聚合物蛋白微粒的制作方法

聚合物蛋白微粒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了包含治疗性蛋白核心和生物相容的且生物可降解的聚合物皮层的微粒，和制造和使用所述微粒的方法。本发明显示，所述治疗性蛋白在生理溶液中在延长的时期内，从所述微粒延长释放。
【专利说明】聚合物蛋白微粒
发明领域
[0001]本发明涉及延长释放的蛋白治疗剂的制备、组合物和用途。特别地，本发明涉及多种聚合物包被的蛋白微球体的制备、组合物和用途，其用于蛋白质在基于水的或生理的环境中随时间的延长和均匀的释放。
[0002]发明背景
[0003]施用给生物学目标(例如视网膜或肿瘤)或胃肠外施用的治疗性蛋白的延长释放对于许多不同病况包括癌症、心血管疾病、血管病况、骨科疾病、牙科疾病、创伤、自身免疫性疾病、肠胃失调和眼科疾病的治疗是期望的。用于受控地和延长地递送药物的生物相容的和生物可降解的聚合物已使用了数十年。随着聚合物随时间的降解，治疗性药物缓慢释放。
[0004]对于眼内治疗剂，存在着对于延长释放的制剂的显著的、未被满足的医学需求，所述制剂用于通过尽可能少的眼内注射来随时间有效地递送蛋白治疗剂。对于其他疾病，例如癌症、炎性疾病和其他疾病，存在着对于包含蛋白治疗剂的改良的可植入的延长释放的制剂的需求。
[0005]本 申请人:已发现并于本文中公开和要求保护，制备和使用包含生物可降解聚合物和治疗性蛋白的微粒 的方法，所述微粒能够在延长的时间段内均匀地释放治疗有效量的治疗性蛋白。
[0006]发明概述
[0007]在一个方面，本发明提供了包含聚合物包被的蛋白的微粒。在一个实施方案中，所述微粒具有约2微米至约70微米的直径。在一个实施方案中，所述微粒具有约15微米的直径。
[0008]在一个实施方案中，蛋白是抗原结合蛋白。在一个实施方案中，蛋白包含Fe结构域。在一个实施方案中，蛋白包含受体结构域。在一个实施方案中，蛋白是抗体。在另一个实施方案中，蛋白是受体-Fe融合蛋白。在另一个实施方案中，蛋白是陷讲型(trap-type)蛋白，其包含同源受体片段和Fe结构域。在一个具体实施方案中，蛋白是VEGF-Trap蛋白。在一个实施方案中，VEGF-Trap蛋白包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。
[0009]在一个实施方案中，聚合物是生物可降解聚合物。在一些实施方案中，聚合物选自聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚_D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、PLGA-环氧乙烷延胡索酸、酯化至聚乙二醇1000的PLGA-α -生育酚琥珀酸酯(PLGA-TGPS)(PLGA-alpha-tocopheryl succinate esterified to polyethyleneglycol 1000)、聚酐聚[1，6-二(对-羧基苯氧基)己烧](pCPH)、聚(轻丁酸-共羟基戍酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-ε -己内酯(PCL)、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯(PAC)、聚(乙基)氰基丙烯酸酯(PEC)、聚异丁基氰基丙烯酸酯、聚-Ν-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(聚(HPMA))、聚-β -R-羟基丁酸酯(PHB)、聚-β -R-羟基链烷酸酯(PHA)、聚β -R-苹果酸、磷脂-胆固醇聚合物、2- 二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱/聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(D0PC/PEG-DSPE)/胆固醇、多糖、纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、藻酸盐或酯、葡聚糖和葡聚糖水凝胶聚合物、直链淀粉、菊粉、果胶和瓜尔胶、壳聚糖、壳多糖、肝素、透明质酸、基于环糊精(CD)的聚轮烷和聚类轮烷、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚亮氨酸、亮氨酸-谷氨酸共聚物、聚丁烯琥珀酸盐或酯(PBS)、明胶、胶原、纤维蛋白、丝心蛋白、聚原酸酯、聚原酸酯-聚脒共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、掺入潜在性酸的聚原酸酯、聚(乙二醇)/聚(对苯二甲酸丁二醇酯)共聚物，及其组合和共聚物。在一个实施方案中，聚合物是聚-ε-己内酯(PCL)或其衍生物或共聚物。在一个实施方案中，聚合物是PLGA或其衍生物或共聚物。在一个实施方案中，聚合物是乙基纤维素或其衍生物或共聚物。在一个实施方案中，聚合物是聚原酸酯或其衍生物或共聚物。
[0010]在一个实施方案中，微粒包含小于10微米的微粒化蛋白核心和聚合物皮层。在一个实施方案中，微粒化蛋白核心用聚合物包被至少50 %，也即，暴露不多于50 %的微粒化蛋白核心的表面。在一个实施方案中，用聚合物包被至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、至少99 %或100 %的微粒化蛋白核心的表面。
[0011]在一个实施方案中，粒度大于10微米的微粒包含(a)小于10微米的微粒化蛋白核心，其中所述蛋白是抗体或抗体片段、受体或其可溶性片段、可溶性T细胞受体片段、可溶性MHC片段、受体-Fe融合蛋白、陷阱型蛋白和VEGF-Trap蛋白中的任一种或多种；和(b)聚合物涂层，其中所述聚合物是下列中的任一种或多种:生物相容的聚合物、生物可降解聚合物、生物可蚀解聚合物、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、PLGA-环氧乙烷延胡索酸、酯化至聚乙二醇1000的PLGA-α -生育酚琥珀酸酯(PLGA-TGPS)、聚酐聚[1，6-二(对-羧基苯氧基)己烷](pCPH)、聚(羟丁酸-共羟基戊酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-ε-己内酯(PCL)、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯(PAC)、聚(乙基)氰基丙烯酸酯(PEC)、聚异丁基氰基丙烯酸酯、聚-N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(聚(HPMA))、聚-β-R-羟基丁酸酯(PHB)、聚-β -R-羟基链烷酸酯(PHA)、聚β -R-苹果酸、磷脂-胆固醇聚合物、2- 二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱/聚乙 二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(D0PC/PEG-DSPE)/胆固醇、多糖、纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、藻酸盐或酯、葡聚糖和葡聚糖水凝胶聚合物、直链淀粉、菊粉、果胶和瓜尔胶、壳聚糖、壳多糖、肝素、透明质酸、基于环糊精(CD)的聚轮烷和聚类轮烷、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚亮氨酸、亮氨酸-谷氨酸共聚物、聚丁烯琥珀酸盐或酯(PBS)、明胶、胶原、纤维蛋白、丝心蛋白、聚原酸酯、聚原酸酯-聚脒共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、掺入潜在性酸的聚原酸酯、聚(乙二醇)/聚(对苯二甲酸丁二醇酯)共聚物，及其组合和共聚物。
[0012]在一个实施方案中，具有约15微米至约30微米的平均直径的微粒包含(a)约10微米至约12微米的微粒化蛋白核心，其中所述蛋白是VEGF-Trap蛋白；和(b)聚合物涂层，其中所述聚合物是下述中的任一种或多种:PCL、PLGA、乙基纤维素和聚原酸酯，以及其共聚物和衍生物。
[0013]在一个方面，本发明提供多个微粒，其具有约2微米至约70微米的粒度，并且包含约2微米至约30微米的微粒化蛋白核心和聚合物皮层。
[0014]在一个实施方案中，蛋白是抗原结合蛋白。在一些实施方案中，抗原结合蛋白是抗体或抗体片段、受体或其可溶性片段、可溶性T细胞受体片段、可溶性MHC片段、受体-Fe融合蛋白、陷阱型蛋白和VEGF-Trap蛋白中的任一种或多种。在一个实施方案中，蛋白包含Fe结构域。在一个实施方案中，蛋白是抗体。在另一个实施方案中，蛋白是受体-Fe融合蛋白。在另一个实施方案中，蛋白是陷阱型蛋白，其包含同源受体片段和Fe结构域。在一个具体实施方案中，蛋白是VEGF-Trap蛋白。在一个具体实施方案中，VEGF-Trap蛋白包含SEQ IDNO:1中所示的氨基酸序列。
[0015]在一个实施方案中，聚合物是生物相容的聚合物。在一个实施方案中，聚合物是生物可蚀解聚合物。在一个实施方案中，聚合物是生物可降解聚合物。在一些实施方案中，聚合物选自聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、PLGA-环氧乙烷延胡索酸、酯化至聚乙二醇1000的PLGA-α -生育酚琥珀酸酯(PLGA-TGPS)、聚酐聚[1，6_ 二(对-羧基苯氧基)己烷](pCPH)、聚(羟丁酸-共羟基戊酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-ε -己内酯(PCL)、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯(PAC)、聚(乙基)氰基丙烯酸酯(PEC)、聚异丁基氰基丙烯酸酯、聚-Ν_(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(聚(HPMA))、聚-β-R-羟基丁酸酯(PHB)、聚-β -R-羟基链烷酸酯(PHA)、聚β -R-苹果酸、磷脂-胆固醇聚合物、2- 二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱/聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(D0PC/PEG-DSPE)/胆固醇、多糖、纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、藻酸盐或酯、葡聚糖和葡聚糖水凝胶聚合物、直链淀粉、菊粉、果胶和瓜尔胶、壳聚糖、壳多糖、肝素、透明质酸、基于环糊精(CD)的聚轮烷和聚类轮烷、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚亮氨酸、亮氨酸-谷氨酸共聚物、聚丁烯琥珀酸盐或酯(PBS)、明胶、胶原、纤维蛋白、丝心蛋白、聚原酸酯、聚原酸酯-聚脒共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、掺入潜在性酸的聚原酸酯、聚(乙二醇)/聚(对苯二甲酸丁二醇酯)共聚物，及其组合和共聚物。在一个实施方案中，聚合物是聚-ε -己内酯(PCL)或其衍生物或共聚物。在一个实施方案中，聚合物是PLGA或其衍生物或共聚物。在一个实施方案中，聚合物是乙基纤维素或其衍生物或共聚物。在一个实施方案中，聚合物是掺入潜在性酸的聚原酸酯。
[0016]在一个实施方案中，多个微粒中的大多数微粒的微粒化蛋白核心用聚合物包被至少50%,也即，暴露不多于 50%的微粒化蛋白核心的表面。在一个实施方案中，用聚合物包被至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、至少99 %或100 %的微粒化蛋白核心的表面。
[0017]在一个实施方案中，具有约2微米至约70微米的粒度的多个微粒包含(a)约2微米至约30微米的微粒化蛋白核心，其中所述蛋白是抗体或抗体片段、受体或其可溶性片段、可溶性T细胞受体片段、可溶性MHC片段、受体-Fe融合蛋白、陷阱型蛋白和VEGF-Trap蛋白中的任一种或多种；和(b)聚合物皮层，其中所述聚合物是下列中的任一种或多种:生物相容的聚合物、生物可降解聚合物、生物可蚀解聚合物、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、PLGA-环氧乙烷延胡索酸、酯化至聚乙二醇1000的PLGA-α -生育酚琥珀酸酯(PLGA-TGPS)、聚-ε -己内酯(PCL)、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯(PAC)、聚酐聚[1，6- 二(对-羧基苯氧基)己烷](pCPH)、聚(羟丁酸-共羟基戊酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚(乙基)氰基丙烯酸酯(PEC)、聚异丁基氰基丙烯酸酯、聚-N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(聚(HPMA))、聚-β -R-羟基丁酸酯(PHB)、聚-β -R-羟基链烷酸酯(PHA)、聚β -R-苹果酸、磷脂-胆固醇聚合物、2- 二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱/聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(D0PC/PEG-DSPE)/胆固醇、多糖、纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、藻酸盐或酯、葡聚糖和葡聚糖水凝胶聚合物、直链淀粉、菊粉、果胶和瓜尔胶、壳聚糖、壳多糖、肝素、透明质酸、基于环糊精(CD)的聚轮烷和聚类轮烷、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚亮氨酸、亮氨酸-谷氨酸共聚物、聚丁烯琥珀酸盐或酯(PBS)、明胶、胶原、纤维蛋白、丝心蛋白、聚原酸酯、聚原酸酯-聚脒共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、掺入潜在性酸的聚原酸酯、聚(乙二醇)/聚(对苯二甲酸丁二醇酯)共聚物，及其组合和共聚物。
[0018]在一个实施方案中，具有约2微米至约70微米粒度、具有约15微米至约30微米粒度中值的多个微粒包含(a)具有约10微米至约12微米粒度中值的约2微米至约30微米的微粒化蛋白核心，其中所述蛋白是VEGF-Trap蛋白；和(b)聚合物皮层,其中所述聚合物是下述中的任一种或多种:PLA、PCL、PLGA、乙基纤维素和聚原酸酯及其共聚物和衍生物。
[0019]在一个方面，本发明提供了制备微粒的方法，所述微粒包含蛋白核心和聚合物皮层。在一个实施方案中，制备的微粒具有约2微米至约70微米的直径，或约15微米至约30微米的直径中值。在一个实施方案中，制备微粒的方法包括(I)获得蛋白颗粒；(2)在包含聚合物和溶剂的溶液中悬浮蛋白颗粒；和(3)去除溶剂，其中形成了包含由聚合物皮层包被的蛋白核心的微粒。
[0020]在一个实施方案中，步骤(1)的蛋白颗粒是微粒化的蛋白颗粒，其通过喷雾干燥包含所述蛋白的溶液来获得。在一些实施方案中，蛋白溶液通过双喷嘴超声法、单喷嘴超声法或电喷射来喷雾干燥。在一些实施方案中，产生的微粒化蛋白颗粒(其形成制备的微粒的核心)具有约2微米至约30微米的直径、约10微米至约12微米的直径中值。
[0021]在一些实施方案中，形成核心的蛋白是抗原结合蛋白。在一些实施方案中，抗原结合蛋白是抗体(例如IgG)或抗体片段、受体或其可溶性片段、可溶性T细胞受体片段、可溶性MHC片段、受体-Fe融 合蛋白、陷阱型蛋白和VEGF-Trap蛋白中的任一种或多种。在特别的实施方案中，蛋白是包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的VEGF-Trap蛋白。
[0022]在一个实施方案中，通过产生步骤(2)的蛋白-聚合物-溶剂混合物的分散相和允许溶剂从所述分散相产生的微滴中挥发来在步骤(3)去除溶剂。在一个实施方案中，通过喷雾干燥来产生分散相，所述喷雾干燥可通过双喷嘴超声法、单喷嘴超声法或电喷射来进行。在一个实施方案中，通过应用热或空气或通过化学萃取来从微滴去除溶剂。
[0023]在一个实施方案中，聚合物是生物可降解的、生物可蚀解的和/或生物相容的。在一些实施方案中，聚合物是下列的任意一种或多种:聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、PLGA-环氧乙烷延胡索酸、酯化至聚乙二醇1000的PLGA-α-生育酚琥珀酸酯(PLGA-TGPS)、聚酐聚[1，6-二(对-羧基苯氧基)己烷](PCPH)、聚(羟丁酸-共羟基戊酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-ε -己内酯(PCL)、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯(PAC)、聚(乙基)氰基丙烯酸酯(PEC)、聚异丁基氰基丙烯酸酯、聚-Ν-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(聚(HPMA))、聚-β -R-羟基丁酸酯(PHB)、聚-β -R-羟基链烷酸酯(PHA)、聚β -R-苹果酸、磷脂-胆固醇聚合物、2- 二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱/聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(D0PC/PEG-DSPE)/胆固醇、多糖、纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、藻酸盐或酯、葡聚糖和葡聚糖水凝胶聚合物、直链淀粉、菊粉、果胶和瓜尔胶、壳聚糖、壳多糖、肝素、透明质酸、基于环糊精(CD)的聚轮烷和聚类轮烷、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚亮氨酸、亮氨酸-谷氨酸共聚物、聚丁烯琥珀酸盐或酯(PBS)、明胶、胶原、纤维蛋白、丝心蛋白、聚原酸酯、聚原酸酯-聚脒共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、掺入潜在性酸的聚原酸酯、聚(乙二醇)/聚(对苯二甲酸丁二醇酯)共聚物，及其组合和共聚物。在一个实施方案中，聚合物是聚-ε -己内酯(PCL)或其衍生物或共聚物。在一个实施方案中，聚合物是PLGA或其衍生物或共聚物。在一个实施方案中，聚合物是乙基纤维素或其衍生物或共聚物。在一个实施方案中，聚合物是聚原酸酯或其衍生物，其包含对酸敏感的成分(acid labile elements)。在另一个实施方案中，聚合物是PLA。
[0024]在一个方面，本发明提供制备微粒的方法，所述方法包含如下步骤:⑴通过喷雾干燥包含蛋白的溶液形成具有约2微米至约30微米直径、约10微米至约12微米直径中值的微粒化蛋白颗粒，其中所述蛋白是抗原结合蛋白。在一些实施方案中，抗原结合蛋白是抗体或抗体片段、受体或其可溶性片段、可溶性T细胞受体片段、可溶性MHC片段、受体-Fe融合蛋白、陷阱型蛋白和VEGF-Trap蛋白(例如具有SEQID NO:1的序列的蛋白)中的任一种或多种；(2)在包含聚合物和溶剂的溶液中悬浮微粒化蛋白颗粒，其中所述聚合物是下列中的任一种或多种:聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、PLGA-环氧乙烷延胡索酸、酯化至聚乙二醇1000的PLGA-α -生育酚琥珀酸酯(PLGA-TGPS)、聚酐聚[1，6-二(对-羧基苯氧基)己烷](pCPH)、聚(羟丁酸-共羟基戊酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-ε-己内酯(PCL)、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯(PAC)、聚(乙基)氰基丙烯酸酯(PEC)、聚异丁基氰基丙烯酸酯、 聚-N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(聚(HPMA))、聚-β-R-羟基丁酸酯(PHB)、聚-β -R-羟基链烷酸酯(PHA)、聚β -R-苹果酸、磷脂-胆固醇聚合物、2- 二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱/聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(D0PC/PEG-DSPE)/胆固醇、多糖、纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、藻酸盐或酯、葡聚糖和葡聚糖水凝胶聚合物、直链淀粉、菊粉、果胶和瓜尔胶、壳聚糖、壳多糖、肝素、透明质酸、基于环糊精(CD)的聚轮烷和聚类轮烷、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚亮氨酸、亮氨酸-谷氨酸共聚物、聚丁烯琥珀酸盐或酯(PBS)、明胶、胶原、纤维蛋白、丝心蛋白、聚原酸酯、聚原酸酯-聚脒共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、掺入潜在性酸的聚原酸酯、聚(乙二醇)/聚(对苯二甲酸丁二醇酯)共聚物，及其组合和共聚物；和(3)通过下列来去除溶剂:喷雾干燥微粒化蛋白颗粒-聚合物-溶剂悬液，和通过应用热或空气或通过萃取溶剂而馏出溶剂，其中形成了具有约2微米至约70微米直径、约15微米至约30微米直径中值并且包含蛋白核心和聚合物皮层的微粒。
[0025]在一些实施方案中，通过双喷嘴超声法、单喷嘴超声法或电喷射来进行步骤(1)或步骤(3)的喷雾干燥。
[0026]在一个实施方案中，制备微粒的方法包括如下步骤:(1)通过喷雾干燥包含VEGF-Trap蛋白的溶液来形成具有约10微米至约12微米直径的微粒化VEGF-Trap颗粒；
(2)在包含掺入潜在性酸的聚原酸酯和相容的溶剂或者包含乙基纤维素和相容的溶剂的溶液中悬浮微粒化的VEGF-Trap颗粒；和(3)通过下列来去除溶剂:(a)喷雾干燥微粒化VEGF-Trap颗粒-聚原酸酯-潜在性酸-溶剂的悬液或微粒化VEGF-Trap颗粒-乙基纤维素-溶剂的悬液和(b)通过应用热或空气或通过萃取溶剂而馏出溶剂，其中形成了具有约15微米至约30微米直径并且包含VEGF-Trap核心和聚原酸酯及其共聚物或衍生物的聚合物皮层的微粒。
[0027]在一个方面，本发明提供了治疗性蛋白的延长释放制剂，其用于随时间过去释放或递送稳定水平的治疗性蛋白。所述延长释放制剂包含多个微粒，其具有约2微米至约70微米的粒度，其中每一个微粒包含约2微米至约30微米的微粒化蛋白核心和聚合物皮层。
[0028]在一个实施方案中，治疗性蛋白是抗原结合蛋白。在一些实施方案中，抗原结合蛋白是抗体(例如IgG)或抗体片段、受体或其可溶性片段、可溶性T细胞受体片段、可溶性MHC片段、受体-Fe融合蛋白、陷阱型蛋白和VEGF-Trap蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的一级结构的蛋白)中的任一种或多种。在一个实施方案中，治疗性蛋白包含Fe结构域。在一个实施方案中，蛋白是抗体。在另一个实施方案中，蛋白是IgG。在另一个实施方案中，治疗性蛋白是受体-Fe融合蛋白。在另一个实施方案中，治疗性蛋白是陷阱型蛋白，其包含同源受体片段和Fe结构域。在一个具体实施方案中，治疗性蛋白是VEGF-Trap蛋白。在另一个实施方案中，VEGF-Trap蛋白包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。[0029]在一个实施方案中，聚合物皮层包含生物相容的聚合物。在一个实施方案中，聚合物皮层包含生物可蚀解的聚合物。在一个实施方案中，聚合物皮层包含生物可降解的聚合物。在一些实施方案中，聚合物皮层包含选自下列的聚合物:聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、PLGA-环氧乙烷延胡索酸、酯化至聚乙二醇1000的PLGA-α -生育酚琥珀酸酯(PLGA-TGPS)、聚酐聚[I, 6- 二(对-羧基苯氧基)己烷](pCPH)、聚(羟丁酸-共羟基戊酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-ε -己内酯(PCL)、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯(PAC)、聚(乙基)氰基丙烯酸酯(PEC)、聚异丁基氰基丙烯酸酯、聚-N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(聚(HPMA))、聚-β -R-羟基丁酸酯(PHB)、聚-β -R-羟基链烷酸酯(PHA)、聚β -R-苹果酸、磷脂-胆固醇聚合物、2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱/聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(D0PC/PEG-DSPE)/胆固醇、多糖、纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、藻酸盐或酯、葡聚糖和葡聚糖水凝胶聚合物、直链淀粉、菊粉、果胶和瓜尔胶、壳聚糖、壳多糖、肝素、透明质酸、基于环糊精(CD)的聚轮烷和聚类轮烷、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚亮氨酸、亮氨酸-谷氨酸共聚物、聚丁烯琥珀酸盐或酯(PBS)、明胶、胶原、纤维蛋白、丝心蛋白、聚原酸酯、聚原酸酯-聚脒共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、掺入潜在性酸的聚原酸酯、聚(乙二醇)/聚(对苯二甲酸丁二醇酯)共聚物，及其组合和共聚物。在一个实施方案中，聚合物是聚-ε-己内酯(PCL)或其衍生物或共聚物。在一个实施方案中，聚合物皮层包含PLGA。在一个实施方案中，聚合物皮层包含乙基纤维素。在一个实施方案中，聚合物皮层包含PLA、PLGA、乙基纤维素和聚原酸酯及其共聚物或衍生物的任一种或多种。
[0030]在一个实施方案中，多个微粒包含具有一系列厚度的聚合物皮层的微粒的集合，以便微粒集合中的个体微粒以不同的速率降解，从而允许治疗性蛋白以均匀的速率释放。
[0031]在一个实施方案中，多个微粒包含未包被的微粒化蛋白颗粒和具有一系列厚度的聚合物皮层的微粒的混合物，其允许治疗性蛋白根据皮层厚度以周期性间隔释放。
[0032]在一个实施方案中，多个微粒包含具有不同疏水性水平的聚合物皮层的微粒的混合物，以控制降解和随后释放的时间安排(timing)或持续时间。在一个实施方案中，微粒各自包含内聚合物层和外聚合物层，其中外聚合物层限制内聚合物层的水合以控制治疗性蛋白的释放。
[0033]在一个实施方案中，当微粒在水性环境中时，治疗性蛋白以约0.01mg/周至约0.30mg/周的速率以至少60天的持续时间从多个微粒中释放。在一个实施方案中,水性环境是体外缓冲液。在一个实施方案中，水性环境是体内的。在一个实施方案中，水性环境是离体的。在一个实施方案中，水性环境是玻璃体液。
[0034]在一个实施方案中，延长释放制剂包含多个微粒，其具有约2微米至约70微米的粒度并且包含(a)约2微米至约30微米的微粒化治疗性蛋白的核心，其中所述治疗性蛋白是抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白在一些情况下可以是抗体或抗体片段、受体或其可溶性片段、可溶性T细胞受体片段、可溶性MHC片段、受体-Fe融合蛋白、陷阱型蛋白和VEGF-Trap蛋白中的任一种或多种；和(b)具有一系列厚度的聚合物皮层，其中所述聚合物是下列中的任一种或多种:生物相容的聚合物、生物可降解聚合物、生物可蚀解聚合物、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA) ,PLGA-环氧乙烷延胡索酸、酯化至聚乙二醇1000的PLGA- α -生育酚琥珀酸酯(PLGA-TGPS)、聚酐聚[1，6_ 二(对-羧基苯氧基)己烷](pCPH)、聚(羟丁酸-共羟基戊酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-ε -己内酯(PCL)、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯(PAC)、聚(乙基)氰基丙烯酸酯(PEC)、聚异丁基氰基丙烯酸酯、聚-N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(聚(HPMA))、聚-β -R-羟基丁酸酯(PHB)、聚-β -R-羟基链烷酸酯(PHA)、聚β -R-苹果酸、磷脂-胆固醇聚合物、2- 二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱/聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(D0PC/PEG-DSPE)/胆固醇、多糖、纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、藻酸盐或酯、葡聚糖和葡聚糖水凝胶聚合物、直链淀粉、菊粉、果胶和瓜尔胶、壳聚糖、壳多糖、肝素、透明质酸、基于环糊精(CD)的聚轮烷和聚类轮烷、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚亮氨酸、亮氨酸-谷氨酸共聚物、聚丁烯琥珀酸盐或酯(PBS)、明胶、胶原、纤维蛋白、丝心蛋白、聚原酸酯、聚原酸酯-聚脒共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、掺入潜在性酸的聚原酸酯、聚(乙二醇)/聚(对苯二甲酸丁二醇酯)共聚物，及其组合和共聚物，其中所述微粒以约0.01mg/周至约0.30mg/周的速率释放或递送稳定水平的治疗性蛋白至少60天。
[0035]在一个实施方 案中，延长释放制剂包含多个微粒，其具有约2微米至约70微米的粒度、约15微米至约30微米的粒度中值，并且包含(a)具有约10微米至约12微米粒度中值的约2微米至约30微米的微粒化蛋白核心,其中所述蛋白是VEGF-Trap蛋白；和(b)具有一系列厚度的聚合物皮层，其中所述聚合物是PLGA、乙基纤维素和聚原酸酯及其共聚物或衍生物中的任一种或多种，从而在水性环境中微粒以约0.06±0.02mg/周的速率释放或递送稳定水平的VEGF Trap至少60天。
[0036]在一个方面，本发明提供了用于调节蛋白释放的方法。在一个实施方案中，所述方法包括，制造如上文所述的多个微粒的步骤和随后将所述微粒置于溶剂中的步骤。在一些实施方案中所述溶剂是水性的。溶剂可以是体外的，例如在磷酸盐缓冲溶液中。溶剂可以是体内的，例如玻璃体液。
[0037]附图
[0038]图1 描述了从 50mg/ml 的 VEGF Trap 蛋白、25mg/ml 的 VEGF Trap 蛋白和 25mg/ml的VEGF Trap蛋白加0.1 %聚山梨酯80制备的蛋白颗粒群体中的具有给定直径(ECD ( μ m))的无聚合物皮层的蛋白颗粒的相对量(体积％)。
[0039]图 2 描述了从50mg/ml 的 VEGF Trap 蛋白加 50mg/ml P0E、250mg/ml POE和 50mg/mlEC制备的微粒群体中具有给定直径(ECD ( μ m))的微粒的相对量(由MFI测定的体积％ )。
[0040]图3 描述了在大约 60 天内从由 50mg/ml P0E、250mg/ml POE 或 50mg/ml EC 制备的微粒中释放的VEGF Trap蛋白的量(以毫克计)。
[0041]发明详述
[0042]本发明的微粒和蛋白核心颗粒在形状上是大致球形的。一些微粒和蛋白核心接近球形，而其他的则在形状上较不规则。因此，如本文中所用，术语“直径”意指下列的每一个和任一个:(a)限定微粒或蛋白核心的球体的直径，(b)适合在微粒或蛋白核心范围内的最大球体的直径，(c) (a)的限定球体和(b)的限制球体之间的任意测量值，包括两者之间的平均值，(d)微粒或蛋白核心的最长轴的长度，(e)微粒或蛋白核心的最短轴的长度，(f)(d)的长轴长度和(e)的短轴长度之间的任意测量值，包括两者之间的平均值，和/或(g)圆当量直径(“ECD”)，如通过微流成像(MFI)、纳米颗粒径迹分析(NTA)或光阻法例如动态光散射(DLS)所测量的。通常参见 Sharma 等人，Micro-flow imaging: flow microscopyapplied to subvisible particulate analysis in protein formulations,AAPSJ.2010Sep ;12(3):455-64。直径通常以微米(μ m或微米)表示。直径可通过光学测量来测定。
[0043]术语“微粒化蛋白颗粒”或“蛋白颗粒”意指含有低的、很低的或接近于零的量的水(例如，按重量〈3%的水)的、包含多个蛋白分子的颗粒。如本文中所用，微粒化蛋白颗粒在形状上通常是球形的并且具有2微米至约35微米的ECD。微粒化蛋白颗粒不限于任何特定的蛋白实体，并且适合于制备和递送治疗性蛋白。常用的治疗性蛋白特别地包括抗原结合蛋白，例如可溶性受体片段，抗体(包括IgG)和抗体衍生物或片段，其它的含Fe蛋白，包括Fe融合蛋白，和受体-Fe融合蛋白，包括陷讲型蛋白(Huang, C.，Curr.0pin.Biotechnol.20:692-99(2009))例如 VEGF-Trap。
[0044]本发明的微粒化蛋白颗粒可以用本领域已知的用于制造微米尺寸的蛋白颗粒的任何方法来制造。例 如，特别地，可通过喷雾干燥(参见下文所述)、冷冻干燥、气流粉碎、悬滴结晶(Ruth 等人,ActaCrystallographica D56:524-28 (2000))、逐步沉淀(US7，998，477 (2011))、蛋白-PEG (聚乙二醇)水性混合物的冷冻干燥(Morita etal., Pharma.Res.17:1367-73 (2000))、超临界流体沉淀(US6, 063，910 (2000))或高压二氧化碳诱导的颗粒形成(Bustami et al., Pharma.Res.17:1360-66 (2000))来制造蛋白颗粒。
[0045]如本文中使用，术语“蛋白”意指，包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸残基的分子。肽、多肽和蛋白还可包含修饰，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的Y-羧化、羟基化和ADP-核糖基化。多肽可具有科学上或商业上的益处，包括基于蛋白的药物。多肽特别地包括抗体和嵌合或融合蛋白。多肽可通过使用细胞培养方法由重组动物细胞系产生。
[0046]术语“抗体”意指由4条多肽链(通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链)组成的免疫球蛋白分子。每一条重链具有重链可变区(HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域:CH1、CH2和CH3。每一条轻链具有轻链可变区和轻链恒定区。轻链恒定区由一个结构域(CL)组成。VH和VL区域可进一步细分为高变区(称为互补决定区(CDR))，其间间插有更为保守的区域(称为框架区(FR))。每一个VH和VL包含3个CDR和4个FR，其从氨基末端至羧基末端按下列顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。术语“抗体”包括任意同种型或亚类的糖基化和非糖基化的免疫球蛋白。术语“抗体”包括但不限于通过重组方法制备、表达、产生或分离的那些抗体，例如从被转染以表达抗体的宿主细胞分离的抗体。IgG构成抗体的亚组。
[0047]术语“Fe融合蛋白”包含两种或更多种蛋白的部分或全部，其中一个蛋白是免疫球蛋白分子的Fe部分，其在天然状态下不是融合的。包含融合至抗体来源多肽的不同部分(包括Fe结构域)的某些异源多肽的融合蛋白的制备已描述于例如Ashkenazi等人，Proc.Natl.Acad.ScL USA88:10535, 1991 ；Byrn 等人,Nature344:677, 1990 ;和 Hollenbaugh 等人，"Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins' in Current Protocols in Immunology, Suppl.4, pagesl0.19.1-10.19.11, 1992。术语“受体 Fe 融合蛋白”包括，偶联至Fe部分的受体的一个或多个胞外结构域，所述Fe部分在一些实施方案中包含铰链区和随后的免疫球蛋白CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，Fe融合蛋白包含与单个或多于一个配体结合的两个或更多个不同的受体链。例如，Fe融合蛋白是陷阱蛋白，例如IL-1陷阱蛋白(例如Rilonac印t，其包含融合至与hlgGl的Fe融合的IL-1R1胞外区的IL-1RAcP配体结合区；参见U.S.Pat.N0.6，927，004，其通过引用整体并入本文)，或VEGF Trap (例如，Aflibercept,其包含与hlgGl的 Fe融合的融合至VEGF受体Flkl的Ig结构域3的VEGF受体 Fltl 的 Ig 结构域 2 ;例如 SEQ ID NO:1 ;参见 U.S.Pat.Nos.7，087，411 和 7，279，159，其通过引用整体并入本文)。
[0048]如本文中所用，术语“聚合物”意指，包含通过共价化学键连接的重复单体的大分子。在本发明的颗粒中使用的聚合物是生物相容的和生物可降解的。生物相容的和生物可降解的聚合物可以是天然的或合成的。天然的聚合物包括多核苷酸、多肽，例如天然存在的蛋白、重组蛋白、明胶、胶原、纤维蛋白、丝心蛋白、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚亮氨酸、亮氨酸-谷氨酸共聚物；和多糖，例如纤维素藻酸盐或酯、葡聚糖和葡聚糖水凝胶聚合物、直链淀粉、菊粉、果胶和瓜尔胶、壳聚糖、壳多糖、肝素和透明质酸。合成的生物相容的或生物可降解的聚合物包括聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、PLGA-环氧乙烷延胡索酸、酯化至聚乙二醇1000的PLGA-α -生育酚琥珀酸酯(PLGA-TGPS)、聚酐聚[1，6-二(对-羧基苯氧基)己烷](pCPH)、聚(羟丁酸-共羟基戊酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-ε-己内酯(PCL)、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯(PAC)、聚(乙基)氰基丙烯酸酯(PEC)、聚异丁基氰基丙烯酸酯、聚-N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(聚(HPMA))、聚-β-R-羟基丁酸酯(PHB)、聚-β -R-羟基链烷酸酯(PHA)、聚β -R-苹果酸、磷脂-胆固醇聚合物、2- 二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱/聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(D0PC/PEG-DSPE) /胆固醇、乙基纤维素、基于环糊精(CD)的聚轮烷和聚类轮烷、聚丁烯琥珀酸盐或酯(PBS)、聚原酸酯、聚原酸酯-聚脒共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、掺入潜在性酸以控制降解速率的聚原酸酯、和特别地，聚(乙二醇)/聚(对苯二甲酸丁二醇酯)共聚物。
[0049]乙基纤维素(EC)是众所周知的且易于获得的在药物和食品科学中使用的生物材料。其是纤维素衍生物，其中一些葡萄糖羟基被乙醚替换。参见Martinac等人，J.Microencapsulation, 22(5):549-561(2005)及其中引用的参考资料，其描述了使用乙基纤维素作为生物相容的聚合物来制备微球体的方法。关于乙基纤维素和制备乙基纤维素衍生物的方法的详细描述，也参见US4，210，529(1980)及其中引用的参考资料。
[0050]聚-D, L-丙交酯_共-乙交酯(PLGA)也是众所周知的被美国食品和药品管理局(FDA)批准用于组织工程学和药物递送系统的生物相容的和生物可降解的聚合物。PLGA是包含乙醇酸和乳酸单体的聚酯。关于合成PLGA和制备PLGA纳米颗粒的描述，参见Asteteand Sabliov, Biomater.Sc1.Polym.Ed.，17(3):247-89(2006)及其中引用的参考资料。
[0051]聚-ε-己内酯(PCL)是另一个被FDA批准在人类中用作药物递送装置的生物相容的和生物可降解的聚合物。PCL是ε-己内酯的聚酯，其在体内迅速水解以形成无毒的或低毒性的羟基羧酸。关于制备PCL的描述,参见Labet and Thielemans, ChemicalSociety Reviews38:3484 3504 (2009)及其中引用的参考资料。关于制备和使用基于PCL的微球体和纳米球体(用作递送系统)的描述，参见Sinha et al.，Int.J.Pharm.，278(1): 1-23(2004)及其中引用的参考资料。
[0052]聚原酸酯(POE)是设计用于药物递送的生物可蚀解聚合物。其通常是乙烯酮缩二乙醇(优选环化二乙烯酮缩二乙醇，例如3，9-二亚甲基-2，4，8，10-四氧杂螺[5.5]_i烷)的聚合物，其通过乙二醇缩合来聚合以形成原酸酯键。聚原酸酯的合成和不同类型的描述可见于例如US4，304，767。可通过换入或换出不同的疏水二醇和多元醇(例如用癸三醇替换己三醇)；以及可通过将潜在性酸(例如辛二酸等)加入骨架以增加PH灵敏度来修饰聚原酸酯，以控制其药物释放特征和降解速率。其它的对聚原酸酯的修饰包括，整合胺以增加功能性。聚原酸酯的形成、描述和用途描述于US5，968，543 ；US4, 764, 364 ；Heller 和 Ba rr, Biomacromolecules, 5(5):1625-32(2004)；和 Heller, Adv.Drug.Deliv.Rev.，57:2053-62(2005)。
[0053]如本文中所用，表述“喷雾干燥”意指，通过使用喷雾干燥器从浆液或悬液产生包含微米尺寸的颗粒的干燥粉末的方法。喷雾干燥器使用雾化器或喷雾嘴来将悬液或浆液分散成液滴尺寸受控的喷雾。通过喷雾干燥可产生10至500 μ m的液滴尺寸。随着溶剂(水或有机溶剂)的干燥，蛋白物质干燥成微米尺寸的颗粒，形成粉末样物质；或者对于蛋白-聚合物悬液，在干燥期间，聚合物在蛋白负载周围形成硬化的壳。
[0054]本发明的微粒包含由聚合物皮层或涂层包绕的蛋白核心。简言之，形成微粒化蛋白颗粒，其随后在聚合物溶液(聚合物溶于溶剂中)中被分散以形成蛋白-聚合物悬液。蛋白-聚合物悬液随后被分散成微粒化(雾化)微滴，并将溶剂从微粒中馏出。
[0055]在一个实施方案中，通过制造蛋白溶液和随后将蛋白溶液经历分散和加热以形成包含蛋白的干燥粉末来形成微粒化蛋白颗粒。用于形成微粒化蛋白颗粒的一个方法是喷雾干燥。在一个实施方案中，蛋白是治疗性蛋白，所述治疗性蛋白经配制包含缓冲剂、稳定剂和其他药学上可接受的赋形剂，以制造治疗性蛋白的药物制剂。示例性药物制剂描述于US7, 365，165，US7, 572，893，US7, 608，261，US7, 655，758，US7, 807，164，US2010-0279933，US2011-0171241 和 PCT/US11/54856 中。
[0056]包含在本发明的药物制剂内的治疗性蛋白的量可取决于所述制剂的期望的特定性质以及意欲使用所述制剂的特定环境和目的。在某些实施方案中，药物制剂可包含约lmg/mL 至约 500mg/mL 的蛋白；约 5mg/mL 至约 400mg/mL 的蛋白；约 5mg/mL 至约 200mg/mL的蛋白；约25mg/mL至约180mg/mL的蛋白；约25mg/mL至约150mg/mL的蛋白4450mg/mL至约180mg/mL的蛋白。例如，本发明的制剂可包含约lmg/mL ;约2mg/mL ;约5mg/mL ;约IOmg/mL ；约 15mg/mL ；约 20mg/mL ；约 25mg/mL ；约 30mg/mL ；约 35mg/mL ；约 40mg/mL ；约 45mg/mL ;约 50mg/mL ;约 55mg/mL ;约 60mg/mL ;约 65mg/mL ;约 70mg/mL ;约 75mg/mL ;约 80mg/mL ；约 85mg/mL ;约 86mg/mL ;约 87mg/mL ;约 88mg/mL ;约 89mg/mL ;约 90mg/mL ;约 95mg/mL ;约lOOmg/mL ;约 105mg/mL ;约 11 Omg/mT,;约 115mg/mL ;约 120mg/mL ;约 125mg/mL ;约 130mg/mL ;约 131mg/mL ;约 132mg/mL ;约 133mg/mL ;约 134mg/mL ;约 135mg/mL ;约 140mg/mT,;约145mg/mL ;约 150mg/mL ;约 155mg/mL ;约 160mg/mL ;约 165mg/mL ;约 170mg/mL ;约 175mg/mL ;约 180mg/mL ;约 185mg/mL ;约 190mg/mL ;约 195mg/mL ;约 200mg/mL ;约 205mg/mL ;约210mg/mL ;约 215mg/mL ;约 220mg/mL ;约 225mg/mL ;约 230mg/mL ;约 235mg/mL ;约 240mg/mL ;约 245mg/mL ;约 250mg/mL ;约 255mg/mL ;约 260mg/mL ;约 265mg/mL ;约 270mg/mL ;约275mg/mL ;约 280mg/mL ;约 285mg/mL ;约 200mg/mL ;约 200mg/mL ;或约 300mg/mL 的治疗性蛋白。
[0057]本发明的药物制剂包含一种或多种赋形剂。术语“赋形剂”，如本文中所用，意指加入制剂以提供期望的稠度、粘度或稳定作用的任意非治疗性试剂。
[0058]本发明的药物制剂还可包含一种或多种碳水化合物，例如一种或多种糖。糖可以是还原性糖或非还原性糖。术语“还原性糖”包括例如具有酮或醛基的糖，且包含反应性半缩醛基团，所述基团允许糖用作还原剂。还原性糖的具体实例包括果糖、葡萄糖、甘油醛、乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖和麦芽糖。非还原性糖可包含异头碳，其为缩醛并且实质上不与氨基酸或多肽反应以起始麦拉德反应。非还原性糖的具体实例包括蔗糖、海藻糖、山梨糖、蔗糖素、松三糖和棉子糖。糖酸包括例如糖二酸(saccharic acid)、葡糖酸和其他多羟基糖及其盐。
[0059]包含在本发明的药物制剂内的糖的量可根据意欲使用所述制剂的特定环境和目的而不同。在某些实施方案中，所述制剂可包含约0.1%至约20%的糖；约0.5%至约20%的糖；约1%至约20%的糖；约2%至约15%的糖；约3%至约10%的糖；约4%至约10%的糖；或约5%至约10%的糖。例如，本发明的药物制剂可包含约0.5%;约1.0%;约1.5%;约 2.0% ;约 2.5% ;约 3.0% ;约 3.5% ;约 4.0% ;约 4.5% ;约 5.0% ;约 5.5% ;约 6.0% ；6.5% ;约 7.0% ;约 7.5% ;约 8.0% ;约 8.5% ;约 9.0% ;约 9.5% ;约 10.0% ;约 10.5% ；约 11.0% ;约 11.5% ;约 12.0% ;约 12.5% ;约 13.0% ;约 13.5% ;约 14.0% ;约 14.5% ；约 15.0% ;约 15.5% ;约 16.0% ；16.5% ;约 17.0% ;约 17.5% ;约 18.0% ;约 18.5% ;约19.0% ;约19.5% ;或约20.0%的糖(例如蔗糖)。
[0060]本发明的药物制剂还可包含一种或多种表面活性剂。如本文中所用，术语“表面活性剂”意指，减少溶解了其的液体的表面张力和/或减少油和水之间的界面张力的物质。表面活性剂可是离子型或非离子型的。可包含在本发明的制剂中的示例性非离子型表面活性剂包括例如烷基聚(氧化乙烷)、烷基多聚葡萄糖苷(例如辛基葡糖苷和癸基麦芽苷)、脂肪醇例如鲸蜡醇和油醇、椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA和椰油酰胺TEA。可包含在本发明的制剂中的具体非离子型表面活性剂包括例如，聚山梨酯例如聚山梨酯20、聚山梨酯28、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯65、聚山梨酯80、聚山梨酯81和聚山梨酯85 ;泊洛沙姆例如泊洛沙姆188、泊洛沙姆407 ;聚乙烯-聚丙烯二醇；或聚乙二醇(PEG)。聚山梨酯20也称为吐温20、脱水山梨醇单月桂酸酯和聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯。
[0061]包含在本发明的药物制剂内的表面活性剂的量可根据所述制剂的期望的特定性质以及意欲使用所述制剂的特定环境和目的而不同。在某些实验方案中，所述制剂可包含约0.05%至约5%的表面活性剂；或约0.1%至约0.2%的表面活性剂。例如，本发明的制剂可包含约 0.05% ;约 0.06% ;约 0.07% ;约 0.08% ;约 0.09% ;约 0.10% ;约 0.11% ;约0.12% ;约 0.13% ;约 0.14% ;约 0.15% ;约 0.16% ;约 0.17% ;约 0.18% ;约 0.19% ;约0.20% ;约 0.21% ;约 0.22% ;约 0.23% ;约 0.24% ;约 0.25% ;约 0.26% ;约 0.27% ;约0.28% ;约0.29% ;或约0.30%的表面活性剂(例如聚山梨酯20)。
[0062]本发明的药物制剂还可包含一种或多种缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液具有覆盖pH范围5.5-7.4的部分或全部的缓冲范围。在一个实施方案中，缓冲液具有约
6.0±0.5的pKa。在某些实施方案中，缓冲液包含磷酸盐缓冲液。在某些实施方案中，缓冲液以 5mM±0.75mM 至 15mM±2.25mM ;6mM±0.9mM 至 14mM±2.1mM ;7mM±l.05mM 至13mM±l.95mM ;8mM±l.2mM 至 12mM±l.8mM ;9mM±l.35mM 至 llmM±l.65mM ;10mM±l.5mM ；或约IOmM的浓度存在。在某些实施方案中，缓冲系统包含pH为6.0±0.5的10mM± 1.5mM的组氨酸。
[0063]本发明的药物制剂可具有约5.0至约8.0的pH。例如，本发明的制剂可具有约5.0 ;约 5.2 ;约 5.4 ;约 5.6 ;约 5.8 ;约 6.0 ;约 6.2 ;约 6.4 ;约 6.6 ;约 6.8 ;约 7.0 ;约 7.2 ；约7.4 ;约7.6 ;约7.8 ;或约8.0的pH。
[0064]在一个具体实施方案中，治疗性蛋白是VEGF Trap蛋白。用于形成微粒化VEGFTrap蛋白颗粒的药物制剂可包含约10mg/mL至约100mg/mL的VEGF Trap蛋白、约IOmg/mL、约 15mg/mL、约 20mg/mL、约 25mg/mL、约 30mg/mL、约 35mg/mL、约 40mg/mL、约 45mg/mL、约50mg/mL、约 55mg/mL、约 60mg/mL、约 65mg/mL、约 70mg/mL、约 75mg/mL、约 80mg/mL、约 85mg/mL、约90mg/mL、约95mg/mL、或约100mg/mL的VEGF Trap蛋白。溶液可包含一种或多种约5mM至约50mM的缓冲液。在一个实施方案中，缓冲液是具有约6±0.5的pH的约IOmM的磷酸盐。溶液还可包含约1%至约10%浓度的蔗糖。在一个实施方案中，溶液包含约2% w/w的蔗糖。 [0065]在一些实施方案中，治疗性蛋白溶液包含在10mM、pH6.2的磷酸盐、2%蔗糖和任选地0.1 %聚山梨酯中的约25mg/mL或约50mg/mL的VEGF Trap蛋白。
[0066]治疗性蛋白制剂随后经历分散和干燥以形成微粒化蛋白颗粒。制造微粒化蛋白颗粒的一个方法是，将蛋白溶液经历喷雾干燥。喷雾干燥在本领域内是公知的并且可在设备例如BtiCHI Mini Spray Dryer B-290 (Biichi Labortechnik AG, Flawi 1，CH)上进行。在一个具体实施方案中，将蛋白溶液(例如但不限于上文所述的任一种VEGF Trap制剂)以约2mL/min至约15mL/min或约7mL/min的速率注入喷雾干燥器。喷雾干燥器的入口温度设置为高于水沸点的温度，例如约130°C。出口温度低于水沸点且高于室温，例如55°C。在一个具体实施方案中，将蛋白溶液(例如VEGF Trap溶液或IgG溶液)在约130°C的入口温度和约55°C的出口温度下以约7mL/min的速率注入Mini Spray Dryer B-290,抽吸器设置为33m3/h，喷雾气体设置为530L/h。
[0067]形成的微粒化蛋白颗粒的尺寸为约Ιμπι至约100 μ m直径，取决于具体制剂和赋形剂和蛋白的浓度。在一些实施方案中，微粒化蛋白颗粒具有约Iym至约100 μ m、约Ιμπι至约40 μ m、约2 μ m至约15 μ m、约2.5 μ m至约13 μ m、约3 μ m至约10 μ m、约5 μ m、约6 μ m、约7 μ m、约8 μ m、约9 μ m、约10 μ m、约Ilym或约12 μ m的直径。
[0068]微粒化蛋白颗粒随后用生物相容的和生物可降解的聚合物包被。这可通过将微粒化蛋白颗粒悬浮在聚合物溶液中来实现。聚合物溶液实质上是溶解在溶剂中的聚合物。例如，生物相容的和生物可降解的聚合物可特别地溶解于二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯或其他有用的溶剂中。乙酸乙酯是众所周知的安全的溶剂，并且常常用于药物、植入物和食物的制备。
[0069]在一些实施方案中，聚合物可是乙基纤维素(“EC”)、聚(乳酸)(“PLA”)、聚原酸酯(“Ρ0Ε”)、聚-D, L-丙交酯-共-乙交酯(“PLGA”)或聚-ε -己内酯(“PCL”)。聚合物可以以约 10mg/mL 至约 300mg/mL、约 15mg/mL 至约 295mg/mL、约 20mg/mL 至约 290mg/mL、约 25mg/mL 至约 280mg/mL、约 30mg/mL 至约 270mg/mL、约 35mg/mL 至约 265mg/mL、约40mg/mL 至约 260mg/mL、约 45mg/mL 至约 260mg/mL、约 50mg/mL 至约 255mg/mL、约 55mg/mL至约 250mg/mL、约 20mg/mL、约 25mg/mL、约 30mg/mL、约 35mg/mL、约 40mg/mL、约 45mg/mL、约50mg/mL、约 75mg/mL、约 100mg/mL、约 125mg/mL、约 150mg/mL、约 lTSmg/mLj^ZOOmg/mLj.^225mg/mL或约250mg/mL的浓度溶解于溶剂(例如乙酸乙酯)中。
[0070]将微粒化蛋白颗粒以约10mg/mL至约100mg/mL、约15mg/mL至约95mg/mL、约20mg/mL 至约 90mg/mL、约 25mg/mL 至约 85mg/mL、约 30mg/mL 至约 80mg/mL、约 35mg/mL 至约 75mg/mL、约 40mg/mL 至约 70mg/mL、约 45mg/mL 至约 65mg/mL、约 50mg/mL 至约 60mg/mL、约 25mg/mL、约 30mg/mL、约 35mg/mL、约 40mg/mL、约 45mg/mL 或约 50mg/mL 的浓度加入聚合物溶液。将颗粒混合以形成浆液或悬液，随后将其经历分散和干燥以形成聚合物包被的蛋白颗粒(即微粒)。
[0071]在一个实施方案中，蛋白颗粒-聚合物溶液悬液经历喷雾干燥，其以与制备微粒化蛋白颗粒的方法类似的方式进行，但是使用减少的进入温度以防止引燃有机溶剂或聚合物。简言之，以约5mL/min至约20mL/min或约12.5mL/min的速率将蛋白颗粒-聚合物溶液悬液注入喷雾干燥器。以12.5mL/min的速率将悬液注入喷雾干燥器,抽吸器空气和喷雾气体的流速分别为约530L/h和35m3/h(mm)。入口温度设置为90°C且出口温度设置为约54°C。喷雾干燥器的入口温度设置为高于溶剂闪点的温度，例如设置为约90°C。出口温度设置为低于进入温度且高于室温的温度，例如约54°C。在一个具体实施方案中，将在约50mg/mL至约250mg/mL聚合物/乙酸乙酯溶液中包含约50mg/mL蛋白颗粒(例如VEGF Trap)的悬液
以约12.5mL/min的速率注入BtCHI Mini Spray Dryer B-290，其中入口温度为约90°C，
出口温度为约54°C，抽吸器设置为约35m3/h，喷雾气体设置为约530L/h。
[0072]所产生的微粒(其含有在聚合物皮层内的蛋白颗粒核心)具有约2μπι至约70 μ m>^J 5 μ m 65 μ m>^J 10 μ m 60 μ m>^J 15 μ m 55 μ m>^J 20 μ m 50 μ m、约15 μ m、约20 μ m、约25 μ m、或约30 μ m的直径。粒度差异在很大程度上反映聚合物皮层的厚度，尽管蛋白核心的直径可在一定程度上造成粒度差异。操纵聚合物溶液的起始浓度和/或操纵聚合物本身可控制微粒的直径。例如，使用50mg/mL聚合物制备的微粒具有约15 μ m至约20 μ m的粒度中值,然而使用250mg/mL聚合物制备的微粒具有约30 μ m的粒度中值.[0073]本发明的微粒用于蛋白治疗剂的限时释放或延长释放。例如，预期VEGF Trap微粒用于VEGF Trap治疗性蛋白在例如玻璃体(用于治疗眼血管疾病)中或在皮下植入物(用于延长释放VEGF Trap以治疗癌症或其他疾病)中的延长释放。
[0074] 本发明的微粒在生理水性环境中在约37°C以相对恒定的速率在延长的时期内(至少60天)释放蛋白。一般而言，用较高浓度的聚合物(例如250mg/mL)制备的微粒倾向于显示相对线性的蛋白释放特征；而用较低浓度的聚合物(例如50mg/mL)制备的微粒倾向于显示起始的突然释放和随后的延迟的突然释放。此外，相较于从较低浓度的聚合物形成的微粒，从较高浓度的聚合物形成的微粒显示更慢的蛋白释放速率。随时间过去从微粒释放的蛋白质的质量与起始蛋白材料的质量一致。没有或几乎没有发生蛋白降解。
[0075]实施例
[0076]本申请提供下述实施例，以给本领域技术人员提供如何制造和使用本发明的方法和组合物的完整的公开内容和描述，并且下述实施例不意欲限制本发明的保护范围。本申请已尽量确保所使用的数字(例如量、大小等)的准确性，但应当考虑到一些实验误差和偏差。
[0077]在下述实施例中，VEGF-Trap蛋白(“VGT”)(其为包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的多肽的二聚体)用作示例性受体-Fe融合蛋白。
[0078]实施例1:微粒化蛋白
[0079]在IOmM 磷酸盐、2%蔗糖、ρΗ6.2 中含有 25mg/mL VEGF Trap 蛋白(“VGT”)、25mg/mL VGT加0.1 %聚山梨酯80和50mg/mL VGT的溶液各自独立地在喷雾干燥超微粉粉碎机(BUCiI Mini Spray Dryer B-290, Biichi Labortechnik AG, FlawiI, CH)中被雾化以形
成包含VEGF Trap的微滴。利用加热来将水从微滴中蒸发，从而形成包含VEGF Trap的粉末。入口温度设置在130°C，出口温度设置在约55°C。抽吸器设置在33m3/h，喷雾气体设置在530L/h。以约7mL/min的速率注入VGT溶液。
[0080]形成的VGT颗粒的粒度通过微流成像(MFI)和动态光散射(DLS)来测量。图1描述了由MFI测定的、衍生自25mg/ml VGT、25mg/ml VGT加0.1 %聚山梨酯80和50mg/ml VGT浓度中每一个的VGT颗粒的颗粒大小分布。对于所有的浓度，VGT颗粒的圆当量直径(ECD)在约I μ m至约39 μ m的范围内，其中大部分颗粒在约2 μ m至约14 μ m的粒度范围内。对于25mg/ml VGT的溶液，颗粒主要集中在约2.5 μ m至约8.8 μ m的范围内，并具有约6 μ m的众数。对于25mg/ml VGT加0.1 %聚山梨酯80的溶液，颗粒主要集中在约2.5 μ m至约9.7 μ m的范围内，并具有约6 μ m的众数。对于50mg/ml VGT的溶液，颗粒主要集中在约2.7 μ m至约12.8 μ m的范围内，并具有约7 μ m的众数。通过MFI和DLS方法测定的各个制剂的直径中值描述于表1中。
[0081]VGT颗粒在注射用水中进行重建，并且通过尺寸排阻(即，尺寸排阻-超高效液相色谱法(SE-UPLC))来检查，以确定蛋白纯度。相对于起始材料，在微粒化后没有观察到纯度的变化(参见表3)。
[0082]表1:通过MFI和DLS测定的蛋白颗粒粒度中值(μ m)
[0083]
【权利要求】
1.包含用聚合物包被的蛋白的组合物，其中所述组合物是具有约5μ m至约40 μ m直径的颗粒。
2.权利要求1的组合物，其中所述蛋白是抗原结合蛋白。
3.权利要求1或权利要求2的组合物，其中所述蛋白包含Fe结构域。
4.权利要求1-3的任一项的组合物，其中所述蛋白是抗体。
5.权利要求1-3的任一项的组合物，其中所述蛋白是受体-Fe融合蛋白。
6.权利要求1-4的任一项的组合物，其中所述蛋白是抗体片段。
7.权利要求5的组合物，其中所述蛋白是VEGF-Trap。
8.权利要求4的组合物，其中所述抗体是人单克隆抗体。
9.权利要求1-8的任一项的组合物，其中所述聚合物是生物可降解的聚合物。
10.权利要求1-9的任一项的组合物，其中所述聚合物选自--聚(乳酸)(PLA)、聚酐聚[I, 6- 二(对-羧基苯氧基)己烷](pCPH)、聚(羟丁酸-共羟基戊酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-D, L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、聚原酸酯(POE)、乙基纤维素(EC)和聚-ε -己内酯(PCL)。
11.权利要求10的组合物，其中所述蛋白是陷阱蛋白或抗体，并且所述聚合物是Ρ0Ε。
12.权利要求1-11的任一项的组合物,其中所述颗粒的平均直径是约15μ m。
13.权利要求1-10的任一项的组合物，其中所述蛋白是陷阱蛋白或抗体，并且所述聚合物是PLGA。
14.一种微粒，其具有约2 μ m至约70 μ m的直径，并且包含具有约2 μ m至约12 μ m的直径的蛋白颗粒核心和生物可降解的聚合物皮层。
15.权利要求14的微粒，其中所述生物可降解的聚合物选自--聚(乳酸)(PLA)、聚酐聚[I, 6- 二(对-羧基苯氧基)己烷](pCPH)、聚(羟丁酸-共羟基戊酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-D, L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、聚原酸酯(POE)、乙基纤维素(EC)和聚-ε -己内酯(PCL)。
16.权利要求14或权利要求15的微粒，其中所述蛋白颗粒核心包含抗原结合蛋白。
17.权利要求14-16的任一项的微粒，其中所述抗原结合蛋白是受体-Fe融合蛋白。
18.权利要求14-17的任一项的微粒，其中所述蛋白颗粒核心包含VEGF-Trap，且所述聚合物皮层包含POE、PLA或PLGA。
19.权利要求14-16的任一项的微粒，其中所述抗原结合蛋白是抗体。
20.权利要求14-16和19的任一项的微粒，其中所述抗体是人IgG分子，并且所述聚合物皮层包含POE、PLA或PLGA。
21.多个微粒，其具有约2μ m至约70 μ m的直径，并且包含具有约2 μ m至约12 μ m的直径的蛋白颗粒核心和生物可降解的聚合物皮层。
22.权利要求21的多个微粒，其中所述微粒以不同的速率降解，并且在水性环境中在延长的时期内释放蛋白。
23.权利要求22的多个微粒，其中所述时期为至少3天。
24.权利要求22或权利要求23的多个微粒，其中所述时期为至少60天。
25.权利要求21-24的任一项的多个微粒，其中所述蛋白是抗原结合蛋白。
26.权利要求21-25的任一项的多个微粒，其中所述蛋白是受体-Fe融合蛋白。
27.权利要求21-26的任一项的多个微粒，其中所述受体-Fe融合蛋白是VEGF-Trap，并且所述聚合物皮层包含POE、PLA或PLGA。
28.权利要求21-25的任一项的多个微粒，其中所述抗原结合蛋白是抗体。
29.权利要求28的多个微粒，其中所述抗体是人IgG分子，并且所述聚合物皮层包含POE、PLA 或 PLGA。
30.治疗疾病的方法，其包括将治疗上有效量的权利要求21-29任一项的多个微粒施用给患者，其中治疗性蛋白在延长的时期内从所述微粒释放。
31.权利要求30的方法，其中所述蛋白是VEGF-Trap，并且所述聚合物是POE、PLA或PLGA0
32.权利要求30或权利要求31的方法，其中所述疾病是眼科疾病，并且将所述微粒以不少于60天的间隔递送至患者的玻璃体。
33.制备包含蛋白和生物可降解的聚合物的组合物的方法，所述方法包括如下步骤: a.获得蛋白颗粒； b.在包含聚合物和溶剂的溶液中悬浮蛋白颗粒；和 c.去除溶剂， 其中形成包含由聚 合物包被的蛋白的颗粒。
34.权利要求33的方法，其中通过喷雾干燥包含所述蛋白的溶液来获得所述蛋白颗粒。
35.权利要求34的方法，其中所述喷雾干燥通过双喷嘴超声法、单喷嘴超声法或电喷射来进行。
36.权利要求33-35的任一项的方法，其中通过下述来蒸发所述溶剂:经由喷雾干燥产生步骤(b)的蛋白悬液的分散相。
37.权利要求33-36的任一项的方法，其中通过加热蒸发、空气蒸发或萃取来去除所述溶剂。
38.权利要求33-37的任一项的方法，其中所述聚合物选自--聚(乳酸)(PLA)、聚酐聚[I, 6- 二(对-羧基苯氧基)己烷](pCPH)、聚(羟丁酸-共羟基戊酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-D, L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、聚原酸酯(POE)、乙基纤维素(EC)和聚-ε -己内酯(PCL)。
39.权利要求33-38的任一项的方法，其中所述蛋白是受体-Fe融合蛋白或抗体。
40.权利要求33-39的任一项的方法，其中所述蛋白是VEGF-Trap或IgG分子，并且所述聚合物是POE、PLA或PLGA。
41.权利要求33-40的任一项的方法，其中所述颗粒具有约15μ m的平均直径。
42.调节蛋白释放的方法，其包括，步骤(a)将蛋白与生物可降解的聚合物组合以形成蛋白-聚合物复合物；随后步骤(b)将所述蛋白-聚合物复合物与溶剂接触，其中所述聚合物随时间过去而降解，并且所述蛋白逐渐地释放到溶剂中。
43.权利要求42的方法，其中根据权利要求33-41的任一项进行步骤(a)。
44.权利要求42或权利要求43的方法，其中所述蛋白是VEGF-Trap或IgG分子，并且所述聚合物是POE、PLA或PLGA。
45.权利要求42-44的任一项的方法，其中所述颗粒具有约15μ m的平均直径。
46.权利要求42-45的任一项的方法，其中所述蛋白在至少3天期间从所述蛋白-聚合物复合物释放。
47.权利要求42-46的任一项的方法，其中所述蛋白在至少60天期间从所述蛋白-聚合物复合物释放。
48.权利要求42-47的任一项的方法，其中所述溶剂是缓冲盐水。
49.权利要求42-47的任一项的方法，其中所述溶剂是体内的。
50.权利要 求42-47和权利要求49的任一项的方法，其中所述溶剂是玻璃体液。
【文档编号】A61K9/16GK103957898SQ201280056324
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2012年11月18日 优先权日:2011年11月18日
【发明者】H·陈, S·沃尔什 申请人:瑞泽恩制药公司