Bcma和cd3的结合分子的制作方法
【专利摘要】本发明涉及包含第一和第二结合结构域的至少双特异性的结合分子，其中第一结合结构域能够结合至BCMA的表位簇，且第二结合结构域能够结合至T细胞CD3受体复合物。此外，本发明提供编码所述结合分子的核酸序列，包含所述核酸序列的载体以及用所述载体转化或转染的宿主细胞。更进一步地，本发明提供用于生产本发明所述结合分子的方法，所述结合分子的医学用途以及包含所述结合分子的试剂盒。
【专利说明】BCMA和CD3的结合分子
【背景技术】
[0001]BCMA(B-细胞成熟抗原，TNFRSF17, CD269)是一种属于TNF受体超家族的跨膜蛋白。BCMA最初报道为人成熟B淋巴细胞的高尔基体内的整合膜蛋白，即，作为细胞内蛋白(Gras 等,(1995) Internat1nal Tmmunol 7 (7):1093-1105),其表明 BCMA 看起来在 B-细胞发育和稳态中具有重要作用。Gras等的发现可能与这样的事实有关，即Gras等描述的BCMA蛋白由于染色体易位是一种BCMA与IL-2之间的融合蛋白。同时，由于其与也称为TALL-1或TNFSF13B的配体BAFF (B细胞活化因子)和APRIL (增殖诱导配体)推测的必须相互作用，BCMA也被设定为对B-细胞的发育和稳态所必须的B-细胞标记物(Schliemann等，(2001) Science293 (5537):2111-2114)。
[0002]BCMA的表达限于B-细胞谱系且主要存在于浆细胞和浆母细胞上，并在一定程度上存在于记忆B-细胞上，但是实际上不存在于外周和纯真B-细胞上。BCMA也在多发性骨髓瘤(MM)细胞上表达。BCMA与其家族成员跨膜激活剂及亲环蛋白配体作用因子(TACI)和TNF家族受体(BAFF-R)的B细胞活化因子一起调节体液免疫、B-细胞发育和稳态的不同方面。BCMA的表达出现在B-细胞分化作用的较后期并有利于浆母细胞和浆细胞在骨髓中的长期存活。小鼠中BCMA基因的靶向缺失不会影响成熟B-细胞的产生、体液免疫应答的质量和幅度、生发中心的形成以及短暂寿命的浆细胞的生成。然而，这种小鼠骨髓中长寿命浆细胞的数量显著降低，这表明了 BCMA对其存活的重要性(O’ Connor等，2004)。
[0003]根据这一发现，BCMA也支持多发性骨髓瘤(MM)细胞的生长和存活。Novak等发现MM细胞系和最新分离的MM细胞在其细胞表面表达BCMA和TACI蛋白并且在其细胞表面具有 BAFF-R 蛋白的可变表达(Novak 等，(2004) Bloodl03 (2):689-694)。
[0004]多发性骨髓瘤(MM)是第二大常见恶性血液病且其占所有癌症死亡例的2%。MM是一种异质性疾病并且多数是由t (11 ;14)、t(4 ;14)、t(8 ;14)、del (13)、del (17)(除其他外)的染色体易位引起的(Drach 等，(1998)Blood92(3):802-809 ;Gertz 等，(2005)Bloodl06(8):2837-2840 ;Facon 等:，(2001) Blood97 (6):1566-1571) ? MM 受累患者可能经历因骨髓浸润、骨质破坏、肾衰竭、免疫缺陷以及癌症诊断的心理负担而经历多种与疾病相关的症状。截至2006年，丽的5年相对生存率约为34%，这表明丽是一种至今无治愈先例的难以治疗的疾病。
[0005]令人振奋的新疗法，如化疗和干细胞移植的方法，已可供使用并且其能提高生存率，但是常常伴有有害的副作用，因此MM仍然难以治疗(Lee等，(2004) J Natl Compr CaneNetwS (4) =379-383)。迄今为止，对于多发性骨髓瘤患者而言两种最常用的治疗选择是类固醇、沙利度胺、来那度胺、硼替佐米或多种细胞毒素试剂的组合，和对于较年轻的患者采用高剂量化疗理念配合自体干细胞移植。
[0006]多数的移植为自体型，即使用患者自身的细胞。这种移植，尽管不具有治愈性，但其显示延长选定患者的生命。其可在新诊断的患者中作为初始疗法或在复发时进行。有时为了适当的控制疾病，可能会建议选定患者采用一种以上的移植。
[0007]用于治疗该疾病的化疗试剂是环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和美法仑，与免疫调节剂如沙利度胺(Thalomid? )、来那度胺(Revlimid? )、硼替佐米(Velcade? )和皮质类固醇(如地塞米松)的组合疗法已经成为用于治疗新确诊患者和化疗或移植均失败的疾病晚期患者中骨髓瘤的重要选择。
[0008]目前所用疗法是通常非治愈性的。因为高龄、其它严重疾病的存在或其它身体上的限制，干细胞移植可能不是用于多数患者的选择。化疗仅能部分控制多发性骨髓瘤，且极少达到完全缓解。因此，迫切需要新的创新疗法。
[0009]Bellucci等(Blood, 2005 ；105(10))在已接受供者淋巴细胞输注(DLI)的多发性骨髓瘤患者中鉴别出了 BCMA-特异性抗体。这些患者的血清能够介导由ADCC和CDC对BCMA-特异性细胞裂解并且仅在具有抗肿瘤应答的患者中检测到(4/9)，而未在非应答患者中检测到(0/6)。作者推测，BCMA-特异性抗体的诱导作用有利于骨髓瘤细胞的消除和患者的长期缓解。
[0010]Ryan 等(Mo1.Cancer Ther.2007 ；6 (11))报道了一种拮抗型 BCMA-特异性抗体的产生，其阻止与在正常和恶性B-细胞中强效促存活信号转导通路有关的NF- K B活化。另外，该抗体在体外给多发性骨髓瘤细胞系赋予强效的抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)，这由Fe-工程化显著增强。
[0011]在对抗血源性肿瘤或自身免疫性障碍方面的其它方法专注于BAFF和APRIL(即TNF配体超家族的配体)与其由BAFF和/或APRIL活化的受体TAC1、BAFF_R和BCMA之间的相互作用。例如，通过将人免疫球蛋白的Fe-结构域与Zymogenetics公司的TACI融合产生了阿塞西普(TAC1-1g)，来中和这两种配体并阻止受体的活化。阿塞西普目前正处于用于治疗系统性红斑狼疮(SLE，第III期)多发性硬化症(MS，第II期)及类风湿性关节炎(RA，第II期)的临床试验中，以及处于用于治疗B细胞恶性肿瘤慢性淋巴细胞白血病(CLL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)及丽的第I期临床试验中。在临床前研究中，阿塞西普在体外(Moreaux 等，Blood, 2004,103)和体内(Yaccoby 等，Leukemia, 2008, 22,406-13)降低了初始丽细胞和丽细胞系的生长和存活，这表明了 TACI配体对于丽细胞的相关性。由于多数MM细胞及其衍生的细胞系都表达BCMA和TACI，两者的受体可能有利于配体介导的生长与存活。这些数据表明，对BCMA和TACI的拮抗作用可能有益于浆细胞障碍的治疗。另外，已经描述了与TACI交叉反应的BCMA-特异性抗体(W002/066516)。
[0012]人类基因组科学公司和葛兰素史克已经开发出一种称为贝利木单抗的靶向BAFF的抗体。贝利木单抗阻断可溶性BAFF与其受体BAFF-R、BCMA及TACI在B细胞上的结合。贝利木单抗不直接结合B细胞，但是通过结合BAFF，贝利木单抗抑制包括自体反应性B细胞的B细胞的存活，并减少B细胞分化为产生免疫球蛋白的浆细胞。
[0013]然而，尽管存在BCMA、BAFF-R和TACI (即属于TNF受体超家族的B细胞受体)及其配体BAFF和APRIL服从在对抗癌症和/或自身免疫性障碍中的治疗方案这一事实，仍然需要据哟用于治疗这种医学病症的其它可用选择。
【发明内容】
[0014]因此，本文提供了一种结合分子形式的用于解决这一问题的手段和方法，该结合分子为至少双特异性的，具有一个与细胞毒性细胞(即细胞毒性T细胞)结合的结合结构域和与BCMA结合的第二结合结构域。
[0015]需要注意的是，除非本文另有明确说明，本文所用单数形式“一种”、“一个”和“该”包含所提及的复数形式。因而，例如，提到“一种试剂”包括此类不同试剂的一种或多种，及提到“该方法”包括提到本领域普通技术人员已知的能够修饰或取代本文所述方法的等同步骤和方法。
[0016]除非本文另有说明，一系列要素前的术语“至少”应理解为是指这一系列的每个要素。本领域技术人员采用不超出常规实验即能认识到或确定许多与本文描述的本发明具体实施方案的等同情况。本发明旨在涵盖这些等同情况。
[0017]本文所用术语“和/或”包括“和”、“或”及“所述术语连接的要素的所有或任意其它组合”的含义。
[0018]本文所用术语“大约”或“接近”表示在给出值或范围的±20%内，优选在±15%内，更优选在± 10 %内，最优选在± 5 %内。
[0019]在本文整个说明书及以下的权利要求书中，除非上下文另有所指，词语“包含(comprise) ”及其变形如“包含(comprises) ”和“包含(comprising) ”应理解为意指包括所述整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任意其它整数或步骤或者整数或步骤的组。本文所用术语“包含”又可用术语“含有”或“包括”替代，或本文所用术语有时可用术语“具有”替代。
[0020]本文所用“由...组成”排除未在要求保护的要素中具体提到的任一要素、步骤或成分。当本文使用“基本上由...:组成”时不排除对权利要求的基本和新特征没有重大影响的材料或步骤。
[0021]在本文每个实例中任一术语“包含”、“基本上由...组成”和“由...组成”可用其它二词中任一取代。
[0022]
【发明内容】
[0023]表位簇1、2、3、4、5、6、7由BCMA的胞外结构域组成。“BCMA的胞外结构域”或“BCMAECD”是指基本上不含BCMA跨膜结构域及胞质结构域的BCMA的一种形式。技术人员可以理解，鉴定的本发明所述BCMA多肽的跨膜结构域是根据本领域用于识别这种疏水结构域的常规采用标准进行鉴别的。跨膜结构域的精确边界可以变化，但最可能在本文具体提及的结构域的任一末端处变化不超过约5个氨基酸。优选的BCMA E⑶示于SEQ ID NO:1007o一种优选的鼠ECD示于SEQ ID NO:1008o
[0024]表位簇I对应于人BCMA胞外结构域(SEQ ID NO:1007)的氨基酸I至7，表位簇2对应于人BCMA胞外结构域(SFQ ID NO:1007)的氨基酸8至21，表位簇3对应于人BCMA胞外结构域(SEQ ID NO:1007)的氨基酸24至41，表位簇4对应于人BCMA胞外结构域(SEQID NO:1007)的氨基酸42至54，表位簇5对应于人BCMA胞外结构域(SEQ ID NO:1007)氨基酸22，表位簇6对应于人BCMA胞外结构域(SEQ ID NO:1007)的氨基酸25，表位簇7对应于人BCMA胞外结构域(SEQ ID NO:1007)的氨基酸39。设想到表位簇5至7代表单一氨基酸置换。
[0025]T细胞CD3受体复合物是一种蛋白质复合物，由四个不同的链组成。在哺乳动物中，该复合物包含一个⑶3 Y链、一个⑶3 δ链及两个⑶3 ε (epsilon)链。这些链与称为T细胞受体(TCR)的分子和ζ链结合从而在T淋巴细胞中产生活化信号。
[0026] 由双特异性分子通过募集T细胞导致的靶细胞的重新定向裂解涉及溶细胞突触的形成和穿孔素及颗粒酶的传递。参与的T细胞能够进行连续的靶细胞裂解，且不会受到干扰肽抗原处理及传递的免疫逃逸机制或克隆T细胞分化的影响；参见，例如，W02007/042261。
[0027]从本公开的意义上说，术语“结合分子”表示能够(特异性地)与靶分子BCMA和CD3结合、相互作用或识别的任意分子。根据本发明所述，优选的结合分子是多肽。该种多肽可包括蛋白质性部分和非蛋白质性部分(如化学连接物或化学交联剂，如戊二醛)。
[0028]如此说来，结合分子为所述一种或多种结合结构域提供了支架，从而使所述结合结构域能与靶分子BCMA和CD3结合/相互作用。例如，这种支架可以由蛋白质A提供，特别是其Z-结构域(亲和体)、I_E7 (免疫蛋白)、BPTI/APPI (库尼茨结构域)、Ras-结合蛋白AF-6 (PDZ-结构域)、卡律布德蝎毒素(蝎毒素)、CTLA-4、Min-23 (打结素)、脂质运载蛋白(anticalin)、新制癌菌素、纤连蛋白结构域、锚蛋白共有重复结构域或硫氧还原蛋白(Skerra, Curr.0pin.B1technol.18,295-304 (2005) ；Hosse 等，Protein Sc1.15,14-27(2006) ；Nicaise 等，Protein Sc1:13，1882-1891 (2004) ；Nygren 和 Uhlen, Curr.0pin.Struc.B1l.7，463-469 (1997))。优选的结合分子是抗体。
[0029]也可以设想到本发明所述结合分子除其与靶分子BCMA和CD3结合的功能外还具有其它功能。在这种情况下，结合分子是三-或多功能结合分子，其通过与BCMA结合靶向浆细胞，通过CD3结合介导细胞毒性T细胞的活性并提供进一步的功能，如通过募集效应细胞如NK细胞来介导抗体-依赖的细胞毒性的功能完整的Fe恒定结构域、标记(荧光等)、治疗剂如毒素或放射性核素和/或增强血清半衰期的方式等。
[0030]本文所用术语“双特异性”是指包含至少第一和第二结合结构域的结合分子，其中第一结合结构域能够结合至一个抗原或靶标，第二结合结构域能够结合至另一抗原或靶标。本发明所述“结合分子”也包含多特异性结合分子，如三特异性结合分子，后者包含三个结合结构域。
[0031]设想到，结合分子由噬菌体展示或文库筛选方法产生(或可得到)，而不是通过将CDR序列从预先存在的(单克隆)抗体嫁接到支架中，所述支架例如本文所公开的支架。
[0032]术语“结合结构域”与本发明联合表征这样的结构域，该结构域能够特异性与靶分子BCMA和CD3上给定的靶表位或给定靶位点结合/相互作用。
[0033]结合结构域可源自结合结构域供体，如抗体、蛋白质A、ImmE7(免疫蛋白)、BPTI/APPI (库尼茨结构域)、Ras-结合蛋白AF-6(PDZ-结构域)、卡律布德蝎毒素(蝎毒素)、CTLA-4、Min-23 (打结素)、脂质运载蛋白(anticalin)、新制癌菌素、纤连蛋白域、锚蛋白共有重复结构域或硫氧还原蛋白(Skerra, Curr.0pin.B1technol.18, 295-304 (2005)；Hosse 等，Protein Sc1.15，14-27 (2006) ;Nicaise 等，Protein Sc1.13，1882-1891 (2004)；Nygren 和 Uhlen, Curr.0pin.Struc.B1l.7,463-469 (1997))。优选的结合结构域源自抗体。设想到，本发明所述结合结构域包括至少前述结合结构域的任一的所述部分，要求该部分与靶分子BCMA和CD3上给定的靶表位或给定靶位点结合/相互作用。
[0034]设想到，前述结合结构域供体的结合结构域以这些供体的这一部分为特征，该部分负责结合相应的靶标，即当这一部分从结合结构域供体移除时，所述供体就失去了其结合能力。“失去”是指与结合供体相比结合能力至少下降50%。绘制这些结合位点的图谱的方法为本领域熟知的——因此，其在本领域技术人员定位/绘制结合结构域供体的结合位点且由此从相应的结合结构域供体“衍生”出所述结合结构域的标准知识范围内。
[0035]术语“表位”是指与结合结构域特异性结合的抗原上的位点，如抗体或免疫球蛋白或者抗体或免疫球蛋白的衍生物或片段。“表位”为抗原性的，因此本文所述术语表位有时也指“抗原性结构”或“抗原决定簇”。因此，所述结合结构域为“抗原-相互作用-位点”。所述结合/相互作用也可理解为定义“特异性识别”。在一个实例中，所述与靶分子BCMA和CD3上给定的靶表位或给定靶位点(特异性)结合/相互作用的结合结构域是抗体或免疫球蛋白，且所述结合结构域为抗体或免疫球蛋白的VH和/或VL区。“表位”既可由邻接氨基酸也可由通过蛋白质的三级折叠而并列的非邻接氨基酸形成。
[0036]“线性表位”是其中氨基酸一级序列含有识别表位的表位。在一个特定的序列中，线性表位通常包括至少3个或至少4个、更通常至少5个或6个或至少7个、例如约8个至约10个氨基酸。
[0037]与线性表位相比，“构象表位”是这样的表位，其中包含所述表位的氨基酸一级序列不是识别的表位的唯一定义部件(如，其中氨基酸的一级序列不一定被结合结构域识别的表位)。典型的构象表位相对于线性表位包含数量增加的氨基酸。关于构象表位的识别，所述结合结构域识别抗原、优选肽或蛋白质或其片段的三维结构(在本发明的上下文中，任一结合结构域的抗原包含在BCMA蛋白内)。例如，当蛋白分子折叠形成三维结构时，形成构象表位的某些氨基酸和/或多肽骨架成为并列形式，从而使该抗体能够识别所述表位。确定表位构象的方法包括、但不限于，X-射线晶体学、二维核磁共振(2D-NMR)谱和定点自旋标记法及电子顺磁共振(EPR)光谱。另外，本文提供的实例描述了检测给定结合结构域是否与给定蛋白、特别是BCMA的一个或多个表位簇结合的进一步的方法。
[0038]本文所用术语“表位簇”表示位于抗原的限定邻接部分中的表位的整体。表位簇可以包含一个、两个或更多个表位。在本文中本发明所定义的在BCMA的胞外结构域中的表位簇如上所述并示于表1。
[0039]术语“(能够)与...结合”、“特异性识别”、“指向”和“与...相互作用”是指与依照本发明所述结合结构域能够特异性与表位的一个或多个、优选至少两个、更优选至少三个且最优选至少四个氨基酸结合。
[0040]本文所用术语“特异性相互作用”、“特异性结合”或“特异性的结合”是指结合结构域对特定蛋白或抗原表现出可估量的亲和性，并且通常不会对除BCMA或CD3之外的蛋白质或抗原表现出显著的反应性。“可估量的亲和性”包括以约10_6M(KD)或更强的亲和性结合。优选地，当结合亲和性为约ΙΟ-12至1H2至1H2至10-10Μ、Kr11至10、、优选为约10_n至10_9M时，所述结合被认为是特异性的。尤其是通过将所述结合结构域与靶蛋白或抗原的反应与所述结合结构域与除BCMA或CD3之外的蛋白质或抗原的反应进行比较，可以测定结合结构域是否特异性与靶标反应或结合。优选地，本发明所述结合结构域基本上不结合或不能够结合除BCMA或CD3以外的蛋白质或抗原(即，第一结合结构域不能与BCMA以外的蛋白质结合且第二结合结构域不能与CD3以外的蛋白质结合)。
[0041]人们认为特异性结合受到结合结构域和抗原的氨基酸序列中的特异性基序的影响。因此，结合的发生是由于其一级、二级和/或三级结构以及所述结构的二级修饰的结果。抗原-相互作用-位点与其特异性抗原之间的特异性相互作用可能导致所述位点与抗原的简单结合。另外，作为另外一种选择或除此之外，抗原-相互作用-位点与其特异性抗原的特异性相互作用可能导致信号的启动，如由于抗原构象的改变、抗原寡聚化等的诱导坐寸O
[0042]术语“基本上不结合”或“不能够结合”是指本发明所述结合结构域不结合除BCMA或CD3之外的另一蛋白质或抗原，即当与BCMA或CD3的结合分别设定为100%时，该结合结构域与除BCMA或CD3以外的蛋白或抗原表现出的反应性不超过30%，优选不超过20%，更优选不超过10%，特别优选不超过9%、8%、7%、6%或5%。
[0043]“蛋白质”(包含其片段，优选生物活性片段，以及通常具有少于30个氨基酸的肽)包含通过共价肽键彼此相连的一个或多个氨基酸(从而产生一个氨基酸链)。本文所用术语“多肽”描述了一组由超过30个氨基酸组成的分子。多肽可更进一步形成多聚体如二聚体、三聚体及更高的低聚体，即由多于一个多肽分子组成。形成此类二聚体或三聚体等的多肽分子可以相同或不同。这种多聚体对应的较高阶结构因此称为同源二聚体或异源二聚体，同源三聚体或异源三聚体等。一个异源多聚体的实例是抗体分子，在其天然存在的形式中由两个相同的轻多肽链和两个相同的重多肽链组成。术语“多肽”和“蛋白质”也指经天然修饰的多肽/蛋白，其中所述修饰由如蛋白质翻译后修饰(如糖基化、乙酰化、磷酸化等)产生。本文所提到的“多肽”也可以经化学修饰，如经聚乙二醇化。这些修饰是本领域熟知的。
[0044]术语“氨基酸”或“氨基酸残基”通常指具有其本领域公知定义的氨基酸，如选自以下的氨基酸:丙氨酸(Ala或A);精氨酸(Arg或R);天冬酰胺(Asn或N);天冬氨酸(Asp或D);半胱氨酸(Cys或C);谷氨酰胺(Gln或Q);谷氨酸(Glu或E);甘氨酸(Gly或G);组氨酸(His或H);异亮氨酸(He或I);亮氨酸(Leu或L);赖氨酸(Lys或K);甲硫氨酸(Met或Μ);苯丙氨酸(Phe或F) ;脯氨酸(Pro或P);丝氨酸(Ser或S);苏氨酸(Thr或T);色氨酸(Trp或W);酪氨酸(Tyr或Y);及缬氨酸(Val或V)，尽管可以根据需要使用修饰、合成或罕见的氨基酸。通常，可以根据所具有的非极性侧链(如Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、Val);具有负电荷的侧链(如Asp、Glu);具有正电荷的侧链(如Arg、His、Lys)或不带电荷的极性侧链(如 Asn、Cys> Gin、Gly、His、Met、Phe> Ser、Thr、Trp 和 Tyr)将氨基酸分组。
[0045]术语“抗体”的定义包括如单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体及人抗体的实施方案。除全长抗体之外，该定义还包括抗体衍生物及抗体片段，尤其是Fab片段。抗体片段或衍生物进一步包括F (ab' )2、Fv、scFv片段或单结构域抗体如结构域抗体或纳米抗体、包含可能为VHH、VH或VL的仅一个可变结构域的单可变结构域抗体或免疫球蛋白单可变结构域，其独立于其它V区或结构域特异性结合抗原或表位；参见，例如Harlow和Lane (1988)和(1999),上述引文;Kontermann 和 Diibel, Antibody Engineering, Springer,2nd ed.2010and Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, CambridgeUniversity Press2009。所述术语也包括双链抗体或双亲和性再祀向(DART)抗体。进一步设想到(双特异性)单链双链抗体、串联双链抗体(Tandab’ s)、由如下所列结构示例的“微抗体”:(VH-VL-CH3)2、(scFv-CH3)2 或(scFv-CH3_scFv)2 ;“Fc DART 抗体”及“IgG DART”抗体；及多链抗体如三链抗体。
[0046]免疫球蛋白单可变结构域不仅包括分离的抗体单可变结构域多肽，而且还包括较大多肽，该种多肽含有抗体单可变结构域多肽序列的一个或多个单体。
[0047]免疫球蛋白单可变结构域不仅包括分离的抗体单可变结构域多肽，而且还包括较大多肽，该种多肽含有抗体单可变结构域多肽序列的一个或多个单体。
[0048]本领域已知可以用于这种抗体和/或其片段的生产的各种方法。因此，可以通过模拟肽生产(抗体)衍生物。另外，所述用于生产单链抗体的技术(尤其参见美国专利 4，946，778，Kontermann 和 Dubel (2010)，上述引文和 Little (2009)，上述引文)可以适用于生产对所选定的多肽具有特异性的单链抗体。此外，转基因动物可用于表达对本发明的多肽和融合蛋白具有特异性的人源化抗体。对于单克隆抗体的制备，可以采用提供通过连续细胞系培养生产的抗体的任何技术。此类技术的实例包括杂交瘤技术(K0hler和Milstein Nature256 (1975)，495-497)、三源杂交瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor，Immunology Today4 (1983), 72)及用于生产人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, Inc.(1985), 77-96)。可以使用BIAcore系统中的表面等离子体共振来增加噬菌体抗体与靶多肽(例如CD3 ε )的表位结合的效率(Schier, Human Antibodies Hybridomas7 (1996) ,97-105 ；Malmborg,J.1mmunol.Methodsl83 (1995)，7-13)。另外设想到在本发明的上下文中，术语“抗体”包含可以在下文所述宿主中表达的抗体构建体，如可以通过特别是病毒或质粒载体转染和/或转导的抗体构建体。
[0049]另外，本文所用术语“抗体”也涉及本文描述的与所述抗体具有相同特异性的所述抗体的衍生物或变体。“抗体变体”的实例包括非人抗体的人源化变体、“亲和性成熟的”抗体(参见例如 Hawkins 等.J.Mol.B1l.254,889-896 (1992)和 Lowman 等，B1chemistry30,10832-10837(1991))和效应功能改变的抗体突变体(参见例如美国专利5，648，260，Kontermann 和 Diibel (2010)，上述引文和 Little (2009)，上述引文)。
[0050]一种制备抗体的示例性方法包括蛋白质表达文库(如噬菌体或核糖体展示文库)的筛选。噬菌体展示描述于如Ladner等美国专利N0.5，223，409 ；Smith (1985) Science228:1315-1317 ；Clackson 等(1991)Nature, 352:624-628 中。
[0051] 除了展示文库的使用，所述指定抗原可用于免疫接种非人动物，如啮齿类动物，如鼠、仓鼠或大鼠。在一个实施例中，所述非人动物包含人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如，可采用人Ig基因座的大片段对在小鼠抗体生产方面具有缺陷的小鼠品系进行基因工程。使用杂交瘤技术，可以生产和筛选源自具有期望特异性的基因的抗原-特异性单克隆抗体。参见例如 XEN0M0USE?、Green 等.(1994) Nature Genetics7:13-21、US2003-0070185、W096/34096 和 W096/33735。
[0052]抗体或其片段还可以通过特异性缺失人T细胞表位或通过描述于W098/52976和W000/34317中的方法“去免疫化”来修饰。简言之，可以针对结合MHC-1I类的肽，分析抗体重链和轻链的可变结构域；这些肽表示潜在T细胞表位(如W098/52976和W000/34317中所定义)。对于潜在T细胞表位的测定，可以应用一种称为“肽线程”的计算机建模方法，另外可以在人MHC-1I类结合肽的数据库中搜索存在于VH和VL序列中的基序，如W098/52976和TO00/34317中所描述。这些基序结合至任一 18种主要的MHC-1I类DR同种抗免疫球蛋白，从而构成潜在T细胞表位。可以通过置换可变结构域中的少量氨基酸残基，或优选通过单一氨基酸置换来去除检测到的潜在T-细胞表位。典型地，进行保守型置换。通常可使用与人生殖细胞系抗体序列中的位置所共有的氨基酸，但不限于此。如描述于Tomlinson等(1992) J.Mol.B1l.227:776-798 ;Cook，G.P.等(1995) Immunol.Today Vol.16(5):237-242 ;和 Tomlinson 等(1995)EMBO J.14:14:4628-4638 中的人生殖细胞系序列。VBASE目录提供人免疫球蛋白可变区序列的详尽目录(由Tomlinson,LA等MRC Centre forProtein Engineering, Cambridge, UK编汇)。这些序列可用作人序列的来源,如提供框架区及用于⑶R。也可以使用共有的人框架区，如美国专利N0.6，300, 064中所述。
[0053]VH和VL的成对一起形成单一抗体结合位点。最接近VH的CH结构域称为CHl。每个L链通过一个共价二硫键连接至H链，而基于H链同工型，两个H链通过一个或多个二硫键相互结合。VH和VL结构域由被称为框架区的相对保守的四个区(FR1、FR2、FR3和FR4)组成，其形成高变序列的三个区(互补决定区即OTR)的支架。所述⑶R包含负责抗体与抗原特异性相互作用的大多数残基。⑶R称为⑶RU⑶R2和⑶R3。因此，重链上的⑶R组分称为H1、H2及H3，而轻链上的⑶R组分称为L1、L2及L3。
[0054]术语“可变的”是指免疫球蛋白结构域的在其序列中表现出变异性的且涉及决定特定抗体的特异性和结合亲和性的部分(即，“可变结构域”)。变异性并非均匀分布于抗体的整个可变结构域；其集中在重链及轻链可变区的子结构域中。
[0055]这些子结构域被称为“高变”区或“互补决定区” (OTR)。可变结构域的较保守(即非高变的)部分被称为“框架”区(FRM)。天然存在的重链和轻链的可变结构域各自包含四个FRM区，所述四个FRM区大多采用β-折叠结构，其由三个高变区连接形成环状连接，并且在某些情况下形成β折叠结构的部分。FRM使得每条链的高变区与其它链的高变区靠近在一起，从而有助于抗原-结合位点的形成(参见Kabat等，上述引文)。恒定结构域并不直接涉及于抗原结合，但表现出多种效应物功能，如，例如抗体-依赖性的、细胞-介导的细胞毒性及补体活化。
[0056]本文所用术语“高变区”(也被称为“互补决定区”或⑶R)是指位于免疫球蛋白的V-区结构域(通常是具有极端序列变异性的三个或四个短区)的抗体的氨基酸残基，所述氨基酸残基形成抗原-结合位点并是抗原特异性的主要决定因素。至少有两种方法来鉴别CDR残基:(I)基于跨物种序列变异性的方法(即Kabat等，上述引文);和(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Chothia，C:等，J.Mol.B1l.196:901-917 (1987))。然而，就两个残基鉴别技术界定重叠区而非相同区而言，可将其组合以定义杂合CDR。但是，一般而言，所述CDR残基的鉴别优选根据所谓的Kabat (编号)系统进行。
[0057]本文所用术语“抗原-结合结构域”、“抗原-结合片段”及“抗体结合区”是指抗体分子的一部分，该部分包含负责抗体与抗原之间特异性结合的氨基酸。被抗体特异性识别和结合的抗原的一部分称为本文上述的“表位”。如上所述，抗原-结合结构域可以典型地包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH);但是其不必同时包含两个可变区。例如，Fd片段具有两个VH区，其常常保留完整抗原-结合结构域的某个抗原-结合功能。抗体的抗原-结合片段的实例包括(I) Fab片段，其是一种具有VL、VH、CL及CHl结构域的单价片段；(2)F(ab' )2片段，其为具有由在绞链区的二硫键连接的两个Fab片段的一种二价片段；(3) Fd片段，其具有两个VH和CHl结构域；(4) Fv片段，其具有抗体单臂的VL和VH结构域；(5)dAb片段(Ward等，(1989)Nature341:544-546)，其具有VH域；(6)分离的互补决定区(CDR)，及(7)单链FV(scFv)，优选为后者(例如源自scFV文库)。尽管Fv片段的两个结构域即VL和VH是由独立的基因编码的，但是使用重组的方法可以将其连接，通过合成的连接子能够使它们成为单一蛋白链，该蛋白链中的VL和VH区成对形成单价分子(称为单链 Fv(scFv);参见例如 Huston 等.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85:5879-5883)。这些抗体片段采用本领域技术人员已知的常规技术得到，并且根据与完整抗体相同的方法来评估这些片段的功能。
[0058]本文所用术语“单克隆抗体”是指从基本上为均质性抗体的群中得到的一种抗体，即，除去可能少量存在的可能天然发生的突变和/或翻译后修饰(如异构化、酰胺化)，组成该群的单个抗体是相同的。单克隆抗体具有高度特异性的，其针对单一的抗原位点。另外，与典型地包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除其特异性之外，单克隆抗体的优点在于其通过杂交瘤培养合成，从而未被其它免疫球蛋白污染。修饰词“单克隆”是指从基本上为均质性抗体的群中得到的抗体的特性，而不应当解释为要求通过任何特定的方法来生产抗体。例如，依据本发明所使用的单克隆抗体可以首先通过描述于Kohler等，Nature, 256:495(1975)中的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法制备(参见例如美国专利N0.4，816，567)。例如，所述“单克隆抗体”还可采用Clackson等,Nature, 352:624-628 (1991)和Marks等，J.Mol.B1l.,222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。
[0059]本发明的单克隆抗体具体地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其重链和/轻链的部分与源自特定物种或属于特定抗体类型或亚类的抗体的相应序列是相同的或是同源的，而其链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类型或亚类的抗体的相应序列是相同的或是同源的，以及这种抗体的片段，只要其能表现出期望的生物活性即可(美国专利N0.4，816，567 ；Morrison 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 81:6851-6855 (1984))。本文感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类动物化”抗体，该抗体包含源自非人灵长动物类(如旧世界猴、猿(Ape)等)和人恒定区序列的可变结构域抗原-结合序列。
[0060]单克隆抗体可以从非人动物中获得，然后可使用本领域已知的重组DNA技术生产进行经修饰如人源化、去免疫化、嵌合化的。已经描述了用于制备嵌合抗体的多种方法。参见例如 Morrison 等，Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A.81:6851,1985 ；Takeda 等，Nature314:452，1985，Cabilly 等，美国专利 N0.4，816，567 ；Boss 等，美国专利 N0.4，816，397 ；Tanaguchi 等，EP0171496 ；EP0173494, GB2177096。
[0061]非人(如鼠)抗体的“人源化”形式是大部分人序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体的其它抗原-结合亚序列)，其包含极少数的源自非人免疫球蛋白的序列。多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区(即CDR)的残基被来自如具有所需特异性、亲和性和能力的小鼠、大鼠或兔的非人物种(供体抗体)的高变区的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，本文所用“人源化抗体”可还包括既不存在于受体抗体也不存在于供体抗体中的残基。进行这些修饰是为了进一步改进和优化抗体的性能。所述人源化抗体可选的还包括，免疫球蛋白(特别是人免疫球蛋白)恒定区(Fe)的至少一部分。关于进一步的细节，参见Jones等,Nature, 321:522-525(1986) ；Reichmann等，Nature, 332:323-329(1988);和 Presta,Curr.0p.Struct.B1l.，2:593-596 (1992)。人源化抗体还可使用如转基因小鼠生产，所述小鼠表达人重链和轻链基因，而不能表达内源小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因。Winter描述了一种可以用于制备本文所述人源化抗体的示例性⑶R-移植方法(美国专利N0.5，225，539)。特定人抗体的的所有⑶R都可被非人CDR的至少一部分替代，或仅仅某些CDR可被非人CDR替代。其只需替代人源化抗体与预定抗原结合所需的CDR数目。
[0062]人源化抗体或其片段可以例如通过替代Fv可变结构域的序列来产生，所述Fv可变结构域的序列不直接涉及抗原与来自人Fv可变结构域的等价序列的结合。Morrison(1985)Science229:1202-1207 ;0i 等.(1986)B1Techniques4:214 ;和US5, 585，089 ；US5, 693，761 ；US5, 693，762 ；US5, 859，205 ;和 US6, 407，213 提供了用于生产人源化抗体或其片段的示例性方法。这些方法包括分离、操纵及表达编码来自重链或轻链至少一个的所有或部分免疫球蛋白Fv可变结构域的核酸序列。这种核酸可以从杂交瘤中获得，该杂交瘤产生如上所述的针对预定靶标的抗体，也可从其它来源获得。编码人源化抗体分子的重组DNA随后可被克隆至合适的表达载体中。
[0063]可以通过保守置换、共有序列置换、种系置换和/或回复突变的引入来优化人源化抗体。这类免疫球蛋白分子的改变可以通过本领域已知的数种技术中任一种来实现(如 Teng 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.，80:7308-7312,1983 ；Kozbor 等，ImmunologyToday, 4:7279,1983 ;01sson 等，Meth.Enzymo1.,92:3_16，1982)，并且也可依据 EP239400的教导实现。
[0064]术语“人抗体”包括具有基本上与本领域已知的人生殖细胞系免疫球蛋白序列相应的可变区和恒定区的抗体，包含如由Kabat等(参见Kabat等(1991)上述引文)描述的抗体。本发明的人抗体可包括并非由人生殖细胞系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如在体内通过随机或位点特异性诱变引入或在体内通过体细胞突变引入的突变)，在如CDR中，特别是在CDR3中。 人抗体可具有至少一个、两个、三个、四个、五个或更多个被并非由人生殖细胞系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基替代的位点。
[0065]本文所用“体外产生的抗体”是指可变区(如至少一个⑶R)的全部或部分是在无免疫力的细胞筛选(如体外噬菌体展示、蛋白质芯片或其它任何能够测定候选序列与抗原结合能力的方法)中产生的抗体。因此该术语优选不包括在免疫细胞中由基因组重排产生的序列。
[0066]“双特异性”或“双功能性”抗体或免疫球蛋白是具有两个不同重/轻链对及两个不同结合位点的人工杂交抗体或免疫球蛋白。双特异性抗体可以通过包括杂交瘤的融合技术或Fab’片段连接技术在内的多种方法生产。参见例如Songsivilai&Lachmann, Clin.Exp.1mmunol.79:315-321 (1990)。本领域已知的许多方法可用来得到抗体或其抗原-结合片段。例如可以采用重组DNA法来生产抗体(美国专利N0.4，816，567)。根据已知的方法单克隆抗体也可以通过杂交瘤的产生来生产(参见例如Kohler和Milstein(1975)Nature,256:495-499)。以这种方式形成的杂交瘤之后通过标准方法(如酶联免疫吸附测定(ELISA)和表面等离子共振(BIAC0RE?)分析法)进行筛选，从而识别一个或多个杂交瘤，所述杂交瘤产生与指定抗原特异性结合的抗体。所述指定抗原的任一形式都能用作免疫原，如重组抗原、天然存在的形式、任一变体或其片段以及其抗原肽。
[0067]术语“⑶R”及其复数形式“⑶Rs”，是指互补决定区(OTR)，其中三个构成轻链可变区的结合特性(⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3)，三个构成重链可变区的结合特性(OTRHUDRffi和CDRH3)。CDR有助于抗体分子的功能活性并被构成骨架或框架区的氨基酸序列分隔。确切定义上的CDR的边界及长度受到不同分类和编号系统的影响。因此，所述CDR可以参考Kabat, Chothia、接触或其他任何边界的定义，包括本文描述的编号系统。尽管具有不同的边界，这些系统的每一个在构成可变序列中的所谓“高变区”时有一定程度的重叠。因此依据这些系统的CDR定义可以就临近的框架区在长度和边界区方面有所不同。参见如Kabat、ChothiaJP / 或 MacCalIum(Kabat 等，上述引文；Chothia 等，J.Mol.B1l, 1987,196:901 ；和MacCallum等.，J.Mol.B1l，1996，262:732)。但是，依据所谓的Kabat系统的编号是优选的。
[0068]典型地，⑶R形成一个可以分类为经典结构的环形结构。术语“经典结构”是指抗原结合(CDR)环所采用的主链构象。通过比较结构的研究发现，六个抗原结合环中的五个仅具有限制性谱的可用构象。每个经典结构的特征可在于多肽骨架的扭转角。因此，抗体之间对应的环可以具有非常相似的三维结构，尽管这些环的大部分都具有高度氨基酸序列变异性(Chothia 和 Lesk, J.Mol.B1l.，1987，196:901 ；Chothia 等，Nature, 1989，342:877 ；Martin和Thornton, J.Mol.B1l, 1996,263:800,它们中的每一个均通过全文引用并入)。此外，在采用的环结构与其周围的氨基酸序列之间存在联系。特定经典类型的构象是由环的长度和位于环内以及保守框架区(即环外部分)内关键位置的氨基酸残基决定的。因此，经典类型的分配可以在这些关键氨基酸残基存在的情况下进行。术语“经典结构”还可包括关于抗体的线性序列的考虑，如由Kabat进行的编目分类(Kabat等，上述引文)。Kabat编号方案(系统)是广泛认可的以一致的方式编码抗体可变结构域的氨基酸残基的标准，且是如本文别处提到的优选的用于本发明的方案。其它结构方面的考虑因素也可用于抗体经典结构的测定。例如，不能由Kabat编号全部反映的这些差异可以通过Chothia等的编号系统描述和/或通过其它技术(例如晶体学和二维或三维计算机建模)揭示。因此，一个给定的抗体序列能被置于经典类型，除其它事项外，该经典类型允许识别合适的基础(chassis)序列(如基于期望在文库中包含多种经典结构)。抗体氨基酸序列的Kabat编号和如Chothia等(上述引文)描述的结构考虑因素以及其对抗体结构的经典方面分析的影响都描述于文献中。
[0069]CDR3是典型的抗体-结合位点中分子多样性的最大来源。例如H3，可以短至两个氨基酸残基或超过26个氨基酸残基。不同类型的免疫球蛋白的亚基结构和三维构象是本领域熟知的。关于抗体结构的综述参见Antibodies:A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory, eds.Harlow等，1988。本领域技术人员能够认识到每个亚基结构(如CH、VH、CL、VL、⑶R、FR结构)都包含活性片段，如结合至抗原结合的VH、VL或⑶R亚基的部分，即抗原-结合片段，或，如结合至和/或激活如Fe受体和/或补体的CH亚基的部分。CDR典型地指Kabat CDR,如描述于 Sequences of Proteins of immunological Interest,US Department of Health and Human Services (1991), eds.Kabat 等。另一个用于表征抗原结合位点的标准是指如由Chothia描述的高变环。参见如Chothia,等(1987 ;J.Mo1.B1l.227:799-817);和 Tomlinson 等(1995)EMBO J.14:4628_4638。还有另外一种标准是Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用的AbM定义。整体参见例如Protein Sequenceand Structure Analysis of Antibody Variable Domains.1n:Antibody Engineering LabManual (Ed.:Duebel, S.和 Kontermann, R.，Springer-Verlag, Heidelberg)。可选择地用所述的关于Chothia高变环或AbM定义环的相似的关系实施关于Kabat CDR所述实施方案。
[0070]在组装和体细胞突变后抗体基因的序列是高度可变的，并且这些可变的基因预计编码 101° 种不同的抗体分子(Immunoglobulin Genes, 2nd ed.，eds.Jon1 等，AcademicPress, San Diego，CA，1995)。因此，免疫系统提供免疫球蛋白的谱。术语“谱”是指全部或部分源自至少一个编码至少一种免疫球蛋白的序列的至少一个核苷酸序列。所述序列可以通过在体内重链的V、D和J节段及轻链的V和J节段的重排而产生。或者，所述序列可以在响应于例如体外刺激发生重排的细胞中产生。或者，所述序列的部分或全部可通过DNA剪接、核苷酸合成、诱变及其它方法得到。参见如，美国专利5，565，332。一个谱可包括仅一个序列或可包括多个序列，包括在基因多样性集合中的所述序列。
[0071]术语“框架区”是指本领域已知的存在于较高变异度(即高变的)⑶R之间的抗体可变区的部分。典型地，这种框架区被称为框架I至4(FR1、FR2、FR3和FR4)并在三维空间中为六个CDR (三个来自重链及三个来自轻链)的呈现提供支架，从而形成抗原-结合表面。
[0072]本发明的结合分子优选是“分离的”结合分子。当“分离的”用于描述本文所公开的结合分子时，是指结合分子已经从其生成环境的组分中被识别、分离和/或重新获得。优选地，分离的结合分子不含有与其生成环境相关的其它组分。其生成环境的污染组分，如由重组转染细胞产生的，是将典型地干扰多肽诊断或治疗用途的材料，且可包括酶、激素和其它蛋白质性或非蛋白质性的溶质。在一个优选的实施方案中，所述结合分子将纯化至(I)足以通过使用转杯测序仪获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(2)在非还原或还原条件下通过SDS-PAGE使用考马斯亮蓝或优选的银染得到均一性。然而，通常一个分离的抗体是通过至少一个纯化步骤制备的。
[0073]设想到本文所结合分子的氨基酸序列的修饰。例如，提高抗体的结合亲和性和/或其它生物性能可以是可取的。所述结合分子的氨基酸序列变体是通过在结合分子核酸序列中引入适当的核苷酸变化或通过肽的合成作用制备的。
[0074]这种修饰包括，例如，结合分子氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或置换。可进行缺失、插入和置换的任意组合以进入最终的构建体中，条件是最终的构建体具有期望特性。氨基酸的改变也可改变结合分子的翻译后过程，如改变糖基化位点的数目或位置。在CDR中，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸可被置换，而在框架区(FR)中，优选1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或 25 个氨基酸可被置换。本文所述的置换优选为保守性置换。除此之外或作为另外一种选择，在每个CDR中可以插入或缺失1、2、3、4、5或6个氨基酸(当然，取决于⑶R的长度)，而在每个FR中可以插入或缺失
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或 25 个氨基酸。
[0075]—种用于识别结合分子的某些残基或区域为诱变发生的优选位置的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，该方法由Cunningham和Wells在Science，244:1081-1085(1989)中描述。在该方法中，识别出结合分子中的一个残基或一组祀残基(如带电荷残基，如arg、asp、his、Iys及glu)并被中性或带负电荷氨基酸(最优选为丙氨酸或聚丙氨酸)替代从而影响氨基酸与表位的相互作用。
[0076]然后显示出对于置换具有功能敏感性的这些氨基酸位置通过在置换位点的进一步或其它变体的引入进行精制。因此，尽管用于引入氨基酸序列变化的位点是预先确定的，但是突变本身的性质无需预先确定。例如，为了分析突变在给定位点的表现，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变并筛选具有所期望活性的表达的结合分子变体。
[0077]优选地，氨基酸序列插入包括长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基到包含一百个或更多个残基的多肽的氨基-和/或羧基-末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入作用。所述结合分子的插入变体包括向抗体的N-或C-与酶的融合或与增加抗体血清半衰期的多肽的融合。
[0078]另一种类型的变体是氨基酸置换变体。优选地，这些变体具有结合分子中至少1、
2、3、4、5、6、7、8、9或10个的氨基酸残基被不同的残基替代。最感兴趣的取代型诱变位点包括重链及/或轻链的CDR，尤其是高变区，但亦设想到重链及/或轻链中的FR改变。
[0079]例如，如果⑶R序列包含6个氨基酸，设想到这些氨基酸中的一个、两个或三个被置换。类似地，如果⑶R序列包含15个氨基酸，设想到这些氨基酸中的一个、两个、三个、四个、五个或六个被置换。
[0080]通常，如果重链及/或轻链的一个或多个或全部CDR的氨基酸被置换，则获得的“经置换的”序列与“原始”⑶R序列的同一性优选为至少为60%，更优选为65%，甚至更优选为70%，特别优选为75%，更特别优选为80%。其含义是“经置换的”序列与“原始”序列的同一性程度取决于CDR的长度。例如，一个具有5个氨基酸的CDR与其置换序列的同一性优选为80%，这是为了至少有一个被置换的氨基酸。因此，结合分子的CDR与其经置换的序列可以具有不同程度的同一性，如，⑶RLl可具有80%，而⑶RL3可具有90%。
[0081]优选的置换(或替代)是保守性置换。然而，设想到任何置换(包括非-保守性置换或一个或多个列于下文中表1的“示例性置换”)，只要结合分子保持其通过第一结合结构域与BCMA结合以及通过第二结合结构域与CD3 ε结合的能力，和/或结合分子的CDR与随后被置换的序列具有同一性(与“原始”⑶R序列的同一性至少为60%，更优选为65%，甚至更优选为70%，特别优选为75%，更特别优选为80% )。
[0082] 保守性置换示于表1中“优选的置换”的标题下。如果这种置换导致生物活性的改变，则可以引入较大幅度的改变(在表1中称为“示例性置换”，或在下文中参照氨基酸类型进一步描述)并对产物进行期望特征的筛选。
[0083]表1:氨基酸置换
[0084]
【权利要求】
1.一种至少双特异性的结合分子，所述结合分子包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中: (a)所述第一结合结构域能够结合至BCMA的表位簇3和表位簇4;和 (b)所述第二结合结构域能够结合至T细胞CD3受体复合物；且 其中所述BCMA的表位簇3对应于如SEQ ID NO:1002中所示序列的氨基酸残基24至41，所述BCMA的表位簇4对应于如SEQ ID NO:1002中所示序列的氨基酸残基42至54。
2.根据权利要求1所述的结合分子，其中所述第一结合结构域不能够结合至如SEQIDNO:1015中所示的BCMA的嵌合的胞外结构域。
3.根据权利要求1或2所示的结合分子，其中所述第一结合结构域还能够结合至猕猴BCMA0
4.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中所述第二结合结构域能够结合至CD3 ε。
5.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中所述第二结合结构域能够结合至人⑶3和猕猴⑶3。
6.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域和/或所述第二结合结构域源自抗体。
7.根据权利要求6所述的结合分子,其选自(scFv)2、(单结构域mAb)2、scFv-单结构域HlAb、双链抗体和它们的寡聚体。
8.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域包含VH区和VL区，所述VH区含有选自以下的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3，所述VL区含有选自以下的 CDR-Ll、CDR-L2 以及 CDR-L3: (a)如SEQ ID NO:231 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:232 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:233 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:234 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:235 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:236中所示的CDR-L3 ； (b)如SEQ ID NO:241 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:242 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:243 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:244 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:245 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:246中所示的CDR-L3 ； (c)如SEQ ID NO:251 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:252 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:253 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:254 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:255 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:256中所示的CDR-L3 ； (d)如SEQ ID NO:261 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:262 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:263 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:264 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:265 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:266中所示的CDR-L3 ； (e)如SEQ ID NO:271 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:272 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:273 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:274 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:275 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:276中所示的CDR-L3 ； (f)如SEQ ID NO:281 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:282 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:283 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:284 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:285 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:286中所示的CDR-L3 ；(g)如SEQ ID NO:291 中所示的 CDR-HU SEQ ID NO:292 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:293 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:294 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:295 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:296中所示的CDR-L3 ； (h)如SEQ ID NO:301 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:302 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:303 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:304 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:305 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:306中所示的CDR-L3 ； ⑴如 SEQ ID NO:391 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:392 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:393 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:394 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:395 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:396中所示的CDR-L3 ； (k)如 SEQ ID NO:401 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:402 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:403 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:404 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:405 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:406中所示的CDR-L3 ； (I)如 SEQ ID NO:411 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:412 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:413 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:414 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:415 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:416中所 示的CDR-L3 ； (m)如 SEQ ID NO:421 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:422 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:423 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:424 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:425 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:426中所示的CDR-L3 ； (η)如 SEQ ID NO:431 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:432 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:433 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:434 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:435 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:436中所示的CDR-L3 ； (ο)如 SEQ ID NO:441 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:442 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:443 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:444 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:445 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:446中所示的CDR-L3 ； (P)如 SEQ ID NO:451 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:452 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:453 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:454 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:455 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:456中所示的CDR-L3 ； (q)如 SEQ ID NO:461 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:462 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:463 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:464 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:465 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:466中所示的CDR-L3 ； (r)如 SEQ ID NO:471 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:472 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:473 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:474 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:475 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:476中所示的CDR-L3 ； (s)如 SEQ ID NO:481 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:482 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:483 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:484 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:485 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:486中所示的CDR-L3 ； (t)如 SEQ ID NO:491 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:492 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:493 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:494 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:495 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:496中所示的CDR-L3 ;和(u)如 SEQ ID NO:501 中所示的 CDR-HU SEQ ID NO:502 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:503 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:504 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:505 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:506中所示的CDR-L3。
9.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域包含VH区，所述VH区选自如以下序列中所示的VH区:SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:257、SEQID NO:267、SEQ ID NO:277、SEQ ID NO:287、SEQ ID NO:297、SEQ ID NO:307、SEQ ID NO:397,SEQ ID NO:407、SEQ ID NO:417、SEQ ID NO:427、SEQ ID NO:437、SEQ IDNO:447,SEQ ID NO:457、SEQ ID NO:467、SEQ ID NO:477、SEQ ID NO:487、SEQ ID NO:497和 SEQ ID NO:507o
10.根据前述权 利要求中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域包含VL区，所述VL区选自如以下序列中所示的VL区:SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:258、SEQID NO:268、SEQ ID NO:278、SEQ ID NO:288、SEQ ID NO:298、SEQ ID NO:308、SEQ ID NO:398,SEQ ID NO:408、SEQ ID NO:418、SEQ ID NO:428、SEQ ID NO:438、SEQ IDNO:448,SEQ ID NO:458、SEQ ID NO:468、SEQ ID NO:478、SEQ ID NO:488、SEQ ID NO:498和 SEQ ID NO:508o
11.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域包含选自以下的VH区和VL区:
⑴如SEQ ID NO:497中所示的VH区，和如SEQ ID NO:498中所示的VL区；和 (U)如SEQ ID NO:507中所示的VH区，和如SEQ ID NO:508中所示的VL区。
12.根据权利要求10所述的结合分子，其中所述第一结合结构域包含选自以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:259、SEQ ID NO:269、SEQ ID NO:.279、SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:309、SEQ ID NO:399、SEQ ID NO:409、SEQ ID NO:419,SEQ ID NO:429、SEQ ID NO:439、SEQ ID NO:449、SEQ ID NO:459、SEQ IDNO:469, SEQ ID NO:479、SEQ ID NO:489、SEQ ID NO:499 和 SEQ ID NO:509。
13.根据权利要求1-7中任一项所述的结合分子，其具有示于SEQID NO:300或SEQID NO:500的氨基酸序列。
14.一种编码根据权利要求1至13中任一项所定义的结合分子的核酸序列。
15.—种包含根据权利要求14所定义的核酸序列的载体。
16.一种采用根据权利要求14所定义的核酸序列或根据权利要求15所定义的载体转化或转染的宿主细胞。
17.一种用于生产根据权利要求1至13中任一项所述的结合分子的方法，所述方法包括在允许根据权利要求1至13中任一项所定义的结合分子表达的条件下培养根据权利要求16所定义的宿主细胞并从培养物中回收产生的结合分子。
18.—种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至13中任一项所述的结合分子或包含根据权利要求17所述的方法生产的结合分子。
19.根据权利要求1至13中任一项所述的结合分子或根据权利要求17所述的方法生产的结合分子，所述结合分子用于预防、治疗或改善选自浆细胞障碍、其它与BCMA表达有关的B细胞障碍和自身免疫性疾病的疾病。
20.一种用于治疗或改善选自浆细胞障碍、其它与BCMA表达有关的B细胞障碍和自身免疫性疾病的疾病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用根据权利要求1至13中任一项所述的结合分子或根据权利要求17所述的方法生产的结合分子。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述浆细胞障碍选自:多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、浆细胞白血病、巨球蛋白血症、淀粉样变性、华氏巨球蛋白血症、孤立性骨浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、骨硬化性骨髓瘤、重链病、意义不明确的单克隆丙种球蛋白病以及郁积型多发性骨髓瘤。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是全身性红斑狼疮。
23.—种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1至13中任一项所定义的结合分子、根据权利要求14所定义的核酸分子、根据权利要求15所定义的载体和/或根据权利要求16所定义的宿主细胞。
24.BCMA的表位簇3和表位簇4在结合分子生产中的用途，所述结合分子优选为能够结合至BCMA的抗体，其中BCMA的表位簇3对应于如SEQ ID NO:1002中所示序列的氨基酸残基24至41，BCMA的表位簇4对应于如SEQ ID NO:1002中所示序列的氨基酸残基42至54。
25.一种用于生产抗体，所述抗体优选为能够结合至BCMA的结合分子的方法，所述方法包括: (a)用包含BCMA的表位簇3和表位簇4的多肽免疫动物，其中BCMA的表位簇3对应于如SEQ ID NO:1002中所示序列的氨基酸残基24至41，BCMA的表位簇4对应于如SEQ IDNO:1002中所示序列的氨基酸残基42至54 ; (b)获得所述抗体，和 (c)可选地，将所述抗体转化为结合分子，所述结合分子能够结合至人BCMA，优选结合至T细胞⑶3受体复合 物。
【文档编号】A61K39/395GK104169300SQ201280056358
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2012年11月15日 优先权日:2011年11月15日
【发明者】彼得·库菲, 托拜厄斯·劳姆, 帕特里克·霍夫曼, 罗曼·基谢尔, 拉尔夫·鲁特布瑟, 桃瑞丝·芳, 保罗·亚当, E·伯格斯, B·赫比斯, 苏珊娜·希普 申请人:安进研发（慕尼黑）股份有限公司, 贝林格尔·英格海姆国际有限公司