一株拮抗黄栌枯萎病菌的菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株细菌菌株，特别涉及一株拮抗植物病原真菌的细菌菌株及其应 用，属于微生物领域，可用于植物保护，防治植物病害。
【背景技术】
[0002] 黄栌又称黄道栌、黄栌材，为灌木或小乔木，株高3~5m，是漆树科黄栌属植物。黄 栌是优良的秋季红叶树种，也是我国长江流域、华北、华中地区常见的荒山绿化树种，具有 生长强健及耐贫瘠等特性。入秋霜后，黄栌树叶红艳，是一种具有很高经济价值和观赏价值 的树种。北京市的香山、八达岭、八大处等地均有种植，其中最为著名的是"香山红叶"景观， 吸引了众多中外游客前来参观游览，已经成为北京市重要的绿色景观和特殊的人文景观， 为北京市的生态环境建设和旅游业发展起到了重要作用。
[0003] 黄栌枯萎病是黄栌上的一种毁灭性的病害，为害轻者影响红叶景观，重者很快死 亡造成毁灭性破坏。黄护枯萎病的病原是大丽轮枝菌（Verticillium dahliae)。大丽轮枝 菌作为土传的植物病原真菌，在世界范围内分布，其寄主范围十分广泛，能够侵染包括木本 植物在内的近200种植物，引起轮枝菌枯萎病，可造成木质部变色、萎蔫、落叶等，最终导致 植物枯死。大I?轮枝菌在生活史和侵染后期产生大量微菌核（Microsclerotia),微菌核在 轮枝菌病害发生与流行中发挥着极其重要的作用。另外镰刀菌（Fusarium spp.)的存在能 促进大丽轮枝菌对黄栌的侵染，从而扩大了黄栌枯萎病的发生和危害。
[0004] 黄栌枯萎病自上世纪80年代在北京、山东等地被发现，该病害最初报道是呈零星 分布，在片林中发生率约为1~3%，感病严重的植株能够全株死亡，幼苗对该病害更加敏 感，发病严重的苗圃中发病率为5~10%，死亡率可达为3~5%。自有报道以来，该病害的 发生率不断提高，1990年的调查显示，北京香山公园内黄栌枯萎病的发病株率为46. 2%， 在1981年到1991年的10年期间，砍伐死亡的黄栌树共计13600余株。到2003年，香山上 的黄栌已经由于枯萎病的发生而出现大面积的枯死现象，虽然在2005年进行了大面积的 砍伐清理，并补栽3000株黄栌幼苗，但是并不能有效的控制该病害的发生和扩展。黄栌枯 萎病已经成为严重影响黄栌林的健康和观赏的重大灾害，严重威胁着北京等地区生态环境 建设。因此，预防与控制黄栌枯萎病的爆发成灾已经成为保障北京等地生态安全的重要任 务之一。
[0005] 目前，对黄栌枯萎病菌的防治的方法主要有化学防治、农业措施、物理方法等。由 于病菌产生微菌核，在世界范围内至今仍然没有其解决防治技术问题。生物防治具有安全 有效、无环境化学药剂污染等优点，已被广泛应用于植物病害的防治中。因此，筛选有效的 拮抗菌，采用生物防治方法控制黄栌枯萎病病将具有良好前景和生态意义。我们从盐碱地 土壤中分离筛选获得了对黄栌枯萎病菌及尖孢镰刀菌有拮抗效果，且能抑制黄栌枯萎病菌 产生微菌核的枯草芽孢杆菌。这是首次报道能抑制黄栌枯萎病菌的生长及微菌核的形成的 枯草芽孢杆菌，对于黄栌枯萎病的生物防治具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对植物病害防治中存在的植物病原菌产生抗药性的技术问题 提供一株拮抗黄栌枯萎病的细菌菌种及其在防治黄栌枯萎病中的应用，本发明的细菌菌株 是从盐碱地土壤中分离筛选获得的对黄栌枯萎病具有高效拮抗作用的生防细菌菌株，能高 效抑制黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌的生长，并能明显抑制黄栌枯萎病菌产生微菌核，应用 本发明的拮抗菌Bacillus subtilis C-2-3-2的菌株解决了目前黄栌枯萎病化学农药、农 业措施、物理方法防治难，黄栌枯萎病的病菌产生微菌核，导致黄栌枯萎病防治困难，而且 防治过程中容易造成环境严重污染而生物防治现有技术空白的问题。
[0007] 为实现本发明的目的，本发明一方面提供一株拮抗黄栌枯萎病的细菌菌株枯草芽 孢杆菌（Bacillus subtilis C-2-3-2)，其微生物保藏号为 CGMCC NO. 9369。
[0008] 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
[0009] 本发明的拮抗黄栌枯萎病的细菌菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2,其微生物保藏号是：CGMCC NO. 9369;分类命名是：Bacillus subtilis;保藏时 间：2014年6月23日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路，中国科学院微生物研究所；保藏 单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC)。
[0010] 本发明的拮抗菌菌株Bacillus subtilis C-2-3-2能高效防治黄栌枯萎病菌和尖 孢镰刀菌的生长，而且还能抑制黄栌枯萎病菌产生微菌核。
[0011] 本发明所述拮抗黄栌枯萎病的细菌菌株的形态特征：
[0012] 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2为革兰氏阳性杆菌，菌体大小约 0· 4-0. 8 μ mX L 4-2. 3 μ m，有芽孢，周生鞭毛，能运动。
[0013] 菌体在LB培养基平板上呈灰白色，不透明，菌落光滑，圆形，中央隆起，边缘完整。
[0014] 本发明拮抗黄栌枯萎病的细菌菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2的 分离筛选方法：
[0015] 1、取盐碱地土壤5g，置于灭菌三角瓶中，加入45mL无菌水，置于摇床上，在28°C、 200rpm条件下振荡30min，静置，得到菌悬液；
[0016] 2、取ImL菌悬液采用10倍梯度稀释法依次稀释得到10'10'KT8浓度梯度的稀 释液，从各个浓度梯度稀释液中分别取〇. lmL，用无菌涂布棒涂于LB培养基平板上，以无菌 水为对照，涂抹均匀后放到恒温箱中28°C恒温倒置培养；
[0017] 3、连续观察8天后，挑取菌落形态不同的菌株，在LB培养基平板上进行划线纯化 培养，获得多株盐碱地土壤细菌菌株，于4°C下保存备用。
[0018] 4、将黄栌枯萎病菌（购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号： CFCC82516)、尖孢镰刀菌（购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CFCC82468) 分别接种于不同的马铃薯琼脂培养基PDA平板上，在28°C条件下，恒温培养7d后用6mm打 孔器打取菌饼，获得直径6_的新鲜的黄栌枯萎病菌菌饼、尖孢镰刀菌菌饼；
[0019] 5、将新鲜的、直径为6mm的菌饼分别接种于不同的马铃薯琼脂培养基PDA平板中 央，接着用接种环分别挑取步骤3)中分离纯化后的土壤细菌，分别在距离黄栌枯萎病菌菌 饼和尖孢镰刀菌菌饼2. 5cm处四点对称点种（接种），放置于培养箱中，28°C恒温倒置对峙 培养进行初筛；
[0020] 6、在黄栌枯萎病菌菌饼的PDA培养皿中接种土壤细菌15d后，观察并记录抑菌圈 的有无，选出多株对黄栌枯萎病菌具有抑制效果的盐碱地土壤细菌菌株；
[0021] 在尖孢镰刀菌菌饼的PDA培养皿中接种土壤细菌7d后，观察并记录抑菌圈的有 无，选出多株对尖孢镰刀菌具有抑制效果的盐碱地土壤细菌菌株；
[0022] 筛选出对黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌同时具有抑制效果的盐碱地土壤细菌菌 株；
[0023] 7、将对黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌均具有拮抗作用的土壤细菌菌株分别接种于 不同的三角瓶中，每个三角瓶中装有IOOmL LB液体培养基，接着将三角瓶置于摇床上，于 28°C，200rpm的条件下振荡培养Id得到多个土壤细菌菌液；然后将各个土壤细菌菌液按 1% (V/V)的接种量分别接种到不同的三角瓶中，每个三角瓶装有IOOmL液体发酵培养基， 然后将三角瓶置于摇床上，于28°C，200rpm的条件下振荡培养4d，将培养后的菌液在4°C， 1000 Orpm的条件下离心20min，收集上清液，上清液通过0. 22 μ m细菌滤膜过滤除菌，得 到对黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌均具有拮抗作用的拮抗菌无菌滤液（即发酵培养液的无 菌过滤液）；然后分别将各个拮抗菌的无菌滤液以l:l〇(V/V)的比例与加热熔融后冷却至 40~50°C的PDA培养基混合，倒平板（导入培养皿，冷却后制得固体平板培养基），再于不 同的培养基平板中央分别接入直径6mm的新鲜黄栌枯萎病菌、尖孢镰刀菌菌饼，在不同的 PDA培养基平板（不添加拮抗菌无菌滤液）的中央分别接入直径6mm的新鲜黄栌枯萎病菌 菌饼、尖孢镰刀菌菌饼作为对照，28 °C倒置培养。
[0024] 8、待对照组的菌落直径达到培养皿直径的3/4以上时，测量土壤细菌拮抗菌落直 径，选取平板上黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌菌落直径最小，即对黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀 菌同时具有最强抑制效果的拮抗菌无菌滤液，此无菌滤液对应的拮抗菌菌株即为对黄护枯 萎病菌和尖孢镰刀菌同时具有最强抑制效果的盐碱地土壤细菌菌株。
[0025] 本发明菌株Bacillus subtilis C-2-3-2的筛选及防治黄护枯萎病特性测定采用 的培养基如下：
[0026] LB培养基成分：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaC110g，琼脂粉15g，水1000mL，pH 7. 0-7. 2。
[0027] LB液体培养基成分：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaC110g，水1000mL，pH 7. 0-7. 2。
[0028] NB液体培养基成分：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaC15g，水lOOOmL，pH 7. 0-7. 2。
[0029] 马铃薯琼脂（PDA)平板培养基成分：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉17g，水 1000 mL, pH 7. 0-7. 2〇
[0030] 液体发酵培养基成分：葡萄糖10. 〇g，蛋白胨5. 0g，大豆粉5. 0g，KH2PO4LOg, MgSO4