专利名称：Mhc－ⅱ结合和/或mhc－ⅱ模拟分子用于预防和/或治疗炎性疾病的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用特异分子来干扰毒素如脂多糖(LPS)本身或它与诸如CD14和LBP的其它分子组成的复合体与其转导细胞之间的相互作用。本发明还涉及将所述分子用于预防和治疗炎性疾病，如败血症性休克的用途。
LPS是革兰氏阴性细菌的细胞壁组分。革兰氏阴性细菌的感染会导致危及生命的疾病，这种疾病是由LPS与诸如单核细胞、巨噬细胞和粒细胞之类的吞噬细胞的特异结合所致，这种结合能激活所述细胞并使其分泌各种细胞因子，包括肿瘤坏死因子-α、白介素1(IL-1)、IL-6、IL-8及其它炎症介质。这些物质或通过直接作用或通过激化次级介质而引起一系列反应，从而导致凝集系统病、血管舒张病、多器官缺损病并最终导致败血症性休克病(4，5)。
一般，能导致分泌多种炎症介质的吞噬细胞的显著活化作用是在被称为系统性炎症反应综合征(SIRS)的一种病态的发病过程中的一个重要反应。除了由LPS激活之外，多种其它临床疾病也会导致SIRS，如由细菌或病毒引起的感染、创伤、烧伤、胰腺炎、移植物抗宿主疾病和宿主抗移植物疾病、吞噬血细胞作用等。炎性疾病的例子之一是由来自革兰氏阳性细菌的葡萄球菌毒素A之类的外毒素引起的中毒性休克。已知其为超级抗原的其它外毒素有葡萄球菌毒素B和链球菌毒素。
业已证实，LPS能与糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定的单核细胞抗原CD14结合。CD14存在于单核细胞、巨噬细胞和粒细胞的表面，但它也能以无GPI锚定的可溶形式存在于健康个体的血清中。此外还证实，抗-CD14单克隆抗体能抑制LPS对单核细胞的激活作用。由此表明，CD14可起到LPS受体的作用(1)，并能介导LPS对细胞质的作用。不过，CD14-阴性细胞也能对LPS作出反应(2，7，8)。
此外，还了解到CD14是一种缺乏跨膜和胞质结构域的糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定分子(9)。因此，CD14不能向细胞质转导信号。一种被普遍接受的假设是，与GPI连接的蛋白需要相关的跨膜分子以便进行信号转导。因此，LPS及其它可能的SIRS刺激的转导分子尚未得到鉴定。
在由LPS活化细胞的情况下，为了解释LPS引起的细胞激活作用，迫切需要CD14之外的其它分子(10)。有人提出，LPS能与膜结合的或可溶的CD14以及LPS结合蛋白(LBP)组成复合体。其它源于血清的分子也能加入该复合体。该复合体能与细胞表面上的一种尚未得到鉴定的分子结合，使该细胞被激活。
已证实CD14在引起由来自革兰氏阳性及革兰氏阴性细菌的细菌包膜产物产生的细胞激活作用方面起着重要作用(13)。同样地，其它膜结合或源于血清的分子可能参与同所述细胞表面分子的相互作用，从而导致细胞的激活作用。
本发明已经发现，主要组织相容性复合体II(MHC-II)分子是LPS激活细胞所必须的，这种分子起着由LPS和诸如CD14和LBP之类的分子组成的分子复合体的受体和/或信号转导因子的作用。在人体内，MHC被称为人类白细胞抗原(HLA)。业已发现，LPS-反应性取决于MHC II型分子在细胞表面的表达。一种在本文中被称为“THP-1MHC+”的细胞系是一种MHC II型表达单核细胞系，Tsuchiya等称之为THP-1(3)。另一种在本文中被称为“THP-1.6MHC-”的细胞系是由THP-1MHC+通过自发突变产生的一种MHC II型-阴性单核细胞系。THP-1MHC+细胞能效应于LPS分泌细胞因子，而THP-1.6MHC-细胞不能。CD14-阳性、MHC II-阴性人类外周血单核细胞(PBMC)也不能对LPS作出反应。通过用CIITA转染THP-1.6MHC-细胞可以恢复MHC II型表达和LPS反应性，CIITA是一种能编码对MHC-II分子在细胞表面的表达很关键的核因子的cDNA。
其它SIRS刺激向细胞的转导也能由MHC-II分子介导。以前已经证实，外毒素也能结合于细胞表面的MHC-II分子上。其它革兰氏阳性产物的活性至少部分是由CD14介导的，因此，所述产物与CD14的复合体很有可能也会与MHC-II分子相互作用，以活化细胞。
因此，通过干扰由LPS和诸如CD14和LBP组成的复合体(以下称“CD14/LPS/LBP复合体”)与细胞结合MHC-II之间的相互作用可以预防和/或治疗系统性炎症反应综合征。根据本发明，可以两种不同方式实施上述干扰。
首先，可以用诸如抗MHC-II抗体、CD14或其肽衍生物之类的MHC-II结合分子阻止CD14/LPS/LBP复合体与细胞结合MHC-II的结合。这种分子能与CD14/LPS/LBP复合体竞争，从而阻止该复合体结合，但它本身不能激活MHC-II。由此阻止了MHC-II的转导功能。
其次，循环的LPS或CD14/LPS/LBP复合体能被MHC-II模拟分子捕捉。与可溶性MHC-II或类MHC-II分子结合的复合体不再能与细胞结合的MHC-II结合。从而防止对该细胞的激活作用。
MHC-II结合分子包括能阻止LPS或CD14/LPS复合体与MHC-II结合的任何分子。在实践中，所述分子包括针对细胞的CD14/LPS或LPS结合位点的抗MHC II抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体。抗体片段也适于作为MHC-II结合分子。
MHC-II模拟分子同时包括可溶性MHC-II分子本身和任何其它能封闭LPS或CD14/LPS复合体上的MHC-II结合位点的分子。这类分子可以包括完整MHC-II分子或其片段或亚单位。此外，还可以采用能与LPS或LPS/CD14/LBP复合体结合而又不会激活MHC-II的肽。所述肽可以与MHC-II至少部分同源，并含有合适的D-氨基酸，使该肽具有拮抗特性。所述分子可以为可溶形式或与一种载体的表面连接。
根据本申请提供的信息，本领域技术人员可以鉴定合适的结合和/或模拟分子。
这类分子可以来自任何合适的来源，如来源于人或其它生物，并可能用各种方法制备，例如，从MHC-II阳性细胞的细胞培养物上清液中提取或从细胞裂解液中提取。最佳提取方法为免疫亲和层析法。还可以用基因技术、蛋白质化学方法或任何其它合适方法制备合适的分子。
根据本发明，可将两种类型的分子用于预防和/或治疗炎性疾病，如败血症性休克、器官移植(例如骨髓移植)后的移植物抗宿主疾病、移植排斥反应、因烧伤、意外伤害、胰腺感染等引起的炎症反应。
本发明还适于预防和/或治疗其它炎症反应，例如手术后的炎症反应，如毛细管泄露综合征、过敏性炎病，自身免疫病、如红斑狼疮(LE)及其亚型、硬皮病及其亚型、嗜伊红性粒细胞筋膜炎(eosinophilicfasciitis)、Sjogren综合征、多肌炎、皮肤肌炎、结节性动脉外膜炎、Wegener’s肉芽肿病、颞动脉炎、风湿性多肌痛等，类风湿病，如类风湿关节炎、少年慢性关节炎、Felty综合征、Caplan综合征、类风湿性脊椎炎(Marie-Strumpell-Bechterew病)、牛皮癣、Reiter综合征、Behcet综合征。
可以用本发明方法治疗的而且至少部分地因自身免疫机制所致的其它疾病有糖尿病、Crohn病、溃疡性结肠炎、消化道溃疡、肾感染，如肾小球性肾炎和肾炎，动脉硬化病、多发性硬化、老年性痴呆、甲状腺机能亢进、甲状腺机能低下。
本发明还可用于与肿瘤病有关的一种或几种器官的炎症反应，如白血病、血细胞瘤、癌症、纤维瘤、肉瘤及各种类型的组织细胞增多病。
本发明还能用于预防和/或治疗病毒病，如AIDS。已知LPS刺激能增强细胞内人类免疫缺陷病毒(HIV)的复制。通过本发明的MHC-II结合分子和/或模拟分子阻止LPS的刺激作用，可以克服这种复制刺激。因此，本发明的MHC-II结合分子和/或模拟分子可用于以通过细胞激活刺激的方式阻止对病毒复制的刺激而对HIV感染的细胞产生保护作用。
基于在实施例中提供的资料，可以设想出以下用LPS激活细胞的模型。一方面，LPS可结合于膜结合CD14(mCD14)上，这是一种由LPS结合蛋白(LBP)加速的相互作用(14)。LPS和GPI锚定mCD14以及可能的LBP组成的复合体随后与跨膜MHC II型分子相互作用，导致信号转导。这种情形如图3A所示。另一方面，LPS与LBP一起能结合在存在于血清里的可溶性CD14(sCD14)上，该复合体然后结合于CD14-阴性细胞表面上的MHC II型分子上，导致CD14-阴性、但MHC II型-阳性的细胞被激活。这种情形如图3B所示。尽管示出的接触发生于CD14与MHC-II之间，LBP和LPS也可参与该相互作用，这与其它尚未得到鉴定的分子一样。革兰氏阳性细菌也能引起上述激活刺激，不过在这种情况下LBP的作用尚未确定。这里并不排除在没有与CD14或LBP形成复合体的情况下某些激活刺激直接作用于MHC-II分子的可能性。现已证实这种刺激作用是由MHC-II分子介导的。所述封闭或模拟分子将阻止这种激活刺激的转导。
本发明还涉及MHC-II结合分子、MHC-II模拟分子、以及包括两种类型分子中的一种或两种的药物组合物。药物组合物含有一种或几种MHC-II结合分子和/或MHC-II模拟分子作为活性成分，用于干扰用于诸如吞噬细胞的能表达MHC-II分子的细胞的诸如LPS的激活刺激物与细胞结合的MHC-II分子之间的相互作用，该组合物的形式为粉状、悬浮液、溶液、气雾剂、乳液、灌注液、吸入组合物、软膏或乳液，并可用于局部施用、鼻内使用、直肠内使用、阴道内使用，还可用于口服、肠胃外(静脉、皮下、肌内、鞘内等)或经表皮使用、吸入使用等。本发明的药物组合物可以这样制备将所述活性化合物与具有中性特征的可以药用的赋形剂(如水或无水溶剂、稳定剂、乳化剂、去污剂、添加剂)合并(即通过混合、溶解等)，如果必要的话并进一步与着色剂和调味剂合并。药物组合物中活性成分的浓度根据处理的性质和用药方法可以在0.001％-100％间变化。所服用的活性成分的剂量还取决于具体用途和服用途径，但举例来说，可以在0.01μg-1mg/kg体重间变化，最好在0.1μg-100μg/公斤体重间变化。
将结合以下实施例对本发明进行说明，这些实施例不是用于限定本发明范围的。实施例例1说明通过比较用LPS刺激时由MHC II型-阳性(HLA-DR)和MHC II型-阴性细胞系分泌的细胞因子验证这样的假说在由LPS激活吞噬细胞时，MHC-II是包括LPS、CD14、LBP以及可能有的其它分子的复合体的转导物和/或受体。细胞因子的分泌可以指示细胞的激活。
材料和方法THP-1MHC+是一种来源于人的CD14-阴性、MHC II型-阳性单核细胞系(3)。THP-1.6MHC-是一种自发产生的THP-1MHC+的MHC II型-阴性突变体，它是通过重复限制稀释克隆的。
通过用CIITA(II型反式激活蛋白；一种为MHC II型蛋白表达所必需的核蛋白(12))转染THP-1.6MHC-细胞重建HLA-DR表达，以获得THP-1.6MHC-CIITA。
通过流式细胞计量法评价HLA-DR和CD18在THP-1MHC+细胞(野生型)、THP-1.6MHC-细胞(突变细胞系)和THP-1.6MHC-CIITA(用CIITA转染的THP-1.6MHC-细胞)表面的表达。
各细胞系以106细胞/ml的密度在补充了10％FCS的培养基中培养，并用LPS分别以0，1，10，100ng/ml和1μg/ml的剂量进行刺激。24小时后收集上清液并通过ELISA测定其TNF-α和IL-8的含量。
结果和讨论LPS处理不会损害细胞的生活力。通过台盼蓝染色证实，95％以上的细胞是有生活力的。
尽管CD18的表达在三个细胞系中的表达是类似的，但由THP-1.6MHC-细胞表达的HLA-DR量明显低于THP-1MHC+细胞表达的。
在用LPS刺激THP-1MHC+细胞时，该细胞的反应是分泌TNF-α和IL-8(
图1)。形成对比的是，用LPS，即使是高剂量的LPS刺激HLA-DR-阴性细胞系THP-1.6MHC-，也不能诱导其分泌TNF-α或IL-8。然而，用CIITA转染可以恢复HLA-DR-表达和LPS-反应性。结论是，HLA-DR分子的表达是LPS激活单核细胞所必需的。例2说明为了证实例1的发现，用获自患有MHC-II型缺陷-一种罕见的遗传病，其表现为在幼儿的早期出现严重的合并性免疫缺陷-的患者的细胞证实用细胞系系统所获得的结果。在这种患者体内CD-14的表达不受影响。在存在大剂量LPS的条件下培养MHC II型缺陷型患者的PBMC和对照个体的PBMC，并测定所述培养物的上清液中TNF-α和IL-1的含量。
材料和方法从MHC-II缺陷型患者和健康的对照体内获取外周血单核细胞(PBMC)。
通过直接免疫荧光染色和流式细胞计量法测定HLA-DR在所述患者的PBMC表面的表达(画影线的直方图，在图2的左侧)和在健康的对照的PBMC表面的表达(灰色直方图)。
以106细胞/ml的浓度在补充了10％正常的人AB-阳性血清的培养基中培养获自患者的PBMC(粗线)和获自对照的PBMC(细线)，并分别以0，1，10和100ng/ml的LPS进行刺激。24小时后收获上清液，并通过ELISA测其TNF-α含量。
结果和讨论正象所预期的，由于LPS刺激，来自健康个体的PBMC分泌TNF-α和IL-1。然而，患者的MHC II型-缺陷的PBMC不会因LPS刺激而分泌显著量的细胞因子(图2)。由此证实了对表达MHC II型分子的要求并不局限于细胞系的THP-1MHC+家族。
数据表明，膜结合CD14不是由LPS激活细胞时所必需的(THP-1MHC+细胞不表达CD14)，而且量也不足(来自MHC II型缺陷型患者的PBMC表达正常水平的CD14)。
然而，上述实验未涉及可溶性CD14的作用。在所有实验中，采用补充了含有可溶性CD14的血清的培养基。因此，这些实验是重复的，在无血清的培养基中培养THP-1MHC+、THP-1.6MHC-和THP-1.6MHC-CIITA细胞。用大剂量LPS处理不会导致分泌显著量的TNF-α。
以上结果表明，MHC II型分子重要地参与了LPS-反应性。HLA-DR阴性细胞不会因LPS刺激而分泌细胞因子。人们也许会说，缺乏对LPS的反应是与一个同MHC II型紧密结合的一个因子相关，而且也是由CIITA调节，而不是缺乏MHC II型表达本身导致抑制LPS-反应性。然而，对LPS反应的缺乏并不局限于单独一种细胞因子的分泌，因为TNF-α及IL-1和IL-8的分泌也受到抑制。另外，尽管做了深入研究，至今尚未发现MHC II型之外的由CIITA调节的分子。最后，患者的疾病不是因为一种与CIITA相关的缺陷而起。转染来自该患者的由EBV转化的B细胞不能恢复MHC II型分子的表达。例3说明用3种不同方法验证MHC II型分子与CD14之间的物理相互作用。
首先，将MHC II阳性细胞系和MHC II阴性细胞系的裂解液与MHC II特异性抗体或对照抗体和放射性CD14(CD14*)或放射性对照分子一起培养。只有通过蛋白A琼脂糖与MHC II特异抗体间的相互作用才能使MHC II与CD14*复合体沉淀。当采用对照分子或对照抗体时，在该沉淀中不应当有放射性。如果无MHC II，在所述沉淀中也不会有放射性。
其次，将MHC II与放射性CD14一起培养。假设会形成MHCII/CD14*复合体。理论上讲，这种复合体可以用对该复合体的两种组分中任一种具有特异性的抗体和蛋白A琼脂糖进行沉淀。
第三，检验抗CD14抗体是否能阻止MHC II与CD14*发生相互作用。
在图4中对这些实验的原理作进一步说明。方法1.生产放射性CD14已通过体外转录/翻译由全长CD14 cDNA生产出重组CD14。所述cDNA是用PCR技术制备的，并用TNT T7接合的网织红细胞裂解物系统，按生产商推荐的方案(Promega，瑞士)在有35S-蛋氨酸的条件下测定其核苷酸序列。作为对照，用相同的系统通过体外转录/翻译生产放射性标记的荧光素酶。2.生产细胞裂解物所谓293细胞是来源于人胚胎的肾脏的用人类腺病毒5型DNA转化的细胞(ATCC命名为CRL 1573)；通过FACS分析发现，野生型293细胞不表达MHC II型分子。该细胞被作为MHC II阴性细胞。用源于人类MHC II型的α-、β和不变(i)链的cDNA转染的293细胞由Jacques Neefjes博士(Netherland Cancer Institute，阿姆斯特丹)惠赠。这种细胞能表达MHC II，因此被用作MHC II阳性细胞。按以下方法制备来自MHC II型阳性和MHC II型阴性细胞系的裂解物。
在培养皿中，在1ml裂解缓冲液(Boehringer Mannheim，细胞标记和免疫沉淀试剂盒)里裂解5×106个细胞。30分钟后收集裂解的细胞并进行声波处理(3×15秒)，接着在冰上培养30分钟，然后离心。按下述方法对上清液进行免疫沉淀。
3.在实验1中进行免疫沉淀用购自Boehringer Mannheim(瑞士)的“细胞标记和免疫沉淀试剂盒”，按所述试剂推荐的方案进行免疫沉淀。简言之，用50μl蛋白A-琼脂糖悬浮液对样品进行预清除。离心除去该蛋白A-琼脂糖，然后将上清液与以下抗体一起温育L243(抗-HLA-DR，ATCC命名HB55)；IB5(抗-MHC II型，由Jacque Neefjes博士惠赠，Netherland Cancer Institute，阿姆斯特丹)；和抗-CD3(Pharminger，San Diego，USA/AMS Biotechnology，瑞士)。1小时后加入50μl蛋白A-琼脂糖，并将该样品温育3小时，随后洗涤6次。
然后将沉淀再悬浮于30μl缓冲液(50mM Tris，pH7.5，20mMNaCl，1mM EDTA，2mM PMSF)中，并加入5μl在体外转录/翻译反应中获得的含有放射性标记CD14的溶液，在室温下温育该混合物30分钟。离心之后用#2洗涤缓冲液洗涤2次，然后再用#3洗涤缓冲液洗涤2次(#2和#3缓冲液源自Boehringer Mannheim的细胞标记和免疫沉淀试剂盒，瑞士)。将沉淀溶于标准SDS-PAGE加样缓冲液中并煮沸，在10％ SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后进行放射性自显影。4.纯化MHC II型分子对Gorga等的方法(15)稍加改进后将其用于从THP-1细胞中提取并纯化MHC II型分子。通过与二甲基庚二酸亚胺化物(dimethypimelimidate)交联将L243(抗-HL-DR，ATCC命名HB55)在蛋白A-Sepharose 4B柱上固定化。将THP-1细胞置于冰上，在含有0.1mM PMSF的Tris-HCl(pH8.0)中裂解。随后的一切步骤均在4℃下进行。以3000xg离心所得裂解物，洗涤沉淀直至上清液澄清。将收集的上清液以160000xg离心40分钟，并通过以4％终浓度加入Nonidet P40的方式重新溶解沉淀。在以160000xg离心2小时后，将上清液以下述顺序加至一系列的柱上Sepharose 4B(10ml)、正常兔血清Affigel 10(10ml)、蛋白A-Sepharose 4B(2ml)L243-Sepharose4B(12ml)。用以下溶液洗涤这些柱10mM Tris-HCl/0.1％ Nonidet P40pH8.0(5倍体积)；10mM MOPS/140 mM NaCl/0.1％脱氧胆酸盐pH8.0(2倍体)；10mM Tris-HCl/0.1％脱氧胆酸盐pH8.0(4倍体积)。将L243柱与其它柱分离，迅速用50mM甘氨酸/0.1％脱氧胆酸盐pH11.5洗脱。收集10ml级分，并在其被2M甘氨酸pH2.0洗脱后调至pH7.0-8.0。通过用30kDal截断膜超滤浓缩洗脱的HLA-DR分子。在Tris-HCl/0.1％脱氧胆酸盐pH8.0中洗3次，然后将蛋白重新稀释于同一缓冲液中。5.在实验2中进行免疫沉淀将5μl在体外转录/翻译反应中获得的含有放射性标记的CD14的溶液与1μl含有大约10ng MHC II型分子的溶液混合，并在室温下温育30分钟。然后加入抗体，并将该样品在4℃下温育1小时。加入50μl蛋白A-琼脂糖后再在4℃下温育样品3小时。离心后用#2洗涤缓冲液将沉淀洗2次，接着再用#3洗涤缓冲液洗2次(细胞标记和免疫沉淀试剂盒，Boehringer Mannheim，瑞士)。然后将沉淀溶解于标准SDS-PAGE加样缓冲液中并煮沸，在10％ SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行凝胶电泳，然后进行放射性自显影。6.在实验3中进行免疫沉淀在向与其它实验相同的免疫沉淀样品中加入放射性标记的CD14之前，将含有CD14的溶液与一种抗-CD14抗体混合物一起在室温下温育10分钟。所述混合物含有以下抗-CD14抗体各10μgRMO 52(Immunotech，瑞士)；LeuM3(Beckton & Dickinson，瑞士)；MY4(Coulter，瑞士)；Tuk4(Dako，瑞士)；和100μl下列抗-CD14杂交瘤的上清液3C10，63D3(均获自ATCC)。作为对照，将PBS以与抗体混合物相同的体积加至5μl含有放射性标记的CD14的溶液中。
用于免疫沉淀的抗体为MY4(抗-CD14)和L243(抗-MHCII)。结果实验1用来自MHC II型阳性和MHC II型阴性细胞的裂解物验证MHC II型分子与CD14的共沉降该实验的结果如图5所示。图的左侧示出的是用来自用MHC II型转染(即用MHC II型的α、β和i链共转染)的293-细胞的裂解物进行的实验的结果，图的右侧示出的是用MHC II型阴性293野生型细胞的裂解液获得的结果。
泳道1和2中只有微弱的带，可能是由对照抗体抗-CD3分另与放射性CD14(泳道1)和荧光素酶(泳道2)进行非特异沉淀所致。在泳道3和5中相应于放射性标记CD14(CD14*)的带清晰可见；识别MHC II型分子的两种不同抗体(泳道3L243；泳道5IB5)具有(共-)沉淀的CD14*。这些抗-MHC II型抗体的共沉淀作用对CD14是特异性的，因为无显著量的放射性标记的对照蛋白(荧光素酶)被这些抗体共沉淀(泳道4和6)。抗-MHC II型抗体对CD14的共沉淀取决于MHC II型分子的存在，因为在没有MHC II型分子时无由抗-MHC II型抗体产生的沉淀(利用来自MHC II型阴性293细胞的裂解物，泳道7-9)。实验2用通过免疫亲和层析柱纯化的MHC II型分子验证MHC II型分子与CD14的共沉淀结果如图6所示。在图的左侧示出的是在有纯化的MHC II型分子的情况下进行免疫沉淀的结果，图的右侧示出的是在没有纯化的MHC II型分子时进行的实验，即以缓冲液作为阴性对照的结果。
在泳道1和4中仅可见相当于由对照抗体(抗CD3)非特异地沉淀的微弱带。在泳道3中，由于抗-CD14抗体的沉淀作用而出现了一条相当于CD14的带。在泳道2中，相当于CD14的带比泳道3中的带更明显，尽管在该实验中是用抗-MHC II型分子进行沉淀的。在无纯化的MHC II型分子的条件下，CD14能由抗-CD14抗体进行有效沉淀(泳道6)，但由抗-MHC型抗体与CD14进行的共沉淀未超过背景水平(泳道5)。
实验3可以用抗-CD14抗体抑制CD14和MHC II型分子之间的物理相互作用结果如图7所示。泳道1和5表明，抗-CD14抗体MY4能沉淀通过体外转录/翻译产生的放射性标记的CD14，而与有(泳道1)或没有(泳道5)MHC II型分子无关(对照)。在有MHC II型分子的条件下，一种抗-MHC II型抗体即L243能有效沉淀CD14(泳道2)，但在无MHC II型分子的条件下仅相当于背景水平(泳道6)。如果在与含有MHC II分子的细胞裂解物混合之前首先用抗-CD14抗体混合物处理CD14，CD14就不能被抗-MHC II型抗体沉淀。泳道4显示，缓冲液(对照)对于CD14与抗MHC II型抗体的共沉淀无影响。泳道7和8表示的是与在泳道3和4的相同实验中的结果，但该实验是在无MHCII型分子的条件下进行的。例4说明为了证实MHC II在体内激活细胞的作用，使用MHC II型敲除(knock-out)小鼠。如果MHC II参与LPS引起的激活机制，缺乏MHCII的小鼠将不应表现出常见的LPS刺激的生理效果。用同一小鼠的血进行类似的体外实验。方法在进行体内实验时，将100μg LPS(大肠杆菌0111B4，在无菌0.9％NaCl中稀释)静脉注射到野生型C57BL/6和B6-Aa°/Aa°MHC II型敲除小鼠(Hoffmann-La Roche；文献16)。2小时以后，通过无菌操作杀死小鼠并放血。在室温下让血凝固，并以13,000rpm离心5分钟。然后除去血清。通过ELISA(Biosource)测定血清里TNFα的含量，其为吞噬细胞激活的标志。结果如图8所示。
为了进行体外实验，在存在0，0.1，1，10和100ng/ml LPS的条件下温育肝素化的获自野生型MHC II阳性C57 BL/6小鼠(图9中的黑圆点)和B6-Aa°/Aa°敲除小鼠(空心方框)的全血，在所述敲除小鼠中，在定向破坏MHC II型基因Aa1后缺乏MHC II型表达。温育4小时之后通过ELISA(Biosource)测血浆中TNF-α的含量。结果如图9所示。
很明显，在能表达MHC II型分子的小鼠或细胞内TNF-α分泌较多。例5说明以如下方法测定MHC II结合分子和MHCII模拟分子的体内作用。方法对野生型C57B1/6小鼠进行单独称量，并以在预备实验中确定的LD50进行注射。在注射LPS之前，对小鼠做如下预处理第1组可溶性MHC II型分子，剂量范围为1μg-1mg/kg体重；第2组抗-MHC II型抗体，剂量与第1组的相同；以及第3组仅有盐水(对照组)；作为对照的其它三组，分别用可溶性MHC II型、抗MHC II或盐水进行预处理，但此后不用LPS进行刺激。
监测7天的存活率。在开始48小时在正常条件下观察、注意症状。在LPS诱导致死之前将一个亚组的小鼠杀死并放血，通过ELISA测定来自上述小鼠的血清中的TNF-α含量。
结果比较而言，用可溶性MHC II型分子或抗MHC II抗体处理的小鼠组的死亡率和TNF-α在血清中的含量明显降低(结果未显示)。用MHC II型分子或抗-MHC II抗体处理、但不用LPS刺激的对照组与用盐水处理、但不用LPS刺激的小鼠之间无显著差异。参考文献1.Wright，S.D.，Ramos，R.A.，Tobias，P.S.，Ulevitch，R.J.& Mathison，J.C.，Science 249，1431-1433(1990)2.Couturier，C.，Jahns，G.，Kazatchkine，M.D.& HaeffnerCavaillon，N.，Eur.J.Immunol.22，1461-1466(1992)。3.Tsuchiya，M.，等，Int.J.Cancer 26，171-176(1980)4.Bone，R.，Chest 101，802-808(1991)5.Glauser，M.，Zanetti，G.，Baumgartner，J.& Cohen，J.，Lancet 33R，732-736(1991)6.Schumann，R.R.，等，Science 249，1429-1431(1990)7.Frey，E.A.，等，J.Exp.Med.176，1665-1671(1992)8.Haziot，A.，Rong，G.W.，Silver，J.& Goyert，S.M.，J.Immunol.151，1500-1507(1993)9.Haziot，a.，等，J.Immunol.141，547-552(1988)10.Tobias，P.S.& Ulevitch，R.J.，Immunobiology 187，227-232(1993).11.Marrack，P.& Kappler，J.，Science 248，705-711(1990)12.Steimle，V.，Otten，L.A.，Zufferey，M.& Mach，B.，Cell75，135-146(1993)13.Pugin，J.，等，Immunity 1，509(1994)14.Hailmann，E.，等，J.Exp.Med.179，269-277(1994)15.Gorga，J.C.等，J.Biol.Chem.262，16087-16094(1987)16.Kntgen等，International Immunology 5，957-964(1993)
权利要求
1.MHC-II结合分子和/或MHC-II模拟分子，用于干扰用于带有MHC-II的细胞的激化刺激物与细胞结合的MHC-II分子间的相互作用。
2.将MHC-II结合分子和/或MHC-II模拟分子，用于干扰用于吞噬细胞的激活刺激物与细胞结合的MHC-II分子之间的相互作用。
3.MHC-II结合分子和/或MHC-II模拟分子，用于干扰脂多糖(LPS)或与诸如CD14和LBP之类的其它分子组成复合体的LPS和细胞结合的MHC-II分子之间的相互作用。
4.MHC-II结合分子和/或MHC-II模拟分子用于干扰来自革兰氏阳性细菌的产物或由来自革兰氏阳性细菌的产物与诸如CD14分子组成的复合体和细胞结合的MHC-II分子的相互作用。
5.如权利要求1-4中任一项的MHC-II结合分子和/或MHC-II模拟分子，其中所述MHC-II结合分子是一种抗-MHC-II抗体或其片段，或任何由这样的抗体衍生的分子，如人源化的、双特异性的或其它工程分子等。
6.如权利要求1-4中任一项的MHC-II结合分子和/或MHC-II模拟分子，其中所述MHC-II结合分子选自CD14、其片段、其修饰形式或具有MHC-II结合特性的肽。
7.如权利要求1，2，3或4的MHC-II结合分子和/或模拟分子，其中所述MHC-II模拟分子选自可溶性完整MHC-II、MHC-II的一个或几个亚基、完整MHC-II或其亚基的片段、完整MHC-II或其亚基的修饰形式、具有MHC-II或其亚基的LPS或LPS/CD14/LBP复合体结合特性的肽。
8.如权利要求1、2、3、4或7的MHC-II结合分子和/或MHC-II模拟分子，其中所述MHC-II模拟分子与一种载体连接。
9.权利要求1-8中任一项的MHC-II结合分子和/或MHC-II模拟分子，用于预防和/或治疗炎性疾病；败血症性休克；器官移植，如骨髓移植后的移植物抗宿主疾病；移植排斥反应；因烧伤、意外伤害、胰腺感染所造成的人体上的一种或多种器官的炎症反应，如成人呼吸窘迫综合征(ARDS)等；在手术后出现于一种或几种人体器官的炎症反应，如毛细管泄露综合征；发生于人体的一种或几种器官的过敏反应；与自身免疫病相关的一种或几种器官的炎症反应，如红斑狼疮(LE)及其亚型、硬皮病及其亚型、嗜伊红性粒细胞筋膜炎、Sjogren综合征、多肌炎、皮肤肌炎、结节性动脉外膜炎、Wegener’s肉芽肿病、颞动脉炎、风湿性多肌痛等；与类风湿病有关的一种或几种器官的炎症反应，如类风湿性关节炎、少年慢性关节炎、Felty综合征、Caplan综合征、类风湿性脊椎炎(Marie-Strumpell-Bechterew病)、牛皮癣、Reiter综合征、Behcet综合征；与至少部分是因自身免疫机制而引起的疾病有关的一种或几种器官的炎症反应，如糖尿病、Crohn病、溃疡性结肠炎、消化道溃疡、肾炎，如肾小球性肾炎和肾炎，动脉硬化病、多发性硬化、老年性痴呆、甲状腺机能亢进、甲状腺机能低下等；与肿瘤病有关的人体一种或几种器官的炎症反应，如白血病、血细胞肿瘤、癌、纤维瘤、肉瘤、和各种类型的组织细胞增多症；以及病毒病，如AIDS。
10.MHC-II结合分子。
11.MHC-II模拟分子。
12.含有作为活性成分的MHC-II结合分子和/或MHC-II模拟分子及一种合适的赋形剂的药物组合物。
13.将MHC-II结合分子和/或MHC-II模拟分子用于制备一种用来干扰带有MHC-II的细胞的激活刺激物与细胞结合的MHC-II分子之间的相互作用的药物组合物的用途。
14.将MHC-II结合分子和/或MHC-II模拟分子用于制备一种用来干扰吞噬细胞的激活刺激物与细胞结合的MHC-II分子之间的相互作用的药物组合物的用途。
15.将MHC-II结合分子和/或MHC-II模拟分子用于制备一种用来干扰脂多糖(LPS)或与诸如CD14和LBP的其它分子形成复合体的LPS和细胞结合的MHC-II分子之间的相互作用的药物组合物的用途。
16.将MHC-II结合和/或MHC-II模拟分子用于制备一种用来干扰来自革兰氏阳性细菌的产物或由来自革兰氏阳性细菌的产物与诸如CD14的其它分子形成的复合体和细胞结合的MHC-II分子之间的相互作用的药物组合物的用途。
全文摘要
本发明涉及MHC－II结合和/或MHCII模拟分子,可将其用于干扰用于带有MHC－II的细胞,如吞噬细胞的激活刺激物与细胞结合的MHC－II分子之间的互作,脂多糖(LPS)或与其它诸如CD14和LBP的分子组成复合体的LPS与细胞结合的MHC－II分子之间的互作,来自革兰氏阳性细菌的产物或来自革兰氏阳性细菌的产物与诸如CD14的分子组成的复合体同细胞结合的MHC－II分子之间的相互作用。MHC－II结合分子可以是任何抗MHC－II抗体或其片段,或任何由上述抗体衍生的分子,如人源化分子、双特异性分子或其它工程分子等。MHC－II结合分子可选自CD14、其片段、其修饰形式或具有MHC－II结合特性的肽。
文档编号C07K14/705GK1171117SQ95196985
公开日1998年1月21日 申请日期1995年12月27日 优先权日1994年12月23日
发明者R·P·拉恩尔 申请人:实验室奥姆公司, 德意志奥姆药物股份有限公司