专利名称：双特异性死亡受体激动型抗体的制作方法
双特异性死亡受体激动型抗体本发明涉及包含特异性针对死亡受体(death receptor)的第一抗原结合位点和特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点的双特异性抗体，其生产方法，包含所述抗体的药物组合物，及其用途。由于对癌细胞上差异表达的抗原的选择性靶向，单克隆抗体在癌症的治疗中已证明是有效的治疗剂。大多数目前开发的单克隆抗体的治疗策略包括靶向肿瘤相关的抗原， 以修饰肿瘤细胞生物学，抑制生长因子受体，抑制血管生成，诱导凋亡和通过补体结合的细胞毒性或抗体依赖性细胞毒性。一些抗体靶向对癌细胞存活极其重要的生长因子受体，例如曲妥珠单抗(Herceptin )和西妥昔单抗(Erbitux )。用激动型单克隆抗体靶向癌细胞上的TRAIL死亡受体代表了新一代单克隆抗体治疗，因为其能够直接诱导靶向的细胞的凋亡。使用针对死亡受体(而不是TRAIL)的激动型单克隆抗体可能是有利的TRAIL靶向包括死亡受体和诱捕受体(decoy receptor)的多种受体，因此影响到选择性。另外，相比单克隆抗体，TRAIL具有短得多的血液半衰期，这是影响剂量和时间表参数的一个因素。 相比单克隆抗体，TRAIL的非常短的血液半衰期将需要大量和频繁的剂量。另外，生产重组 TRAIL是非常困难和耗时的。Michaelson J. S.等人(mAbs，卷 1，期号 2，ρ :128-141 ；2009 年 3 月 /4 月)描述了改造的I gG样双特异性抗体，其靶向2种TNF家族成员受体，即TRAIL-R2 (TNF相关凋亡诱导配体受体- 和LT β R (淋巴毒素β受体)。Herrmann Τ.等人(Cancer Res 2008 ；68 :(4) ；ρ :1221-1227)描述了针对 CD95/ Fas/Αρο-Ι细胞表面受体和成胶质细胞瘤细胞上的3种靶抗原NG2，EGFR和⑶40的双特异性单价化学结合的Fab分子。本发明涉及组合靶向死亡受体的抗原结合位点和靶向第二抗原的第二抗原结合位点的抗体。由此死亡受体变得交联并诱导靶细胞的凋亡。这些双特异性死亡受体激动型抗体相比传统的靶向死亡受体的抗体的优势在于，仅在表达第二抗原的位点诱导凋亡的特异性。在第一个方面(object)，本发明涉及包含特异性针对死亡受体抗原的第一抗原结合位点和特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点的双特异性抗体。在双特异性抗体的优选实施方案中，死亡受体选自死亡受体4多肽(DR4)，死亡受体5多肽(DR5)或FAS多肽，优选地人DR4多肽(Seq. Id. No. 1)，人DR5多肽(Seq. Id. No. 2) 或人 FAS 多肽(Seq. Id. No. 3)。在双特异性抗体的进一步优选的实施方案中，第二抗原与肿瘤疾病或类风湿性关节炎相关。在双特异性抗体的进一步优选的实施方案中，第二抗原选自癌胚抗原(CEA)多肽，CRIPTO蛋白，神奇迂回(magic roundabout)同源物4(R0B04)多肽，黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)多肽，腱生蛋白C多肽和成纤维细胞活化蛋白(FAP)多肽，优选地人 CEA 多肽(Seq. Id. No. 4)，人 CRIPTO 多肽(Seq. Id. No. 5)，人 R0B04 多肽(Seq. Id. No. 6)， 人MCSP多肽(Seq. Id. No. 7)，人腱生蛋白C多肽(Seq. Id. No. 8)和人FAP多肽(Seq.Id. No. 9)。在双特异性抗体的进一步优选的实施方案中，双特异性抗体是包含第一抗体和第二抗体的二聚分子，所述第一抗体包含第一抗原结合位点和所述第二抗体包含第二抗原结合位点。在本发明的二聚双特异性抗体的优选实施方案中，第一和第二抗体包含抗体重链的Fc部分，其中第一抗体的Fc部分包含第一二聚化模块，第二抗体的Fc部分包含第二二聚化模块，从而允许2种抗体的异源二聚化。在二聚双特异性抗体的进一步优选的实施方案中，根据杵臼结构(knobs into holes)策略(见 Carter P. ；Ridgway J. B. B. ；Presta L. G. :Immunotechnology,卷 2,号 1，1996年2月，pp. 73-73(1))，第一二聚化模块包含杵(knob)和第二二聚化模块包含臼
(hole) ο在二聚双特异性抗体的进一步优选的实施方案中，第一抗体是包含轻链和重链的免疫球蛋白(Ig)分子，和第二抗体选自scFv, SCFab，Fab或Fv。在进一步优选的实施方案中，双特异性抗体包含相比野生型Fc部分对Fc Y受体具有降低的结合亲和力的修饰的Fc部分，例如LALA修饰。在二聚双特异性抗体的进一步优选的实施方案中，Ig分子包含特异性针对死亡受体的第一抗原结合位点和第二抗体包含特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点。在双特异性抗体的进一步优选的实施方案中，Ig分子包含特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点，和第二抗体包含特异性针对死亡受体的抗原结合位点。在二聚双特异性抗体的进一步优选的实施方案中，第二抗体被融合在Ig分子重链的N-或C-端。在二聚双特异性抗体的进一步优选的实施方案中，第二抗体被融合在Ig分子轻链的N-或C-端。在二聚双特异性抗体的进一步优选的实施方案中，Ig分子是IgG。在二聚双特异性抗体的进一步优选的实施方案中，第二分子通过肽接头，优选地具有约10-30氨基酸长度的肽接头融合至Ig分子。在二聚双特异性抗体的进一步优选的实施方案中，第二抗体包含另外的半胱氨酸残基以形成二硫键。根据本发明的双特异性抗体至少是二价的且可为三价或多价的，例如四价或六价的。在第二个方面，本发明涉及包含本发明的双特异性抗体的药物组合物。在第三个方面，本发明涉及用于治疗癌症或类风湿性关节炎的本发明的双特异性抗体。在另外的方面，本发明涉及包含编码本发明的双特异性抗体重链的序列的核酸序列，包含编码本发明的双特异性抗体轻链的序列的核酸序列，包含本发明的核酸序列的表达载体，并涉及包含本发明的载体的原核或真核宿主细胞。发明详述本文使用的术语“多肽”指本发明的多肽，即来自任意动物，例如哺乳动物物种 (包括人)的DR4，DR5，FAS, CEA, CRIPT0, R0B04, MCSP，腱生蛋白C和FAP的天然氨基酸序列和序列变体。“天然多肽”指具有与天然存在的多肽相同的氨基酸序列的多肽，不管其制备模式。术语“天然多肽”特别包含本发明的多肽的天然存在的截短或分泌的形式，天然存在的变体形式(例如另外的剪接形式)，和天然存在的等位基因变体。在序列表中的氨基酸序列 (Seq. Id. No. 1-9)指本发明的蛋白质的天然人序列。术语“多肽变体”指在天然序列中包含一个或多个氨基酸取代和/或缺失和/或插入的天然序列的氨基酸序列变体。氨基酸序列变体一般与本发明的多肽的天然序列的氨基酸序列具有至少约75 %，优选至少约80 %，更优选至少约85 %，甚至更优选至少约90 %， 最优选至少约95%的序列同一性。术语“抗体”包含抗体结构的多种形式，包括但不限于整个抗体和抗体片段。根据本发明的抗体优选地是全人抗体，人源化抗体，嵌合抗体，或其它基因改造的抗体，只要其保留根据本发明的特征性能。“抗体片段”包含全长抗体的一部分，优选地其可变结构域，或至少其抗原结合位点。抗体片段的实例包括双抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。在例如 Houston，J. S.，Methods in Enzymol. 203(1991)46-96)中描述了 scFv 抗体。另外，抗体片段包含具有VH结构域特征(即能够与VL结构域组装在一起)，或具有VL结构域特征 (即能够与VH结构域组装在一起)，以形成功能性抗原结合位点并因此提供全长抗体的抗原结合性能的单链多肽。如本文中所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一氨基酸组成的抗体分子的制备物。术语“嵌合抗体”是指包含来自一种来源或物种的可变区即结合区，以及至少一部分来源于不同来源或物种的恒定区的抗体，通常通过重组DNA技术制备。优选包含鼠源可变区和人源恒定区的嵌合抗体。由本发明包括的“嵌合抗体”的其他优选形式是其中恒定区已经从原始抗体的恒定区得以修饰或改变，以产生根据本发明的特性，特别是有关Clq结合和/或Fc受体(FcR)结合的那些嵌合抗体。此类嵌合抗体也称为“类别转换抗体”。嵌合抗体是包含编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段的免疫球蛋白基因的表达产物。用于产生嵌合抗体的方法涉及本领域熟知的常规重组DNA和基因转染方法。参见，例如，Morrison，S. L.等，Proc. Natl. Acad Sci. USA 81(1984)6851-6855; 美国专利 No. 5，202，238 和 5，204，244。术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中框架或“互补决定区”(OTR)已经被修饰， 以包含与亲本免疫球蛋白相比具有不同特异性的免疫球蛋白的CDR。在优选的实施方案中，将鼠CDR移植至人抗体的框架区，以制备“人源化抗体”。参见例如，Riechmarm，L.等， Nature 332 (1988) 323-327 ；以及 Neuberger，Μ· S.等，Nature 314(1985068-270。特别优选的CDR对应于提供这样序列的CDR，所述序列识别上述嵌合抗体的抗原。由本发明包括的 “人源化抗体”的其他形式是其中恒定区已经从原始抗体的恒定区得以修饰或改变，以产生根据本发明的特性，特别是有关Clq结合和/或Fc受体(FcR)结合的那些人源化抗体。如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。人抗体在本领域是众所周知的(van Dijk, Μ. Α.和van de Winkel, J. G.，Curr · Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374)。人抗体也可以在转基因动物(如小鼠)中生产，所述转基因动物经免疫后能够生产全部或选择的人抗体，而无内源免疫球蛋白生产。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到这样的种系突变小鼠中导致在抗原刺激时生产人抗体(参见例如Jakobovits，A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(1993)2551-2555 Jakobovits, Α.等，Nature 362(1993)255-258 ；Bruggemann, Μ.等，Year Immunol. 7 (1993) 33-40)。人抗体也可以在噬菌体展示文库中生产 (Hoogenboom, H. R.和 Winter，G.，J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 ；Marks, J. D.等，J. Mol. Biol. 222(1991)581-597)。还可以利用Cole等及Boerner等的技术制备人单克隆抗体 (Cole Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985)；禾口 Boerner，P.等，J. Immunol. 147(1991)86-95)。如已经提及的根据本发明的嵌合抗体和人源化抗体，如本文中所用，术语“人抗体”也包含其中例如通过“类别转换”(即改变或突变 Fc部分，例如从IgGl到IgG4和/或IgGl/IgG4的突变)修饰恒定区，以产生根据本发明的特性，特别是有关Clq结合和/或Fc受体(FcR)结合的此类抗体。如本文所用，术语“重组人抗体”旨在包括通过重组手段制备、表达、创建或分离的所有人抗体，例如，从宿主细胞例如NSO或CHO细胞或者从转基因人免疫球蛋白基因的动物 (例如小鼠)中分离的抗体或利用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。此类重组人抗体具有以重排形式的可变区和恒定区。可以将根据本发明的重组人抗体进行体内体细胞高度突变。因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是在体内人抗体种系所有组成成分内并不天然存在的序列，尽管其来源于并与人种系VH和VL序列有关。如本文所用的“可变结构域”(轻链可变结构域(VL)、重链可变结构域(VH))表示直接参与抗体与抗原结合的每一对轻链和重链结构域。轻链和重链可变结构域具有相同的一般结构，并且每一区域包含由三个“高变区”(或互补决定区，⑶R)连接的序列广泛保守的四个构架(FR)区。该构架区采用β折叠构象，并且⑶R可以形成连接β折叠结构的环。 每一链中的CDR通过构架区固定在其三维结构中并与来自其他链的CDR—起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在根据本发明的抗体的结合特异性/亲和力中起着特殊的重要作用，并因此提供了本发明的另外目的。当在本文中使用时，术语“抗体的抗原结合部分”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“构架”或 “FR”区是非如本文中定义的高变区残基的这些可变区区域。因此，抗体的轻链和重链可变结构域从N末端到C末端包含区域FRl、OTRl、FR2、raR2、FR3、raR3和FR4。特别地，重链的 ⑶R3是最有助于抗原结合的和定义抗体性能的区域。⑶R和FR根据Kabat等，kquences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的标准定义和/或来自“高变环”的残基确定。抗体特异性指抗体对抗原的特定表位的选择性识别。例如天然抗体是单特异性的。根据本发明，“双特异性抗体”是具有两个不同的抗原结合特异性的抗体。本发明的抗体特异性针对两种不同的抗原，即作为第一抗原的死亡受体抗原和第二抗原。如本文中所用，术语“单特异性”抗体指具有一个或多个结合位点的抗体，其中每一结合位点结合相同抗原的相同表位。如本文中所用，术语“双特异性”抗体指具有至少两个结合位点的抗体，其中每一结合位点结合相同抗原或不同抗原的不同表位。
如在本申请中所用，术语“价”指在抗体分子中存在的结合位点的具体数目。因此， 术语“二价的”、“四价的”和“六价的”指在抗体分子中分别存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。根据本发明的双特异性抗体至少是“二价的”，且可为“三价的”或“多价的”(例如“四价的”或“六价的”)。本发明的抗体具有两个或多个结合位点，并且是双特异性的。即，甚至在存在多于两个结合位点(即抗体是三价的或者多价的)的情况下，抗体也可以是双特异性的。本发明的双特异性抗体包括，例如多价单链抗体，双抗体和三链抗体，以及具有全长抗体的恒定结构域结构的抗体，其上可通过一个或多个肽接头连接另外的抗原结合位点(例如单链 Fv，VH结构域和/或VL结构域，Fab或(Fab) 2)。抗体可为来自单个物种的全长抗体，或为嵌合的或人源化的。“单链Fab片段”是由抗体重链可变结构域(VH)，抗体恒定结构域1 (CHl)，抗体轻链可变结构域(VL)，抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头从N-端至C-端方向上具有以下顺序之一a) VH-CHl-接头-VL-CL，b) VL-CL-接头-VH-CH1，c) VH-CL-接头-VL-CH1 或 d) VL-CHl-接头-VH-CL ；其中所述接头是至少30氨基酸，优选在32和50氨基酸之间的多肽。 所述单链 Fab 片段 a) VH-CHl-接头-VL-CL，b) VL-CL-接头-VH-CH1，c) VH-CL-接头-VL-CH1 和d) VL-CHl-接头-VH-CL通过在CL结构域和CHl结构域之间的天然的二硫键稳定。另夕卜， 可通过半胱氨酸残基的插入(例如，在根据Kabat编号的重链可变区第44位和轻链可变区第100位之间)形成链间二硫键进一步稳定这些单链Fab分子。术语“N-端”指N-端的最后一个氨基酸。术语“C-端”指C-端的最后一个氨基酸。如本文使用的，术语“核酸”或“核酸分子，，旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可为单链或双链的，但优选是双链DNA。如在本申请中使用的术语“氨基酸”指天然存在的羧基α -氨基酸组，其包括丙氨酸(三字母编码ala，单字母编码A)，精氨酸(arg，R)，天冬酰胺(asn，N)，天冬氨酸(asp， D)，半胱氨酸(cys，C)，谷氨酰胺(gln，Q)，谷氨酸(glu，Ε)，甘氨酸(gly，G)，组氨酸(his， H)，异亮氨酸(ile，I)，亮氨酸(leu，L)，赖氨酸(lys，K)，甲硫氨酸(met，M)，苯丙氨酸(phe， F)，脯氨酸(pro，P)，丝氨酸(ser，S)，苏氨酸(thr，Τ)，色氨酸(trp，W)，酪氨酸(tyr，Y)， 和缬氨酸(val，V)。当核酸与另一核酸序列处于功能关联状态时，其“有效连接”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA的连接表达为参与所述多肽分泌的前蛋白，则他们有效连接；如果启动子或增强子的连接影响编码序列的转录，则他们有效连接；或者如果核糖体结合位点与编码序列的排置有利于翻译，则他们有效连接。通常，“有效连接”表示连接的 DNA序列是相邻的，而且在分泌前导序列的情况下是相邻且同读框连接的。不过，增强子不必相邻。连接通过便利的限制性位点处的连接实现。如果不存在这样的位点，则按照常规操作使用合成的寡核苷酸适配体(adaptor)或接头。如本文使用的，措辞“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”是互换使用的，且所有名称包括其后代。因此，词语“转染体”和“转染细胞”包括原代对象细胞和来源于其的培养物，不管传代次数。也应当理解，由于故意或无意突变，所有后代在DNA含量中不是精确相同的。包括与原始转化细胞所筛选的功能或生物学活性具有相同功能或生物学活性的变体
8后代。如本文使用的，术语“结合”或“特异性结合”指在体外测定中，优选在表面等离子共振(SPR，BIAcore，GE-Healthcare Uppsala, Sweden)测定中，抗体与抗原表位的结合。通过术语ka (抗体/抗原复合物中的抗体的结合速率常数)，kD (解离常数)和KD(kD/ka)定义结合亲和力。结合或特异性结合指10_8mol/l或更低，优选101至10_13mol/l的结合亲和力(KD)。可通过BIAcore测定(GE-Healthcare Uppsala，Sweden)研究抗体与死亡受体的结合。通过术语ka(抗体/抗原复合物中的抗体的结合速率常数)，kD(解离常数)和 KD(kD/ka)定义结合亲和力。术语“表位”包括能够与抗体特异性结合的任意多肽决定簇。在某些实施方案中， 表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，在某些实施方案中，可以具有特殊三维结构特征和/或特殊电荷特征。表位是抗原结合抗体的区域。抗体的“Fe部分”不直接参与抗体与抗原的结合，但展示多种效应子功能。“抗体的Fc部分”是本领域技术人员熟知的术语，并基于抗体的木瓜蛋白酶切割定义。取决于抗体的重链的恒定区的氨基酸序列，将抗体或免疫球蛋白分为=IgA型、IgD型、IgE型、IgG型和 IgM型，并且可以将这些的几种进一步分成亚型(同种型)，例如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4、 IgAl和IgA2。根据重链恒定区将免疫球蛋白的不同种类分别称为α，δ，ε，Y和μ。抗体的Fc部分直接参与基于补体激活、Clq结合和Fc受体结合的ADCC (抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和⑶C(补体依赖的细胞毒性)。补体活化(⑶C)通过补体因子Clq与大多数I gG 抗体亚型的Fc部分结合引发。尽管抗体对补体系统的影响取决于特定的条件，通过Fc部分中的确定的结合位点引起与Clq的结合。这样的结合位点是现有技术中已知的，并例如由 Boakl e 等人，Nature 282(1975)742-743, Lukas 等人，J. Immunol. 127(1981)2555-2560， Brunhouse and Cebra, Mol. Immunol. 16 (1979)907-917, Burton 等人，Nature 288(1980)338-344，Thommesen 等人，Mol. Immunol. 37(2000)995-1004, Idusogie 等人， J. Immunol. 164(2000)4178-4184, Hezareh 等人，J. Virology 75(2001) 12161-12168, Morgan 等人，Immunology 86 (1995) 319-324，EP 03074 描述。这样的结合位点是，例如， L234、L235、D270、拟97、E318、K320、K322、P331 和 (根据 Kabat 的 EU 索引编号，见下)。 IgGl, IgG2和IgG3亚类的抗体通常显示补体激活和Clq和C3结合，而IgG4不激活补体系统且不结合Clq和C3。根据本发明的抗体通过重组手段生产。因此，本发明的一个方面是编码根据本发明的抗体的核酸，且进一步的方面是包含编码根据本发明的抗体的所述核酸的细胞。用于重组产生的方法在本领域广为人知，并且包括在原核和真核细胞中表达蛋白质，随后分离抗体多肽，并通常纯化至可药用的纯度。为在宿主细胞中表达如前所述的抗体，通过标准方法将各自编码修饰的轻链和重链的核酸插入表达载体中。在合适的原核或真核宿主细胞如 CHO 细胞、NSO 细胞、SP2/0 细胞、HEK293(包括 HEK293 EBNA)细胞、COS 细胞、PER. C6 细胞、 酵母或大肠杆菌细胞中进行表达，从细胞(裂解后的上清液或细胞)中回收抗体。用于抗体的重组生产的一般方法在本领域众所周知，并描述于例如Makrides，S. C.，Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183—202 ；Geisse, S.等，Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282 ；Kaufman,R. J.，Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161 ；Werner, R. G.，Drug Res. 48 (1998) 870-880 的综
述文章中。可以通过常规的免疫球蛋白纯化方法例如，如蛋白质A-琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析从培养基中适当地分离根据本发明的抗体。编码单克隆抗体的DNA和RNA利用常规方法很容易分离，并进行测序。杂交瘤细胞可用作为此类DNA和RNA 的来源。DNA —经分离，即可将DNA插入到表达载体中，随之转染到否则将不生产免疫球蛋白的宿主细胞例如HEK293细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞中，以实现宿主细胞中重组单克隆抗体的合成。通过将合适的核苷酸改变引入到抗体DNA中，或者通过核苷酸合成制备根据本发明的抗体的氨基酸序列变体(或突变体)。可以进行此类修饰，然而，仅以非常有限的范围， 例如，如上所述。例如，修饰并不改变上述的抗体特征，例如IgG同种型和抗原结合，但可以改进重组产物的产率、蛋白质稳定性或有助于纯化。如在本申请中所有，术语“宿主细胞”指可以工程改造以产生根据本发明的抗体的任一类型的细胞系统。在一个实施方案中，将HEK293细胞和CHO细胞用作为宿主细胞。如本文使用的，措辞“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”是互换使用的，且所有名称包括其后代。因此，词语“转染体”和“转染细胞”包括原代对象细胞和来源于其的培养物，不管传代次数。也应当理解，由于故意或无意突变，所有后代在DNA含量中不是精确相同的。包括与用于筛选原始转化细胞的功能或生物学活性具有相同功能或生物学活性的变体后代。在NSO 细胞中表达由例如，Barnes, L. Μ.等，Cytotechnology 32 (2000) 109-123 ； Barnes, L. Μ.等，Biotech. Bioeng. 73 Q001)洸1_270 描述。瞬时表达由例如，Durocher, Y.等，Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9 描述。可变区的克隆由 Orlandi，R.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837 ；Carter, P.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1992)4285-4289 ；和 Norderhaug，L.等，J. Immunol. Methods 204(1997)77-87 描述。优选的瞬时表达系统(HEK 293)由 khlaeger，Ε. -J.，and Christensen, K.， 在 Cytotechnology 30(1999)71—83 中禾口由 Schlaeger，Ε.-J.，在 J. Immunol. Methods 194(1996) 191-199 中描述。适合于原核生物的调控元件序列，例如，包括启动子，备选的操纵序列和核糖体结合位点。真核细胞已知利用启动子、增强子和多聚腺苷化作用信号。通过标准技术，包括本领域众所周知的碱/SDS处理、氯化铯分带(CsClbanding)、 柱层析、琼脂糖凝胶电泳等等进行抗体的纯化，以除去其他细胞组分或其他杂质，如其他细胞核酸或蛋白质(参见Ausubel，F.等编辑Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York(1987))。已经建立了不同的方法并广泛用于蛋白质纯化，例如使用微生物蛋白质的亲和层析(例如A蛋白或G蛋白亲和层析)、离子交换层析(例如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨乙基树脂)和混合模式交换)、亲硫吸附(例如用β -巯基乙醇和其他SH配体)、疏水作用或芳族吸附层析(例如用苯基琼脂糖、氮杂-arenophilic树脂或间-氨基苯基硼酸 (m-aminophenylboronic acid))、金属螯合亲和层析(例如用Ni(II)和Cu(II)亲和材料)大小排阻层析和电泳方法(例如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi，Μ. A. App 1. Biochem. Biotech. 75(1998)93—102)。
如本文中所用，“药物载体”包括生理上相容的任何及所有溶剂、分散介质、包衣、 抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。优选载体适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊锥(spinal)或表皮给药(例如通过注射或输注)。本发明的组合物可通过本领域公知的多种方法给药。正如技术人员将会理解的那样，给药路径和/或方式将随期望的结果而变动。为通过某些给药路径给药本发明的化合物，可能需要用防止化合物失活的材料对其进行包衣，或化合物与之共给药。例如，可以向受试者给药处于适宜载体例如脂质体或稀释剂中的化合物。可药用稀释剂包括盐溶液和水性缓冲溶液。可药用载体包括无菌水性溶液或分散液，以及用于临时制备无菌注射液或分散液的无菌粉剂。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。如本文所用的短语“肠胃外给药”和“经肠胃外给药”，表示不同于肠和局部给药的给药方式，通常是通过注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。如本文中所用，术语癌症指增生性疾病，例如淋巴瘤、淋巴细胞白血病、肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、细支气管细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈的癌、皮的或眼内的黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区的癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、 结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管的癌、子宫内膜的癌、子宫颈的癌、阴道的癌、外阴的癌、霍奇金病、食管的癌、小肠的癌、内分泌系统的癌、甲状腺的癌、甲状旁腺的癌、肾上腺的癌、软组织的肉瘤、尿道的癌、阴茎的癌、前列腺癌、膀胱的癌、肾或输尿管的癌、肾细胞癌、肾盂的癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆癌、中枢神经系统(CNS)的瘤、脊椎轴肿瘤(spinal axis tumor)、 脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星细胞瘤、斯万细胞瘤、室管膜细胞瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤文肉瘤，包括任一上述癌的难治类型或者一种或多种上述癌的组合。这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过前述灭菌操作，以及通过纳入多种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等，均可以确保防止微生物的存在。还可能期望在组合物中纳入等渗剂，如糖、氯化钠等。另外，可注射药物形式的延迟吸收可以通过纳入延迟吸收的药剂如单硬脂酸铝和明胶来实现。无论所选的施用路径如何，可以以适宜水合物形式使用的本发明的化合物和/或本发明的药物组合物通过本领域公知的常规方法配制为可药用剂型。根据本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可有变动，以获得有效量的活性成分，从而对于特定的患者、组合物和给药方式实现期望的治疗反应，而对患者没有毒性。所选的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本发明特定组合物的活性、给药路径、给药时间、所采用特定化合物的排泄速率、与所采用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、病情、总体健康和既往病史、 以及医学领域众所周知的类似因素。组合物必需是无菌和流动的，从而组合物可以通过注射器递送。除了水之外，载体还可以是等渗缓冲盐溶液。例如，可以通过使用包衣如卵磷脂，分散剂的情况下通过维持所需的颗粒大小，通过使用表面活性剂，来维持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中纳入等渗剂，例如糖，多元醇如甘露醇或山梨糖醇，和氯化钠。如本文中所用，术语“转化”指将载体/核酸转移到宿主细胞中的方法。如果将没有坚固的细胞壁屏障的细胞用作为宿主细胞，例如通过如Graham，F. L.，和van der Eb, A.J.，Virology 52 (1973) 456-467所述的磷酸钙沉淀方法实施转染。然而，也可以使用将DNA引入细胞的其他方法，例如通过核注射或通过原生质体融合。如果使用含有坚固的细胞壁结构的原核细胞或细胞，例如，转染的一种方法是使用如由Cohen，S.N.等， PNAS. 69 (197 2110-2114所述的氯化钙的钙处理。如本文中所用，“表达”指核酸转录成mRNA的过程和/或所述转录的mRNA (也称为转录物)随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽都称为基因产物。如果多核苷酸来源于基因组DNA，那么在真核细胞中表达包括mRNA的剪接。“载体”是将核酸分子插入到宿主细胞中和/或之间的，特别是自复制的核酸分子。 该术语包括主要用于将DNA或RNA插入到细胞中(例如，染色体整合)的载体，载体的复制主要用于DNA或RNA的复制，以及用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达载体。也包括提供一个以上的如上所述功能的载体。“表达载体”是当将其引入到合适的宿主细胞时，能转录并翻译成多肽的多核苷酸。“表达系统”通常指包含可以用于产生想要的表达产物的表达载体的合适宿主细胞。提供如下实施例、序列列表和附图以帮助理解本发明，本发明的真正范围阐释在所附权利要求书中。应当理解，可以对所示的操作进行改动而不会偏离本发明的精神。附图简述图 1:在不同人细胞系(Lovo, 0VCAR-3, AsPC-1，BxPC3, LS174T 和 MKN-45)中的CEA，DR5和FAS表达水平的FACS结合分析，使用未标记的市售鼠IgGl抗体(CEA Abcam# 11330 ；DR5 :R&D#MAB631 ；FAS :BD#555671)和常用的山羊抗小鼠 FITC 标记的 IgG (Serotec Starl05F)检测。使用仅包含细胞或包含细胞和仅第二抗体的样品作为对照。 除了 Lovo细胞以外，所有检测的细胞系在表面上表达大量的DR5和FAS。与这相比，CEA表达非常低。当用针对3种抗原的其他抗体检测相同的细胞时，Lovo细胞也在FACS分析中为DR5，FAS和CEA表达阳性的(数据未显示)。图2 在与市售的能够在溶液中诱导凋亡的无交联的抗体(DR5 :R&D#MAB631 ；FAS Millipore/Ups tate =CHll)孵育4小时后，不同细胞系的凋亡诱导(DNA片段化测定)分析。为了检测凋亡，使用用于分析组蛋白相关的DNA片段化的细胞死亡检测ELISAPLUS试剂盒。在BxPC-3，Lovo和LS174T细胞中，通过DR5和FAS可明显地诱导凋亡，而ASPC-I细胞完全没有经历凋亡。相比其他细胞系，MKN-45细胞对DR5更具抗性。图3 与ApomAM白色条)、与抗人Fc抗体交联的ApomAb (阴影线灰色条)、 ApomAb_Sm;3e_A(黑色条)和ApomAb_Sm;3e_Al (带点灰色条)双特异性分子孵育4小时后 LS174T细胞的诱导凋亡(DNA片段化测定)。可检测通过双特异性抗体靶向的高度交联的 CEA结合依赖的凋亡的诱导。此作用与通过ApomAb的交联诱导的凋亡在相同的范围内，并可通过与过量的sm;3e IgG的预孵育完全消除。在对照(仅有细胞或Sm;3e IgG)中未观察到凋亡，且单独的ApomAb在使用的浓度(lyg/ml)上没有诱导凋亡。图4 在使用与凋亡诱导剂孵育4小时的LS174T细胞的DNA片段化测定中，相比单独的ApomAb (白色条)或与抗人Fc抗体交联的ApomAb (阴影线灰色条)，不同的ApomAb_ Sm;3e双特异性分子的凋亡诱导活性的比较。大体上，其中sm;3e scFv与ApomAb重链的C-端融合的分子(形式A，黑色条)似乎比其中Sm;3e scFv与ApomAb轻链的C-端融合的构建体 (形式B，灰色条)活性高。此外，包含二硫化物稳定的scFv的双特异性抗体(形式Al，带点灰色条和Bi，小网格条)似乎比具有野生型scFv的分子活性略差。图5 与ApomAM白色条)、与抗人Fc抗体交联的ApomAb (阴影线灰色条)或 ApomAb_PRlA3_A双特异性构建体(黑色条)孵育4小时后的LS174T细胞的凋亡诱导分析 (DNA片段化测定)。在每种情况下，凋亡诱导都依赖于使用的抗体浓度。单独的ApomAb 也在高浓度下诱导了低水平的凋亡，但通过交联凋亡水平显著提高了。双特异性ApomAb_ PR1A3_A分子在没有第二交联剂时甚至比交联的ApomAb活性更高。图6 与ApomAb (白色条)、与抗人Fc抗体交联的ApomAb (灰色条)或ApomAb_ PR1A3_A双特异性构建体(黑色条)孵育4小时后的Lovo细胞的凋亡诱导分析(DNA片段化测定)。在每种情况下，凋亡诱导都依赖于使用的抗体浓度。单独的ApomAb也在高浓度下诱导了低水平的凋亡(如上所述)，但通过交联凋亡水平显著提高了。双特异性ApomAb_ PR1A3_A分子自身与交联的ApomAb —样有活性。图7 在与不同凋亡诱导双特异性抗体孵育4小时后，在LS174T细胞中的DNA片段化的比较。使用的分子是ApomAb_PRlA3双特异性分子，其中PRlA3scFV(Wt = Α/Β或二硫化物稳定的=Α1/Β1)与重链(Α，阴影线灰色条)或轻链(B，带点条)的C端融合。尽管在此情况下scFv的融合位置似乎就凋亡诱导而言没有区别，使用的融合scFv的类型却是重要的相比包含与ApomAb融合的wt scFv,使用二硫化物稳定的scFv几乎完全消除了凋亡的诱导(分别是灰色和黑色条)。由于PR1A3相比Sm;3e的较低的亲和力，用包含raiA3 的双特异性分子的整体凋亡诱导也较低。图8 =ApomAb-CEA (PR1A3)双特异性构建体在MKN-45细胞上的FACS结合分析。比较了具有野生型㈧或二硫化物稳定的scFv(Al)的ApomAb_PRlA3双特异性构建体。两种双特异性构建体都以浓度依赖的方式与靶细胞结合，但包含野生型scFv形式的PR1A3的分子比包含二硫化物稳定的raiA3scFv的分子以高得多的亲和力结合抗原。图9 在NCCIT和重组的表达CRIPTO的HEK293细胞上通过FACS结合实验进行 CRIPTO, FAS和DR5表面表达分析。相比重组的HEK293-CRIPT0细胞，NCCIT细胞不表达 FAS，仅表达少量的CRIPTO但表达类似量的DR5。后一种细胞显示了低水平的FAS，显著水平的DR5和相当高水平的CRIPTO表达。
图10 使用FAS (HFE7A IgG)，通过抗人Fc抗体交联的FAS (HFE7A IgG)和 FAS-CRIPTO双特异性分子(HFE7A_LC020H3L2Dl，其中wt(A)或二硫化物稳定的(Al)CRIPTO scFv与HFE7A重链的C端融合)的凋亡诱导比较(在HEK293-CRIPT0细胞中的DNA片段化)。单独的FAS IgG，单独的CRIPTO IgG和FAS-MCSP双特异性分子不诱导凋亡，而交联的FAS和HFE7A-CRIPT0双特异性分子在4小时的孵育后显示了 DNA片段化，所述DNA片段化可通过与过量的抗CRIPTO IgG预孵育部分消除。图11 相比重组的HEK293_FAP(成纤维细胞活化蛋白)细胞(白色条)，在重组的 HEK293-CRIPT0细胞(黑色条)中通过HFE7A-CRIPT0双特异性分子的凋亡诱导(DNA片段化测定)。在两种细胞系中，可使用诱导凋亡的市售抗体(CHll)和使用通过第二种Fc特
13异性抗体交联的HFE7A IgG诱导凋亡，而单独的HFE7A在所使用条件下不诱导凋亡。使用双特异性FAS-CRIPT0分子的凋亡诱导比用交联的HFE7A IgG更高，但不能通过与过量的抗 CRIPTO IgG预孵育被完全抑制。在HEK293-FAP细胞中可观察到一定的低背景凋亡，这也不能被过量的CRIPTO IgG完全竞争(out-competed)。甚至阴性对照分子(其中二硫化物稳定的MCSP特异性scFv与HFE7A重链的C端融合)在HEK293-FAP细胞中显示了低程度的凋亡。图12 使用2种不同抗体在不同细胞系(MCF7，SkBr3, A431，A549, HCT-116和 U87-MG)上测定MCSP表面表达水平的FACS结合分析。使用2种抗体都可检测到相同水平的MCSP表达，表明U87-MG显示了最高的MCSP表达，HCT-116具有低MCSP表达，而所有其他检测的细胞系为MCSP阴性的(在阴性对照例如未染色细胞的范围中)。图13 使用可溶的和交联的ApomAb (黑色条)和HFE7A(灰色条)和相关对照分子(单独的抗FAS_CH11，抗DR5_R2和抗Fc-IgG)评估U87_MG(A)和HCT-116 (B)细胞的凋亡能力。尽管在HCT-116细胞中仅可通过DR5受体在4小时后诱导凋亡且不通过FAS诱导凋亡，在U87-MG细胞中则不同。这里，在M小时后才观察到显著的凋亡。与HCT-116细胞相反，通过交联的HFE7A的U87-MG凋亡诱导效率是使用交联的ApomAb的2倍。已经在溶液中赋予凋亡的对照抗体甚至更有效。图14 与双特异性HFE7A-MCSP抗体(mAb 9. 2. 27)(其中野生型(A形式)或二硫化物稳定的MCSP scFv (Al形式)与ApomAb重链的C-端融合)孵育M小时后在U87-MG神经胶质瘤细胞中的凋亡诱导分析。在此情况中，包含二硫化物稳定的scFv的构建体证明了比包含野生型scFv的分子显著更高的凋亡(尽管通过DNA片段化测量的凋亡量相对低)。 然而，在两种情况下，可通过细胞与过量竞争MCSP IgG的预孵育完全消除凋亡的诱导。图15 2种不同细胞系(SW872和GM05389)的人成纤维细胞活化蛋白(FAP)表达水平的FACS结合分析(A)。使用不同浓度的抗FAP抗体测量的荧光强度在3个数量级的范围上显示(黑色、灰色和阴影线条)。仅有第二抗体和细胞的阴性对照反应分别以带点条和白色条显示。尽管GM05389细胞在所有检测的抗体浓度上展示了高于背景的FAP表达，在 SW872细胞中仅在使用的最高抗体浓度(10 μ g/ml)上可检测到FAP表达，表明这些细胞不适合用于基于FAP的结合/凋亡诱导实验。另外显示，此细胞系几乎不经历ApomAb介导的凋亡(B)。单独的ApomAb或另一种市售的抗DR5抗体没有诱导相关的DNA片段化。只有当 ApomAb与抗人Fc抗体交联时，可观察到可检测的低水平的凋亡诱导。图16 相比共同培养两种细胞系(黑色条)，单独的GM05389(白色条)和 MDA-MB-231(灰色条)的凋亡诱导分析。在所有细胞系中，单独的ApomAb仅具有微弱的作用，而ApomAb的交联导致在MDA-MB-231细胞中的显著的凋亡诱导。用死亡受体激动型双特异性构建体(ApomAb-FAP)诱导的DNA片段化仅在共同培养两种细胞系时出现高水平。这里，单独ApomAb交联没有在相同的范围中提高凋亡，表明为了最佳的诱导凋亡，两种细胞系是必需的一种表达死亡受体和第二种表达FAP抗原。图17 使用四价双特异性ApomAb_PRlA3_scFab分子(其中scFab与ApomAb (A 形式)重链的C-端融合)在MKN-45细胞上的凋亡诱导测定(M小时)的结果。与 ApomAM+/-与10倍过量的抗人Fc抗体交联)和阴性对照比较凋亡诱导。以0. 1和l.Oyg/ ml的浓度使用所有构建体。在使用的测定条件下，双特异性Ap0mAb_PRlA3_SCFab构建体(黑色条)清楚显示了浓度依赖的凋亡诱导，其与高度交联的ApomAb(灰色条)所观察到的在相同的范围中，且其显著高于使用单独的ApomAb(阴影线条)诱导的凋亡。图18 相比双特异性三价构建体(ApomAb_Sm;3e_SCFab ；2x1价，黑色条)和阴性对照，通过ApomAb (单独的，阴影线条或高度交联的，灰色条)的LS174T细胞的凋亡诱导分析。使用0. 1和1. O μ g/ml浓度的构建体进行4小时测定。双特异性ApomAb_sm;3e_scFab 构建体能够以浓度依赖的方式诱导凋亡，所述凋亡与高度交联的ApomAb诱导的凋亡在相同范围中。图19 相比载体对照，ApomAb和双特异性DR5激动型抗体ApomAb_sm;3e_Al在使用人结肠癌细胞系LS174T的脾内转移模型中的体内效力分析。用PBS(黑色线)、ApomAb (黑色圆圈)或ApomAb-Sm;3e_Al双特异性抗体(黑色方块)处理每组10只小鼠的随机组。将存活百分比对实验的时间进程作图。
实施例实施例1 识别人死亡受体5和人CEA的双特异性抗体的设计以下描述了四价双特异性抗体，其包含与第一抗原(人死亡受体，DR5)结合的全长抗体和与第二抗原(人癌胚抗原，CEA)结合的2条单链Fv片段的组合，所述单链Fv片段通过肽接头与所述全长抗体的重或轻链的C-端融合。在所述单链Fv中的抗体结构域和接头具有以下方向VH-接头-VL。使用Adams在US2007/0031414A1中描述的ApomAb抗体的序列作为DR5识别抗体
的轻和重链可变区。用于结合CEA 抗原的 scFv，使用 PR1A3 (Bodmer 等人，I"9 ；US5965710)和 sm;3e (Begent等人，2003 ；US7232888B2)的轻和重链可变区的序列。通过基因合成和重组DNA技术，通过甘氨酸-丝氨酸(G4Q 4接头连接对应的CEA 抗体的VH和VL以产生单链Fv，所述单链Fv通过(G4S)n连接头(其中η = 2或4)与ApomAb IgGl的重或轻链的C-端融合。除了 “野生型” scFv以外，制备了在重链可变区的Kabat位置44和轻链可变区的 Kabat位置100上包含半胱氨酸残基的变体，以在VH和VL之间产生链间二硫键。这具有稳定scFv分子以最小化潜在的聚集倾向的目的。为了避免双特异性分子的非特异性交联，例如通过Fc受体作为人Fc γ RIIIa，改变了双特异性分子的IgG部分的Fc区中的2个氨基酸。通过定点诱变，用丙氨酸残基替换了 Fc区中的第234和235位的2个亮氨酸残基。描述了此所谓的LALA突变以消除Fc-FcR 相互作用(Hessell 等人，Nature 449(2007)，IOlff)。所有这些分子被重组表达，制备和使用标准抗体纯化技术(包括蛋白质A亲和层析后的大小排阻层析)纯化。在表达产量、稳定性和生物活性方面表征了分子。表1中提供了由ApomAb-CEA组合组成的不同的双特异性死亡受体激动型抗体分子的总结。可从分子名称中推断不同分子的设计描述，其中第一部分表征靶向死亡受体的 IgG (例如ApomAb)，第二名称描述了靶向CEA的scFv的来源(例如raiA3或sm3e)，字母和数字组合描述了融合位置和scFv的二硫化物稳定性能。表1 靶向人DR5和人CEA的不同的双特异性死亡受体激动型抗体及其相关特征的描述。
权利要求
1.双特异性抗体，其包含特异性针对死亡受体抗原的第一抗原结合位点和特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点。
2.权利要求1的双特异性抗体，其中所述死亡受体选自DR4，DR5或FAS，优选人DR4， 人DR5或人FAS。
3.权利要求1或2的双特异性抗体，其中所述第二抗原与肿瘤疾病或类风湿性关节炎相关。
4.权利要求1-3的双特异性抗体，其中所述第二抗原选自CEA，CRIPTO,R0B04, MCSP, 腱生蛋白C和FAP，优选人CEA，人CRIPT0，人R0B04，人MCSP，人腱生蛋白C和人FAP。
5.权利要求1-4的双特异性抗体，其中所述第一抗原选自DR5和FAS，所述第二抗原选自 CEA，CRIPTO, FAP 禾口 MCSP。
6.权利要求5的双特异性抗体，其选自双特异性抗体DR5-CEA，DR5-FAP，FAS-CRIPT0 和 FAS-MCSP。
7.权利要求1-6的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体是二聚体分子，所述二聚体分子包含含有第一抗原结合位点的第一抗体和含有第二抗原结合位点的第二抗体。
8.权利要求7的双特异性抗体，其中所述第一和第二抗体包含抗体重链的Fc部分，其中所述第一抗体的Fc部分包含第一种二聚化模块，所述第二抗体的Fc部分包含第二种二聚化模块，所述二聚化模块允许所述两种抗体的异源二聚化。
9.权利要求8的双特异性抗体，其中根据杵臼结构(knobsinto holes)策略，所述第一种二聚化模块包含杵(knob)，所述第二种二聚化模块包含白(hole)。
10.权利要求7的双特异性抗体，其中所述第一抗体是包含轻链和重链的免疫球蛋白 (Ig)分子，所述第二抗体选自scFv, scFab, Fab或Fv0
11.权利要求10的双特异性抗体，其中所述Ig分子包含特异性针对死亡受体的第一抗原结合位点，所述第二抗体包含特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点。
12.权利要求10的双特异性抗体，其中所述Ig分子包含特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点，所述第二抗体包含特异性针对死亡受体的抗原结合位点。
13.权利要求10-12的双特异性抗体，其中所述第二抗体与Ig分子重链的N-或C-端融合。
14.权利要求10-12的双特异性抗体，其中所述第二抗体与Ig分子轻链的N-或C-端融合。
15.权利要求10-14的双特异性抗体，其中所述Ig分子是IgG。
16.权利要求10-15的双特异性抗体，其中所述第二分子通过肽接头，优选具有约 10-30个氨基酸长度的肽接头与Ig分子融合。
17.权利要求10-16的双特异性抗体，其中所述第二分子包含另外的半胱氨酸残基以形成二硫键。
18.权利要求10-17的双特异性抗体，其中所述Ig分子包含Fc变体，所述Fc变体相比野生型Fc区具有对Fc γ受体的降低的亲和力。
19.药物组合物，其包含权利要求1-18的双特异性抗体。
20.权利要求1-18的双特异性抗体，用于治疗癌症或类风湿性关节炎。
21.核酸序列，其包含编码权利要求1-18的双特异性抗体的重链的序列。
22.核酸序列，其包含编码权利要求1-18的双特异性抗体的轻链的序列。
23.表达载体，其包含权利要求21和/或权利要求22的核酸序列。
24.原核或真核宿主细胞，其包含根据权利要求23的载体。
25.如本文描述的发明，特别是参考前述实施例。
全文摘要
本发明涉及包含特异性针对死亡受体的第一抗原结合位点和特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点的双特异性抗体，其生产方法，包含所述抗体的药物组合物，及其用途。
文档编号C07K16/30GK102574921SQ201080043541
公开日2012年7月11日 申请日期2010年9月27日 优先权日2009年9月29日
发明者C·兰伯特, C·弗拉拉科勒, E·默斯纳, I·瓦尔德豪尔, P·乌马纳, P·布鲁恩克尔, S·格劳, S·赫尔特 申请人:罗切格利卡特公司