（例如，微粒、纳米颗粒等）等）上的捕获蛋 白（例如，不是二聚物）的捕获配体（例如，HALOTAG配体）的结合来捕获当前经生物活性 剂连接至捕获配体的细胞标靶（参见图1，下面的方案）。
[0040] 在一些实施方案中，提供了用于捕获或"下拉"内源标靶（例如，已知和未知的 小分子标靶）的方法。在一些实施方案中，结合至小分子/捕获配体缀合物（例如，然后 (SM-HTL)的内源蛋白被捕获蛋白（例如，展示于表面（例如，孔、管、载片、板、基质、树脂、微 流通道、毛细管、珠、颗粒（例如，微粒、纳米颗粒等）等）上）共价结合（例如，下拉））。这 样的下拉方法可接鉴定所捕获的蛋白的分析（例如，在从表面洗脱内源标靶后）。分析技术 包括Western印迹、凝胶电泳、质谱、核磁共振谱等。当用于这样的环境中时，本文提供的系 统、组合物和方法提供了许多优点。在某些实施方案中，对细胞中氯代烷-药物缀合物（例 如，HTL-SM)的结合促进了特异性相互作用，导致更高的捕获低亲和力标靶的概率。在一些 实施方案中，本文提供的方法的速度和效率（例如，对于共价捕获内源标靶〈30分钟（例 如，〈25分钟、〈20分钟、〈15分钟、〈10分钟、〈5分钟、〈1分钟）使复合物崩解最小化（例如， 维持鉴定二级标靶（例如，与由SM-HTL结合的标靶非共价相互作用的蛋白）并且维持低亲 和力相互作用。在另一些实施方案中，快速捕获使非特异性捕获最小化。在某些实施方案 中，通过用非缀合的药物竞争而释放内源标靶降低了背景，这加强了对低丰度标靶的检测。
[0041] 在某些实施方案中，在纯化表面-(捕获配体）-(捕获融合体）-(捕获配体）-(生 物活性剂）-(细胞标靶）复合物后（例如，通过纯化表面（例如，机械分离、洗涤等），通过 任意合适的机制使细胞标靶从固体表面（例如，孔、管、载片、板、基质、树脂、微流通道、毛 细管、珠、颗粒（例如，微粒、纳米颗粒等）等）释放或洗脱（参见图2,下面的方案）。在一 些实施方案中，将过量未经束缚的生物活性剂添加至系统，以将细胞标靶从捕获配体束缚 的生物活性剂竞争掉。在另一些实施方案中，切割（例如，化学切割、酶切割）捕获融合体 的两个捕获蛋白之间的连接（例如，TEV蛋白酶切割位点），以释放（捕获蛋白）-(捕获配 体）_(生物活性剂）_(细胞标靶）复合物。在另一些实施方案中，切割（例如，化学切割、 酶切割）捕获配体与生物活性剂之间的连接，以释放（生物活性剂）-(细胞标靶）复合物。 在一些实施方案中，在切割后，连接体的全部或部分保持连接至一个或两个释放的组分。
[0042] 在另一些实施方案中，在纯化表面_(捕获蛋白）_(捕获配体）_(生物活性 剂）_(细胞标靶）复合物后（例如，通过纯化表面（例如，机械分离、洗涤等），通过任意 合适的机制使细胞标靶从固体表面（例如，孔、管、载片、板、基质、树脂、微流通道、毛细管、 珠、颗粒（例如，微粒、纳米颗粒等）等）释放或洗脱（参见图2,下面的方案）。在一些实施 方案中，将过量未经束缚的生物活性剂添加至系统，以将细胞标靶从捕获配体束缚的生物 活性剂竞争掉。在另一些实施方案中，切割（例如，化学切割、酶切割）报告分子与细胞标 靶之间的连接（例如，TEV蛋白酶切割位点）以释放报告分子。在另一些实施方案中，切割 (例如，化学切割、酶切割）捕获配体与生物活性剂之间的连接，以释放（生物活性剂）_(细 胞标靶）复合物。在另一些实施方案中，从表面释放捕获蛋白，从而释放完整的（捕获蛋 白）_(捕获配体）_(生物活性剂）_(细胞标靶）复合物。在细胞标靶融合至报告分子的任 意实施方案中，除非另有说明（例如，基于切割细胞标靶与报告分子之间的连接），否则报 告分子保持连接至包含细胞标靶的任何复合物。
[0043] 在细胞标靶连接/融合至报告分子分子（例如，荧光团、荧光素酶等）的一些实施 方案中，通过生成和/或检测来自报告分子的信号来检测从捕获复合物释放的细胞标靶。 在细胞标靶连接/融合至报告分子分子（例如，荧光团、荧光素酶等）的另一些实施方案 中，通过生成和/或检测来自报告分子的信号来检测仍然结合至捕获复合物的细胞标靶。 在一些实施方案（例如，其中细胞标革巴不连接/融合至报告分子分子）中，表征和/或鉴定 (例如，通过生物物理学分析和/或生物化学分析（例如质谱、光谱等）从捕获复合物释放 的细胞标靶。
[0044] 通过具有捕获蛋白（例如，受体蛋白、HALOTAG脱卤素酶等）的捕获配体（例如小 分子（例如HAL0TAG配体））促进了捕获生物活性剂的细胞标靶。在某些实施方案中，以捕 获系统的分开的步骤以及本文描述的方法进行两次捕获配体/捕获蛋白相互作用（参见图 1)。首先，将捕获配体束缚或以其他方式连接至感兴趣的生物活性剂。一旦生物活性剂结 合至其细胞标靶（例如，体内），即添加捕获融合体（例如，捕获实体的同二聚物），并由捕 获实体中的一个结合捕获配体。接着，添加展示多个相同捕获配体的固体载体，并且捕获融 合体的未结合的半部分结合至表面。现在细胞标靶通过两次捕获配体/捕获蛋白相互作用 束缚固体载体（参见图1)。在一个替代实施方案中，在添加至测定前（以及在结合束缚至 生物活性剂的捕获配体前）使捕获融合体结合至固体载体（例如，通过其与表面展示的捕 获配体的相互作用）。任一替代方案都导致相同的捕获构型。
[0045] 在另一些实施方案中，捕获蛋白存在为捕获单体而非捕获融合体。在一些实施方 案中，提供固体载体（例如，孔、管、载片、板、基质、树脂、微流通道、毛细管、珠、颗粒（例如， 微粒、纳米颗粒等）等），以在其表面上展示捕获单体（例如，HALOTAG脱卤素酶）。当捕获 配体（例如，HALOTAG配体）与捕获蛋白（例如，HALOTAG)相互作用时，束缚至生物活性剂 的捕获配体被固定在表面上。如果生物活性剂已经与细胞标靶（例如，由报告分子标记的） 相互作用（例如，稳定地、平衡地等），则细胞标靶连接（例如，经生物活性剂、捕获配体和捕 获蛋白）至固体载体。
[0046] 在某些实施方案中，本文中的组合物、方法和系统提供生物活性剂。在一些实施方 案中，提供生物活性剂和捕获配体的缀合物。在一些实施方案中，生物活性剂是能够与细胞 的生物学相互作用的任何小分子、大分子或分子复合物。在一些实施方案中，通过任意合适 的结构或机制（例如，化学连接（例如，直接或间接）、酶连接、由连接体（例如，肽、核酸、 聚合物、酯键、PEG连接体、碳链等）连接）来使生物活性剂和捕获配体（例如，HALOTAG配 体）融合、束缚、连接等。连接的类型不应视为限制。
[0047] 在一些实施方案中，捕获配体包含和/或经连接部分束缚至生物活性剂。在一些 实施方案中，连接体部分是捕获配体的部分。在一些实施方案中，通过偶联化学将连接体 部分添加至捕获配体，以附着至生物活性剂。在一些实施方案中，通过偶联化学将连接体 部分添加至生物活性剂，以附着至捕获配体。本发明不受限于任何具体的连接体部分。事 实上，设想了多种连接体部分，并且合适的连接体可包括但不限于：烷基、亚甲基碳链、醚、 聚醚、烷基酰胺连接体、肽连接体、经修饰的肽连接体、聚（乙二醇）（PEG)连接体、链霉亲 和素-生物素连接体或抗生物素蛋白-生物素连接体、聚氨基酸（例如聚赖氨酸）、官能 化的PEG、多糖、葡萄糖胺寡聚糖、树枝状聚合物（W093/06868以及由Tomaiia等在Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29 :138-175 (1990)中，通过引用整体并入本文）、PEG-螯合剂聚合物 (W94/08629、W094/09056和W096/26754,通过引用整体并入本文）、寡核苷酸连接体、磷脂 衍生物、烯基链、炔基链、二硫化物或其组合。在一些实施方案中，连接体包括以下基团中的 任意组合：烷基、烯基、炔基、苯基、环烷基、杂环烷基、苄基、卤素、氟、氯、溴、溴、碘、羟基、羰 基、醛、卤代甲酰基、碳酸酯、羧酸酯、羧基、酯、氢过氧基、过氧基、醚、半缩醛、半缩酮、缩醛、 缩酮、原酸酯、酰胺、胺、亚胺、酰亚胺、叠氮化物、偶氮、氰酸酯、硝酸酯、亚硝酸酯、腈、硝基、 亚硝基、吡啶、疏基、硫醚、二硫化物、亚砜、砜、亚磺酸（sulifinic acid)、磺酸、硫氰酸醋、 硫酮、硫醛、膦、膦酸、磷酸酯，和/或磷酸二酯。使用任何合适官能团的任何合适连接体都 落在本发明实施方案的范围以内。在一些具体实施方案中，连接体是氨基甲酸酯连接体。在 一些实施方案中，使生物活性剂经连接体连接至捕获配体，并且感兴趣的实体的连接是可 逆的（例如，可切割（例如，光可切割、化学可切割、酶可切割））。在一些实施方案中，连接 体是细胞可渗透的。在一些实施方案中，上述连接体可用于连接或束缚本文描述的另一些 组分（例如，捕获蛋白）。
[0048] 在一些实施方案中，捕获配体（和连接体）包含或由-O(CO)NH(CH2CH 2O) y-(CH2)x-卤素组成，其中y为1至8, X为2至20,并且卤素是Cl、Br或F(例如，-O(CO) NH (CH2CH2O) 2 (CH2) x Cl，0 (CO) NH (CH2CH2O) 2 (CH2) 6-卤素，0 (CO) NH (C
[0049] 在某些实施方案中，提供生物活性剂库（例如，>10种试剂、>50种试剂、>100种试 剂、>500种试剂、>1000种试剂、>5000种试剂、>10, 000种试剂、>50, 000种试剂等）。在一 些实施方案中，提供了系统、方法和组合物用于筛选用于表型效应和/或活性的生物活性 剂的库。在一些实施方案中，本发明提供了捕获文库中任何负责产生、诱发、诱导等表型效 应和/或活性的生物活性剂的细胞标靶的方法。在一些实施方案中，本发明提供对生物活 性剂（例如，负责表型效应和/或活性的生物活性剂）的细胞标靶进行捕获、鉴定、表征等 的方法。
[0050] 在一些实施方案中，细胞标靶包括生物活性剂（例如，小分子、蛋白、核酸、脂质 等）的任何合适的结合/相互作用配偶体（例如，受体、酶）。在一些具体实施方案中，细胞 标靶是结合至生物活性剂或以其他方式与生物活性剂相互作用（例如，稳定地、特异地、非 共价地、平衡地等）的蛋白。在一些更具体的实施方案中，细胞标靶是结合至小分子生物活 性剂或以其他方式与小分子生物活性剂相互作用（例如，稳定地、特异地、非共价地、平衡 地等）的受体蛋白或酶。本发明不受细胞标靶的同一性、类型或分类的限制。在某些实施 方案中，由数百种、数千种、数万种或更多不同种的细胞标靶组成的文库可用于本发明。
[0051] 在一些实施方案中，细胞标靶表达于其中将进行测试的细胞中。在一些实施方案 中，以细胞标靶内源水平（例如，天然丰度）或在该水平附近表达细胞标靶（例如，细胞标 靶不过表达）。在一些实施方案中，本文的方法使得能够捕获以其天然丰度或内源丰度或者 近似该丰度存在于细胞中的细胞标靶，从而使测定的生物相关性最大化。在某些实施方案 中，因为该方法使得能够以细胞标靶的内源水平来捕获，所以该方法可用于捕获未知的生 物活性剂的标靶（例如，人们认为不适于过表达的那些）。在一些实施方案中，所述细胞标 靶是细胞内源的。
[0052] 在一个具体的示例性实施方案中，捕获蛋白是经修饰以与其底物形成共价键 的脱卤素酶（参见例如，美国专利No. 7, 425, 436 ;美国专利No. 7, 429, 472 ;美国专利 No. 7, 867, 726 ;美国专利 No. 7, 888, 086 ;美国专利 No. 7, 935, 803 ;美国专利 No. RE42. 931 ; 美国专利No. 8, 168,405 ;美国专利No