一种低产双乙酰啤酒酵母的筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种低产双乙酰啤酒酵母的筛选方法。
【背景技术】
[0002] 连二酮类物质是啤酒中"生酒味"的主要来源，也是啤酒成熟的限制性指标之一， 主要包括双乙酰和戊二酮，其中以双乙酰尤为重要。双乙酰是挥发性的、有强烈刺激性的化 合物，它是多种香味物质的前驱物，也是黄油、奶酪等乳制品的主要香味物质。双乙酰在啤 酒中的阈值在0. 1-0. 2mg/L之间，当含量>0. 5mg/L时有类似馊米饭味的不愉快刺激味；当 含量>0. 2mg/L时有似烧焦的麦芽味。优秀淡爽型啤酒双乙酰应控制在0. 06mg/L以下。筛 选低产双乙酰啤酒酵母不仅可以在啤酒发酵的主酵部分有效降低双乙酰含量，也为啤酒后 酵部分双乙酰的快速还原奠定了良好基础。因此，采用简单有效、适用性强的筛选低产双乙 酰啤酒酵母方法，将会为啤酒产业生产优质啤酒带来事半功倍的效果。
[0003] 双乙酰是酵母合成缬氨酸等含氮物质的旁路产物，其前驱物α -乙酰乳酸在积累 过量时会通过非酶氧化分解反应直接生成双乙酰。灌装后的成品啤酒中残留的α-乙酰乳 酸，会在一定条件下反应生成双乙酰，造成双乙酰"反弹"的现象，影响成品啤酒风味。研宄 表明，向发酵液中添加过量缬氨酸会反馈抑制α-乙酰乳酸合成缬氨酸的代谢途径，从而 减少α-乙酰乳酸的生成，使啤酒中双乙酰含量降低。减少双乙酰含量报道有很多，但在啤 酒工业化生产过程中大量添加氨基酸或相关酶类成本过高，也会对啤酒的风味产生一定影 响；通过基因重组得到缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸营养缺陷型酵母菌株的方法虽能有效降低 双乙酰含量，但考虑到食品安全问题，目前鲜有工厂采用该法进行工业化生产。
[0004] D-Val是L-缬氨酸（L-Val)的旋光异构体，实验证实，一定浓度的D-Val对酵母生 长代谢具有一定抑制作用。筛选对D-Val敏感的酵母菌株，能有效降低啤酒发酵中α-乙 酰乳酸的积累，从而减少的双乙酰生成并解决双乙酰"反弹"的现象。本方法所建立的低产 双乙酰啤酒酵母筛选方法，其优点在于能有效降低啤酒的双乙酰含量，克服双乙酰"反弹" 问题，对优质啤酒的研发与生产具有很强的理论和实践意义。
【发明内容】
[0005] 本发明主要根据酵母α -乙酰乳酸生成双乙酰和缬氨酸的代谢途径，利用D-Val 对酵母生长代谢的抑制作用，采用含有适当浓度D-Val的13° P麦汁在适当条件下驯化酵 母，取酵母泥稀释至一定倍数涂布于麦汁琼脂培养基中，筛选D-Val敏感菌株进行发酵实 验，检测敏感菌株和出发菌株双乙酰含量，计算敏感菌株的双乙酰降低率，以此评价该法的 有效性。
[0006] 技术方案 本发明主要根据酵母α -乙酰乳酸生成双乙酰和缬氨酸的代谢途径，首先设置含不同 浓度梯度D-Val和L-Val的麦汁琼脂培养基，验证D-Val对酵母代谢生长具有抑制作用并 绘制生长抑制曲线。
[0007] 利用D-Val对酵母生长代谢的抑制作用，选取含适当浓度D-Val的13° P麦汁 在28°C下驯化酵母，发酵液中对D-Val较敏感菌株从发酵液中沉淀，相对非敏感菌株则悬 浮于发酵液中生长繁殖，倒掉上层发酵液并保留底层沉淀，据此从发酵液中驯化得到D-Val 敏感酵母泥。
[0008] 取酵母泥稀释至一定倍数涂布于13° P麦汁琼脂培养基中，以适当浓度D-Val和 L-Val的13° P麦汁琼脂培养基做对照，筛选D-Val敏感菌株进行发酵实验。
[0009] 参照《啤酒分析方法》GB/T4928-2008中双乙酰的测定方法检测敏感菌株和出发菌 株双乙酰含量，计算敏感菌株的双乙酰降低率，以此评价该法的有效性。
[0010] 本发明的具体操作方法： 1) 取适量酵母泥活化，以10%的接种量接入含有300mL13° P麦汁(含D-Val500mg/L) 的三角瓶中，28°C恒温静置培养8-12h，此时酵母开始起发； 2) 倒掉上层浑浊发酵液，仅保留底层酵母泥； 3) 倒入300mL无菌水（pH3. 5)摇匀后静置2-3h，酸洗浸泡非敏感酵母；倒掉上层浊液， 仅保留底层沉淀酵母泥； 4) 倒入 300mL13° P 麦汁(含 L-Val500ppm) 28°C恒温培养 24h ; 5) 将发酵液稀释至适当浓度涂布于13° P麦汁琼脂平板中，28°C恒温培养24h ; 6) 分离并保藏单菌落，用无菌牙签将其分别点接入含下列物质（A:含D-Val 500mg/L， B:无，C:L-Val 500mg/L)的13° P麦汁琼脂平板中，28°C恒温培养24h ; 7) 每隔6h观察各菌株在不同平板上的生长情况； 8) 敏感菌株在A上受到D-Val抑制菌落最小甚至不生长，在C上受L-Val促进作用菌 落最大。因此，选取依次在A、B、C平板上菌落由小到大变化较为明显的菌株作为D-Val敏 感菌株进行发酵实验； 9) 参照《啤酒分析方法》GB/T4928-2008中双乙酰的测定方法检测D-Val敏感菌株和 出发菌株双乙酰含量，计算敏感菌株的双乙酰降低率。
[0011]
【具体实施方式】
[0012] 下面通过实施例对本发明作进一步的说明，其目的是更好的理解本发明的内容。 实施例
[0013] I. D-Val对啤酒酵母的抑制作用实验： 1) 从酵母斜面上接适量酵母泥(接种量约为I. 5 X 107CFU/mL)于含IOmL 13° P麦汁 培养液的试管中，摇匀，28°C活化培养24h ; 2) 将13° P麦汁琼脂培养基分装于7个三角瓶中，每瓶100mL，115°C下灭菌20min。 然后，在无菌麦汁琼脂培养基还未凝固前分别向各三角瓶中添加终浓度依次为0、100、500、 1000、1500、3000、5000mg/L的D-Val溶液，摇匀后制成平板，每个平板均含培养基25mL，用 小量筒倾倒，凝固后备用； 3) 制备含相同浓度梯度L-Val的13° P麦汁琼脂平板作为阳性对照组，制备条件与原 理同上； 4)取ImL活化后的酵母液，用梯度稀释法稀释至一定浓度后，依次取100 μ L涂布于不 同浓度D-Val和L-Val平板中，每个浓度梯度设3个平行，然后于28°C下培养2-3d。
[0014] 实验结果如下： 酵母致死率随D-Val浓度增加而稳定升高，在D-Val浓度达到5000mg/L时致死率为 40. 61% ;而随着对照组L-Val浓度的增加，酵母致死率呈缓慢负增长趋势，在L-Val浓度达 到5000mg/L，致死率为-13. 22%。由此可见，D-Val对酵母生长有一定的抑制作用；相反， L-Val对酵母生长只有微弱的促进作用，无明显抑制作用。
[0015] 2. D-Val敏感菌株筛选及发酵实验： 1) 取适量酵母泥活化，以10%的接种量接入含有300mL 13° P麦汁(含D-Val500mg/L) 的三角瓶中，28°C静置培养8-12h ; 2) 倒掉上层浑浊发酵液，仅保留底层酵母泥； 3) 倒入300mL无菌水（pH3. 5)摇匀后静置2-3h，酸洗浸泡非敏感酵母；倒掉上层浊液， 仅保留底层沉淀酵母泥； 4) 倒入 300mL13° P 麦汁(含 L-Val 500mg/L) 28°C恒温培养 24h ; 5) 将发酵液稀释至适当浓度涂布于13° P麦汁琼脂平板中，28°C恒温培养24h ; 6) 分离并保藏单菌落，用无菌牙签将其分别点接入含下列物质（A:含D-Val 500mg/L， B:无，C:L-Val 500mg/L)的13° P麦汁琼脂平板中，28°C恒温培养24h ; 7) 每隔6h观察各菌株在不同平板上的生长情况，选取依次在A、B、C平板上菌落由小 到大变化较为明显的菌株作为D-Val敏感菌株进行发酵实验； 8) 主酵结束后，参照《啤酒分析方法》GB/T4928-2008中双乙酰的测定方法蒸馏双乙 酰，并利用紫外分光光度法，在335nm紫外光下检测D-Val敏感菌株和出发菌株双乙酰含 量，计算敏感菌株的双乙酰降低率。
[0016] 实验结果如下： 表1实验菌株(含出发菌株）双乙酰含量及其降低率_
【主权项】
1. 一种低产双乙酰啤酒酵母的筛选方法，包括以下步骤： 取适量酵母泥活化，以10%的接种量接入含有300mL13° P麦汁(含D-Val500mg/L)的 三角瓶中，28°C恒温静置培养8-12h ; 倒掉上层浑浊发酵液，仅保留底层酵母泥； 倒入300mL无菌水（pH3. 5)摇匀后静置2-3h，酸洗浸泡非敏感酵母，倒掉上层浊液，仅 保留底层沉淀酵母泥； 倒入 300mL13。P 麦汁(含 L-Val500ppm) 28°C恒温培养 24h ; 将发酵液稀释至适当浓度涂布于13° P麦汁琼脂平板中，28°C恒温培养24h ; 分离并保藏单菌落，用无菌牙签将其分别依次点接入含下列物质（A:含D-Val 500mg/ L，B:无，C:L-Val 500mg/L)的13° P麦汁琼脂平板中，28°C恒温培养24h ; 每隔6h观察各菌株在不同平板上的生长情况； 敏感菌株在A上受到D-Val抑制菌落最小甚至不生长，在C上受L-Val促进作用菌落 最大，选取依次在A、B、C平板上菌落由小到大变化较为明显的菌株作为D-Val敏感菌株进 行发酵实验。
【专利摘要】本发明属于一种低产双乙酰啤酒酵母的筛选方法。D-缬氨酸（D-Val）对酵母生长代谢具有一定抑制作用。本方法采用含有适当浓度D-Val的13°P麦汁在适当条件下驯化酵母，从酵母泥中筛选出对D-Val敏感的菌株并进行发酵实验，检测敏感菌株双乙酰含量，其降低率可达到34.08%。该方法操作简单，结果准确稳定，为啤酒产业研发与生产优质啤酒提供了技术支撑。
【IPC分类】C12C11-00, C12N1-18
【公开号】CN104877922
【申请号】CN201510258686
【发明人】李红, 加布里·埃法卡斯, 坤·西拉德, 金玮鋆, 宋绪磊, 贝尔特·唯客思日.赫琦, 苏珊娜克思
【申请人】中国食品发酵工业研究院
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年5月20日