专利名称：对肿瘤细胞具有抑制作用的活性寡肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及5种对肿瘤细胞具有抑制作用的活性寡肽，可作为抗肿瘤药物应用。
背景技术：
早在1969年，Reddy和Sirse发现相思子提取物可抑制吉田肉瘤的生长，随后的研究发现相思子蛋白对动物白血病、L1210白血病的治疗有明显疗效、可显著抑制艾氏腹水癌细胞的增殖、对B16黑痔瘤和Lewis肺癌也有不同程度的抗肿瘤活性。体外实验研究表明，相思子蛋白对艾氏腹水癌、对人类黑色素瘤MMX-G.E、Lewis 肺癌、结肠癌具有显著的抑制效应，但由于相思子蛋白的毒性较强，人工合成困难，临床应用有其局限性。在2009年，Sujit K等人将摩尔比为1 50的胰蛋白酶和相思子蛋白，放置在 37°C温箱中消化过夜，用截流分子量为IOkD的滤膜超滤后，用质谱检测酶解片段的分子量范围，用MTT法检测酶解片段对DL细胞的影响。质谱结果显示超滤后的相思子蛋白酶解片段(ABP)在600-1500Da范围内，可影响DL细胞的存活率。在体内通过DL-荷瘤小鼠模型检测了相思子蛋白酶解片段的抗肿瘤作用，结果显示ABP可显著降低小鼠腹水体积和腹水中细胞的数量，并可增加DL-荷瘤小鼠的存活率，而 ABP对细胞和小鼠的毒性却大大降低，但由于ABP为寡肽混合物，大大限制了其进一步研究和应用。
发明内容
本发明旨在提供5种高效低毒的抗肿瘤活性寡肽。1.本发明提供的寡肽序列为QAQGSNN。2.本发明提供的寡肽序列为⑶LERW。3.本发明提供的寡肽序列为SLENNW。4.本发明提供的寡肽序列为GTYGDL。5.本发明提供的寡肽序列为DVTNAY。本发明中的寡肽是通过相思子蛋白体外酶解后，用不同截留分子量的超滤管超滤、分级；将低分子量的混合多肽冷冻干燥后，用含TFA-water溶解，滤膜过滤，RP-HPLC对酶解混合多肽进行分离；用离心管将收集到的RP-HPLC各组分，冷冻干燥后，用MTT法检测分离组分抑制HCT-8细胞增殖的活性；将有活性的组分用含TFA水溶解后进行质谱分析； 质谱分析各肽片段的分子量与胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶解后的肽片段分子量进行比对， 确定各肽片段的氨基酸顺序，人工合成寡肽片段。本发明提供了上述寡肽在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明还提供了寡肽在抗肿瘤药物中重量百分比为0.01% 100%。本发明中所述药物是丸剂、粒剂、片剂、胶囊或注射液。将人工合成的寡肽用MTT法进行体外细胞实验，研究发现其中5个寡肽可抑制HT-29和HCT-8细胞的增殖。而对小鼠的毒性在10 1000mg/kg。本发明确定了寡肽的氨基酸顺序，由于寡肽的分子量在600_800Da之间，可以通过人工合成的方法大量获得，具备了生产周期短、生产规模大、生产成本低的优点，因此在肿瘤治疗性药物的研究和临床应用具有较大的实际意义和广阔的应用前景。
图1分子量小于3kD的相思子蛋白酶解混合多肽的RP-HPLC分离25号组分中与胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶相匹配的肽片段图3活性肽片段对HCT-8和HT-四细胞增殖的抑制作用(上左正常HCT-8细胞；上右给药组HCT-8细胞下左正常细胞；下右给药组细胞)
具体实施例方式实施例1、相思子蛋白的体外酶解及分级分离1、相思子蛋白的体外酶解将相思子蛋白样品溶于20mmol/L NH4HCO3溶液中，配成2 μ g/μ 1的31^丨1^2溶液， 混勻后，100°c加热5mi n，加入浓度为20ng/ml胰蛋白酶，使酶与底物的比例为1 50, 37°C 恒温孵育12h。2相思子蛋白酶解产物的分级分离将相思子蛋白酶解产物用截留分子量为IOkD和3kD的超滤管超滤分级。酶解产物被分为分子量大于IOkD和3kD IOkD和3kD的三组混合多肽。用MTT法检测三组混合多肽对HCT-8细胞增殖的抑制作用。实施例2、分子量小于3kD的酶解混合多肽的分离将分子量小于3kD的混合多肽冷冻干燥后，用含0. 的TFA-water溶解，0. 22 μ m 滤膜过滤，除去沉淀，用RP-HPLC对酶解混合多肽进行分离。色谱条件=A相0. 1% TFA-water, B相为100%的乙腈。柱温:37°C ；流速:1ml/ min ；检测波长280nm。二元洗脱梯度为0 20min，B从0%变为45% ；20 55min，B从 45%变为100% ；55 65min，B从100%变为；65 80min，B从变为0%。用离心管分部收集RP-HPLC分离产物。实施例3、分子量小于3kD混合多肽组分的活性鉴定将用离心管收集到的RP-HPLC各组分，冷冻干燥后，用MTT法检测分离组分抑制 HCT-8细胞增殖的活性。共收集到39个组份，结果表明，组份5、26、观都具有抑制HCT-8增殖的活性。实施例4、活性分离组分的质谱鉴定及活性肽片段氨基酸序列的确定及人工合成将有活性的组分用含0. 1 % TFA水溶解后进行质谱分析。质谱结果显示，5号组分中小肽的分子量在550 800Da之间；表1可与相思子蛋白酶解片段匹配的5号组分中肽片段及活性位点周围肽片段
权利要求
1.一种寡肽，其特征在于，它的序列是QAQGSNN。
2.一种寡肽，其特征在于，它的序列是GDLERW。
3.一种寡肽，其特征在于，它的序列是SLENNW。
4.一种寡肽，其特征在于，它的序列是GTYGDL。
5.一种寡肽，其特征在于，它的序列是DVTNAY。
6.如权利要求1、2、3、4或5所述的寡肽，其特征在于寡肽来源于相思子蛋白或化学合成，该寡肽用于制备抗肿瘤药物或单独作为抗肿瘤药物；寡肽用于抗肿瘤药物的重量百分比为0.01% 100%，寡肽用于药物的类型为丸剂、粒剂、片剂、胶囊或注射液。
全文摘要
本发明公开了对肿瘤细胞具有抑制作用的5种活性寡肽及其应用，其目的是提供对肿瘤细胞具有抑制作用的活性寡肽的分离、鉴定方法及以这5种寡肽为活性成分的药物。这5种寡肽的氨基酸序列分别为1)QAQGSNN；2)GDLERW；3)SLENNW；4)GTYGDL；5)DVTNAY。本发明的5种寡肽可以通过人工合成的方法大量获得，具备了生产周期短、生产规模大、生产成本低的优点，因此在肿瘤治疗性药物的研究上具有较大的实际意义和广阔的应用前景。
文档编号A61P35/00GK102268071SQ20111018484
公开日2011年12月7日 申请日期2011年7月4日 优先权日2011年7月4日
发明者李丽琴, 王惠芳, 石童, 鹿晓晶 申请人:中国人民解放军63975部队