域已知的为用于生成 T细胞的宿主的任何动物。
[0026] 在涉及以上方法的本发明的此类实施方案的背景下，并且其中使用非人宿主生物 体，此类非人宿主生物体优选地还包括失活的内源性TCR基因座，优选地，其中所述内源性 TCR基因座编码所述非人宿主生物体的TCRa和β链。
[0027] 在本发明的一个非常具体的实施方案中，所述宿主-生物体为"ABabDII"小鼠。术 语"ABabDII"小鼠是指如在Li等人，2010 ;16:1029-34Nature Medicine中所述制备的转 基因动物。当然，应理解用与Li等人所述相同的方法制备的任何其它转基因动物也应涵盖 为本文所述的本发明的实施方案中使用的合适的宿主生物体。
[0028] 替代实施方案涉及方法，其中用如本文所述的肽免疫人，例如健康个体或患有肿 瘤性疾病的人患者。在该实施方案中，可从人受试者的血液分离T细胞，随后进行免疫过 程。该实施方案具有优势：改良的T细胞受体在人，理想为自体T细胞上表达，所述T细胞 然后可在过继性T细胞治疗中用于再输注。
[0029] 在本发明方法的背景下用于免疫宿主生物体的肽包含与所对应的野生型细胞蛋 白质的氨基酸序列相比，至少一个氨基酸残基为突变的氨基酸序列。本发明涉及肿瘤特异 性抗原的用途，因此，在肿瘤细胞的形成中为突变的并且因此呈该特异性突变形式的蛋白 质仅存在于肿瘤细胞中。然而，正常的健康细胞仍可表达最初未突变的（野生型）蛋白质。 因此，对于本文所述的本发明，特别优选的是用于免疫的肽在其序列中包含突变，所述突变 将TSA与最初未突变的细胞蛋白质相区分。用于本发明方法中的优选的肽包含SEQ ID No. 1 至27中显示的任何序列。在本发明的优选实施方案中，用于免疫的肽包含SEQ ID No. 1中 显示的氨基酸序列。
[0030] 可将在肿瘤细胞中特异性表达但在健康组织中不表达的抗原分类成四种类型： (I)在肿瘤-形成期间通过肿瘤细胞内的点突变或易位形成突变的抗原。那些抗原严格为 肿瘤特异的。在本发明的背景下，这些抗原被称为肿瘤特异性抗原（TSA)。（II)癌症/种 系抗原通常仅在成熟生物体的生殖细胞内表达而不在健康的体细胞组织中表达。然而，在 癌细胞中，由于表观遗传调节的丧失，生殖细胞特异性基因可被活化。（III)分化抗原在肿 瘤及其健康祖细胞中表达。针对此类抗原的CTL响应经常导致自身免疫反应。（IV)过表达 的TAA在健康细胞中仅显示少量表达，而在肿瘤中那些抗原被强烈地活化。对于本发明，优 选的是仅使用第一类型的抗原。
[0031] 对于本发明包括通过任何种类的突变形成的TSA。仅出于说明性原因，描述了以下 类型的突变：氨基酸置换、缺失、添加、插入或化学或翻译后修饰。此外，包括染色体易位以 及仅在肿瘤细胞中表达的剪接变体，例如所述剪接变体通过导致新的剪接位点的非特异性 剪接突变出现。
[0032] 对于免疫过程，所述肽可具有任何长度。然而，最低要求是存在含有上述突变序列 的表位。本发明的优选的肽的长度为100个氨基酸，优选为50个氨基酸，更优选为30个氨 基酸，甚至更优选为8至16个氨基酸。准确的肽长度可取决于TSA被MHC I类还是MHC II 类呈递而变化。
[0033] 为了增强宿主生物体的免疫，优选的是将佐剂与肽一起使用。佐剂为例如但不限 于此，CpG和/或弗氏不完全佐剂。在用肽进行初始免疫后，将所述宿主生物体用所述肽和 /或选择的佐剂优选处理至少一次或两次、三次或四次。弗氏佐剂为油溶液（矿物油），其 中用于免疫的抗原被乳化。弗氏不完全佐剂，如本发明中优选使用的，不含有任何分支杆菌 组分。
[0034] 在免疫过程中以及之后，所述宿主生物体应形成表达针对本发明的TSA特异的重 排的T细胞受体的T细胞。然后，在优选的实施方案中，此类T细胞克隆从所述宿主生物体 中分离。例如细胞可从脾细胞、淋巴结细胞或血液中分离。可例如经由CD4或CD8的表面 表达选择T细胞克隆，这取决于TSA表位是MHC I类还是II类。从宿主生物体分离单个T 细胞克隆的方法是本领域技术人员熟知的。本发明不限制用于分离T细胞的特定方法。然 而，在本发明的一个优选实施方案中，在分离后，对所述T细胞或所述T细胞克隆表达能结 合本发明的方法中使用的TSA的TCR进行进一步测试。这优选地使用TSA特异性HLA四聚 体通过四聚体结合（染色）来完成。任选地，与未突变版本的细胞蛋白质相比，也测试分离 的T细胞或T细胞克隆对TSA的特异性。为此，比较T细胞对包含突变的肽以及对包含野 生型版本的肽的反应性。在优选的实施方案中，根据本发明的方法分离此类T细胞或T细 胞克隆，其对TSA具有高度选择性而对未突变版本的细胞蛋白质不具有高度选择性。
[0035] 本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中在分离T细胞或T细胞克 隆之后，克隆TCR序列。在该实施方案中，步骤d中的方法，如上文所述，包括以下其它方法 步骤⑴由所述T细胞克隆制备cDNA，（ii)扩增所述cDNA，以及（iii)将各个TCRa和β 基因克隆入载体。优选地，将用于转导人外周血淋巴细胞的逆转录病毒载体用作本发明的 TCR的媒介物。用于此类克隆程序的途径和方法为技术人员熟知的。
[0036] 在本发明的另一个优选实施方案中，使用的TSA在肿瘤细胞或肿瘤疾病中表达。
[0037] 如本文所用，术语"肿瘤"或"肿瘤疾病"意指良性肿瘤和恶性肿瘤两者或赘生物 并且包括黑素瘤、淋巴瘤、白血病、癌和肉瘤。肿瘤组织的说明性实例为皮肤肿瘤，诸如恶 性黑素瘤和蕈样霉菌病；血液系统肿瘤，诸如白血病，例如，急性淋巴母细胞性白血病、急 性髓细胞白血病或慢性髓细胞白血病；淋巴瘤，诸如霍奇金疾病或恶性淋巴瘤；妇科肿瘤， 诸如卵巢肿瘤和子宫肿瘤；泌尿系肿瘤诸如前列腺肿瘤、膀胱肿瘤或睾丸肿瘤的那些；软 组织肉瘤、骨肉瘤或非骨肉瘤、乳腺肿瘤；垂体肿瘤、甲状腺肿瘤和肾上腺皮质肿瘤；胃肠 肿瘤诸如食道肿瘤、胃肿瘤、肠肿瘤和结肠肿瘤的那些；胰腺肿瘤和肝肿瘤；喉乳头状瘤 (laryngeae papillomestasas)以及肺肿瘤。在本发明背景下的优选肿瘤选自黑素瘤、肺肿 瘤、子宫内膜肿瘤、神经胶质瘤、淋巴瘤、白血病或前列腺肿瘤。
[0038] 可经历本文所述的本发明方法的示例性TSA-不限制本发明-在Krauthammer等 人，2012 (Nature Genetics)中描述。由HLA A2型呈递的优选选择的TSA为RACl、RAC2、 RHOTl、MAP2K1、MAP2K2、Nosl、EGFR、SMCA4、STKll、ARID1A、RBM10、U2AF1、EP300、CHD4、 FBXW7、H3F3A、KLHL6、SPOP或MED12。其各个突变的表位序列在下文实施例部分提供。
[0039] 本发明的目标通过编码根据本发明方法获得的或可获得的TCR的核酸分子进一 步解决。本发明中进一步提供编码本发明的TCR的各个α或β链，或编码本发明的TCR 的可变结构域或恒定结构域，或编码本发明的TCR的片段的核酸分子，优选地，其中TCR的 此类片段仍具有结合其TSA的活性/能力。除此之外，核酸分子任选地具有其它序列，所述 其它序列对于核酸序列的蛋白质表达，特别是哺乳动物/人中的表达，最优选为免疫细胞 中的表达是必需的。使用的核酸可包含在适合于允许表达与细胞中的TCR相应的核酸序列 的载体中。
[0040] 还提供包含本文以上所述的核酸分子的载体或细胞，特别是，其中所述载体用于 医学中。还提供包含根据本发明的载体的细胞。
[0041] 在另一方面，本发明提供T细胞受体（TCR)或其片段，如通过本发明的方法获得 或可获得的。在该背景下，特别优选的是本发明的TCR为显示减少免疫治疗中不良作用的 TCR。本发明的TCR优选不靶向健康细胞或组织，其表达用于生成TCR的未突变（野生型） 版本的TSA。在优选的实施方案中，当给予受试者时，本发明的TCR不诱导坏死事件并且不 会增加对健康细胞或组织的免疫响应。本发明的优选的TCR为对SEQ ID No. 1中显示的表 位特异的TCR。
[0042] 优选地，根据本发明的TCR可以为本文在以下所述的TCR。
[0043] 本发明的另一实施方案涉及单链TCR(scTCR)，优选α β-scTCR，其来源于本发明 的TCR的序列。单链TCR (scTCR)为由单条氨基酸链组成的人工构建体。scTCR可包含第一 TCR链（如，[α ]链）的可变区的多肽以及整个（全长）第二TCR链（如，[β]链）的多 肽，或反之亦然。此外，scTCR可任选地含有一个或多个接头，所述接头将两条或更多条多 肽连接在一起。接头可为，例如，将两条单链连接在一起的肽，如本文所述。
[0044] 还提供本发明的此类scTCR或本发明的其它TCR源的分子，其与诸如IL-2、IL-7 或IL-15的人细胞因