专利名称：一种去除调节性t细胞的特异性肿瘤疫苗的制备方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，特别涉及一种去除调节性T细胞的特异性肿瘤疫苗的制备方法。背景技术：
肿瘤是各种致癌因素诱发细胞恶变和多种免疫细胞抗肿瘤监测杀伤功能两种“阴阳” 机制互动失衡导致的恶性疾病。传统的肿瘤治疗主要是通过手术、化疗与放疗来达到早期根除肿瘤和减轻瘤负荷的目的，存在着肿瘤转移与复发的危险性，具有损伤正常组织与免疫功能低下等严重副作用，导致目前临床上肿瘤转移、复发和死亡的几率极高。肿瘤的免疫细胞治疗是通过恢复与增强肿瘤患者自身的免疫监测和杀瘤功能，可以有效地杀灭患者术后和放化疗后体内残存的肿瘤细胞，达到治疗肿瘤、预防复发与转移和最终根治肿瘤的目的，具有特异性强、副作用轻等优点，正在逐步成为肿瘤综合治疗中的一个重要环节，也是当前肿瘤治疗基础研究和临床应用的热点与发展方向。根据诱导方法和来源的不同用于肿瘤生物治疗效应细胞主要有肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、细胞毒性T 细胞(T淋巴)等，由于一些细胞免疫治疗因其效应细胞来源困难(如TIL)或治疗副反应较大(如LAK)等原因，目前研究和报道越来越少；CIK虽然细胞增殖速度杀瘤活性高，杀瘤谱更广，但是没有特异性。目前普遍认为肿瘤抗原特异性T淋巴是肿瘤靶向治疗最为理想的免疫效应细胞。目前肿瘤抗原特异性T淋巴的培养过程中，扩增的细胞是含⑶8+和⑶4+⑶25+ 异质性T细胞群，CD8+T淋巴细胞为机体最主要的抗肿瘤淋巴细胞群体，其中含有识别肿瘤抗原的特异性杀伤性T细胞，对肿瘤细胞进行特异性的杀伤；而CD4+CD25+T细胞亚群是一种免疫抑制细胞，又称为调节性T细胞或Tregs (T-regulatory cells )，它表达CD3、 ⑶25和R)xP3，可抑制性调节⑶4+或⑶8+T细胞的活化与增殖，并能同时抑制初始T细胞与记忆性T细胞的增殖反应，从而达到负向调控免疫应答的作用，对在胸腺内不能形成自身耐受的自身反应性T细胞克隆有抑制作用；同时能抑制非己抗原诱发的免疫应答， Treg的显著增加，导致肿瘤病人免疫监测与杀伤肿瘤功能的低下，最终抑制自身免疫反应和协助肿瘤的免疫逃避中发挥着重要作用，并导致疫苗诱导的抗肿瘤免疫应答的效用受到⑶4+⑶25+T细胞的限制。因选择性地剔除患者体内Tregs细胞可能增强抗肿瘤免疫的功能，达到免疫杀瘤的疗效。
发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种特异性好、杀伤力强的去除调节性T细胞的特异性肿瘤疫苗的制备方法。本发明是通过如下技术方案实现的
一种去除调节性T细胞的特异性肿瘤疫苗的制备方法，主要包括如下步骤 (1)采集患者6(Tl20ml的自体外周血，分离其中的单核细胞和单个核细胞，置于全营养培养基中培养，分别诱导获得CD8+及CD4+CD25+组成的异质性T淋巴细胞群和具有强大抗原提呈作用的DC细胞；
所述全营养培养基为添加青/链霉素和10%FBS的1640培养基，并将培养基置于C02 细胞孵育箱内放置2小时后收集悬浮液，离心获得T淋巴细胞群，贴壁的DC细胞加DC培养基继续培养，然后收集上清液，离心获得DC细胞。(2) DC细胞用相应的肿瘤抗原刺激，使DC细胞在体外致敏，得到致敏的DC细胞； DC细胞置于无血清培养基中，加入相应的肿瘤特异性抗原蛋白，37°C下于C02孵育箱
内感染2小时，加入全营养培养基(含有20ng/mL的GM-CSF和IL-4)至^il，继续培养M、8 小时，即得到诱导成熟的DC细胞。(3) T淋巴细胞群通过磁性分选，去除⑶4+⑶25+调节性T细胞(Tregs)，获取 CD8+T淋巴细胞，去除了 Tregs细胞的抑制作用，增强了 T淋巴细胞杀伤肿瘤的作用；
(4)将致敏的DC细胞和分选出的CD8+T淋巴细胞混合培养，携带肿瘤抗原的DC细胞将抗原信息提呈给⑶8+T淋巴细胞并使之活化，得到特异性肿瘤疫苗DC-⑶8+ CTL0⑶8+T淋巴细胞和DC细胞按10:1的体积比混合，培养三天后加入IL_2 10U/mL, 及时分盘，每三天补充IL-2，14天后得到活化特异性肿瘤疫苗。本发明通过去除淋巴细胞中⑶4+⑶25+调节性T细胞，获得了⑶8+T淋巴细胞，能够大大增强T淋巴细胞杀伤肿瘤的作用，此细胞简称去除调节性T细胞的特异性肿瘤疫苗 (Tregs-Deletion-Cancer- Vaccine, TDCV)。这种方法所扩增的细胞主要为杀伤性的⑶8+T淋巴细胞巴细胞，⑶8+ T淋巴细胞为机体最主要的抗肿瘤淋巴细胞群体，其中含有识别肿瘤抗原的特异性杀伤性T细胞，对肿瘤细胞进行特异性的杀伤。这种肿瘤疫苗回输至患者体内后，DC激活的⑶8+T淋巴细胞能快速杀伤体内的肿瘤细胞，同时携带肿瘤抗原的DC细胞会继续将抗原信息提呈给体内的CD8+T细胞并使之活化，从而诱导机体产生大量具有特异性细胞毒性功能的T淋巴细胞，对肿瘤细胞具有特异性杀伤作用。本发明步骤简捷，操作简便，培养的细胞活化性好，对肿瘤细胞具有特异性杀伤作用，有效治愈肿瘤疾病，适于广泛推广应用。
具体实施方式
实施例
所用试剂如下
肝素或枸橼酸钠抗凝管、Ficoll-Paque Plus、胎牛血清(FBS)、DPBS, IL_4、GM-CSF, IL-2、IL-6 ；
全营养培养基(CM) =RPMI 1640 (Invitrogen), 100U 的青霉素、100U 的链霉素，10%FBS。1. PBMCs的分离和培养
(1)抽取新鲜外周全血60-120mL，分成每份30mL于50mL离心管，加入6mLDPBS，缓慢加入 IOmL 的 Ficoll-Paque Plus ；
(2)离心(水平转子)400g室温20min；
(3)小心吸出位于红细胞上的白色条带，S卩外周血单个核细胞(PBMCs)；
(4)用DPBS30 mL稀释PBMCs，室温300g离心10 min,重复两次，去除上清；
(5)将PBMCs合并，重新混悬于10-20mL CM中，进行细胞计数；(6)力口5-10mL1640培养基(含10%FBS)，加到25 CM培养瓶内，在CO2细胞孵育箱内放置2小时，让细胞充分贴壁；
(7)轻摇培养瓶2-3min，以便未贴壁细胞充分悬浮，将培养瓶用1640培养基冲洗两遍， 收集悬浮溶液，贴壁的细胞加DC培养基继续培养，第6天开始，收集含有非贴壁细胞的培养上清，更换培养基，共两天，合并所收集的上清，离心，脱离贴壁的细胞，即为未成熟的DCs ；
(8)收集到的悬浮溶液300g离心lOmin，收集到的细胞为异质性T淋巴细胞群。2. DC的诱导成熟
(1)特异性肿瘤抗原的制备
先将肿瘤组织在75%的酒精中浸泡10秒，立即置入无菌生理盐水中浸泡5分钟。然后将肿瘤组织置入适量的1640细胞培养液中，用无菌手术剪将其剪碎，放入低温冰箱中反复冻融3次，用超声波细胞破碎仪将肿瘤组织进一步打碎。离心除去细胞残渣，上清液经 0. 22 μ针式过滤器过滤，用核酸蛋白测定仪标定蛋白含量，即特异性的肿瘤抗原。(2)肿瘤特异性抗原诱导DC的分化
IO6个DCs混悬于0. 5 mL的无血清培养基内，加入相应的肿瘤特异性抗原蛋白，37°C， CO2孵箱内感染2小时，加入CM至2 mL含GM-CSF 20ng/mL、IL_4 ng/mL，继续培养M-48小时，即为诱导成熟的DC。3.⑶8+ T淋巴细胞的磁性分离
(1)将得到的异质性T淋巴细胞群悬浮液，两次洗涤，分别300g离心，IOmin；
(2)台盼蓝染色计数；
(3)重悬细胞80uLbuffer (0. 5%BSA、2mM EDTA PH7. 2 PBS，真空抽滤除菌及液体内气体)/107细胞，手工混勻；
(4)加入20uL CD8磁珠标记的抗体/IO7细胞；
(5)充分混勻，在2-8°C孵育15min；
(6)加入1-2mL buffer清洗/IO7细胞，然后加入10-20倍体积缓冲液300g离心， IOmin ；
(7)500 uL buffer溶液重悬108细胞；
(8)buffer缓冲液润洗柱子；
(9)0.5mL细胞悬液过柱子进行磁性分选；
(10)收集未标记的阴选细胞，冲洗柱子三次；MS=3x500 uL，LS :3x3 mL ；
(11)从磁场中取下分离柱，插在适当的试管口上；用分选柱配备的活塞用力推尽液体， 冲出阳性结合的细胞。4. DC-CD8+ T 淋巴的诱导
⑶8+T淋巴细胞/DCs 10 :1混合，培养三天后，加入IL-2 10U/mL，及时分盘，每三天需补充IL-2，细胞分裂速度低于⑶4细胞，14天后用INF y ELISPOT法测活性。活化的细胞即为去除调节性T细胞的特异性肿瘤疫苗。综上所述，DC-CD8+T淋巴细胞即为去除调节性T细胞的特异性肿瘤疫苗，携带特异性肿瘤抗原的DC细胞会将抗原信息提呈给CD8+T淋巴细胞并使之活化，进而激活机体中有细胞毒性功能的T淋巴细胞，从而对肿瘤细胞具有特异性杀伤作用。
权利要求
1.一种去除调节性T细胞的特异性肿瘤疫苗的制备方法，其特征为，主要包括如下步骤(1)采集患者6(Tl20ml的自体外周血，分离其中的单核细胞和单个核细胞，置于全营养培养基中培养，分别诱导获得CD8+及CD4+CD25+组成的异质性T淋巴细胞群和具有强大抗原提呈作用的DC细胞；(2) DC细胞用相应的肿瘤抗原刺激，使DC在细胞在体外致敏，得到致敏的DC细胞；(3) T淋巴细胞群通过磁性分选，去除⑶4+⑶25+调节性T细胞(Tregs)， 获取⑶8+T淋巴细胞；(4)将致敏的DC细胞和分选出的⑶8+T淋巴细胞混合培养，携带肿瘤抗原的DC细胞将抗原信息提呈给CD8+T淋巴细胞并使之活化，得到特异性肿瘤疫苗。
2.根据权利要求1所述的去除调节性T细胞的特异性肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于步骤(1)中，所述全营养培养基为添加青/链霉素和10%FBS的1640培养基，并将培养基置于(X)2细胞孵育箱内放置2小时后收集悬浮液，离心获得T淋巴细胞群，贴壁的DC细胞加DC培养基继续培养，然后收集上清液，离心获得DC细胞。
3.根据权利要求1或2所述的去除调节性T细胞的特异性肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于步骤(2)中，DC细胞置于无血清培养基中，加入相应的肿瘤特异性抗原蛋白，37°C 下于(X)2孵育箱内感染2小时，加入全营养培养基至anl，继续培养M 48小时，即得到诱导成熟的DC细胞。
4.根据权利要求1或2所述的去除调节性T细胞的特异性肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于步骤(4)中，⑶8+T淋巴细胞和DC细胞按10:1的体积比混合，培养三天后加入IL-2 10U/mL，及时分盘，每三天补充IL-2，14天后得到活化特异性肿瘤疫苗。
5.根据权利要求3所述的去除调节性T细胞的特异性肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于所述全营养培养基中含有20ng/mL的GM-CSF和IL-4。
全文摘要
本发明属于生物医学领域，特别公开了一种去除调节性T细胞的特异性肿瘤疫苗的制备方法。本发明通过去除淋巴细胞中CD4+CD25+调节性T细胞，获得了CD8+T淋巴细胞，能够大大增强T淋巴细胞杀伤肿瘤的作用，此细胞简称去除调节性T细胞的特异性肿瘤疫苗。本发明步骤简捷，操作简便，培养的细胞活化性好，对肿瘤细胞具有特异性杀伤作用，有效治愈肿瘤疾病，适于广泛推广应用。
文档编号A61K39/00GK102319426SQ20111022561
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月8日 优先权日2011年8月8日
发明者刁晓娟, 孙理兰, 张慧慧, 李荣荣, 王泰华 申请人:王泰华