出现物理或光学变化。报道分子可直接或间接产生可定量的可检测信号。报道分子的连接可以是直接或间接地、共价地(例如通过肽键)或非共价地连接。通过肽键的连接可以是因编码抗体和报道分子的基因融合物的重组表达而产生。在各个方面和实施方案中，本发明扩展到能与任何本文所定义的结合成员竟争与IgE的结合的结合成员，所述本文所定义的结合成员例如亲本抗体或抗体1-36中任一个抗体，例如为IgGl形式。各结合成员之间的竟争可容易地在体外进行测定，例如这样测定将特异性报道分子标记到一个能在其他未加标记的结合成员存在下进行检测的结合成员，以使得可以鉴定能结合同一表位或重叠表位的各结合成员。竟争可例如用ELISA来测定，其中IgE固定化到板上，将加标记的(tagged)或标记的(labelled)第一结合成员连同一个或多个其他未加标记的(untagged)或未标记的(unlabelled)结合成员加到该板。能与力口标记的结合成员竟争的未加标记的竟争成员，其存在由加标记的结合成员所发射的信号的减少来观察到。例如，本发明包括鉴定IgE结合化合物的方法，所述方法包括(i)将IgE固定化到载体，(ii)使所述固定化IgE同时或以逐步方式与至少一个加标记的或标记的本发明结合成员和一个或多个未加标记的或未标记的受试结合化合物接触，和(iii)通过观察来自加标记的结合成员的结合标记(boundtag)的量的减少，来鉴定出新的IgE结合化合物。这种方法可用多孔板(multiwell)或阵列形式以高通量方式进行。这种测定还可在溶液中进行。参见例如U.S.5,814,468，该专利通过引用全文并入本文。如上所述，对结合的检测可由执行该方法的人员直接阐释，例如通过目测观察可检测标记或者标记存在量的减少来阐释。或者，本发明的结合方法可以如下形式产生报告放射自显影图、照片、计算机打印输出、流式细胞术报告、图(graph)、图表(chart)、含有结果的试管或容器或孔(well),或者该方法的结果的任何其他可视或物理表示法。竟争性测定还可用于表位作图。在一个例子中，可用表位作图来鉴定被任选可具有优化的中和和/或调节特性的IgE结合成员所结合的表位。这种表位可以是线性的或者有构象的。构象表位可包含IgE的至少两个不同片段，其中所述片段在IgE折叠成其三级或四级结构而形成可被IgE抑制剂如IgE结合成员识别的构象表位时，被定位成互相靠近在一起。在试验竟争情况时，可采用抗原的肽片段，特别是包括目的表位或者基本上由目的表位组成的肽。可使用具有表位序列加上在任一末端有一个或多个氨基酸的肽。本发明的结合成员可以本发明进一步提供编码本发明结合成员的分离核酸。核酸可包括DNA和/或RNA。在一个实施方案中，本发明提供编码如上定义的本发明CDR或一组CDR或VH结构域或VL结构域或抗体-抗原结合位点或抗体分子如scFv或IgGl的核酸。本发明还提供包含至少一个如上所述多核苷酸的质粒、载体、转录盒或表达盒形式的构建物。本发明还提供包含一个或多个如上所述的构建物的重组宿主细胞。编码本发明所提供的任何CDR或一组CDR或VH结构域或VL结构域或抗体-抗原结合位点或抗体分子如scFv或IgGl的核酸，其本身构成本发明的一个方面，而产生编码产物的方法也构成本发明的一个方面，所述方法包括从编码核酸进行表达。表达可便利地通过在适当条件下培养含有核酸的重组宿主细胞来实现。进行表达生产后，VH或VL结构域或者结合成员可用任何合适的技术进行分离和/或纯化，然后加以适当使用。本发明的核酸可包含DNA或RNA,且可以是完全或部分合成的。若提到本文所给出的核苷S吏序列，则涵盖具有指定序列的DNA分子，和涵盖具有其中U置换T的指定序列的RNA分子，除非上下文另有要求。又一方面是提供产生抗体VH可变结构域的方法，所述方法包括引起从编码核酸的表达。这种方法可包括在用于生产所述抗体VH可变结构域的条件下培养宿主细胞。43作为本发明的进一步的方面，提供了用于生产VL可变结构域以生产方法可包括分离和/或纯化产物的步骤。生产方法可包括将产物配制成包括至少一种另外的成分如药物可接受赋形剂的组合物。用于在多种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是公知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、丝状真菌、酵母和杆状病毒系统以及转基因植物和动物。抗体和抗体片段在原核细胞中的表达是本领域已确立的。有关综述参见例如PKickthun[参考文献60]。通用的细菌宿主是大肠杆菌(五.co//)。在培养物中的真核细胞中的表达，也可作为生产结合成员的可选方法供本领域技术人员使用[参考文献61,62,63]。本领域可供用来表达异源多肽的哺乳动物细胞系，包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NSO小鼠黑素瘤细胞、YB2/0大鼠黑素瘤细胞、人胚胎肾细胞、人胚胎视网膜细胞和许多其他细胞。合适的载体可进行选择或构建，含有适当的调节序列，包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其他视所需而定的序列。载体视所需而定可以是质粒如噬菌粒或者病毒如噬菌体[参考文献64]。在Ausubel等人[参考文献65]中，详细描述了许多已知的用来操纵核酸和分析蛋白质的技术和方案，所述操纵核酸例如是制备核酸构建物、诱变、测序、将DNA导入到细胞中及基因表达。本发明的又一个方面提供含有本文所公开的核酸的宿主细胞。这种宿主细胞可以是体外的和可以是在培养物中的。这种宿主细胞可以抗体"或者说细胞内部的抗体进行胞内表达。胞内抗体可用于基因治疗。本发明再一个方面提供这样的方法，它包括将本发明的核酸导入到宿主细胞中。导入可釆用任何可用的技术进行。对于真核细胞，合适的技术可包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染和用反转录病毒或其他病毒(例如牛痘，或者对于昆虫细胞用杆状病毒)进行的转染。将核酸导入在宿主细胞特别是真核细胞中，可使用基于病毒或质粒的系统。质粒系统可以附加型形式保持，或者可掺入到宿主细胞中或者掺入到人工染色体中。掺入可通过将一个或多个拷贝随机或定向整合在单个或多个基因座来进行。对于细菌细胞，合适的技术可包括氯化钙转化、电穿孔和用噬菌体转染。导入后，接着例如通过在适于基因表达的条件下培养宿主细胞，来引起或允许从核酸的表达。表达产物的纯化可通过本领域技术人员知道的方法来实现。本发明的核酸可整合到宿主细胞的基因组(例如染色体)中。可通过按标准的技术添加能促进与基因组的重组的序列，来促进整合。本发明还提供这样的方法，它包括在表达系统中使用如上所述的构建物，以表达上述的结合成员或多肽。的方法中。IgE结合成员可用来治疗以IgE介导的生物效应为特征的病恙，特别是过敏症和哮喘。例如，本发明的结合成员可用来治疗过敏性鼻炎、变应性接触性皮炎、特应性皮炎、过敏反应、食物过敏、荨麻渗、炎性肠病、嗜酸性粒细胞性胃肠炎、药源性皮疹、过敏性眼病、过敏性结膜炎、支气管哮喘、气道高反应性、化妆品过敏、药源性过敏、药源性超敏性综合症、金属过敏、职业性超敏性肺炎、慢性超敏性肺炎、冷超敏性、蠕虫感染引起的超敏性、乳胶过敏或枯草热。粒，减少FcsRl介导的体内或体外生物应答，以及减少人或动物患者中的循环IgE。因此，本发明提供抑制哺乳动物中过敏原引起的肥大细胞脱粒的方法，所述方法包括将本发明的结合成员、抗体、VH结构域或VL结构域，以足以中和IgE的量给予所述哺乳动物。本发明还提供减少FcsRl介导的生物应答的作用的方法，所述方法包括使表达FcsRl的细胞与本发明的结合成员、抗体、VH结构域或VL结构域，在IgE的存在下进行接触。当试验细胞与本发明的结合成员在体外接触时，还可将对照细胞用于阳性对照(例如不含结合成员的反应)和/或阴性对照(例如不含IgE和/或抗原的反应)。当细胞在体内被结合成员接触时，例如通过将本发明的结合成员给予显示FcsRl介导的生物应答的哺乳动物来进行接触时，本发明的结合成员是以足以中和IgE的量给予。此外，本发明还提供减少哺乳动物如人中的循环IgE的方法，所述方法包括将本发明的结合成员、抗体、VH结构域或VL结构域，以足以中和和减少循环游离IgE的量给予。种或多种疾病或病恙过敏性鼻炎、变应性接触性皮炎、特应性皮炎、过敏反应、食物过敏、荨麻渗、炎性肠病、嗜酸性粒细胞性胃肠炎、药源性皮渗、过敏性眼病、鼻结膜炎和过敏性结膜炎。有关IgE参与上述疾病的证据是本领域知道的。本文针对IgE的结合和中和所给出的数据因此表明，本发明的结合成员可用来治疗或预防这些病恙，包括减轻病恙的严重性。因此，本发明提供治疗或减少任何本文所述病恙的至少一个症状的严重性的方法，所述方法包括将有效量的一种或多种本发明结合成员单独地或者在与本领域知道的或本文所述的另一适当药物的组合治疗方案中，给予有需要的患者，使得任何上述病恙的至少一个症状的严重性得到减少。本发明的结合成员可用于适当的动物和用于疾病的动物模型特別是猴子中。因此，本发明的结合成员可在涉及IgE,例如IgE产生、表达和/或活性特别是异常产生、表达或活性的疾病或病恙的治疗中用作治疗剂。治疗方法可包括将有效量的本发明结合成员给予有需要的患者，其中IgE的异常产生、表达和/或活性因此得到降低。治疗方法可包括(i)例如使用上述的诊断方法，鉴定出显示异常IgE水平或活性的患者，和(ii)将有效量的本发明结合成员给予该患者，其中IgE的的异常产生、表达和/或活性得到降低。本发明的有效量，是能降低IgE的异常产生、表达和/或活性，从而降低或减轻所治疗的特定疾病或病恙的至少一个症状的严重性，但未必治愈该疾病或病恙的这么一个量。本发明还提供拮抗IgE的至少一个效应的方法，所述方法包括接触或给予有效量的一种或多种本发明结合成员，使得IgE的所述至少一个效应得到拮抗。可通过本发明方法拮抗的IgE效应，包括FcsRl介导的生物应答，和因为这些结合反应而出现的任何下游效应。因此，本发明的更多方面提供本发明的分离结合成员、抗体、VH结构域或VL结构域用于制造供治疗如本文所讨论与IgE有关或由IgE介导的病恙的药物的用途。药物或药物组合物的这种用途或制造方法，包括将结合成员与药物可接受的赋形剂进行配制。药物可接受的赋形剂可以是这样的化合物或者化合物的组合，它进入到药物组合物中，但没有引起次生反应，能例如促进活性化合物的给予、提高活性化合物在体内的有效期和/或功效、提高活性化合物在溶液中的溶解度，或者改善活性化合物的保存。这些药物可接受的介质是公知的，本领域技术人员会根据所选的活性化合物的性质和给予方式进行调整。本发明的结合成员通常会以药物组合物的形式给予，该药物組合物除了结合成员外还可包含至少一种成分。因此，根据本发明且供按本发明使用的药物组合物，除了活性成分外，还可包含药物可接受的赋形剂、载体、缓沖剂、稳定剂或本领域技术人员公知的其他材料。这些材料应当是无毒的，不应干扰活性成分的功效。载体或其他材料47的明确性质要取决于给予途径，给予途径如下所述可以是口服、吸入、气管内、局部、嚢内给予或注射给予。本发明也设想到了供口服给予的药物组合物，例如单结构域抗体分子(例如"nanobodiesTM，，)等。这种口服制剂可以为片剂、胶嚢剂、散剂、液体剂或半固体剂形式。片剂可包含固体载体，如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包含液体载体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可包括生理盐水溶液、右旋糖或其他糖溶液或二醇，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。对于静脉内注射或者在患病部位的注射，活性成分将是无热原且具有合适的pH、等渗性和稳定性的胃肠外可接受水溶液的形式。本领域具有相关技能的人员完全有能力用例如等渗介质制备出合适的溶液，如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液。可按需应用防腐剂、稳定剂、緩冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂，包括緩冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸和曱硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二曱基千基氯化铵、六曱氯铵、苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯曱酸烷基酯，如对羟基苯曱酸曱酯或对羟基苯曱酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3，-戊醇；和间甲酚)；低分子量多肽；蛋白质，如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA;糖类，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反荷离子，如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEEN顶、PLURONICS或聚乙二醇(PEG)。视分子的理化性质和递送途径而定，本发明的结合成员可以以液体、半固体或固体形式配制。制剂可包括赋形剂或赋形剂的组合，例如糖类、氨基酸和表面活性剂。液体制剂可包括很宽范围的抗体浓度和pH。固体制剂可例如通过冷冻干燥、喷雾干燥或超临界流体技术进行的干燥来产生。抗IgE的制剂要取决于预定的递送途径例如，肺部递送制剂可由具有能确保在吸入时渗入肺部深处的物理性质的颗粒组成；局部制剂(例如用于治疗疤痕，如皮肤疤痕)可包括能延长药物停留在作用部位的时间的稠度调节剂。结合成员可用能保护结合成员不被快速释放的载体制备，如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶嚢递送系统。可使用生物可降解、生物相容性的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。许多制备这些制剂的方法是本领域技术人员知道的[参考文献66]。抗IgE治疗可口服给予(如单结构域抗体分子(例如"nanobodiesTM"))，注射给予(例如皮下、关节内、静脉内、腹膜内、动脉内或肌肉内注射)，吸入给予，气管内给予，嚢内途径给予(滴注到膀胱)，或者局部给予(例如眼内、鼻内、直肠内、伤口内、皮肤上)。治疗可通过脉冲式灌注来给予，特别是以结合成员剂量逐渐减低的方式灌注。给予途径可由治疗的理化特性、由对疾病的特殊考虑或者由优化功效或使副作用减至最低的要求来决定。一个特定的给予途径是静脉内给予。另一个给予本发明药物组合物的途径是皮下给予。设想到，抗IgE治疗不会局限于临床使用。因此，使用无针头装置进行的皮下注射也是有利的。组合物可以单独给予或者与其他治疗法组合给予，组合给予时视所要治疗的病症而定同时给予或依次给予。IgE的结合成员可用作与另外的医药成分联用的组合疗法的一部分。组合治疗可用来提供显著的协同作用，特别是抗IgE结合成员与一种或多种其他药物的组合。IgE的结合成员可与另一治疗剂或几种多种本文所列的病症。本发明的结合成员可与其他可用的针对哮喘和过敏性疾病或其他涉及IgE介导效应的病恙的治疗法进行联合配制和/或使用。本发明的结合成员可与一种或多种以下药剂组合提供，或者提供本发明的结合成员时另外提供一种或多种以下药剂-细胞因子或者细胞因子功能的激动剂或拮抗剂(例如作用于细胞因子信号转导途径的药剂，如SOCS系统的调节剂)，如a-，f3-和/或"干扰素；胰岛素样生长因子I型(IGF-1),其受体和相关结合蛋白；白细胞介素(IL),例如IL-1至33中的一个或多个，和/或白细胞介素拮抗剂或抑制剂，如阿那白滞素(anakinra);白细胞介素家族成员的受体的抑制剂或者这种受体的特异性亚单位的抑制剂，肿瘤坏死因子a(TNF-a)抑制剂，如抗TNF单克隆抗体(例如英夫利昔单抗、阿达木单抗和/或CDP-870)和/或TNF受体拮抗剂，例如免疫^t蛋白分子(如依那西普)和/或低分子量药剂，如已酮可可豆碱；-B细胞的调节剂，例如靶向B淋巴细胞(如CD20(利妥昔单抗)或MRA-alL16R)或者T淋巴细胞(例如CTLA4-Ig、HuMax11-15或Abatacept)的单克隆抗体；-抑制破骨细胞活性的调节剂，例如抗RANKL抗体；-趋化因子或趋化因子受体功能的调节剂，如CCR1、CCR2、CCR2A、CCR2B、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CC詣和CCRll(对于C-C家族)；CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4和CXCR5和CXCR6(对于C-X-C家族)和CX3CR1(对于C-X3-C家族)的拮抗剂；-基质金属蛋白酶(MMP)的抑制剂，例如多西环素之类的药剂，所述酶即以下酶中的一个或多个溶基质素、月交原酶和明月交酶以及聚集蛋白聚糖酶，特别是胶原酶-1(MMP-1)、胶原酶-2(MMP-8)、胶原酶-3(MMP-13)、溶基质素-1(MMP-3)、溶基质素-2(MMP-10)和/或溶基质素-3(MMP-ll)和/或MMP-9和/或MMP-12;-白三烯生物合成抑制剂、5-脂肪加氧酶(5-LO)抑制剂或5-脂肪加氧酶激活蛋白(FLAP)拮抗剂，如齐留通；ABT-761;芬留顿；替泊沙林；Abbott-79175;Abbott-85761;N-(5-取代)-p塞吩-2-烷基磺酰胺；2,6-二叔丁基苯腙；甲氧基四氲吡喃如ZenecaZD-2138;化合物SB-210661;吡咬基取代的2-氰基萘化合物，如L-739,010;2-氰基喹啉化合物，如L-746，530;吲哚和/或喹啉化合物，如MK-591、MK-886和/或BAYx1005;-白三烯(LT)B4、LTC4、LTD4和LTE4的受体拮抗剂，选自吩p塞漆-3-ls,如L-651,392;脒基化合物，如CGS-25019c;benzoxalamine，如昂唑司特；苯甲脒，如BIIL284/260;和诸如以下的化合物扎鲁司特、阿鲁司特、孟鲁司特、普仑司特、维鲁司特(MK-679)、RG-12525、Ro-245913、伊拉司特(CGP45715A)和BAYx7195;-磷酸二酯酶(PDE)抑制剂，如曱基黄。票呤(methylxanthanine)，例如茶碱和/或氨茶碱；和/或选择性PDE同工酶抑制剂，例如PDE4抑制剂和/或同种型PDE4D的抑制剂和/或PDE5的抑制剂；-组胺l型受体拮抗剂，如西替利。秦、氯雷他定、地氯雷他定、非索非那定、阿伐斯汀、特非那定、阿司咪唑、氮卓斯汀、左卡巴斯汀、氯苯那敏、异丙溱、赛克力。秦和/或咪唑斯汀(通常口服、局部或胃肠外应用)。-质子泵抑制剂(如奥美拉唑)或胃保护性组胺2型受体拮抗剂；-组胺4型受体的拮抗剂；-a-l/oc-2肾上腺素受体激动剂血管收缩剂拟交感神经剂，如六氩脱氧麻黄碱、苯肾上腺素、苯丙醇胺、麻黄碱、伪麻黄碱、盐酸萘曱唑啉、盐酸羟曱唑啉、盐酸四氢唑啉、盐酸赛洛唑啉、盐酸萘胺唑啉和盐酸乙诺那林；-抗胆碱能剂，例如毒蕈碱性受体(M1、M2和M3)拮抗剂，如阿托品、东莨菪碱、格隆铵、异丙托溴铵、噻托溴铵、氧托溴铵、哌仑西平和替仑西平；-卩-肾上腺素受体激动剂(包括卩受体亚型1-4),如异丙肾上腺素、沙丁胺醇、福莫特罗、沙美特罗、特布他林、奥西那林、曱磺酸比托特罗和/或吡布特罗，例如它们的手性对映异构体；-色酮，例如色甘酸钠和/或奈多罗米纳；-糖皮质类固醇，如氟尼缩松、曲安萘德、二丙酸倍氯米松、布地奈德、丙酸氟替卡松、环索奈德和/或糠酸莫米松；-调节核激素受体的药剂，如PPAR;-免疫球蛋白(Ig)或Ig制品或者调节lg功能的拮抗剂或抗体，如其所结合的表位与本发明结合成员相同或不同的抗IgE;-其他全身应用或局部应用的抗炎剂，例如沙利度胺或其衍生物、类^L色素、地蒽酚和/或卡泊三醇；-对氨基水杨酸和磺胺吡啶的组合，如柳氮磺吡啶、美沙拉，秦、巴柳氮和奥沙拉嗪；和免疫调节剂，如硫嘌呤；和皮质类固醇，如布地奈德；-抗细菌剂，例如青霉素衍生物、四环素、大环内酯、(3-内酰胺、氟壹诺酮、曱硝唑和/或吸入的氨基糖苷；和/或抗病毒剂，例如阿昔洛韦、泛昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦、西多福韦、金刚烷胺、金刚乙胺；利巴韦林；扎那米韦和/或奥司他韦；蛋白酶抑制剂，如茚地那韦、奈非那韦、利托那韦和/或沙奎那韦；核苷反转录酶抑制剂，如去羟肌普、拉米夫定、司他夫定、扎西他滨、齐多夫定；非核苷反转录酶抑制剂，如奈伟拉平、依法韦仑；-心血管剂，如钾通道阻断剂、p-肾上腺素受体阻断剂、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、血管紧张素-2受体拮抗剂；降脂剂，如抑制素和/或fibrate;血细胞形态的调节剂，如已酮可可豆碱；溶解血栓剂和/或抗凝剂，例如血小板聚集抑制剂；-CNS剂，如抗抑郁剂(如舍曲林)、抗帕金森病药物(如立司吉林(deprenyl)、L-多巴、罗匹尼罗、普拉克索；MAOB抑制剂，如司立吉林和雷沙吉林；comP抑制剂，如托卡朋(tasmar);A-2抑制剂、多巴胺重摄取抑制剂、NMDA拮抗剂、烟碱、尼古丁激动剂和/或神经元氧化氮合酶的抑制剂)和抗阿尔茨海默病药物，如多奈哌齐、利凡斯的明、他克林、COX-2抑制剂、丙戊茶碱或美曲膦酯；-治疗急性和慢性疼痛的药剂，例如作用于中枢系统或外周系统的止痛剂，如阿片类似物或衍生物、卡巴米嗪、苯妥英、丙戊酸钠、amitryptiline或其它抗抑郁剂、朴热息痛或非甾体抗炎药；-胃肠外或局部应用的(包括吸入)局部麻醉剂，如利诺卡因或其类似物；-抗骨质疏松剂，例如激素剂，如雷洛昔芬，或者二膦酸盐，如阿仑膦酸；-(i)类胰蛋白酶抑制剂；(ii)血小板激活因子(PAF)拮抗剂；(iii)白细胞介素转换酶(ICE)抑制剂；(iv)IMPDH抑制剂；(v)黏着分子抑制剂，包括VLA-4拮抗剂；(vi)组织蛋白酶；(vii)激酶抑制剂，例如以下激酶的抑制剂酪氨酸激酶(如Btk、Itk、Jak3MAP,抑制剂的实例可包括吉非替尼、曱磺酸伊马替尼)、丝氨酸/苏氨酸激酶(例如MAP激酶如p38、JNK、蛋白激酶A,B和C及IKK的抑制剂)，或者参与细胞周期调节的激酶(例如细胞周期蛋白依赖性激酶)；(viii)葡萄糖-6磷酸脱氢酶抑制剂；(ix)激肽B.subl,和/或B.sub2,受体拮抗剂；(x)抗痛风剂，例如秋水仙碱；(xi)黄嘌呤氧化酶抑制剂，例如别嘌醇；(xii)促尿酸尿剂，例如丙磺舒、磺吡酮和/或苯溴马隆；(xiii)生长激素促分泌素；(xiv)转化生长因子(TGFp);(xv)血小板衍生生长因子(PDGF);(xvi)成纤维细胞生长因子，例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF);(xvii)粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF);(xviii)辣椒素软膏；(xix)速激肽NK,subl.和/或NK,sub3.受体拮抗剂，如NKP-608C、SB-233412(他奈坦)和/或D-4418;(xx)弹性蛋白酶抑制剂，例如UT-77和/或ZD-0892;(xxi)TNF-a转换酶抑制剂(TACE);(xxii)诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂或者(xxiii)在TH2细胞上表达的化学引诱物受体同源物分子(如CRTH2拮抗剂)；(xxiv)P38的抑制剂；(xxv)调节Toll样受体(TLR)的功能的药剂和(xxvi)调节嘌呤能受体的活性的药剂，如P2X7;(xxvii)转录因子激活的抑制剂，如53抑制剂可以是特异性的，或者可以是混合抑制剂，例如靶向超过一个上述分子(例如受体)或分子类别的抑制剂。结合成员还可与化学治疗剂或另一酪氨酸激酶抑制剂联合，以共给予或免疫缀合物的形式使用。所述抗体的片段还可用于通过重组机制或生化偶联获得的双特异性抗体，然后将上述抗体的特异性与其他能够识别参与涉及IgE的活性的其他分子的抗体的特异性相关联。对于治疗炎性疾病，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、哮喘、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病(COPD)或牛皮癣，可将本发明的结合成员与一种或多种药剂进行组合，例如非甾体抗炎药剂(下文称NSAIDs),包括非选择性环氧合酶(C0X)-l/C0X-2抑制剂，不管是局部应用还是全身应用，如吡罗昔康、双氯芬酸、丙酸如萘普生、氟比洛芬、非诺洛芬、酮洛芬和布洛芬、芬那酸如曱芬那酸、吲哚美辛、舒林酸、阿扎丙宗、吡唑啉酮如苯基丁氮酮、水杨酸如阿司匹林)；选择性COX-2抑制剂(如美洛昔康、塞来考昔、罗非考昔、伐地考昔、lumarocoxib、帕瑞考昔和依托考昔)；环氧合酶抑制性氧化氮供体(cyclo隱oxygenaseinhibitingnitricoxidedonors,CINODs);并唐皮质类固醇(不管通过局部、口服、肌肉内、静脉内还是关节内途径)；曱氨喋呤、来氟米特；幾氯喹、d-青霉胺、金诺芬(auranofin)或其他胃肠外或口服金制品；止痛剂；双醋瑞因；关节内治疗，如透明质酸衍生物；和营养补充物如葡糖胺。本发明的结合成员和一种或多种上述的另外医药成分可用于药物的制造中。药物可供单独或组合给予个体，因此可包含结合成员和另外成分作为组合制品或作为单独制品。单独制品可用来帮助单独的和依次的或同时的给予，使得各成分可通过不同的途径来给予，例如口服和胃肠外给予。根据本发明，可将所提供的组合物给予哺乳动物。给予通常是以54"治疗有效量，，给予，这足以显示对患者的好处。这种好处可以至少是至少一种症状的改善。实际的给予量、给予的速度和时程，要取决于所治疗疾病的性质和严重性、所治疗的具体哺乳动物、患者个体的临床状况、病恙的原因、组合物的递送部位、结合成员的类型、给予方法、给予时序安排和执业医生知道的其他因素。治疗的处方，例如有关剂量等的决定，是在一般执业者和其他医师的责任范围内，可根据症状的严重性和/或所治疗疾病的进展而定。抗体的适当剂量是本领域公知的[参考文献67,68]。可以使用本文中或者Physician'sDeskReference(2003)中所指明的对所给予的药物的类型适当的具体剂量。本发明结合成员的治疗有效量或合适剂量，可通过在动物模型中比较其体外活性和体内活性来确定。将小鼠和其他试验动物中的有效剂量外推到人类的方法是公知的。精确的剂量要取决于多个因素，包括抗体是用于诊断、预防还是用于治疗、要治疗的区域的大小和位置、抗体的准确性质(例如完全抗体、片段或双抗体)和任何可冲企测标记或与抗体连接的其他分子的性质。典型的抗体剂量，对于全身应用而言会在100(ag-lg的范围，对于局部应用而言在1昭-lmg的范围。一开始可给予较高的负荷剂量(loadingdose),然后给予一个或多个较低的剂量。通常，抗体将是完全抗体，例如IgGl同种型。这是对于成人患者的单次治疗的剂量，对于儿童和嬰儿可4要比例调整，对于其他抗体形式也可按分子量比例调整。治疗可由医生处置，按每日一次、每周两次、每周一次或每月一次的时间间隔重复进行。治疗可以是对于皮下给予而言每两到四周进行，对于静脉内给予而言每四到八周进行。治疗可以是周期性的，各次给予之间的时间为约两周或更长时间，例如约三周或更长时间，约四周或更长时间，或者约一个月。治疗可以在手术之前和/或之后给予，和/或可以直接在手术治疗的解剖部位给予或应用。表格和附图的简述表la-f列出抗体1-36中每一个抗体的重链CDR和轻链CDR的氨基酸序列。表2a-f列出抗体1-36中每一个抗体的轻链的氨基酸序列。表3a-h列出抗体1-36中每一个抗体的重链的氨基酸序列。序列表中的SEQIDNO与表4中所示的对应。表4b显示所附序列表中所示的、来自临时申请的示例性的本发明结合成员的VLDNA和VL氨基酸序列，序列表中的SEQIDNO与表4b中所示的对应。表5a显示在受体-配体结合HTRF⑧测定法中试验时从定向诱变文库鉴定的克隆的示例性效价。表5b显示用SPR(BIACORE)获得的示例性的本发明结合成员与人IgE和食蟹猴IgE的结合亲和力(KD)。表5b进一步显示示例性的本发明结合成员在RBL-ER51钙信号转导测定(25ng/ml人或100ng/ml食蟹猴IgE,在4小时时)中的效价，以ICs。表示。表6显示种系化抗体用BIAcore得到的示例性结合亲和力计算值和用RBL-ER51钓信号转导测定法得到的效价测量值。表7显示抗IgE单克隆抗体(mAb)的一般安全性和能力的评估的研究设计概要。图1涉及实施例2.6,并在x轴上显示以log表示的抗体摩尔浓度，在y轴上显示在RBL-ER51钙信号转导测定中的峰高。空心正方形指抗体ll,十字号指不相关的IgGl对照抗体，空心倒三角形指抗IgE交联抗体(Biosource)。注意在本图中空心正方形和十字号互相重叠。图2显示食蟹猴Cs3-4FLAGHislO的序列。图3显示编码人抗雌二醇scFv(D12—VH)和食蟹猴IgHE基因单元型(haplotype)之一(cylgHETQ)的可变重链的序列。图4显示编码人抗雌二醇scFv(D12J/H)和食蟹猴IgHE基因单56元型之一(cylgHEME)的可变重链的序列。图5显示人抗雌二醇scFv(D12—VL)和食蟹猴X恒定区基因cylGLC4的可变轻链的序列，序列范围1-708。图6显示人抗雌二醇scFv(D12—VL)和食蟹猴X恒定区基因D12—VLcyIGLC7的可变轻链的序列。图7涉及实施例4,显示在没有用封闭性抗IgE处理的B细胞中最大IgE表达的抑制百分数，其中x轴是人白细胞介素4的浓度(ng/ml),y轴是CD19和IgE两者阳性的细胞的百分数。十字号指不存在抗体33的对照，空心圆圈指0.5(ig/ml的抗体33所引起的移动，空心正方形指5jig/ml的抗体33所引起的移动。图8涉及实施例5,显示E85—50IgG!、E85_50IgG2和抗体33在食蟹猴中投与1mg/kg(第1天)、30mg/kg(第8天)和100mg/kg(第16天及以后)剂量后的平均毒性动力学曲线。误差条代表标准偏差。y轴是抗体的血清浓度，x轴是第一次投与后的时间(天数)。组1(E85—50IgG1)用实心圆圈表示，组2(E85—50IgG2)用空心三角形表示，組3(抗体33)用实心正方形表示。图9涉及实施例5,显示接受E85_50IgG!、E85—50IgGz和抗体33的周剂量(第1天1mg/kg、第8天30mg/kg和第16天及以后100mg/kg)的食蟹猴的平均游离IgE曲线。误差条代表标准偏差。y轴是IgE浓度(ng/ml)，x轴是时间(天数)。组l(E85—50IgGl)用实心圆圈表示，组2(E85—50IgG2)用空心三角形表示，组3(抗体33)用实心正方形表示。图10涉及实施例5，显示组1动物(用抗体33处理)的血小板数目(x109/L，以相对于2个投与前数值的平均值的变化百分数表示)对血浆浓度的曲线。该曲线代表了3个组中没有显示对血小板的显著作用的其他16只动物。x轴显示时间(小时)，左y轴显示血小板水平(以相对于处理前平均水平的变化百分lt表示)，左y轴显示抗IgE抗体的浓度(nmol/L)。封闭(closed)正方形表示血小板浓度，实心菱形表示抗IgE抗体的浓度。封闭三角形表示抗IgE抗体的投与量(mg/kg)。实施例使用克隆到基于丝状噬菌体M13的噬菌粒载体的幼稚人单链Fv(scFv)噬菌体展示文库，来进行选择[参考文献69,70]。在重组人IgE上使用一系列的选择循环，从噬菌体展示文库分离抗IgE特异性scFv抗体。对选出的scFv抗体在与人IgE的结合和/或效i^介方面进行优化，并重形成(reformat)IgG4元体。序列IDNO对应如下，其中i)在抗体编号后跟着GL的情况中，例如33GL,这是指其中一个或多个残基已被突变回到种系构型的抗体，一般来说，在使用GL的情况中，所有的能突变回到种系而没有可观的活性损失的非种系残基已被种系化；表4a<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>mRNA加工机制剪接掉，从而使第一外显子的3'末端与第二外显子的5'末端连接。因此，当具有所述核苷酸序列的DNA被表达成RNA时，第一和第二外显子被剪接在一起。剪接的RNA的翻译产生出包含VL结构域和CL结构域的多肽。剪接后，Kabat残基108处的Gly由VL结构域构架4序列的最后一个碱基(g)和CL结构域的前两个碱基(gt)编码。因此，Kabat残基108处的甘氨酸残基被包括在该临时申请中的VL序列的序列表中，但如上所述，它不应被认为是抗体分子的VL结构域的C末端残基，因此已从表4a中的序列表删去。<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>在该临时申请的序列表中，作为抗体35列出的序列在表4a中作为抗体33GL列出。抗体33GL与抗体33共享共同的VH结构域，所以在该临时申请的序列表中序列ID347为空。因此，33GL的VH结构域序列是SEQIDNO277(DNA)和SEQIDNO278(蛋白质)。这已在表4a中更正。实施例1.先导分离(LeadIsolation)"遂#使用克隆到基于丝状噬菌体M13的噬菌粒载体的幼稚人单链Fv(scFv)噬菌体展示文库，来进行选择(Vaughan等人，NatureBiotechnology14:309-314(1996),Hutchings,AntibodyEngineering,R.Kontermann和S.Dubel(编辑).2001，SpringerLaboratoryManuals,Berlin.P93)。基本上按之前Vaughan等人，(Vaughan等人，NatureBiotechnology14:309-314(1996)所述，在血浆纯化的人IgEK(Calbiochem)或血浆纯化的人IgEX(Biodesign)上使用一系列的选择循环，从噬菌体展示文库分离抗IgE特异性scFv抗体。简单的说，对于淘选选择(panningselection),让PBS(Dulbecco，sPBS,pH7.4)中的人IgE在4°C下过夜吸附到Maxisorp微量滴定板(Nunc)的各孔上。将各孔用PBS洗涤，然后用PBS-Marvel(3%w/v)封闭1小时。将PBS-Marvel(3%w/v)中的纯化噬菌体加到各孑L，让它们结合所包被的抗原1小时。未结合的噬菌体用PBS-Tween(0.1。/ov/v)和PBS通过一系列的洗涤循环除去。将结合的噬菌体颗粒洗脱，感染到细菌中，再收获进行下一轮选择(Vaughan等人，NatureBiotechnology14:309-314(1996))。用K和X形式的IgE,进行另外几轮选择。在96孔板中长出代表性数目的来自第二轮选择的scFv个体。70ScFv被表达在细菌周质中，在基于均相FRET(荧光共振能量转移)的人IgE/人FcsRI结合测定中对他们的抑制活性进行筛选。在这个测定中，样品与人FcsRI-Fc(本公司NS0细胞所产生)竟争与标记上铕螯合物(PerkinElmer1244-302)的人IgE(Calbiochem401152)的结合。详细的测定方法在"材料和方法"章节中提供。/j遂化^^cFv7gE与Fcs/7辨/^合好^尸賴对作为未经纯化的周质提取物显示对IgE:FcsRI相互作用的显著抑制作用的ScFv进行DNA测序(Vaughan等人1996，NatureBiotechnology14:309-314)，(Osbourn1996;Immunotechnology.2,181-196)。再次在细菌中表达独特scFv，通过亲和层析(如Bannister等人，(2006)Biotechnology和bioengineering,94.931-937所述)进行纯化。通过使抗FcsRI的纯化制品(本公司NS0细胞所产生)的稀释液系列，竟争与标记上铕螯合物(PerkinElmer1244-302)的人IgE(Calbiochem401152)的结合，来测定这些样品的效价。纯化的scFv制品例如抗体1能够抑制IgE-FcsRI相互作用。详细方案在"材料和方法"章节中提供。通过将VH结构域和结构域分别亚克隆到表达完整抗体重链和轻链的载体中，使各克隆从scFv转换成IgG形式。将Vh结构域克隆到含有人重链恒定结构域和调节元件的载体(pEU15.11或pEU9.2)中，以在哺乳动物细胞中表达完整IgGl或IgG2重链。同样，将V^结构域与调节元件一起，克隆到用于表达人X轻链恒定结构域的载体pEU4.4中，以在哺乳动物细胞中表达完整IgG轻链。用于表达重链和轻链的载体最初由Persic等人(Persic,L.,等人(1997)187,9-18)描述。剑桥抗体技术公司(CambridgeAntibodyTechnology)的载体已被工程改造成包括EBVOriP元件，该元件与EBNA1蛋白一起，能使质粒得以进行附加型复制。为获得IgG,将重链和轻链IgG表达载体转染到EBNA-HEK293哺乳动物细胞中。IgG被表达并分泌到培养基中。将收获物集中，过滤后进行纯化。IgG是用A蛋白层析法进行纯化。将培养物上清液装载在陶瓷A蛋白柱(BioSepra)上，用50mMTris-HClpH8.0,250mMNaCl洗涤。用0.1M柠檬酸钠(pH3.0)将结合的IgG从柱子洗脱下来，并加入Tris-HCl(pH9.0)进行中和。用NaplO柱(Amersham，#17-0854-02)将洗脱的材料緩冲液交换成PBS,使用基于IgG氨基酸序列的消光系数(Mach等人,Anal.Biochem.200(1):20-26，1992)，分光光度法测定IgG浓度。用SEC-HPLC和SDS-PAGE，分析纯化的IgG的聚集或降解情况。磁必^^Fv^/gG乂力i^丄-五W57*^^^/,#脊#^#劍用RBL-ER51钙信号转导测定法，评估纯化scFv和IgG制品对通过FcsRI介导的人IgE生物活性的中和效价。用人FcsRI(RBL-ER51细胞)稳定转染RBL-2H3细胞(大鼠嗜碱性粒细胞系)。细胞附近的游离IgE会结合细胞表面上的FcsRI,受体结合的IgE的随后交联会导致能用荧光成像读板器(FLIPR)检测的钙动员。该方案的详细描述在"材料和方法"章节中提供。抗体1的纯化scFv制品在最大试验浓度下能够抑制RBL-ER51细胞的IgE诱导钙信号转导。当作为纯化的IgG进行试验时，抗体l的IQ。经计算为267nM(n=3)。7.6在举在Z^LPZ4(^4在;^爭都定法尹^^斧嫂和类歪^^c/^x义用DELFIA⑧表位竟争测定法，确定抗体对IgE和结构相关分子IgA、IgM、IgD和IgG的类型交叉反应性和选择性。该测定法是通过测量结合每个固定化抗IgE抗体的生物素酰化IgE(血浆纯化的，BIODESIGNInternational)的抑制情况，来测出相对交叉反应性。在每个测定中试验了纯化的IgA、IgM、IgD和IgG(均获自Calbiochem)的被滴定液(titration)，以确定在测定中由ICso值测量出的每个结构相关蛋白的特异性概况(specificityprofile)。在每个测定中试验了IgE各类型的被滴定液，这些类型包括食蟹猴lgECs3-Cs4结构域(本公司HEK-EBNA衍生的)、人lgECs3-Cs4结构域(本公司HEK-EBNA衍生的)和人IgEX(BIODESIGNInternational),以确定抗体的类型交叉反应性。全长人IgE人产生了抑制曲线。对于人或食蟹猴IgECs3-Cs4结构域或者任何结构相关蛋白，没有观察到抑制情况。这些数据证明，抗体l能结合人IgEX,不过不结合IgECs3-Cs4。另外，抗体1不会结合与IgE最相关的人蛋白质的任何一个。该方案的细节在"材料和方法"章节中提供。A7遂化^/gGW/gE与CD"时潜合##斜IM9细胞(一种人B细胞系)被证实在^出条件(basalconditions)下表达CD23而不是FcsRI。IgE能结合IM9细胞表面上的CD23。CD23结合的IgE然后可用抗IgE藻红蛋白(Caltag)结合，通过流式细胞术(FACSCalibur,BDBiosciences)检测。评估了抗体对IgE/CD23相互作用的抑制。这个方法的详细方案在"材料和方法"中提供。简单的说，将试验IgG的被滴定液与IgE混合，然后与IM9细胞一起温育。温育1小时后，洗涤细胞，用抗IgE藻红蛋白(Caltag)检测结合的IgE。对IgE/CD23与抗体1的相互作用没有可^r测的抑制。7.《Ftt^/潜合^/g五^Jt义A^疰用RBL-ER514丐信号转导测定法，评估了抗体与FcsRI结合的IgE交联的潜力。给"材料和方法"中描述的RBL-ER51细胞荷载IgE。将抗体与IgE荷载细胞一起温育，评估它们刺激钙应答的能力。抗体l不能够诱导可检测的钙应答。实施例2.抗体优化么7滂本i鏖^说'必对抗体1进行了优化，以改进对IgE的亲和力。这是用定向或随机诱变方法实现。对于定向诱变方法，通过使用Clackson和Lowman(2204)PhageDisplayAPracticalApproach,2004.OxfordUniversityPress描述的标准分子生物学技术，对可变重链(VH)互补决定区3(CDR3)进行寡核苷酸定向诱变，产生出衍自抗体1的大scFv噬菌体文库。将文库进行基于亲和力的噬菌体展示选择，以选择出对人IgE具有更高亲和力的变体。结果，这些变体应显示出改进的对IgE与其受体的结合的抑制活性。选择是基本上按之前的描述(Thompson.JournalofMolecularBiology.256:77-88,1996)进行。简单的说，将scFv噬菌体颗粒与重组生物素酰化人IgEX(U266衍生的[Ikeyama等人，1986.MolecularImmunology23(2);第159-167页]和在本公司进行了修饰)一起在溶液中温育。然后，按珠粒生产商的建议，将结合抗原的scFv-谨菌体捕捉在链霉亲和素包被的顺磁性珠粒(Dynabeads⑧M280)上。然后按之前的描述(Osbourn,JK等人，Immunotechnology,2(3):181-96,1996)将所选的scFv-噬菌体颗粒回收，在递减浓度的生物素酰化IgE的存在下重复进行选择过程(250nM-250pM,4轮选择)。随后用标准的分子生物学技术，通过定点诱变将更多的突变导入到可变重链(VH)互补决定区2(CDR2)和可变轻链(VL)互补决定区1(CDR1)中。对于随机诱变方法，使用标准的分子生物学技术，通过对可变重链(V。区域和可变轻链(VO区域进行易错PCR，产生出衍自先导克隆(leadclone)的大scFv核糖体展示文库。将文库进行基于亲和力的核糖体展示选择，以选择出对IgE具有更高亲和力的变体。结果，这些变体应显示出改进的对IgE与其受体的结合的抑制活性。选择是基本上按之前的描述(Hanes等人，2000.MethodsinEnzymology328,404)进行。简单的说，将mRNA-核糖体-scFv复合物与重组生物素酰化人IgE入(U266衍生的[Ikeyama等人,1986.MolecularImmunology23(2);第159-167页]和在本公司进行了修饰)一起温育。然后，按珠粒生产商的建议，将结合抗原的mRNA-核糖体-scFv复合物捕捉在链霉亲和素包被的顺磁性珠粒(DynabeadsM280)上。然后按之前的描述(Hanes等人，2000.MethodsinEnzymology328,404)，使所选的mRNA-核糖体-scFv复合物解离，将mRNA纯化并用于反转录和PCR扩增。在递减浓度的生物素酰化人IgEX的存在下重复进行选择过程((100nM-100pM,5轮选择)。么2^戎傳-豕谬i必^/;t法峑;tA經农谬身^速^^鏖将来自随机诱变选择结果(selectionoutput)的scFv亚克隆到pCantab6载体(CambridgeAntibodyTechnology)中，随后表达在细菌周质中，在表位竟争HTRF⑤(均相时间分辨荧光)测定模式中对其进行筛选，确定是否能抑制标记上铕穴状化合物(CISbioInternational62EUSPEA)的人IgE(U266衍生的[Ikeyama等人，1986.MolecularImmunology23(2);第159-167页])与抗人IgE(抗体1，在实施例1分离)的结合。详细的测定方法在"材料和方法"章节中提供。将显示显著抑制作用的scFv进行DNA测序，将独特的scFv制备成纯化制cr口口。么3遂必^scFv乂,/g五々Fcei7^潜合^^伊教在受体-配体结合HTRF(均相时间分辨荧光)测定模式中，试验纯化的scFv是否能抑制标记上铕穴状化合物(CISbioInternational62EUSPEA)的人IgE(U266衍生的[Ikeyamaet.al.1986.MolecularImmunology23(2);第pl59-167页])或食蟹猴IgE(重组的，参见"材料和方法，，)与人FcsRl-Fc(本公司NS0cell所产生)的结合。示例性的scFv效价数据在表5a中列出。表5a:在受体-配体结合HTRF⑧测定中试验时从随机诱变文库鉴定到的克隆的示例性效亍介<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>24遂必W/gG对i^丄-J^5/*/《^錄/,#脊#^^伊對在重形成IgG后，用改进的RBL-ER51钓信号转导测定法，测出优化的克隆的效价。这个测定法是从先导分离时所使用的方法改进而来，以改善效价更高的抗体的检测灵敏度。该方案的详细描述在"材料和方法"章节中提供。对人和食蟹猴IgE的ICs。效价的数据在表5b中给出。表5b:对优化抗体用BIAcore进行的结合亲和力计算和用RBL-ER51钙信号转导测定进行的效价测量<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>将优化的抗IgE抗体的Vh和VL结构域的氨基酸序列，与VBASE数据库(Tomlinson1997;JournalofMolecularbiology.224.487-499)中的已知的人种系序列进行比对，通过序列相似性鉴定出最接近的种系。对于优化抗体谱系的VH结构域，最接近的种系是Vh3DP-47(3-23)。对于VL结构域，最接近的种系是V人3DPL23(3r)。不考虑保持不变的Vernier残基(Foote&Winter1992)，在抗体1的VH结构域的构架中没有偏离种系的变化，在VL结构域中有6个偏离种系的变化。将VL结构域中的所有变化回复到最接近的人种系序列，以相同地(identically)匹配人抗体。以适当的诱变引物，用标准的定点诱变技术,对这些氨基酸残基进行种系化。然后对种系化的IgG进行再评估，以确认效价或亲和力没有降低。种系化(GL)抗体的示例性亲和力和效价在表6中提供。表6:对种系化的抗体用BIAcore进行的示例性结合亲和力计算和用RBL-ER514丐信号转导测定进行的效价测量<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>2.6磁必好7gGW/g五与CZ)23^潜合^^伊斜用之前描述的IM9结合测定法，对这些优化抗体中的一些评估其是否能抑制IgE/CD23相互作用。发现在这个系统中试验的抗体33能抑制IgE/CD23相互作用，ICsQ为83nM(n=2)。27尸ce7/潜合W/g￡Wit炎'用RBL-ER514丐信号转导测定法，评估了优化抗体与FceRI结合的IgE交联的潜力。给"材料和方法"中描述的RBL-ER51细胞最大地负荷IgE。将优化抗体与IgE荷载细胞一起温育，评估它们刺激钙应答的能力。没能检测到信号转导(图1)。Z^ZFZ4俊《在;^爭避定^W遂举^;^类藝x叉^^用如前所述的DELFIA⑧表位竟争测定法(参见1.6节和"材料和方法")，对先导抗体的选择性和类型交叉反应性进行再评估。在每个测定中试验了纯化的IgA、IgM、IgD和IgG(均获自Calbiochem)的被滴定液，以确定在测定中由IQo值测量出的每个结构相关蛋白的特异性概况。在每个测定中试验了IgE各类型的被滴定液，这些类型包括人IgEX(U266衍生的)和IgEK(Calbiochem)、食蟹猴IgECs3-Cs4结构域(本公司HEK-EBNA衍生的)、人IgECs3-Cs4结构域(本公司HEK-EBNA衍生的)和食蟹猴IgE(本公司HEK-EBNA衍生的)，以确定抗体的类型交叉反应性。全长人IgEX和IgEK以及食蟹猴IgE产生了抑制曲线。对于人或食蟹猴IgECs3-Cs4结构域或者对于任何结构相关蛋白，没有观察到抑制情况。这些数据证明，抗体33GL能结合全长人和食蟹猴IgE，不过不结合Cs4-Cs4结构域。另外，抗体33GL不能结合任何与IgE最相关的人蛋白质。该方案的细节在"材料和方法"章节中提供。2.9-^SZ4core^f说'必^;^辨者，力凝凝基本上4姿Karlsson等人,1991;JournalofImmunologicalMethods145(卜2)229-240的描述，用BIAcore2000生物传感器(BIAcoreAB),通过表面等离振子共振，测定代表性数目的克隆的纯化IgG样品对人和食蟹猴IgE的结合亲和力。筒单的说，按照生产商的说明书(BIAcore),用标准的胺偶联试剂将纯化的人或食蟹猴IgE共价结合到CM5传感器芯片(BIAcore)的表面，以提供100RU的表面密度。使在HBS-EP緩冲液(BIAcoreAB)中以250nM和15.6nM之间的一系列浓度制备的IgG样品经过传感器芯片表面。在各次抗体注射之间，用10mM甘氨酸，pH1.75使表面再生。所得的传感图i普用BIA评估3.1软件进行评估，并与二价分析物模型(bivalentanalytemodd)拟合，以提供相对结合数据。试验的IgE的示例性亲和力在表5b和表6中显示。实施例1和2的材料和方法^趟必^^Pv^"/g五力Fcsi7^潜合^"/伊浙在基于受体-配体结合均相FRET(荧光共振能量转移)的测定模式中，对选择结果筛选其是否能抑制标记上铕螯合物(PerkinElmer1244-302)的人IgE(Calbiochem401152)与人FcsRI-Fc(本公司NS0细胞所产生)的结合。先导分离期间的结果作为含有未纯化scFv的未稀释细胞周质提取物进行筛选，制备于50mMMOPS緩冲液pH7.4,0.5mMEDTA和0.5M山梨糖醇中。将15|il的未纯化scFv样品加到384孔测定板(PerkinElmer6006280)。接着加入15的1lnM人FcsRI-Fc(基于260kDa的分子量)、15|ul的40nM标记上XL665(CISBioInternational61HFCXLA)的抗人FcIgG,然后加入15(il的0.75nM铕标记人IgE。用300nM人IgE(Calbiochem)定义非特异性对照结合。所有稀释都在含有250mM氯化钠和0.05%Tween20(测定緩冲液)的50mMTris-HCl(pH7.8)中进行。接着将各测定板在室温下温育1.5小时，然后用VICTOR2读板器(PerkinElmer)在615nm和665nm发射波长处依次读取时间分辨荧光。数据通过VICTOR2软件归一化，以计算每秒计数(CPS)。随后用CPS值如方程1所述计算％特异性结合。方程1:%特异性结合=(样品的CPS-非特异性结合对照的CPS)X100(总结合对照-非特异性结合对照的CPS)遂必^"Fv乂^7g五与F"77好_#合好/伊教在基于受体-配体结合均相FRET(荧光共振能量转移)的测定模式中，对来自筛选工作所鉴定到的阳性克隆的纯化scFV,试验其对标记上铕螯合物(PerkinElmer1244-302)的人IgE(Calbiochem401152)与人FcsRI-Fc(本公司NS0细胞所产生)的结合的抑制作用。利用scFv浓度的滴定，以确定在测定中由ICs()值测量的scFv效价。将15)Lil的纯化scFv样品被滴定液加到384孔测定板(PerkinElmer6006280)。接着加入15pi的1lnM人FcsRI-Fc(基于260kDa的分子量)、15|il的40nM标记上XL665(CISBioInternational61HFCXLA)的抗人FcIgG,然后加入15pi的0.75nM铕标记人IgE。用300nM人IgE(Calbiochem)定义非特异性对照结合。所有稀释都在含有250mM氯化钠和0.05o/。Tween20(测定緩冲液)的50mMTris-HCl(pH7.8)中进行。接着将各测定板在室温下温育1.5小时，然后用VICT0R2读板器(PerkinElmer)在615nm和665nm发射波长处依次读取时间分辨荧光。数据通过VICTOR2软件归一化，以计算每秒计数(CPS)。随后用CPS值如方程1所述计算％特异性结合。方程1:%特异性结合=(样品的CPS-非特异性结合对照的CPS)X100(总结合对照-非特异性结合对照的CPS)使用GraphPadPrism软件，用四参数logistic方程(方程2)通过曲线拟合测定IC5。值。方程2:Y-最小值(bo加m)+(最大值(top)-最小值)/(l+10A((LogEC50-X)承斜率(HillSlope)))X是浓度的对数。Y是特异性结合。Y从最小值开始，以S形状到达最大值。勿應^朋丄-2f/3*應哞对辨/,#脊,^##用RBL-ER51钙信号转导测定法，评估纯化的scFv和IgG制品对通过FcsRI介导的人IgE生物活性的中和效价。将人FcsRI从人外周血淋巴细胞克隆到pcDNA3.1载体中，用标准的电穿孔方法转染到RBL-2H3细胞(大鼠嗜碱性细胞系)中。将转染的细胞通过有限稀释进行克隆，分析表面FcsRI表达情况。将所得的RBL-ER51细胞维持在含有G418(Invitrogen10131-027)的培养基中，以保持稳定的受体表达。细胞附近的游离IgE会结合FcsRI,受体结合的IgE随后的交联会导致能用荧光成像读板器(FLIPR)检测的钙动员。将RBL-ER51细胞以5xl0"100(il/孔的密度接种到96孔黑壁平底的组织培养处理过的板(Costar),其中的各孔在培养基[DMEM(Invitrogen41966),含9%v/v非热灭活FBS(Invitrogen10100-147)和400吗/mLG418(Invitrogen10131-027)]中，接着在37。C，5%C02下温育18-24小时。这个时间后，将培养基吸出，保持细胞单层完整，换上100pL/孔的FLUO-4AM荷载緩冲液[DMEM，含0.1%FBS,20mMHEPES,2.5mM丙磺舒(probenicid)和2昭/mLFLUO-4AM(TeffLabs)]在37°C,5%C02下保持1-2小时。将荷载緩冲液吸出，用200fiL/孔的PBS洗涤细胞3次。将最终洗涤液吸出，换上70(^L/孔的FLIPR緩冲液[125mMNaCl2,5nMKCl，lmMMgCl2,1.5mMCaCl2，30mMHepes,2.5mM丙磺舒，5mM葡萄糖，0.01%v/vFCS]。将各板在37°C，5%0)2下温育5-45分钟。将纯化的scFv或IgG的试验溶液(一式两份)在V底板(Greiner)中稀释在FLIPR緩沖液中至期望的浓度。不抗IgE的非相关抗体用作阴性对照。将IgE(Calbiochem或U266衍生的[Ikeyamaet.al.1986.MolecularImmunology23(2);第pl59-167页])在FUPR緩冲液中制备，与适当的试验抗体混合，产生在40inl/孔的总体积中3.33(ig/mL的最终IgE浓度。将测定中所使用的IgE的浓度，选择成在最终测定浓度下产生最大钙应答的大约80%的这么一个剂量。所有样品在室温下温育30分钟，然后将30iul的IgE/抗体混合物转移到以上制备的荷载染料的细胞中。将各测定板在37°C下温育IO分钟，让游离IgE结合RBL-ER51细胞。为测量加入交联性抗IgE后的钓动员，将FLIPR(MolecularDevices)按照生产商说明书校准以进行合适的暴露。将稀释于FLIPR缓冲液的抗IgE(BiosourceAHI0501)加到测定板中，至10jug/mL的最终浓度。以1秒的间隔时间进行80次测量，然后以8秒的时间间隔进行40次测量，记录FLUO-4AM染料的荧光。输出每个孔的峰值应答，然后用GraphpadPrism软件分析数据。i5丄-￡75/叙應^^我/g五it联^^量为测量纯化的IgG交联FcsRI结合的IgE的能力，按抑制测定中所述制备RBL-ER51细胞并荷载染料。将细胞在稀释于FLIPR緩沖液的100|LiL的1jLig/mL人IgE(Calbiochem或U266衍生的[Ikeyamaet.al.1986.MolecularImmunology23(2);第pl59-167页])中温育10分钟，以让IgE结合细胞表面上的FcsRI。将测定中所使用的IgE的浓度，选择成产生最大钙应答的大约80%的这么一个剂量。为测量加入交联性抗IgE后的4丐动员，将FLIPR(MolecularDevices)按照生产商说明书校准以进行合适的暴露。将在FLIPR緩沖液中稀释至适当浓度的30pL试验抗体加到荷载IgE的测定板。用抗IgE(BiosourceAHI0501)作为阳性对照。以1秒的间隔时间进4亍80次测量，然后以8秒的时间间隔进行40次测量，记录FLUO-4AM染料(TeffLabs)的荧光。输出每个孔的峰值应答，然后用GraphpadPrism软件分析数据。戎#4￡)￡丄尸"@4在;^爭蚱定^^逸举^和类剪Jt^^^"^将纯化的IgG以这样一个浓度吸附到96孔Maxisorp孩吏量滴定板(Nunc)(于PBS中)上，该浓度是当将生物素酰化的人IgE以大约其对该特定IgG的估计KD加入时，产生出显著的信号。用PBS-Tween(0.1%v/v)洗去过量的IgG,并用PBS-Marvd(3%w/v)封闭各孔1小时。以生物素酰化人IgE与分别的IgG之间的相互作用KD值的大约1000倍的浓度开始，在PBS中制备每个以下竟争物(competitor)的稀释系列人IgE人(BIODESIGNInternational或者U266衍生的[Ikeyamaet.al.1986.MolecularImmunology23(2);第pl59-167页])、人IgEic(Calbiochem)、食蟹猴IgE(本公司HEK-EBNA衍生的)、人IgECs3-Cs4结构域(本公司HEK-EBNA衍生的)、食蟹猴IgECs3-Cs4结构域(本公司HEK-EBNA衍生的)、人IgA、IgM、IgD和IgD(均获自Calbiochem)。向这个系列加入等体积的浓度大约在KD的生物素酰化人IgE(产生出以竟争抗原:生物素酰化人IgE为大约1000:1的这么一个比例开始的系列)。然后将这些混合物转移到被封闭的IgG，让它们平衡1小时。用PBS-Tween(0.1。/。v/v)洗涤除去未结合的抗原，而剩余的生物素酰化人IgE通过链霉亲和素-铕3+缀合物进行检测(DELFIA⑧检测，PerkinElmer)。在EnVision读板器(PerkinElmer)上620腿处测量时间分辨荧光。用GraphpadPrism或MicrosoftExcel软件分析荧光数据。^戎#-恋#^必游定法#定^遽嫂《發以表位竟争HTRF(均相时间分辨荧光)测定模式，对选择输出(selectionoutput)筛选其对标记上铕穴状化合物(CISbioInternational62EUSPEA)的穴状化合物标记人IgE(U266书f生的[Ikeyamaetal.1986.MolecularImmunology23(2);第pi59-167页])与抗人IgE抗体(抗体l)的结合的抑制作用。在先导优化过程中，选择输出作为含有未纯化scFv的未稀释或稀释细胞周质提取物进行筛选，制备于50mMMOPS缓冲液pH7.4,0.5mMEDTA和0.5M山梨糖醇中。将4nM抗人IgE抗体与标记上XL665(CISBioInternational61HFCXLA)的20nM抗人FcIgG进行预混合。将10^il的未纯化的scFv样品加到384孔低容量测定板(Costar3676)。接着加入5^的抗人IgE抗体抗Fc-XL665混合物(mix),然后加入5|il的穴状化合物标记人IgE(大约2.3nM穴状化合物标记人IgE)的1/245稀释液。用300nM人IgE(U266衍生的[Ikeyamaet.al.1986.MolecularImmunology23(2);第pl59-167页])定义非特异性对照结合。所有稀释都在含有0.4M氟化钾和0.1%BSA的磷酸緩冲盐水(PBS)(测定緩冲液)中进行。然后将测定板在室温下lOOOrpm离心1分钟，在室温下温育3小时,接着用EnVision读板器(PerkinElmer)于620nm和665腿发射波长处读取时间分辨荧光。通过计算每个样品的％DeltaF值对数据进行分析。DeltaF按照方程1进行测定。方程1:%DeltaF=(样品665nm/620nm比值)-(非特异性对照665nm/620nm比值)X100(非特异性对照665nm/620nm比值)随后用％DeltaF值按方程2所述计算％特异性结合。方程2:%特异性结合=样品的％DeltaFX100总结合对照的％DeltaF政遽^^cFv("遂必^M,/g五力Fc^/W潜合^^/伊教以受体-配体结合HTRF(均相时间分辨荧光)测定模式，对纯化的scFv试验其对标记上铕穴状化合物(CISbioInternational62EUSPEA)的人IgE(U266衍生的[Ikeyama等人.1986.MolecularImmunology23(2);第pl59-167页])或食蟹猴IgE(重组的，参见"材料和方法")与人Fc汰l-Fc(本公司NS0细胞产生的)的结合的抑制作用。利用scFv浓度的滴定，以确定在测定中由ICso测量出的scFv功效。将1.9nM人Fc汰l-Fc(基于260kDa的分子量)与标记上XL665(CISBioInternational61HFCXLA)的20nM抗人FcIgG进行预混合。将10pi的纯化scFv样品被滴定液加到384孔低容量测定板(Costar3676)。接着加入5(il的FcsRl-Fc抗Fc-XL665混合物，然后加入5fil的穴状化合物标记的人或食蟹猴IgE的1/197稀释液(大约2.9nM穴状化合物标记的人或食蟹猴IgE)。用300nM的人或食蟹猴IgE(本公司衍生的)定义非特异性对照结合。所有稀释都在含有0.4M氟化钾和0.1%BSA的磷酸缓冲盐水(PBS)(测定緩冲液)中进行。然后将测定板在室温下1000rpm离心1分钟，在室温下温育3小时，接着用EnVision读板器(PerkinElmer)于620nm和665nm发射波长处读取时间分辨荧光。通过计算每个样品的％DeltaF值对数据进行分析。DeltaF按照方程1进行测定。方程1:%DeltaF=(样品665nm/620nm比值)-(非特异性对照665nm/620nm比值)X100(非特异性对照665nm/620nm比值)随后用％DeltaF值按方程2所述计算％特异性结合。方程2:%特异性结合=样品的％DeltaF_X100总结合对照的％DeltaF使用GraphPadPrism软件，用四参数logistic方程进行曲线拟合,测定IC5o值(方程3)。方程3:丫=最小值+(最大值-最小值)/(l+10、(LogEC50-X"斜率))X是浓度的对数。Y是特异性结合。Y从最小值开始，以S形状到达最大值。以对先导分离所述的RBL-ER51钙信号转导测定法的修正版本，评估来自改进的抗体的纯化IgG制品的中和功效。将RBL-ER51细胞以5xl0Vl00(il/孔的密度接种到96孔黑壁平底的组织培养处理过的板(Costar),其中的各孔在培养基[DMEM(Invitrogen41966)，含9%v/v非热灭活FBS(Invitrogen10100-147)和400|ig/mLG418(Invitrogen10131-027)]中，并在37。C，5%C02下温育18-24小时。这个时间后，将培养基吸出，换上50laL/孔的试验抗体(66.7nM-13.3pM)于测定培养基[DMEM(Invitrogen41966)，含9%v/v非热灭活的FBS(Invitrogen10100-147)、400|ug/mLG418(Invitrogen10131-027)和1.60/。青霉素/链霉素(Invitrogen15140-122)]中的稀释液，然后加入稀释于测定培养基中以分别产生25ng/ml和100ng/ml的最终IgE浓度的IgE[人(U266衍生的[Ikeyamaet.al.1986.MolecularImmunology23(2);第pl59-167页])或食蟹猴(重组的，参见"材料和方法")]。将各测定板在37°C,5%C02下温育4小时。这个时间后，将抗体/IgE混合物吸出，保持细胞单层完整，换上IOOiliL/孔的FLUO-4AM荷载緩冲液[DMEM，含0.1%FBS,20mMHEPES，2.5mM丙磺舒和2昭/mLFLUO-4AM(Invitrogen)]在37。C,5%C02下保持l-2小时。将荷载緩沖液吸出，用200)nL/孔的PBS洗涤细胞3次。将最终洗涤液吸出，换上100)iL/孔的FLIPR緩沖液[125mMNaCl2,5nMKC1，lmMMgCl2,L5mMCaCl2,30mMHepes,2.5mM丙磺舒，5mM葡萄糖，0.01%v/vFCS]。将各板在37°C,5%C02下温育5-45分钟。为测量加入交联性抗IgE后的4丐动员，将FLIPR(MolecularDevices)按照生产商说明书校准以进行合适的暴露。将稀释于FLIPR緩冲液的抗IgE(BiosourceAHI0501)加到测定板中，至2.3昭/mL(以交联人IgE)或20昭/mL(以交联食蟹猴IgE)的最终浓度。以1秒的间隔时间进行80次测量，然后以3秒的时间间隔进行40次测量，记录FLU04AM染料的荧光。输出每个孔的峰值应答，然后用GraphpadPrism软件分析数据。炎'必戎^U,Fcei/潜合^/gE^it炎^^/量为测量纯化的IgG交联FcsRI结合的IgE的能力，按抑制测定中所述制备RBL-ER51细胞以评估改进的抗体。将RBL-ER51细胞以5xlO"10(Vl/孔的密度接种到96孔黑壁平底的组织培养处理过的板(Costar),其中的各孔在培养基[DMEM(Invitrogen41966),含9%v/v非热灭活FBS(Invitrogen10100-147)和400pg/mLG418(Invitrogen10131-027)]中，并在37。C,5%0)2下温育18-24小时。这个时间后，将培养基吸出，换上100(iL/孔的于测定培养基[DMEM(Invitrogen41966),含9%v/v非热灭活FBS(Invitrogen10100-147)、400吗/mLG418(Invitrogen10131-027)和1.6Q/。青霉素/链霉素(Invkrogen15140-122)]中稀释至l吗/mL的人IgE(U266衍生的[Ikeyamaet.al.1986.MolecularImmunology23(2);第pl59-167页])。选定IgE浓度，以产生RBL-ER51细胞的最大负荷。将各测定板在37°C,5%C02下温育4小时。这个时间后，将IgE溶液吸出，保持细胞单层完整，换上100)iiL/孔的FLUO-4AM荷载緩冲液[DMEM,含0.1%FBS,20mMHEPES,2.5mM丙磺舒和2吗/mLFLUO-4AM(Invitrogen)]在37°C,5%C02下保持1-2小时。将荷载緩沖液吸出，用200pL/孔的PBS洗涤细胞3次。将最终洗涤液吸出，换上10(VL/孔的FLIPR緩冲液[125mMNaCl2，5nMKC1,lmMMgCl2,1.5mMCaCl2,30mMHepes,2.5mM丙磺舒，5mM葡萄糖，0.01%v/vFCS]。将各板在37。C，5%C02下温育5-45分钟。为测量加入交联性抗IgE(1.53uM-2.33nM)后的4丐动员，将FLIPR3(VL的在FLIPR緩沖液中稀释至适当浓度的试验抗体加到测定板中。用抗IgE(BiosourceAHI0501)作为阳性对照。以l秒的间隔时间进行80次测量，然后以3秒的时间间隔进行40次测量，记录FLUO-4AM染料(Invitrogen)的荧光。输出每个孔的峰值应答，然后用GraphpadPrism软件分析数据。遂必W/gG对/g五与/M9CD"^潜合^^伊賴用IM9细胞结合测定法，评估抗体是否能抑制IgE/CD23相互作用。用标准的组织培养程序，将IM9细胞(人B细胞系)保持在培养基[RPMI1640glutamax(Invitrogen61870-010);9%v/v热灭活FBS(Invitrogen10100-147)]。为试验优化的IgG,将IM9细胞用25ng/ml人IL-4(重组的，Peprotech，200-04)在37°C/5%C02下预处理3天，以上调CD23表达。收获IM9细胞，以lxl(^个细胞/mL重悬在流动緩冲液[PBS,含1。/o山羊血清(Sigma)和0.1%BSA流份V(Sigma)]。通过加入Fc片段(TEBU-bio)至5iug/mL的最终浓度，进行Fc受体封闭。将这个细胞悬浮液以100pL/孔接种在U形底聚丙烯板(Greiner)中，在冰上温育30分钟。在U形底聚丙烯板(Greiner)中制备抗体稀释液(667nM-1nM)，并与IgE(U266书亍生的[Ikeyamaet.al,1986.MolecularImmunology23(2);第pl59-167页])混合至10吗/mL的最终IgE浓度，在室温下保持30分钟。将各细胞板在2000rpm下离心2分钟，吸出上清液，保持细胞沉淀完整。将细胞重悬在100pL/孔的抗体/IgE混合物中，在冰上温育l小时。将各细胞板在2000rpm下离心2分钟，吸出抗体/IgE上清液。细胞通过重悬在200)uL/孔的流动緩冲液中进行洗涤，如上进行离心。用稀释1/30,v/v,100]LiL/孔的抗IgE藻红蛋白(Caltag)检测与细胞表面结合的IgE。将各测定板在冰上黑暗温育20分钟，然后在2000rpm下离心2分钟，如上所述用2x200jLiL的流动缓冲液进行洗涤。将细胞重悬在100pL细胞固定液(CellFix,BDbiosciences),用FACSCalibur(BDBiosciences)分析以检测FL2染色。数据用CellQuest软件(BDbiosciences)进行分析。输出FL2几何平均值荧光，然后用MicrosoftExcel和GraphpadPrism软件分析数据。人IgECe3-4的片段如之前在Wurzburg(2000)StructureoftheHumanIgE-FcC3-C4RevealsConformationalFlexibilityintheAntibodyEffectorDomains(人IgE-FcCe3-C4的结构揭示抗体效应子结构域中的构象挠性)中所述。用RT-PCR从IL13刺激的PBMC的总RNA扩增涵盖核芬酸2135-2868(GenBank登录号J00222)的cDNA片段。将这个PCR产物克隆到pCR2.1TA(Invitrogen)中。为使表达的蛋白质能分泌出来，和为产生掺入了符合读框的C末端FLAG表位和聚组氨酸标签(HislO)的序列，将IgECe3-4片段用掺入了5，BssHII位点和3，FLAG表位、聚组氨酸标签(HislO)和XbaI位点的引物进行PCR扩增，随后插入到pEU8.2载体中。该经修饰的pEU8.2载体含有EF-1启动子、鼠IgGl前导肽的基因组序列、oriP复制起点，该复制起点使得载体转染到表达EBNA-1基因产物的细胞系(如HEK293-EBNA细胞)中时能进行附加型质粒复制。用IMAC层析法将蛋白质从条件培养基纯化，然后进行尺寸排阻层析纯化。C^端标记^7^L4G历W0^食奮^/g五Ce3-4^,i通过对用包含人IgHE基因座的核苦酸1174-2989(GenBank登录号J00222)的引物从基因组DNA扩增的PCR产物进行直接测序，测定食蟹猴IgE恒定区。外显子通过与人序列的同源性进行鉴定，因此可以预测食蟹猴IgE重链恒定区的cDNA序列。合成出编码鼠IgGl前导肽的序列、食蟹猴Ce3-4及C末端FLAG表位和聚组氨酸标签的cDNA(DNA2.0),并克隆到pDONR221(Invitrogen)中。然后使用LRGateway⑧反应(Invitrogen),将目的基因转移到表达载体pDEST12.2(Invitrogen)中，该表达载体通过插入来自pCEP4载体(Invitrogen)的oriP复制起点进行修饰，以使得转染到表达EBNA-1基因产物的细胞系(如HEK293-EBNA细胞)中时能进行附加型质粒复制。用IMAC层析法将蛋白质从条件培养基纯化，然后进行尺寸排阻层析纯化。嵌合的D12可变区和食蟹猴IgE恒定区的产生合成出编码可变重链区域(其编码人抗雌二醇scFv(D12一VH)和两个不同的单元型食蟹猴IgHE基因(cyIGHETQ和cyIGHEME)之一的cDNA(DNA2.0),并克隆到pDONR221(Invitrogen)中。还合成出代表可变轻链人抗雌二醇scFv(D12—VL)和两个食蟹猴X恒定区基因(cylGLC4和cylGLC7)之一的cDNA(DNA2.0),并克隆到pDONR221(Invitrogen)中。然后使用LRGateway⑧反应(Invitrogen)，将目的基因转移到表达载体pDEST12.2(Invitrogen)中，该表达载体通过插入来自pCEP4载体(Invitrogen)的oriP复制起点进行修饰，以使得转染到表达EBNA-1基因产物的细胞系(如HEK293-EBNA细胞)中时能进行附加型质粒复制。使用Ikeyam等人(1986)MolImmunol23pl59-67中所述的方法纯化重组嵌合IgE蛋白，该重组嵌合IgE蛋白代表着与食蟹猴IgECel-4融合的人抗雌二醇scFv的可变重链区(图3和4)和与食蟹猴人恒定区融合的人抗雌二醇scFv的可变轻链区(图5和6),从HEK293EBNA细胞表达。人FceRI-Fc(本公司NS0细胞产生的)将包含核苷酸67-711(GenBank登录号NM一002001)的FceRI克隆在人IgGlFc的基因组区域的上游，如同来自Persic等人(1997)187;9-18首次描述的pEU1.2。将这克隆到pcDNA3.1EcoRI-Xbal中。通过用pcDNA3.1FceRI—Fc构建物稳定转染NSO细胞，实现重组融合蛋白FceRI—Fc的表达。如下建立稳定表达用G418进行选择，通过有限稀释分离克隆，和鉴定具有高表达水平的克隆。然后用A蛋白亲和层析法将FceRI—Fc融合蛋白从条件培养基纯化，接着进行制备型尺寸排阻层析纯化。实施例3.IgE和纯化的IgG之间的复合物形成的测量91通过高效尺寸排阻液相层析法，对纯化的人IgE和纯化的抗IgEIgG(抗体33)之间形成的免疫复合物进行表征。另外，用在线多角度光散射(MALS)估计复合物大小。复合物是通过将IgE和IgG以1:1摩尔比在Dulbecco，sPBS中18。C温育1小时来形成。样品中每个蛋白质的浓度为2.5jiM。将样品在两根串联的Bio-Sep-SEC-S4000柱(300x7.8mm)上进行分析。对柱子进行平衡，样品在AgilentHP1100HPLC系统上以1ml/min的流速在Dulbecco，sPBS中进行分析。用二极管阵列检测器于220和280nm处检测各峰，还使洗脱液通过WyattTechnologiesDAWNEOS(MALS)和OptilabrEX(折光指数)检测器。1:1摩尔比样品的层析产生出没有完全分开的、对应于13.38min、14.24min和15.64min保留时间的三个峰(由UV吸光度检测)。这些保留时间表明了IgE与IgG的非共价复合物的形成。MALS分析得出1239kDa(13.88min峰)、914kDa(14.24min峰)和576kDa(15.64min峰)的分子量，这些分子量都高于单独的IgG和IgE蛋白质的质量。没有观察到洗脱在空体积中的蛋白质的证据，这表明没有形成更高分子量的聚集体02百万Da)。实施例4:人B细胞-胞内IgE的抑制通过在Ficoll-Paque梯度(Pharmacia)上进行离心，从人肝素化全血分离外周血单核细胞(PBMC)。随后采用使用磁珠(Miltenyi)进行的阳性抗CD19选择，从PBMC群体分离B细胞。在细胞通过磁性柱过程中，收集阳性和阴性B细胞流份。将来自除B细胞外含有所有PBMC细胞的阴性B细胞流份的细胞用丝裂霉素C处理，以防止增殖。将细胞与50pg/mL丝裂霉素C温育30分钟，然后用组织培养基(RPMI1640，含有Glutamax(Gibco)/10%FCS(Gibco)/50U/mL青霉素/50(ig/mL链霉素(Gibco))进行洗涤，接着与PBS温育70分钟后进行最后洗涤，以确保所有的丝裂霉素C被去除。为诱导B细胞的分化，将4x104个8细胞和来自B细胞阴性流份的9.2x105个细胞接种在96孔板中，该板在补充有3.5jliM卩-巯基乙醇(Sigma)和20(ig/mL转铁蛋白(Chemicon)的组织培养基中，接着与0.001-1OOnM的抗IgE单克隆抗体或对照抗体预温育30分钟，然后加入0-100ng/mL的人白细胞介素-4(IL-4)。随后将细胞在加湿的C02培养箱中温育12天。在第12天，对各板稍作离心，收集上清液，用以下方案对细胞进行染色，确定是否存在胞内IgE。首先将细胞与含1%人血清的PBS—起温育10分钟，以封闭Fc受体结合。接着用BectonDickinson的Cytofix/Cytoperm试剂盒，将细胞在冰上固定并透化处理。然后洗涤细胞，加入1:6最终稀释的多克隆兔抗人IgE-FITC抗体(DAKO)和1:10最终稀释的单克隆小鼠抗人CD19-RPE/Cy5抗体(DAKO)。重要的是将细胞彻底洗涤，以避免残余的抗IgEMAb(单克隆抗体)的干扰。温育30分钟后，洗涤细胞，样品在使用HTS96孔板荷载装置(loaderdevice)的FACSCalibur上进行分析。然后记录CD19+群体中共表达IgE的细胞的百分数，胞内IgE的表达以不用封闭性抗IgE处理的细胞中的最大IgE表达的％抑制表示。为确认胞内染色对于抗IgE单克隆抗体没有干扰，用已确认不显示所用的抗IgE克隆的显著干扰的测定法，即Pharmaciadiagnostics(现为Phadia)ImmunoCap测定法，对上清液进行平行分析，确定是否存在IgE产生。实施例5:抗IgE单克隆抗体诱导幼龄食蟹猴体内血小板数降低的一般安全性和能力的评估介绍在幼龄食蟹猴中进行了调查性(没有遵循GLP)研究，以评估IgE单克隆抗体33和两个其他抗体E85-50IgG!和E85-50IgG2造成血小板数降低的一般安全性和相对能力。研究的目标是l)测定三种候选抗IgE单克隆抗体在幼龄食蟹猴中诱导血小板计数降低/血'j、板减少(TCP)和相关效应的一般安全性和相对能力，2)测定单克隆抗体在食蟹猴中的初步药代动力学参数，3)评估三种候选单克隆抗体造成游离IgE降低的能力和测定单克隆抗体浓度和游离IgE水平之间的(PK/PD)关系。实施例5的材料和方法十八只专门培育的食蟹猴(Macaca/^"'cw/a^)获自毛里求斯Bioculture。这些动物在开始投药时在63-67周龄。对猴子进行预选择(从100只动物的更大群体)，选出具有高IgE水平(U/ml)的猴子，在三个组中归一化，每组雄猴和雌猴各三只，分别接受E85-50IgG^组1)、E85-50IgG2(组2)或抗体33(组3)。三种单克隆抗体各自在50mM乙酸钠，100mMNaCl,pH5.5中配制，以1mL/min的速度慢慢静脉注射(使用电动注射器/输注泵)，以2mL/kg的剂量体积给予动物。各动物每周投药一次(5周/5次剂量)，剂量水平逐渐提高，在第1、8、16、22和29天给予lmg/kg、30mg/kg和100mg/kg(x3)(表8)。在第37天给组1和组2分別另外投与E85-50IgG!和E85-50IgG2。两个最高剂量水平据预测能实现之前用Xolair在幼龄食蟹猴中证实能导致TCP的血清浓度。低剂量预期可以测定单克隆抗体实现游离IgE水平的降低的能力。表7研究设计概要在以下各天的剂量水平动物数目组别说明(mg/kg/天)1816222937雄性雌性1E85-50IgG,130100100100100332E85-50IgG2130100100100100333抗体33130100100100—33在第28天投药后观察动物8周，检查是否从任何毒性作用中恢复。每曰观察所有动物的健康不佳或明显毒性的征候，记录体重和食物消费量。另外，在投药周期内每日给每只动物进行详细体格检查，在非投药周期内至少每周一次进行体格检查。还在每次投药前和在投药后0.5、2、6、24、48和168小时后，对所有动物进行观察。在处理前两次(-2周和-1周)从股静脉/动脉获取血液样品，供分析标准的血液学参数(包括血小板计数；收集在EDTA中)和凝血参数(收集在柠檬酸三钠中)。在每次投药后24小时和144小时(第2、7、9、14、17、22、23、26、30和35天；组1和组2的样品仅在第38天和第43天)，和在8周恢复期每2周(第43、57、71和82天)，收集更多的样品进行血小板计数和标准血液学检查。在每次投药后144小时(第7、14、22、26和35天)和在恢复期结束时(第82天)收集凝血样品。凝血样品还在第57天收集。在处理前(-l周)和处理周期结束后大约24小时(第30天)收集一次血液样品进行补体激活(C3a、C3b和BB片4爻)试验。在以下时间从所有的组收集血清样品进行TK分析在第l天投药前和投药后0.5、6、12、24、48、144小时,在第8、16、22和29天投药后0.5、24和144小时，在第29天(仅组3和组4)投药后336、672、1008、1272小时，在第37天(仅组1和组2)投药后0.5、24、144、480、816、1080小时。使用通用的夹心免疫测定(使用针对单克隆抗体的生物素酰化人IgE和Alexa-647标记鼠抗人IgG检验试剂)和GyrolabBioaffy平台(加入链霉亲和素珠粒柱)，对样品进行单克隆抗体分析。在以下时间收集更多的血清样品进行IgE分析第l天投药前、投药后0.5、6、12、24、48、144小时，第8、16、22和29天投药后0.5、144小时和研究结束时(第82天)最终投药后1272小时(组3和组4)或1080小时(组1和组2)。用ImmunoCap系统(PhadiaAB,Uppsala,瑞典)通过免疫测定对样品进行游离IgE分析，其中人IgG-FcsRIa用于游离IgE捕捉，兔抗人IgE(PCS-缀合物)用于检测。95200880012210.5在第85天结束时，在病理学家的全面监督下进行全面目视检查，记录所有的损伤情况。测定绝对器官重量和器官:体重比。从多个器官收集组织，冻藏，但没有进行显微镜检查(除了目视异常或不按时间表发生的死亡外，见下文)。实施例5的结果一般安全性观察所有三种单克隆抗体总的来说都很好地被动物耐受，除了有一只接受E85-IgG,的动物因为临床状况恶化和体重减轻而被提前送去验尸外，在这个研究中没有健康不佳的临床征候。由于该只动物一直到检查过程中没有发现结果被记录到，因此不认为所观察到的作用与单克隆抗体有关。在所有各组记录到软质或流体粪便的发生，但是由于这些发现结果非剂量相关，不在所有的动物中见到或者不在同一动物的所有时间点见到，且在投药期和恢复期都以同样的频率见到，因此它们不太可能与单克隆有关。平均体重和平均体重增加表明，在研究中每个组当中的各动物间存在一些个体变动。但是，在治疗期所有的动物都如所预期那样增重。各组之间没有明显的差异(除了以上讨论的1只动物外)。在任何组都没有记录到对绝对或相对器官重量的明显治疗相关作用。在总体病理学和微观病理学检查中，在有限范围的可提示单克隆抗体治疗的作用的受检组织中没有记录到发现结果。毒性动力学和IgE水平在本研究中没有观察到TK方面的性别差异。总体上，对于这三种单克隆抗体，暴露情况都相似，且在1-100mg/kg剂量范围似乎与剂量线性相关。E85-50IgGpE85-50IgG2和抗体33的平均TK谱在图8中显示。即使在最低剂量水平，也没有观察到对TK的明显IgE下沉效应(IgE-sinkeffect)。这三种抗体的TK似乎是人IgG在食蟹猴中的典型TK。对于E85-50IgG!、E85-50IgGz和抗体33，在最后100mg/kg剂量后的平均最大观察浓度(Cmax)分别为18700、15900和24000nM。在最后100mg/kg剂量后的平均终点TK半寿期大约为10-13天。没有证据表明由于在这些动物中会潜在产生灵长类动物抗人抗体，而造成TK暴露降低。在食蟹猴中每周投与不同剂量水平的E85-50IgG"E85-50IgG2和抗体33后的平均游离IgE谱在图9中显示。动物接受首次剂量前的平均基线IgE,对于E85-50IgG,组、E85-50IgG2組和抗体33组分别为514、414和690ng/m。在第1天，1mg/kg剂量在投与1小时后诱导了游离IgE降低75-80%。由于在1mg/kg剂量后的低暴露，游离IgE在1周内回复到基线水平。更高的剂量导致了游离IgE在治疗期内的持续抑制。对于两个E85-50组，在研究结束时游离IgE回复到基线，而在抗体33组游离IgE保持被抑制。对血小板的作用除一只动物例外外，三种候选单克隆抗体(E85-50IgGi、E85-50IgG2和抗体33)在任何动物中在任何时间点都没有诱导从平均基线水平的显著的血小板计数下降，该例外的一只动物接受E85-50IgGP在第29天的单个时间点(在第28天第三次100mg/kg剂量后24小时)出现血小板降低(从基线降低34.9%)。在第37天笫四次投与E85-50IgG,和E85-50IgG2，在这个动物或这两组当中的任何动物都没有诱导任何进一步的血小板降低。图10显示组3动物(用抗体33IgGl处理)的血小板数目(x109/L,以相对于2个投与前数值的平均值的变化百分数表示)对血浆浓度的曲线图。这个曲线图代表了3个组中其他16只没有显示对血小板的显著作用的动物。有趣的是，在第29天投药后呈现血小板数目短暂降低的用E85-50IgGl处理的猴子，在这个时间具有最高的Cmax值(29400nmol/L)(但不暴露)。血浆水平随后剧烈下降，血小板计数回复到投药前数值。这暗示这样的可能性，即可能需要更高的血浆浓度阈值来引起血小板数目的下降。但是，有一只用抗体33处理的动物达到类似的水平(28500nm/L),没有相应的血小板作用(图8)。其他血液学作用除了血小板计数外(见下文)，在大多数的血液学参数(血红蛋白浓度、细胞密实体积、平均细胞体积、平均细胞血红蛋白浓度、红细胞分布宽度、血小板比积、血小板分布宽度、红血细胞计数、平均细胞血红蛋白、血红蛋白分布宽度、平均血小板体积、网织红细胞计数、总体和差异白血病计数)和凝血参数(凝血素时间、活化部分促凝血酶原激酶时间)上，没有记录到单克隆抗体治疗的一致性作用。在所有的组中观察到网织红细胞数目的增加，但是这个变化不是剂量/暴露相关性的，在组中不一致(组中的各动物具有相比于投药前数值更高、更低或不变的水平)或者在动物中不一致(在各时间点之间动物中的数值不依赖于暴露而升降)，且在平行对照组不存在下，在这个时间不能完全确定与单克隆抗体治疗的关系。任何这种变化在恢复期结束时通常已逆转。没有记录到对补体激活(C5a、C3a或BB片段)的显著治疗相关作用。i寸论和结论本研究证实，抗IgE单克隆抗体即E85-50IgG!、E85-50IgG2和抗体33当以反复的高剂量水平(最高达100mg/kg)给予幼龄食蟹猴时，受到很好地耐受，没有显著的不良毒理学作用。在18只猴子当中只有1只在投与100mg/kgE85-50IgGi后的单个时间点显示出从平均基线水平的显著的血小板数目下降，此时单克隆抗体的血浆浓度达到几乎30000nmol/L。本研究中所有三种单克隆抗体所达到的血浆Cmax浓度，预期远超过在临床中将会达到的浓度(例如200nmol/L)。参考文献本说明书引述的所有参考文献，包括上文引述的参考文献，都通过引用整体地和为所有目的并入本文。1Haan&Maggos(2004)BioCentury，12(5):Al-A62Koideetal.(1998)JournalofMolecularBiology，284:1141-1151.3Nygrenetal.(1997)CurrentOpinioninStructuralBiology,7:463-4694Wess,L.In:BioCentury,TheBernsteinReportonBioBusiness，12(42),A1-A7,20045Kabat,E.A.etal,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest4thEdition.USDepartmentofHealthandHumanServices.19876Kabat,E.A.etal.(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEdition.USDepartmentofHealthandHumanServices,PublicService,NIH,Washington7Segaletal.,PNAS,71:4298-4302,19748Amitetal"Science,233:747-753,19869Chothiaetal.，J.Mol.Biol.,196:901-917，198710Chothiaetal.，Nature,342:877-883，198911Catonetal.,J.Immunol"144:1965-1968,199012Sharonetal.,PNAS,87:4814-4817,199013Sharonetal.，J.Immunol.,144:4863-4869,199014Kabatetal"J.Immunol"147:1709-1719,199115Holliger&Hudson,7Va,匿所o阮/mo/ogy23(9):1126-1136200516Kontermann,R&Dubel，S,Jw幼o办￡>7g7>zeen'"g,Springer-VerlagNewYork,LLC;2001,ISBN:354041354517Mendez，M.etal.(1997)NatureGenet,15(2):146—15618Knappiketal.J.Mol.Biol.(2000)296,57-8619Krebsetal.JournalofImmunologicalMethods254200167—8420Ward,E.S.etal.，Nature341,544-546(1989)21McCaffertyetal(1990)Nature,348,552-55422Holtetal(2003)TrendsinBiotechnology21,484-49023Birdetal,Science,242，423-426,198824Hustonetal，PNASUSA,85,5879-5883,198825Holliger,P.etal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448，199326Reiter，Y.etal,NatureBiotech,14，1239-1245,199627Hu,S.etal,CancerRes.,56，3055-3061,199628HolligerandBohlen1999Cancerandmetastasisrev.18:411-41929Holliger,P.andWinterG.CurrentOpinionBiotechnol4,446-449199330GlennieMJetal.,1987J.Immunol.139,2367-237531ReppR.etal"1995J.H函t.377-38232StaerzU.D.andBevanM.J.1986PNAS8333SureshM.R.etal.,1986MethodEnzymol.121:210-22834Merchandetal.,1998NatureBiotech.16:677-68135Ridgeway，J.B.B.etal,ProteinEng.,9,616-621,199636HarlowandLane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborN.Y.，pp.726,198837K6hlerandMilstein,Nature,256:495-497,197538Wold，"a/.Multivariatedataanalysisinchemistry.Chemometrics—MathematicsandStatisticsinChemistry(Ed.:B.Kowalski),D.ReidelPublishingCompany,Dordrecht,Holland,1984(ISBN90-277-1846-6)39Normana/.AppliedRegressionAnalysis,Wiley-Interscience;3rdedition(April1998)ISBN:047117082840Kandel,Abraham&Backer,Eric.Computer-AssistedReasoningin￡:1^'，"平7晴，c/>661"/"^s，ggg08;￡隱9"￡:丽'，"ps戸F7兩，J'乙661'7"^丽￡)K(Xsn丛)'uo^p3pu乙'心w.做,3o报'poaPoa^Z^6i一s611。旧(1861)ubuu3^avPubin!uis乙s8i7廿乙寸l7i^:S8VSASVNd(8861)umiidnP现uos化3dK0117尝'兩.兩T(0661)'IBPpipsiivOSK/Z寸U3'81(厶661)s，oqdojp313。，pue'豐O617|7乙8-"8'n"3ug['iojy.(000Z)WV'ss^jpire'tv^.N81/(9861)8"-"Z/￡K'認，7""'卿oidA廿針6掘'O)W1)^。M8岡腦兩1額呵/"'，，i-iv外"8-66A'"乙(Z661)X3。io旧jBin。qowiBirni0〖'卩p。b叩oio^8-A8W)-At^8-0:N3SI'^[3A(x)sic[Studu！suopBqiddvpirn'spo工'，Avyos's3i—叫du0卩B，a3puB,s3(jXjmqn69S06l7U廿0:N8SI'(乙00乙々nf)tsuos"n丛uqofK"098SSI:N3SI'(6661'II，P。):画ra，2ire§J0p\[.suo^Biirauiqdinibab〖S3trbpxp3工purespo丄giqixresi3u〖ipB]/\[iB3〖pRi(j:gu!qpvj'sq!3、ire:y;'Hu可'us:^丛乙t7:M8SI'(000乙J3qui3。3d)fssaidA〖sj3A卩npjqjxo'((J3(fed)乙乙on'S3^i3ssousesIBopspqspjqjxo)SAposcferad虽8n/丄6憲法能改57Markse^/历o/Tec/mo/ogv,1992,J_Q:779-78358Kay,B.K.,Winter,J"andMcCafferty,J.(1996)PhageDisplayofPeptidesandProteins:ALaboratoryManual,SanDiego:AcademicPress59HunterW.M.andGreenwoodF.C.(1962)Nature194:49560Pliickthun,A.Bio/Technology9:545-551(1991)61ChaddHEandChamowSM(2001)CurrentOpinioninBiotechnology12:188-19462AndersenDCandKrummenL(2002)CurrentOpinioninBiotechnology13:11763LarrickJWandThomasDW(2001)CurrentOpinioninBiotechnology12:411-41864SambrookandRussell,A/o/ecw/arC/om'wgva丄a60rflto/3;Mawwa/:3rdedition,2001,ColdSpringHarborLaboratoryPress65Ausubeletal.eds.,^S7c^尸厂otoco/sz>zMo/ecw/ar历o/ogy:爿JohnWiley&Sons,4thedition199966Robinson,J.R.ed.,SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems,MarcelDekker,Inc.,NewYork,197867LedermannJ.A.etal.(1991)Int.J.Cancer47:659-66468BagshaweK.D.etal.(1991)Antibody,ImmunoconjugatesandRadiopharmaceuticals4:915-92269Vaughan,T.J.,etal.(1996).胸群胸ec/mo/ogy14,309-314.70Hutchings,C.GenerationofNai'veHumanAntibodyLibraries,inAntibodyEngineering,R.KontermannandS.Dubel,Editors.2001,SpringerLaboratoryManuals,Berlin,p,93表la<table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage107</formula>表lf<table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table>表2f<table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table>表3b<table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage119</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage122</formula>权利要求1.一种对免疫球蛋白E有特异性的分离结合成员，所述结合成员能与抗体33竞争与免疫球蛋白E的结合。2.权利要求1的分离结合成员，其中所述结合成员抑制RBL-ER51细胞中由25ng/mlIgE诱导的钙信号转导的ICso几何平均值小于lnM。3.权利要求2的分离结合成员，其中所述抑制钙信号转导的IC50几何平均值小于0.2nM。4.5.—种对人免疫球蛋白E有特异性的分离结合成员，所述结合成员包含一组CDR:HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中该组CDR相比于参考组的CDR具有8个或更少个氨基酸置换，其中HCDR1具有SEQ.ID.NO:279的氨基酸序列；HCDR2具有SEQ.ID.NO:280的氨基S吏序列；HCDR3具有SEQ.ID.NO:281的氨基酸序列；LCDR1具有SEQ.ID.NO:284的氨基酸序列；LCDR2具有SEQ.ID.NO:285的氨基酸序列；LCDR3具有SEQ.ID.NO:286的氨基酸序列；6.权利要求5的对人免疫球蛋白E有特异性的分离结合成员，其中所述氨基酸置换包含5个或更少个氨基酸置换。7.—种包含一纟且CDR:HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的分离结合成员，其中HCDR3包含SEQ.ID.NO:281的氨基酸序列。8.权利要求5的包含一组CDR:HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的分离结合成员，其中该组CDR包含HCDR1具有SEQ.ID.NO:279的氨基酸序列；HCDR2具有SEQ.ID.NO:280的氨基酸序列；HCDR3具有SEQ.ID.NO:281的氨基酸序列；LCDR1具有SEQ.ID.NO:284的氨基酸序列；LCDR2具有SEQ.ID.NO:285的氨基酸序列；LCDR3具有SEQ.ID.NO:286的氨基酸序列。9.一种分离结合成员或VH结构域，所述分离结合成员或VH结构域包含具有一个或多个以下置换的抗体1HCDR3(SEQIDNO:5):Kabat残基95被H、L或S置换；Kabat残基96^皮I、S、T、W或F置换；Kabat残基97被A、Y或F置换；Kabat残基98被V、P或F置换；Kabat残基99被A或Y置换；Kabat残基100被G、I或S置换。10.权利要求1-9中任一项的结合成员，其中所述结合成员是单克隆抗体。11.一种编码权利要求1-10中任一项的分离结合成员的分离核酸分子。12.—种转化有权利要求11的核酸分子的宿主细胞。13.—种产生权利要求1-10中任一项的分离结合成员的方法，所述方法包括在适于产生所述结合成员的条件下培养权利要求12的宿主细胞。14.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-10中任一项的结合成员和药物可接受赋形剂。15.权利要求14的組合物，所述组合物用作药物。16.权利要求14的组合物用于治疗与IgE有关的疾病的用途。17.权利要求14的组合物的用途，其中所述疾病是过敏症、哮喘或支气管炎中的一种或多种。18.权利要求14的组合物的用途，其中所述疾病是以下疾病中的一种或多种过敏性鼻炎、变应性接触性皮炎、特应性皮炎、过敏反应、食物过敏、荨麻渗、炎性肠病、嗜酸性粒细胞性胃肠炎、药源性皮渗、过敏性眼病、过敏性结膜炎、支气管哞喘、气道高反应性、化妆品过敏、药源性过敏、药源性超敏性综合症、金属过敏、职业性超敏性肺炎、慢性超敏性肺炎、冷超敏性、蠕虫感染引起的超敏性、乳胶过敏和枯草热。全文摘要本发明涉及IgE的结合成员，特别是抗体分子。结合成员尤其可用于治疗IgE介导的疾病，包括过敏症和哮喘。文档编号A61P37/08GK101687932SQ200880012210公开日2010年3月31日申请日期2008年2月15日优先权日2007年2月15日发明者C·L·多布森,D·科克兰,K·冯-瓦申费尔特,P·D·蒙克,P·-O·F·埃里克森,S·科亨申请人:阿斯利康(瑞典)有限公司;免疫医疗有限公司