专利名称：抑制清道夫受体-a和增强对抗原的免疫应答的方法
技术领域：
本发明涉及免疫疗法的普通领域，更具体地说，本发明提供增强对抗原的 免疫应答的方法。
相关领域
A类巨噬细胞清道夫受体(SR-A)主要由巨噬细胞(M(fO表达，它们是抗微生 物的第一防线(l)。 SR-A是结构各异的膜受体的大家族的原型成员，统称为清 道夫受体(2，3)。该组受体识别许多配体，包括化学修饰或改变的分子，内质网 (ER)驻留陪伴分子，以及与血管疾病的发生有关的改性脂蛋白(3-5)。 SR-A最 初鉴定为乙酰化低密度脂蛋白(acLDL)的清除受体(3，6)，因其与动脉粥样硬化 有关，对其的研究主要涉及该疾病。然而，现在还证明革兰氏阴性细菌的脂多 糖(LPS)和革兰氏阳性细菌的脂磷壁酸竞争结合其它已知的SR-A配体，表明 SR-A起到模式识别受体的作用(2)。在这点上，Suzuki等首先报道Si -^r,一小 鼠对单核细胞增生利斯特菌(1/WeWa mo"oc^ogene"和单纯疱疹病毒感染的 保护作用受损(7)。其他人进行的独立研究也表明SR-A的表达可能对于针 对细菌感染的免疫应答的增强至关重要(8-10)。然而。虽然有关于SR-A在 动脉粥样硬化和病原体识别中的信息可用，但其在获得性免疫中的作用知 之甚少，因此，需要开发能调节SR-A的技术以增强免疫应答。
发明概述本发明提供增强个体对所需抗原的免疫应答的方法。该方法包括给予该个
体所需抗原和能抑制A类巨噬细胞清道夫受体(SR-A)的药物。将该药物和抗原
给予该个体后，该个体对该抗原的免疫应答得到增强。
另一实施方式提供增强个体对肿瘤的免疫应答的方法。该方法包括给予该
个体能抑制A类巨噬细胞清道夫受体(SR-A)的药物，其用量足以增强对肿瘤的 免疫应答，其中给予该药物后该肿瘤的生长受到抑制。该方法还可包括给予该 个体该肿瘤表达的抗原。
所述药物可以是能特异性抑制SR-A的任何组合物。这种药物的例子包括 但不限于干扰SR-AmRNA转录和/或翻译的多核苷酸。所述药物还可以是结合 并拮抗SR-A的抗体。所述药物还可以是能用作SR-A拮抗剂的任何已知的亚 磺酰氨基苯甲酰苯胺(sulfonamidobenzanilide)化合物。
还提供了增强对所需抗原的免疫应答的方法，包括给予个体包含树突细胞 的组合物，其中所述树突细胞的特征在于其SR-A受到特异性抑制。该方法还 包括先将所述树突细胞与所需抗原在体外接触再给予该个体。
本发明还提供包含基本上纯的哺乳动物树突细胞群的组合物，其中所述树 突细胞的特征在于其SR-A活性受到特异性抑制。
附图简述
图1图示了用电离射线(IR)处理的D121 Lewis肺肿瘤细胞免疫接种导致 Si -,A小鼠排斥免疫原性不佳的肿瘤所获得的数据。用137Cs照射D121细胞 免疫小鼠(11 = 5)， 一周后用活的D121肿瘤细胞(4"05个细胞)攻击。各曲 线表示各小鼠中的肿瘤生长情况QtK0.05，免疫的Si "—'—与未免疫的Si J—z— 或免疫的野生型(WT)小鼠)。所示的结果来自进行的3次代表性实验。
图2图示的数据证明UV-照射的B16黑色素瘤细胞在SiM〃小鼠中提供 肿瘤保护作用。用UV-照射的B16细胞、源自B16细胞的细胞裂解液免疫小 鼠(n = 5)，或不处理。 一周后，用活的B16肿瘤细胞(2"05个细胞)攻击小 鼠，随后检测肿瘤生长&<0.05，免疫的SiM^与未免疫的Si -X"或免疫的 WT小鼠)。所示结果表示进行的3次独立实验。
图3图示的数据显示CD8+T细胞对于S/ -^々'小鼠的保护性抗肿瘤免疫力至关重要。免疫接种前通过体内注射抗体以耗尽T细胞的诸亚组。然后用照射 的D121细胞免疫小鼠(11=10)，随后用活的D121细胞进行肿瘤攻击。隔天监测 肿瘤发病率(log秩检验尸-0.002， CD8+T-细胞耗尽组与IgG组；？ = 0.002， 角叉聚糖组与IgG组；尸>0.05， CD4+耗尽组与IgG组)。
图4图示的数据显示用经照射肿瘤细胞免疫接种在S7M^小鼠中引发抗 原-特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。用经照射的B16细胞免疫一周后， 在20 U/ml IL-2存在下用或不用5吗/ml CTL表位gpl00關、TRP2!詣刺 激WT或SiM"-小鼠(11=3)分离的脾细胞(^106个细胞)过夜，或用经照射 c丄o 2w肥现iJizi 2W肥^lN眾。术州tiL丄sru丄"V式验粒柳J IFN陽y严里。显不/ 二 个独立实验的代表性数据。
图5图示的数据证明WT和Si -J;小鼠的M小有效吞噬凋亡细胞。用 CFSE标记UV处理的U121肿瘤细胞。用等体积的胎牛血清温育来猝灭未 结合的染料。洗涤细胞，用巯基醋酸盐(或酯)-引发的M小以2:l比例共同培 养4小时。收集附着的M々，用CDllb-PE抗体染色。利用B-D FACScaliber 仪，通过荧光激活的细胞分选(FACS)将Mc()的吞噬作用定量测定为双阳性染 色细胞的百分比&> 0.05， SAd;的M小与WT的M小)。所示结果代表了 3 个独立实验。
图6图示的数据证明用经照射肿瘤细胞治疗消除了 Si -^;小鼠中己有的 肿瘤细胞。在第0天，小鼠(『8)已有D121路易斯(Lewis)肺肿瘤细胞或B16 黑色素瘤细胞(2xl()S个细胞)。在第2、 4、 6和8天给予经照射的D121细胞或 B16细胞。各曲线表示各小鼠中的肿瘤生长情况(/K 0.05，免疫的S7 -^;与 未免疫的Si -力々-)。所示结果来自进行的3次代表性实验。
图7A和7B图示的数据证明SR-A缺陷型DC更有效地刺激抗原特异性肿 瘤免疫力。图7A:第7天用OVA蛋白质(IO fig/ml)脉冲WT或5T -^— C57BL/6 小鼠的骨髓衍生树突细胞(BM-DQ6小时，然后用LPS (10 ng/ml)刺激过夜。 每隔一周，用抗原加载的WT或Si -」々—DC(lxl(^个细胞/小鼠)免疫接种WT C57BL/6小鼠(11=6)两次，然后用lxl()S个B16-OVA黑色素瘤细胞进行肿 瘤攻击。图7B:每隔一周，用OVA蛋白质-脉冲的WT或Si -^—BM-DC免 疫WT C57BL/6小鼠两次。第二次免疫接种1周后，收集脾细胞并在有IL-2存在下用OVA-特异性MHC I-限制性CTL表位OVA257-264 (1 pg/ml)刺激。 采用ELISPOT试验检测产生IFN-Y的细胞的数量。
图8A和8B图示的数据证明SR-A沉默的DC高度有效地刺激抗原-特异 性抗肿瘤免疫力。图8A:用LV-SW-shRNA， LV-扰乱性(Scramble)-shRNA 以MOI为10转染DC1.2细胞("106个细胞/孔)，或不处理。2天后收集 细胞，并经免疫印迹。(3-肌动蛋白用作对照。图8B:感染2天后收集DC 细胞，用OVA蛋白质(IO吗/ml)脉冲3小时。用LPS (10 ng/ml)刺激过夜后， 彻底洗涤细胞，皮下注射入小鼠。 一周后重复免疫接种。第二次免疫一周 后用B16-OVA攻击小鼠。
图9A和9B图示的数据证明SR-A沉默DC高度有效地引发抗原-特异性 CTL应答。图9A:用LV-扰乱性(Scramble)-shRNA或LV-57L4-shRNA感染 的DC1.2细胞免疫C57BL/6小鼠。然后收集脾细胞，用OVA特异性MHC I-限制性CTL表位OVA257.264刺激。采用ELISPOT试验检测IFNj产量。
图9B:在有IL-2存在下用OVA257.264刺激免疫动物的脾细胞5天，用不同
比例的"Cr-标记B16-OVA肿瘤细胞共同培养。采用铬释放试验检测T-效 应细胞的细胞毒性。
发明详述
本发明提供增强个体对所需抗原的免疫应答的方法。该方法包括给予该个 体能特异性抑制A类巨噬细胞清道夫受体(SR-A)的药物。该药物的给予量足能 有效增强该个体对该抗原的免疫应答。因此，本发明方法在个体中引发的对所 需抗原的免疫应答强于未给予该药物时。在某些实施方式中，还可包括将所需 抗原给予该个体。
"所需抗原"是个体对其的增强免疫应答预期能提供治疗益处的抗原。增 强的免疫应答可以是对抗原的增强体液免疫应答，对抗原的增强细胞介导应答 或它们的组合。
能特异性抑制SR-A的药物是通过与SR-A蛋白质结合或与编码SR-A的 DNA和/或RNA杂交而干扰SR-A表达和/或功能的那些药物。结合SR-A的药 物通过降低或阻断配体结合而特异性抑制SR-A。与编码SR-A的DNA和/或
7RNA杂交的药物通过阻碍SR-A mRNA转录和/或翻译，和/或通过导致SR-A mRNA降解而特异性抑制SR-A。
本发明是基于发现SR-A在对抗原的免疫应答中有出乎意料的作用。具体 地说，我们观察到用经照射的肿瘤细胞免疫接种野生型小鼠(S卩，未经实验改 变SR-A表达的小鼠)不能引发对该肿瘤细胞的免疫应答，但在SR-A缺陷型 (SR-A -/-)小鼠中这种免疫接种能对随后的攻击提供持久的免疫力。用免疫原 性不佳的肿瘤D121 Lewis肺癌和B16黑色素瘤证明了该作用。此外，给予经 照射肿瘤细胞能减少SR-A缺陷型小鼠中已有的肿瘤，但在其相应的野生型小 鼠中不行。重要的是，我们还证明通过特异性抑制野生型小鼠中的SR-A能复 制在811-八-/-小鼠中观察到的对抗原的增强免疫应答。为证明这点，我们分离 了野生型(SR-A +/+)小鼠的树突细胞(DC)，采用RNAi方案抑制DC中的SR-A， 用模型抗原卵白蛋白(OVA)加载所述DC，将所述DC输回该小鼠，并用表达 OVA的B16黑色素瘤细胞攻击该小鼠。采用该技术，肿瘤攻击后36天时在经 治疗小鼠中未检测到肿瘤，而阴性对照组中100%的小鼠在攻击后18天内有肿 瘤。我们还证明与阴性对照相比，DC中的SR-A下调更有效地促进抗原-特异 性CTL应答。因此，我们发现特异性抑制抗原呈递细胞(例如，树突细胞)中的 SR-A能逆转对免疫原性不佳抗原的无反应性或弱反应性免疫反应，我们的数 据表明就先天和获得性免疫而言，小鼠中增强的抗原-特异性CTL反应对于 SR-A受体的相互作用至关重要。因此，据认为本发明提供的方法能增强对任 何所需抗原的免疫力。
能抑制SR-A的任何药物可用于本发明方法中。例如，所述药物可以是干 扰SR-A mRNA转录和/或翻译的多核苷酸，结合SR-A并抑制与其配体结合或 拮抗该受体的抗体，或能特异性抑制SR-A的任何其它化合物。
本领域已知不同物种的SR-A的核苷酸序列和氨基酸序列。例如，生物技 术信息国家中心(NCBI)数据库条目NM 031195 (2006年1月28日录入)提供 了小家鼠(小鼠)SR-A的mRNA和氨基酸序列。NCBI数据库条目BC063878 (2006年8月11日录入)提供了智人(人)SR-A的mRNA和氨基酸序列。这些 小鼠和人SR-A序列共有46%的核苷酸同源性和70°/。的氨基酸同源性。
本领域已知有三种SR-A同种型。同种型1和2衍生自mRNA剪接，而同种型3据信是存在于内质网的无功能SR-A。本发明所用的SR-A抑制剂优 选能特异性抑制各同种型。在这点上，本文所述SR-A缺陷型小鼠中不存在所 有三种SR-A同种型，证明本发明一种实施方式所用的RNAi方案抑制所有三 种同种型。
当所述药物是多核苷酸时，所述药物可以是RNA多核苷酸、DNA多核苷 酸或DNA/RNA杂交体。所述多核苷酸可以是核酶，例如锤头核酶、反义RNA、 siRNA、 DNA酶、发夹核酶或是通过包括与SR-A mRNA或DNA杂交的过程 而能抑制SR-A的任何修饰或未修饰多核苷酸。设计核酶、反义RNA、 siRNA 和DNA酶的方法是本领域熟知的。应该知道任何这样的药物至少部分通过与 编码SR-A的RNA或DNA序列杂交而起作用。因此，本发明的多核苷酸药物 应具有足够的长度并与编码SR-A的RNA或DNA互补，从而能在生理条件下 与该RNA或DNA杂交。通常所述多核苷酸药物的至少约10个连续核苷酸应 与SR-A的编码DNA或RNA互补或相同。
所述多核苷酸药物可包含修饰的核苷酸和/或修饰的核苷酸连接键，从而 能增加该多核苷酸的稳定性。合适的修饰和作出这些修饰的方法是本领域熟知 的。用于本发明的修饰多核苷酸药物的一些例子包括但不限于包含修饰的核糖 核苷酸或脱氧核糖核苷酸的多核苷酸。例如，修饰的核糖核苷酸可在核糖部分 的2'位被含1-6个饱和或不饱和碳原子的-0-低级垸基，或具有2-6个碳原 子的--O-芳基取代，其中所述烷基或芳基可以是未取代的或可以是取代的， 例如被卤素、羟基、三氟甲基、氰基、硝基、酰基、酰氧基、垸氧基、羧 基、烷氧羰基(carbalkoxyl)或氨基；或者被羟基、氨基或卤素基团取代。核 苷酸可由磷酸二酯连接键或合成的连接键，即除磷酸二酯连接键以外的连 接键相连。可用于本发明的多核苷酸药物中核苷酸间连接键的例子包括但 不限于磷酸二酯键、膦酸垸酯键、硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、磷酸 酯键、硫代膦酸烷酯(alkylphosphonothioate)键、氨基磷酸酯键、氨基甲酸 酯键、碳酸酯键、吗啉基、磷酸三酯键、乙酰胺(acetamidate)键、羧甲基酯 键或它们的组合。
在一个实施方式中，所述药物是用于RNA干扰(RNAi)介导沉默或下调 SR-A mRNA的siRNA。 RNAi药物通常在细胞中表达为短发夹RNA(shRNA)。shRNA是含有正义链、反义链和在正义和反义片段之间的短环序列的RNA分 子。shRNA输入细胞质，在该处由切酶加工成短干扰RNA(siRNA)。 siRNA是 21-23个核苷酸的双链RNA分子，其由RNA-诱导沉默复合体(RISC)识别。一 旦掺入RISC， siRNA有助于耙向mRNA的切割与降解。因此，为用于RNAi 介导的沉默或下调SR-A表达，所述多核苷酸药物可以是siRNA或shRNA。
本发明的shRNA可从重组病毒载体表达为两个分开的互补RNA分子，或 表达为具有两个互补区域的一个RNA分子。在这点上，可利用能接受待表达 shRNA分子的编码序列的任何病毒载体。合适载体的例子包括但不限于衍生自 以下病毒的载体腺病毒(AV)、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒(例如， 慢病毒(LV)、杆状病毒、鼠白血病病毒、疱疹病毒等。优选的病毒是慢病 毒。还可通过用其它病毒的被膜蛋白或其它表面抗原假型化该病毒来修饰 病毒载体的嗜性。适用于本发明的shRNA序列的一个例子见SEQ ID NO: 1。 除了在细胞中从重组载体表达shRNA，还可利用化学稳定的shRNA或 siRNA作为本发明的药物。
在另一实施方式中，所述药物可以是识别SR-A的抗体。因此，本发明所 用的抗体结合SR-A，从而该抗体的结合干扰SR-A受体的活性和/或干扰SR-A 配体结合。该抗体优选结合已知存在于受体C-末端部分的SR-A胞外区，氨基 酸125-458位。
本发明所用的识别SR-A的抗体可以是多克隆或单克隆的。所述抗体优选 单克隆的。制备多克隆和单克隆抗体的方法是本领域熟知的。此外，抗-SR-A 抗体可商品化购得，例如购自英国牛津赛罗泰克公司(Serotec， Oxford， UK) 的2F8单克隆抗体。
预计抗体的抗原结合片段可用于本发明方法。合适抗体片段的例子包括 Fab、 Fab'、 F(ab')2和Fv片段。现已开发了各种技术制备抗体片段，这些技 术是本领域熟知的。
还预计抗体或其抗原结合片段可以是人源化的。人源化非人抗体的方法是 本领域熟知的(参见，例如Jones等，淑wre, 321:522-525 (1986); Riechmann 等，A^a化"，332:323-327 (1988); Verhoeyen等，239:1534-1536 (1988))。能抑制SR-A的其它药物也是已知的。例如，美国专利号6,458,845描述 了可用作SR-A拮抗剂的各种亚磺酰氨基苯甲酰苯胺化合物，还描述了检测 SR-A拮抗剂的方法。对这些化合物和方法的描述通过引用纳入本文。
可将能抑制SR-A的药物与任何合适的药学上可接受的运载体、赋形剂和 /或稳定剂混合来制备用于治疗目的的包含该药物的组合物。适合与药物混合的 组合物的一些例子可见《雷明顿药学科学与实践》CRem/"gM": T7ze Sc/e"ce a"d尸rac"ce 0/尸Aarmflc力(2005)第21版，费城，宾夕法尼州，LWW公司 (Lippincott Williams & Wilkins)。
如果所述药物的多核苷酸，可将其作为裸多核苷酸与递送试剂一起，或作 为包含或表达该多核苷酸药物的重组质粒或病毒载体给予个体。用于给药的合 适递送试剂包括Minis Transit TKO亲脂性试剂；脂质转染试剂；脂质转染 胺试剂；细胞感染素(cellfectin);或聚阳离子(例如，聚赖氨酸)，或脂质体。
在一个实施方式中，将所述多核苷酸通过包含该多核苷酸药物的抗原呈递 细胞，例如树突细胞给予个体。
本发明方法的治疗用制剂通常包含增强个体对所需抗原的免疫应答有效 量的药物。对于本发明药物，本领域技术人员考虑到诸如药物的分子构成、待 治疗个体的体形和年龄和疾病的类型及阶段等因素，而知道如何制定给药方 案。如果还将所需抗原给予个体，可以在给予药物之前、同时或之后通过任何 上述途径给予所需抗原。
可采用任何现有的方法和适合于药物递送的途径将包含抑制SR-A的药物 并任选包含抗原的组合物给予个体，以增强对该抗原的免疫应答，所述途径包 括胃肠外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动 脉内、腹膜内和皮下给药。
可将含或不含抗原的药物与用于治疗与所述抗原相关疾病或病症的常规 治疗剂一起给予。例如，如果所述方法用于增强对肿瘤抗原的免疫应答，可在 常规抗癌症治疗方法之前、同时或之后给予所述药物。这些治疗方法包括但不 限于化疗、外科手术干预和放疗。
预计采用本发明方法可获得针对任何所需抗原的增强免疫应答。所述抗原
的例子包括但不限于存在于感染性生物上的抗原和由癌细胞表达的抗原。所需抗原可以经良好表征，但也可以是未知的，除了已知其存在于，例如特定细 胞类型，如肿瘤或细菌的裂解液中。本发明可用的抗原可以商品化购得或由标 准方法制备。
在一个实施方式中，所述抗原是肿瘤抗原。可通过常规技术获得肿瘤抗原， 例如通过在含亮肽素和抑肽酶的磷酸缓冲盐水中反复冻融肿瘤细胞/组织来制 备肿瘤细胞裂解液(从新鲜的肿瘤活检组织或从组织培养而在体外产生的肿瘤 细胞获得)。这种冻融导致细胞裂解。可通过离心并收集上清液获得肿瘤裂解 液。肿瘤细胞裂解液可立即使用或在-7(TC冷冻并保存待用。可使用纯化形式
或部分纯化或未纯化形式(例如细胞裂解液)的抗原。或者，可通过重组DNA 技术在各种表达系统中表达抗原。
对于增强针对肿瘤抗原的免疫应答，在一个实施方式中，本发明提供增强 诊断有肿瘤的个体对该肿瘤所表达抗原的免疫应答的方法。所述方法包括给予 该个体能抑制SR-A的药物，其用量能有效增强针对该抗原的免疫应答，其中 所述肿瘤的生长在给予该药物后受抑制。还任选给予该个体所述肿瘤表达的抗 原。
在另一实施方式中，本发明提供增强个体对所需抗原的免疫应答的方法， 包括给予该个体已接触所需抗原并且SR-A被特异性抑制的抗原呈递细胞 (APC)，例如树突细胞。与只接触过引发更广泛抑制细胞过程，例如细胞分裂、 转录或翻译的药物相比，SR-A被特异性抑制的树突细胞表示该树突细胞包含 和/或已接触能特异性抑制SR-A的药物。在该实施方式的实施中，可首先采用 常规技术从个体分离树突细胞。可从需要对所需抗原的增强免疫应答的个体分 离树突细胞。可将药物给予分离的树突细胞，以特异性抑制分离的树突细胞中 的SR-A。分离的树突细胞还可接触所需抗原，例如用该抗原蛋白预先加载所 述树突细胞或者用抗原的编码DNA转染这些细胞。可将分离的树突细胞给予 个体，以引发针对所需抗原的增强免疫应答。因此，给予个体后，给予个体的 树突细胞可包含药物和/或抗原。
在一个实施方式中，本发明提供增强个体对肿瘤的免疫应答的方法，包括 给予个体有效量的含树突细胞的组合物，其中所述树突细胞的特征在于其
SR-A被特异性抑制，其中给予该组合物增强了针对肿瘤的免疫应答，从而该肿瘤的生长在给予组合物后受到抑制。所述方法还包括先使得所述树突细胞接 触该肿瘤表达的抗原，再给予个体，还可包括采用任何常规抗癌疗法。优选的 抗癌疗法是照射癌细胞。
可采用不同方式以不同方法(例如，抗体、shRNA沉默或抑制性分子)抑制 SR-A功能来促进对肿瘤的免疫介导排斥或控制。例如，可用抗原加载或者用 抗原编码cDNA或mRNA转染其中SR-A已被抑制的分离DC。可将修饰的 DC作为疫苗给予宿主以产生抗原特异性免疫应答。该方法还可用于提高对感 染性疾病相关抗原的免疫应答。
可用其它常规疗法，例如放疗或化疗治疗携带肿瘤的患者，然后将其中 SR-A己被抑制的DC原位给予至肿瘤部位。预计DC会捕获从破坏的肿瘤释 放出的抗原，并将这些抗原呈递至宿主免疫系统以诱导肿瘤特异性免疫应答。
在另一实施方式中，可用抗原或肿瘤特异性疫苗免疫宿主，实现全身性或 DC中局部SR-A抑制的方案可应用于经免疫的宿主以改善疫苗效力。
在另一实施方式中，本发明提供包含基本上纯化的树突细胞的组合物，其 中所述树突细胞的特征在于SR-A表达和/或功能被特异性抑制。可通过，例如 从宿主分离细胞并采用常规技术基本纯化树突细胞与其它细胞类型，使该树突 细胞接触能特异性抑制SR-A的药物来制备这种树突细胞。这种细胞可接触抗 原并输回宿主，以在宿主中产生对该抗原的增强免疫应答。
以下实施例给出了本发明的具体实施方式
，这些实施例是为了说明而不是 限制本发明。
实施例1
本实施例描述了制备SR-A (-/-)小鼠和敲除小鼠的SR-A对特定抗原免 疫应答的影响。
采用以下材料和方法以获得本实施例所示的结果。 V、嚴微應系
SR-A缺乏小鼠(7)与C57BL/6J小鼠(ll)回交，由哈佛医学院(Harvard Medical School)的M. Freeman禾P达特茅斯医学院(Dartmouth Medical School)的B. Berwin馈赠(5,11)。野生型(WT) C57BL/6小鼠购自缅因州巴, Bar Harbor, ME)。将小鼠饲养在 罗斯威尔癌症研究院(Roswdl Park Cancer Institute)的无特定病原体设施中。 按照国立卫生研究院(NIH)指南进行动物照料和实验，得到动物照料和使用 研究学会委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)的批准。B16 (F10)细胞(H-2b)是来自ATCC的自发鼠黑色素瘤细胞，D121细胞系(H-2b) 是我们研究院的S.Ferrone提供的Lewis肺癌亚系，二者培养在补加了 10% 热灭活胎牛血清(生命技术公司(Life Technologies),格兰德岛(Grand Island),纽约)、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100叫/ml链霉素的 DMEM中。
劍吝舒麥辨縱鄉應
在137&-照射器中用100 Gy的电离射线(IR)处理肿瘤细胞，或使之与 UV光(加利福尼亚州拉霍亚斯特拉特基因公司(Stratagen, Inc., La Jolla， CA) 的Stratalinker 1800)接触，5分钟。然后用PBS洗涤细胞并以1 x 107个细 胞/ml悬浮。为制备细胞裂解液，将肿瘤细胞悬浮在PBS中，进行4轮快 速冻/融，4°c， 12,000 rpm离心10分钟以除去细胞碎片。
#舰究
对于肿瘤攻击研究，用"106个经照射肿瘤细胞在左侧腹皮下免疫小鼠(5 只小鼠/组)。在一些情况中，l周后给予第二次加强。免疫7天后，将活的B16 (2"05个细胞/小鼠)或D121肿瘤细胞(4"05细胞/小鼠)皮下注射入右侧腹 来攻击小鼠。对于治疗研究，在第0天用2xl()S个D121肿瘤细胞或B16肿 瘤细胞接种小鼠，然后在第2、 4、 6和8天用经照射的肿瘤细胞治疗。隔天监 测肿瘤生长。利用公式V^最短直径、最长直径)/2计算肿瘤体积。
麟被级微颠丄/，"试邀
分离免疫小鼠和无肿瘤小鼠的脾细胞，采用以前所述的ELISPOT试验(12) 测定肿瘤特异性或抗原特异性IFN-y分泌T细胞。简言之，4°c，用10 Kig/ml 大鼠抗-小鼠IFN-y抗体(克隆R4-6A2，加利福尼亚州圣迭戈法玛金公司 (Pharmingen， San Diego ， CA))包被马萨诸塞州贝德福德米粒波公司 (Millipore, Bedford, MA)的过滤板过夜。然后洗涤平板并用含10%FBS的培 养液封闭。37°C ，在有10 U/ml IL-2存在下用5 ^g/ml H-2Kb限制性CTL表位TRP218(M88 (SVYDFFVWL) (13)或H-2Db限制性CTL表位gpl0025.32 (EGSRNQDWL)(14)温育脾细胞(lxl()6/孔)24小时。在一些情况中，经照射 的B16或D121细胞(脾细胞:肿瘤细胞=20:1)用作刺激物。然后彻底洗 涤平板，4。C用5 |ag/ml生物素化IFN-y抗体(克隆XMG1.2，加利福尼亚州 圣迭戈法玛金公司)温育过夜。洗涤后，加入0.2U/ml亲和素-碱性磷酸酶D (加利福尼亚州伯林格姆市载体实验室公司(Vector Laboratories ， Burlingame， CA))，室温下温育2小时。加入5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酶/ 硝基蓝四唑镨(印第安纳州印第安纳波利斯勃林格曼海姆公司(Boehringer Mannheim， Indianapolis, IN))并在室温下温育20分钟使斑点显色。利用 ELISPOT计数器(卡尔蔡司(Carl Zeiss),德国)计数诸斑点。 沐膽沐奔^
免疫前6天，隔天通过腹膜内分别注射200 GK1.5和2.43 mAb，以 耗尽CD4+、 CD8+ T-细胞亚组。接种前1天通过FACS分析脾细胞来证实 有效耗尽了细胞亚组，在实验期间通过每周两次的抗体注射维持。同种型 匹配的抗体用作对照。对于吞噬细胞的功能性抑制，如(15)所述通过腹膜内 注射200 pi PBS配制的1 mg角叉聚糖(II型，西格玛公司(Sigma))。
存敏微
用3%巯基醋酸盐(或酯)肉汤培养基腹膜内注射小鼠，4天后通过腹腔灌洗 收集引发的巨噬细胞。将M(I)在含10。/。胎牛血清的Dulbecco改进Eagle培养 基中培养过夜，洗涤除去未附着的细胞。流式细胞术对此方式制备的M小 作CDllb常规染色呈阳性(>96%)。 37°C，用PBS配制的2 nM 5 (和6)-二 醋酸羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，俄勒冈州尤金分子探针公司 (Molecular Probes ， Eugene ， OR))标记UV处理的肿瘤细胞5分钟。3 7 °C , 用等体积的胎牛血清温育30分钟以猝灭未结合的染料。用完全培养基洗涤 细胞，并以2:1的比例与巯基醋酸盐(或酯)-引发的M([)共培养4小时。洗去 漂浮的细胞，收集附着的M^)并用CDllb-PE抗体(加利福尼亚州圣迭戈法 玛金公司)染色。用BD公司(Becton Dickinson)的B-D FACScaliber通过 FACS将M^)的吞噬作用定量测定为双阳性染色细胞的百分比。
粉学藩采用斯氏^检验分析肿瘤生长。通过log-秩统计学分析比较无肿瘤小鼠。 /7 < 0.05认为在统计学上显著。
采用上述材料和方法获得以下结果。
^经厲射游#艘潘蘼接辨在^一-~/、^^导教银斥免资嚴丝不虔游#蘑
利用免疫原性不佳和高度转移性的肿瘤-D121 Lewis肺癌(16， 17)测定 SR-A缺乏是否影响肿瘤免疫原性。野生型(WT) C57BL/6和S及-X,'小鼠均用 电离照射(IR)-处理的D121肿瘤细胞免疫，1周后用活的肿瘤细胞攻击。如 预计一般，用或不用IR-D121肿瘤细胞免疫的WT小鼠在肿瘤攻击后产生 了侵袭性生长的肿瘤(图1，右图)。令人吃惊的是，用经照射D121肿瘤细 胞的单剂量免疫能完全保护S7 "々vj、鼠免遭随后的肿瘤攻击，而接种在未 免疫^i J一小鼠中的D121肿瘤的生长情况与野生型小鼠中的相似(图l，下 图)。无肿瘤Si -^^—小鼠即使在8个月后也能耐受第二次肿瘤攻击，提示存 在长期免疫记忆(数据未显示)。在不同组织学来源的另一弱免疫原性肿瘤， B16(F10)黑色素瘤中证实了增强的肿瘤-保护性免疫力具有普遍性(数据未 显示)。此外，用UV处理的B16肿瘤细胞进行单剂量接种在57MZ—而不是 WT小鼠中导致这种预防性肿瘤排斥(图2)，提示辐射源不影响经处理肿瘤 细胞的免疫原性。虽然用肿瘤裂解液免疫Si ^4一小鼠还显著减轻了 M"一 小鼠中的肿瘤生长，但所有小鼠最终还是产生了肿瘤(图2)。
，+ r纷應参与n'-稀纖滩拔辦滅力
通过体内抗体耗尽研究检测免疫效应细胞是否参与D121肿瘤细胞排斥。 免疫前，用抗-CD4 Ab GK1.5或抗-CD8 Ab 2.43处理来耗尽小鼠的CD4+或 CD8+ T-细胞亚组。通过脾和淋巴结(细胞)群的FACS分析评估耗尽了全部 (细胞)的98%以上(数据未显示)。然后用4 ><105个D121肿瘤细胞攻击小鼠 (图3)。耗尽CD8+T细胞完全消除了肿瘤保护性免疫力(p = 0.002，，与IgG 处理组)，而耗尽CD4+T细胞对D121肿瘤的排斥没有影响(p〉0.05，与IgG 处理组)。在致敏阶段还利用角叉聚糖(15)耗尽吞噬细胞。发现耗尽吞噬细 胞也降低了肿瘤保护作用(p- 0.002，与IgG处理组)。
y^经席i^W欲應麥辨歹/发57^八V、嚴游贫嚴辨^丝C7X《座
B16黑色素瘤用作相关模型来评估内源性肿瘤抗原的免疫应答，因为其表达多种黑色素瘤相关抗原，包括gpl00和TRP-2(18)。用经照射的B16肿瘤细 胞免疫后，分离WT或Si J一小鼠的脾细胞，并用CTL表位§ 10025.32或 TRP2,8(M88刺激。ELISPOT试验显示与未免疫的小鼠或免疫的WT小鼠相比， 经照射B16细胞免疫的s/m^j、鼠的脾细胞显示稳定产生抗原特异性 IFN-H图4)。此外，体外用经照射B16细胞而不是D121细胞刺激时，经免疫 s/ j^小鼠的脾细胞也产生高水平的IFN-y，表明致敏CTL有肿瘤特异性。
『r浙1^-^/'//、^效3/-,褒存敏垂^#應
破坏凋亡细胞吞噬作用可能破坏自身耐受性(19-21)， SR-A参与凋亡细胞 的清除(22)。我们比较了M-i〃和WT小鼠的巨噬细胞的吞噬能力。通过检测 也含有CFSE的CDllb+ M小，采用FACscan分析来衡量吞噬作用。吞噬细 胞摄取的定量测定表明衍生自两种小鼠的M(()均有效吞没垂死的肿瘤细胞 0 > 0.05)(图5)。用荧光显微镜目测观察细胞进一步证实了该结果(数据未 显示)，提示APC上存在清除垂死细胞的丰余受体(23)。
I经庸射,蘑潘應必^激餘W-Z- V、 ^已夯游#蘑潘應
鉴于预防性免疫在^S7 -X〃小鼠中导致肿瘤排斥这一事实，我们测定了免疫 接种对荷瘤小鼠中的疗效。首先在第0天用D121肿瘤细胞接种Si "一小鼠， 然后在第2、 4、 6禾卩8天用经照射的D121肿瘤细胞治疗。未治疗的SR-A—" 小鼠中D121肿瘤侵袭性生长。然而，给予经照射的D121细胞导致肿瘤生长 速度显著降低，并且50%的小鼠维持没有肿瘤(图6， /7<0.05，与未处理组)。 在B16黑色素瘤模型中也观察到相似疗效(图6)。
因此，以上实施例首次证明SR-A负调节抗原-特异性抗肿瘤免疫力。该实 施例还证明将某抗原给予SR-A受抑制的哺乳动物导致对该抗原的免疫应答增 强。
实施例2
本实施例证明通过抑制野生型小鼠的抗原呈递细胞(例如，树突细胞)中的 SR-A,并且给予该小鼠增强的免疫应答所针对的抗原可以复制实施例1所示 SR-A -/-小鼠中对某抗原的增强免疫应答。
首先，为测定树突细胞(DC)对在SR-A敲除小鼠中观察到的缺乏SR-A能否增强疫苗效力，我们比较了野生型(WT)或SR-A敲除小鼠的骨髓(BM)-DC刺激抗原-特异性抗肿瘤免疫力的能力(图7A)。
为获得图7所示的结果，用经模型抗原卵白蛋白(OVA)脉冲的DC免疫WT C57BL/6小鼠，然后用表达OVA的B16黑色素瘤进行肿瘤攻击。DC是在有GM-CSF和IL-4存在下从骨髓产生的。简言之，37°C，在5%加湿C02中，用含重组小鼠GM-CSF (20 ng/ml; BD生物科学公司(BD Bioscience))和重组小鼠IL-4 (5 ng/ml; BD生物科学公司)的完全RPMI 1640培养小鼠BM细胞。在培养的第2和4天，除去上清液，替换以含有GM-CSF和IL-4的新鲜培养液。用OVA (10吗/ml)温育培养7天的未附着细胞3小时，然后用1 ng/ml LPS (大肠杆菌血清型026:B6，密苏里州圣路易斯西格玛-阿尔德里奇公司(Sigma-Aldrich， St. Louis， MO))刺激16小时。
观察到DC在控制免疫原性不佳的B16肿瘤生长方面远比WTDC强效。此外，我们比较了两种小鼠品系的BM-DC引发OVA-特异性细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)反应的能力。用OVA-特异性MHC I-限制性CTL表位(即，SIIMFEKL; SEQ ID NO:2)刺激后，DC-免疫小鼠的脾细胞产生的IFN-Y水平远高于WT DC，表明DC在引发抗原-特异性效应器T-细胞反应方面远比WTDC强(图7A)。因此，这些结果证明SR-A负调节抗原呈递细胞(APC)，特别是DC的免疫活化功能，从而提供了DC能控制先天和获得性免疫的调节机制。
鉴于我们发现SR-A在APC的免疫刺激功能中具有抑制性作用，我们测定了阻断或下调(即，抑制)SR-A是否会改善DC(通常认为是免疫启动的至关重要APC)介导的疫苗效力。
与通过促进DC成熟和共-刺激而体外产生免疫强效DC所用的大多数方案不同，本方法试图去除免疫抑制性SR-A的作用。利用慢病毒载体作基因转移和通过RNA干扰(RNAi)使基因沉默，我们检测了使DC的内源性SR-A沉默是否增强了 CTL活化和抗肿瘤免疫力。
利用shRNA的RNA干扰可在哺乳动物细胞中介导有效的序列特异性沉默或下调基因表达。自身灭活的慢病毒载体(LV)用于递送RNAi，因为它们在分裂和非分裂细胞，包括造血干细胞和它们终末分化细胞后代，例如DC，中安全且转导效率优异(24)。
我们设计并筛选了各种慢病毒编码的短发夹RNA(shRNA)来鉴定能下调SR-A表达的shRNA。为进行筛选，37°C，将非复制性LV-SRA-shRNA与DC以50:1比例温育24小时。我们在DC中鉴定了特异性下调SR-A的小干扰RNA(siRNA)(图8A)。如免疫印迹试验所示，与未处理或伪感染细胞相比，用LV-SRA-shRNA感染以产生SEQ ID NO:l构成的shRNA的DC1.2细胞中，SR-A蛋白质水平降低约90。/。。重要的是，观察到用可溶性OVA抗原加载时，SR-A下调的DC消除表达OVA抗原的高度侵袭性B16肿瘤远比用扰乱性shRNA处理的对照DC有效(图8B)。此外，我们证明与扰乱性shRNA相比，通过RNA干扰下调DC中的SR-A更有效地促进抗原
4寺异性CTL反应，如OVA257_264肽刺激后脾细胞中IFN-Y产生水平较高(图9A)和OVA-特异性效应器€08+-丁细胞的溶胞活性增强(图9B)所示。
因此，综合起来，本文所示的数据表明在WT和Si d々'小鼠中观察到的免疫应答的功能差异可能是因为SR-A表达的直接作用，而不是，例如没有SR-A存在下DC发育的改变。重要的是，我们证明特异性抑制DC中的SR-A能增强哺乳动物对所需抗原的免疫应答。
参考文献
1. Hughes等，Eur J Immunol 1995;25:466-73.
2. Pearson等，Chem Biol 1998;5:R193-203.
4. Krieger等，Curr Opin Lipidol 1997;8:275-80.
5. Berwin等，Embo J 2003;22:6127-36.
6. Kodama等，ProcNatl Acad Sci U S A 1988;85:9238-42.
7. Suzuki等，Nature 1997;386:292-6.
8. Thomas等，J Exp Med 2000;191:147-56.
9. Ishiguro等，Am J Pathol 2001;158:179-88.
10. Peiser等，Infect Immun 2002;70:5346-54.
11. Kunjathoor等，J Biol Chem 2002;277:49982-8.
12. Wang等，Cancer Res 2003;63:2553-60.13. Bloom等，J Exp Med 1997;185:453-9.
14. Overwijk等，J Exp Med 1998;188:277-86.
15. Udono等，Proc Natl Acad Sci U S A 1994;91:3077-81.
16. Sugiura等，Cancer Res 1955;15:38-51.
17. Popovic等，Clin Exp Metastasis 1998;16:623-32.
18. Engelhard等，Immunological Reviews 2002;188:136-46.
19. Bondanza等，J Exp Med 2004;200:1157-65.
20. Asano等，J Exp Med 2004;200:459-67.
21. Cohen等，J Exp Med 2002;196:135-40.
22. Piatt等，Proc Natl Acad Sci U S A 1996;93:12456-60.
23. Piatt等，J Immunol 2000;164:4861-7.
24. Rubinson等，Nat Genet 2003;33:401-6.
权利要求
1.一种增强个体对所需抗原的免疫应答的方法，包括给予该个体有效量的包含树突细胞的组合物，其中所述树突细胞的特征在于其A类巨噬细胞清道夫受体(SR-A)被特异性抑制，并且其中所述该组合物增强了该个体对该所需抗原的免疫应答。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述树突细胞先接触所述所需抗原再给予所述个体。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述个体已诊断具有表达所述所需抗原的肿瘤，其中给予包含所述树突细胞的所述组合物后该肿瘤的生长受抑制。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述树突细胞从所述个体分离，并在分离后但将所述组合物给予所述个体之前接触所述所需抗原。
5. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述树突细胞的SR-A活性被具有与编码SR-A的核苷酸序列相同或互补的序列的多核苷酸特异性抑制。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸是shRNA。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述核多核苷酸包含SEQIDNO:l所示序列。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述树突细胞的所述SR-A活性被与SR-A有反应活性的抗体，或被与SR-A有反应活性的抗体片段特异性抑制。
9. 一种增强个体对所需抗原的免疫应答的方法，包括给予该个体该所需抗原和能特异性抑制A类巨噬细胞清道夫受体(SR-A)的药物，该药物的用量有效增强该个体对该所需抗原的免疫应答。
10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述药物包含具有与编码SR-A的核苷酸序列相同或互补的序列的多核苷酸。
11. 如权利要求IO所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸是shRNA。
12. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述核糖多核苷酸是shRNA。
13. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述核糖多核苷酸由SEQIDNO:l所示序列构成。
14. 如权利要求IO所述的方法，其特征在于，所述药物是与SR-A有反应活性的抗体，或被与SR-A有反应活性的抗体片段。
15. —种增强诊断具有肿瘤的个体对该肿瘤所表达抗原的免疫应答的方法，该方法包括给予该个体能抑制A类巨噬细胞清道夫受体(SR-A)的药物，该药物的用量有效增强该个体对该抗原的免疫应答，其中该肿瘤的生长在给予该药物后受到抑制。
16. 如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述药物包含具有与编码SR-A的核苷酸序列相同或互补的序列的多核苷酸。
17. 如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸是shRNA。
18. 如权利要求17所述的方法，其特征在于，还包括给予所述个体包含所述抗原的组合物。
19. 一种基本上纯化的哺乳动物树突细胞群，其中该树突细胞的特征在于其SR-A活性被特异性抑制。
20. 如权利要求19所述的基本上纯化的哺乳动物树突细胞群，其特征在于，所述SR-A活性被shRNA抑制。
全文摘要
提供了增强个体对所需抗原的免疫应答的方法。通过给予该个体能抑制A类巨噬细胞清道夫受体(SR-A)的药物，并任选给予该所需抗原来实施该方法。还提供了通过给予个体包含抗原呈递细胞的组合物来增强对某抗原的免疫应答的方法，所述抗原呈递细胞的特征在于SR-A被特异性抑制。还提供了基本上纯化的哺乳动物树突细胞群体，其特征在于SR-A被特异性抑制。
文档编号A61K31/70GK101675066SQ200880012072
公开日2010年3月17日 申请日期2008年4月16日 优先权日2007年4月16日
发明者J·萨布杰克, 王向阳 申请人:健康研究股份有限公司