子融合。本发明的TCR也可以多聚体复合物提供，所述多聚体复合物 包含至少两个scTCR或TCR分子，其中所述scTCR或TCR分子例如通过引入的生物素-链 霉亲和素官能团互连。
[0045] 本发明的另一方面提供宿主细胞，其包含如本文以上所述的载体、核酸或TCR分 子。在本发明的优选实施方案中，宿主细胞为人细胞，优选为人T淋巴细胞，其对CD4或CD8 的表达为阳性的。本发明的此类宿主细胞优选通过根据本发明的核酸或载体的转导获得。 将核酸分子引入T细胞的转导方法为本领域熟知的并且包括但不限于此病毒转导媒介物。
[0046] 在本发明的替代方面，提供通过用于制备人T细胞受体（TCR)的方法获得的或可 获得的T细胞，所述人T细胞受体对于肿瘤细胞为特异的并且减少过继性T细胞治疗中的 不良作用，如本文以上所述。此类T细胞取决于本发明的方法中使用的宿主生物体，例如人 或非人T细胞，优选为表达人TCR的非人T细胞。
[0047] 在其它方面，本发明所提供的化合物用于医学，例如用于治疗癌性疾病，特别是， 其中癌性疾病特征为所述突变的TSA的特异性表达。最优选地，本发明的化合物用于涉及 过继性T细胞转移的癌症治疗中。
[0048] 本发明的另一方面涉及治疗人受试者，特别是患有肿瘤疾病的人受试者的方法。 治疗方法包括将任何上述化合物施用至需要此种治疗的患者。本发明的化合物的施用可以 例如涉及将本发明的T细胞输注入所述患者。优选地，此类T细胞为用本发明的核酸或TCR 体外转导的患者自体的T细胞。
[0049] 因此还提供药物组合物，其包含根据本发明的TCR或TCR片段，或根据本发明的核 酸、载体、宿主细胞或分离的T细胞。在优选实施方案中，将药物组合物用于免疫治疗。
[0050] 可用于本发明的药学上可接受的载体或稀释剂的实例包括稳定剂诸如SPGA，碳水 化合物（如山梨糖醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖），蛋白质诸如白蛋白或酪蛋白， 含有诸如牛血清或脱脂乳的试剂的蛋白质以及缓冲液（如磷酸盐缓冲液）。
[0051] 在本发明的方法中优选用于获得本发明的TCR的肿瘤抗原列于下表1和2(突变 被指示为括号中表位内的氨基酸交换）：
[0052] 表 1 :
[0053]
【主权项】
1. 用于制备人T细胞受体（TCR)的方法，所述人T细胞受体对肿瘤细胞为特异的并且 在过继性T细胞治疗中具有降低的不良作用，所述方法包括： a. 提供表达未重排的人TCR基因座的宿主生物体， b. 用包含对肿瘤特异性抗原（TSA)特异的表位的肽免疫所述宿主生物体， c. 从所述宿主生物体分离对人突变的TSA具有活性的T细胞克隆， d. 任选地，从所述T细胞克隆分离所述TCR， 其中所述TSA从体细胞突变的抗原类别中选出。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主生物体还包含用于表达人主要组织相容 性复合物（MHC) I类或II类的转基因，所述人主要组织相容性复合物优选已知呈递所述突 变的TSA的人白细胞抗原（HLA)型。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述未重排的人TCR基因座在所述宿主生物 体的基因组中以一种或多种转基因存在。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述人TCR基因座编码TCR a和0 链，并且优选地包含多个TCR V、D、J和/或C基因。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述宿主生物体具有适应性免疫系 统和/或能够增加VDJC重排并且表达异源性TCR ;优选地，所述宿主生物体为转基因动物， 优选哺乳动物，更优选非人哺乳动物，最优选小鼠、大鼠、驴、兔、野兔或猴。
6. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述宿主生物体还包含失活的内源 性TCR基因座，优选地，其中所述内源性TCR基因座编码TCRa和0链。
7. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述宿主生物体为ABabDII小鼠。
8. 根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述肽包含与所对应的野生型细胞 蛋白质的氨基酸序列相比，至少一个氨基酸残基为突变的氨基酸序列。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中突变选自所述至少一个氨基酸残基的置换、缺失、 添加、插入、染色体易位、或化学或翻译后修饰。
10. 根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述肽的长度为100个氨基酸，优 选50个氨基酸，更优选30个氨基酸，甚至更优选8至16个氨基酸。
11. 根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中在步骤b中，将CpG和弗氏不完全 佐剂另外地施用至所述宿主生物体以增强免疫效率。
12. 根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中在初始免疫后，用所述肽加CpG以 及弗氏不完全佐剂将所述宿主生物体处理至少一次或多次。
13. 根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述T细胞克隆从所述宿主生物 体的脾细胞、淋巴结细胞或血液中分离。
14. 根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中步骤d包括以下的其它方法步骤： (i)由所述T细胞克隆制备cDNA，（ii)扩增所述cDNA，以及（iii)将各个TCRa和0基因 克隆入载体。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述载体为用于转导人外周血淋巴细胞的逆转 录病毒载体。
16. 根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述突变的TSA在选自黑素瘤、肺 肿瘤、子宫内膜肿瘤、神经胶质瘤、淋巴瘤、白血病或前列腺肿瘤的肿瘤中表达。
17. 根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述突变的TAA选自RAC1、RAC2、 RHOTl、MAP2K1、MAP2K2、Nosl、EGFR、SMCA4、STKll、ARID1A、RBM10、U2AF1、EP300、CHD4、 FBXW7、H3F3A、KLHL6、SPOP 或 MED12。
18. 核酸分子，其编码权利要求1至17中任一项所述的方法获得的TCR，或其a或后 链，或其可变结构域或恒定结构域，或其具有结合所述突变的TSA的能力的片段。
19. 包含权利要求18所述的核酸的载体。
20. 通过权利要求1至17中任一项所述的方法可获得的TCR，或其a或0链，或其可 变结构域或恒定结构域，或其具有结合所述突变的TAA抗原片段的能力的片段。
21. 包含a和/或0链的TCR，其中所述a和/或0链包含SEQ ID NO: 28至41中 任一项的至少一种⑶R3结构域。
22. 根据权利要求21所述的TCR，其中所述TCR包含选自表3的TCR Tl至17中任一 种的TCR单链的可变区的至少一种可变区，优选地，其中所述可变区包含SEQ ID NO 42至 55中任一项的序列。
23. 宿主细胞，其包含权利要求19所述的载体，权利要求18所述的核酸或权利要求20 至22中任一项所述的TCR。
24. 根据权利要求23所述的宿主细胞，其为人细胞，优选T细胞。
25. 根据权利要求23所述的宿主细胞，其为⑶4或⑶8阳性T细胞。
26. 通过权利要求1至17中任一项所述的方法可获得的非人T细胞。
27. 根据权利要求26所述的非人T细胞，其中所述T细胞为表达人TCR的非人T细胞。
28. 用于医学中的权利要求18所述的核酸分子，权利要求19所述的载体，权利要求20 至22中任一项所述的TCR或权利要求23至25中任一项所述的宿主细胞。
29. 用于治疗癌性疾病的权利要求28所述的核酸分子、载体、TCR或宿主细胞，特别是 其中所述癌性疾病特征为所述突变的TSA的特异性表达。
30. 根据权利要求29所述的核酸分子、载体、TCR或宿主细胞，其中所述治疗涉及过继 性T细胞治疗。
【专利摘要】本发明涉及用于制备新型T细胞受体(TCR)的方法，所述新型T细胞受体在免疫治疗(特别是过继性T细胞转移)中提供降低的不良事件的风险。根据本发明方法制备的TCR对肿瘤细胞为特异的并且不与健康组织反应。另外提供编码本发明的TCR的核酸、包含本发明的TCR的载体和宿主细胞以及它们在治疗肿瘤性疾病中的用途。
【IPC分类】A61K39-00, C07K14-725, C07K14-47
【公开号】CN104853765
【申请号】CN201380062554
【发明人】托马斯·布兰克施泰因, 杰拉尔德·维利姆斯科
【申请人】马克思-德布鲁克-分子医学中心（Mdc）柏林-布赫
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2013年11月29日
【公告号】CA2891967A1, EP2925349A1, WO2014083173A1