白胨0. 5g，酵母提取物2g，氯化钠0. 05g，氯化钾（250mmol/L) lmL，氯化镁 (2mol/L)0. 5mL (单独灭菌），葡萄糖溶液（lmol/L)2mL(无菌滤器除菌），注意：1.氯化钾 (250mmol/L)和氯化镁（2mol/L)在用SOC培养基时加入；2.待培养基温度降至60°C以下 时再加入葡萄糖。
[0061] 1.13初始发酵培养基
[0062] 葡萄糖 20g，蛋白胨 4g，KH2P045g，K2HP045g，MgS04*7H20 0· 25g，NaCI 2g， CaCI20. 08g，去离子水 1000mL，pH7. 0,121°C蒸汽灭菌 20min。
[0063] 实施例二
[0064] 本发明提供一种产生物表面活性剂的混合菌的筛选方法，包括以下步骤：
[0065] 2. 1菌株的活化
[0066] 将冷藏的11株微生物采油菌株转接于斜面培养基上，37°C培养2d。
[0067] 2. 2种子培养
[0068] 取斜面活化后的种子一环，转接于种子液体培养基的三角瓶中，37°C摇床培养 16h，转速为 160r/min。
[0069] 2. 3发酵培养
[0070] 以4%的接种量将种子液种于初始发酵培养基中（200mL/500mL)，37°C摇床培养 72h，转速为 160r/min。
[0071] 2. 4产生物表面活性剂采油菌株的筛选
[0072] 2. 4. 1血平板法初筛
[0073] 利用生物表面活性剂的溶血特性，采用血平板法初步筛选产生物表面活性剂的菌 株。用无菌牙签将待筛选菌株点种在冷却的血平板培养基上，每个菌种重复三次作为平行 实验，37°C培养24h~48h。根据血平板上溶血圈直径来初步判断菌株产生物表面活性剂的 能力。
[0074] 2. 4. 2排油圈法复筛
[0075] 取直径为15cm的培养皿，加入IOOmL的水后加入ImL的液体石蜡，待液体石蜡扩 散成一个圆形油膜时，在其中心加入10 μ L经离心、萃取后的去杂发酵液，测定排油圈的直 径，跟踪检测5天，重复测量三次去平均值。
[0076] 实施例三
[0077] 本发明提供一种产生物表面活性剂的混合菌的系统分类鉴定方法，包括：
[0078] 3. 1形态学鉴定
[0079] 3. I. 1单菌落形态观察
[0080] 将筛选出的菌株平板划线，37°C培养24~48h，进行菌落形态观察。
[0081] 3. L 2菌体形态观察
[0082] 对菌种进行革兰氏染色、芽孢染色和荚膜染色，在光学显微镜下进行形态观察。
[0083] 3. 2生理生化性质鉴定
[0084] 对菌株进行淀粉水解实验、明胶液化实验、石蕊牛奶实验、糖发酵实验、甲基红实 验、乙酰甲基甲醇实验、柠檬酸盐实验、硫化氢实验、接触酶实验、卵磷脂酶实验和硝酸盐实 验。
[0085] 3. 3 rDNA 序列分析
[0086] 3. 3. 1基因组DNA的提取：
[0087] 选择培养至数生长期的菌悬液1500 μ L，12000r/min，lmin，收集菌体；
[0088] 菌体重悬于300 μ LTE缓冲液中；
[0089] 加入溶菌酶6 μ L，37°C保温30min ;
[0090] 加入 68 °C 预热的 10% SDS 16. 5 μ L ;
[0091] 加蛋白酶1((2〇11^/1^)18 4 1^，55。〇保温211;
[0092] 加入等体积的苯酷/氯仿/异戊醇（25 :24 :1)，混勾，12000r/min，离心5min，取上 清至新的离心管中，重复2~3次；
[0093] 上清溶液中加入1/10体积醋酸钠（3mol/L)和等体积的异戊醇，-20°C保持1. 5~ 2h 后 12000r/min，5min ;
[0094] 上清溶液中加入等体积预冷的70°C乙醇，12000r/min，离心15min，弃上清，离心 管置于通风橱内干燥；
[0095] 沉淀用50 μ L ddH20溶解，-20°C保存备用。
[0096] 3. 3. 2PCR扩增、反应物纯化、连接及转化
[0097] 通用引物：正向引物：5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '
[0098] 反向引物：5 ' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 '
[0099] 对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，选用MX胶回收试剂盒对PCR产物进 行纯化，将纯化产物同PMD18-T载体进行连接，而后转化进X菌株感受态细胞中进行蓝白筛 选实验，挑取若干白斑活化，通过菌落PCR实验验证转化结果。
[0100] 3. 3. 3 16S rDNA 序列分析
[0101] 将挑取的阳性克隆子送至测序公司测序，将测序结果提交至GenBank进行Blast 分析并绘制系统进化树。
[0102] 实施例四
[0103] 本发明还提供实施例二所筛选出的产生物表面活性剂的混合菌，所产生的表面活 性剂的定性分析方法及结果。
[0104] 4.1分析方法
[0105] a、将薄层层析硅胶与0. 4%的CMC-Na溶液以1 :3的比例倒入研钵内研磨混匀，均 匀铺在玻璃板上，自然阴干，l〇5°C活化30min后备用。
[0106] b、发酵液10000r/min，离心20min，上清液用等体积的氯仿/甲醇（2/l，v/v)混合 液萃取12h，萃取两次，取下层作为点样样品。
[0107] c、用毛细管吸取离心萃取后的样品进行点样。
[0108] d、选取氯仿/甲醇/水（65/25/4, v/v/v)的混合液作为扩展剂。将适量的扩展剂 倒入层析槽中，将点好样的层析板置于析槽中（注意扩展剂不可以高于标准线），盖好层析 槽盖，层析结束后取出层析板，自然晾干后喷上显色剂。三种显色剂分别为：1.苯酚-硫酸 试剂，检测糖脂类表面活性剂，显棕色。2.钼酸铵-高氯酸显色剂，检测磷脂类表面活性剂 类型，显蓝绿色。3. 0. 5%茚三酮丙酮显色剂；检测脂肽类表面活性剂，显红色。
[0109] 实施例五
[0110] 本发明还提供实施例二所筛选出的产生物表面活性剂的混合菌，所产生的表面活 性剂的定量分析方法及结果。
[0111] 5.1分析方法
[0112] a、生物表面活性剂的提取
[0113] 发酵液lOOOOr/min离心20min，取上清液；用浓盐酸调上清液pH = 2. 0,4°C静置 过夜；lOOOOr/min离心20min，收集沉淀，用少量pH为2的盐酸溶液洗涤沉淀后，用lmol/L 的NaOH溶液将沉淀的pH调至7. 0,冷冻干燥得表面活性剂粗品；将粗品溶于氯仿/甲醇 (2/1，v/v)溶液，旋转蒸发去除有机溶剂，冷冻干燥得到实验室用表面活性剂样品。
[0114] b、标准表面活性剂溶剂的配制
[0115] 称取75mg已提纯的实验室用表面活性剂溶解于无菌蒸馏水中，倒入容量瓶中用 无菌蒸馏水定容至50mL，得到浓度为1500mg/L的标准表面活性剂溶液，将其稀释一定倍数 得到浓度分别为300mg/L、600mg/L、900mg/L和1200mg/L的标准表面活性剂溶液，冰柜4°C 保存。
[0116] c、排油圈直径与生物表面活性剂浓度的关系曲线的绘制
[0117] 据相关文献报道，排油圈的直径与表面活性剂的量呈线性关系，以标准生物表面 活性剂浓度为横坐标，排油圈直径为纵坐标，绘制排油圈直径与生物表面活性剂浓度的关 系曲线。
[0118] d、精密度实验
[0119] 连续测量1200mg/L的标准表面活性剂溶液排油圈6次，计算RSD值。
[0120] e、重复性实验
[0121] 取同批发酵液6份，平行测量其排油圈大小，计算RSD值。
[0122] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技 术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和 变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种产生物表面活性剂的混合菌，其特征在于：混合菌包括里氏木霉、施氏假单胞 菌和鼠李糖乳杆菌，其中里氏木霉购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 编号为CGMCC No. 3. 3711，施氏假单胞菌购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心，编号为CGMCC No. 1. 10279,鼠李糖乳杆菌购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，编号为CGMCC No. 1. 2568。
2. 根据权利要求1所述的产生物表面活性剂的混合菌，其特征在于：里氏木霉的活菌 数为总活菌数的10-20%，施氏假单胞菌的活菌数为总活菌数的20-30%，鼠李糖乳杆菌的 活菌数为总活菌数的50-70%。
3. 一种产生物表面活性剂的混合菌的筛选方法，其特征在于：依次包括以下步骤： 51、 采油菌挑选； 52、 菌株活化及培养； 53、 血平板法初筛：采用血平板法初步筛选产生物表面活性剂的菌株，得到初筛发酵 液； 54、 排油圈法复筛：采用排油圈法复筛步骤S2中的初筛发酵液，得到产生物表面活性 剂的混合菌。
4. 根据权利要求1-2任一项所述的产生物表面活性剂的混合菌，在制备生物表面活性 剂上的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种油田微生物采油技术，尤其涉及一种产生物表面活性剂的混合菌及其筛选方法；混合菌包括里氏木霉、施氏假单胞菌和鼠李糖乳杆菌，其中里氏木霉购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.3.3711，施氏假单胞菌购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.1.10279，鼠李糖乳杆菌购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.1.2568；通过采油菌挑选、菌株活化及培养、血平板法初筛、排油圈法复筛获得。
【IPC分类】C12R1-225, C12P39-00, C12N1-14, C12R1-38, C12N1-20, C12R1-885
【公开号】CN104877928
【申请号】CN201510170685
【发明人】段军, 段浩
【申请人】苏州泽方新能源技术有限公司
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年4月13日