利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法，属于生物化工领域，为解决现有技术中海藻糖提取时间长、提取率低、杂质溶出过多不易提纯的问题。本发明方法包括以下步骤：1）微波处理；2）热处理；3）蜗牛酶处理；4）超声波破碎处理；5）海藻糖的提取与纯化。本发明方法使酵母菌处于胁迫条件下，其应激产生大量的海藻糖，同时抑制海藻糖酶的活性，并通过蜗牛酶处理和超声破破碎处理使得酵母细胞破裂，从而使得海藻糖几乎全部溶出，处理时间短、海藻糖易提纯且得率高。另外，本发明方法未使用强酸、强碱及有毒的有机溶剂，做到了清洁环保，且本发明方法中所产生的废弃液和废渣可用来生产酵母膏，几乎无排放。
【专利说明】利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物化工【技术领域】，特别涉及一种利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法。
【背景技术】
[0002]海藻糖是由两个葡糖糖分子以1，1-糖苷键构成的非还原性双糖，广泛分布于细菌、真菌和动植物体内。在生物体内，它不仅作为结构成分和能量物质存在，而且在高寒、高温和干燥失水等胁迫条件下，对生物体组织和生物大分子具有特异性保护作用。由于其独特的生物学功能，它在食品、分子生物学、医药、化妆品、农业等方面具有广阔的应用前景。虽然海藻糖的资源广泛，但是能够大量积累海藻糖的物种并不很多，而且海藻糖是生物体对抗逆境的一种代谢应激物，一旦外部环境适宜，海藻糖又会迅速降解，给制备带来一定困难。目前海藻糖的生产方法主要有酶转化法、发酵法、微生物抽提法、基因工程法、化学合成法等。
[0003]海藻糖在酵母中的含量最大，因此传统的生产方法主要是从酵母中提取，活性干酵母中虽然海藻糖含量较高，且具有细胞活性，但由于其自身成本较高，限制了其应用。而啤酒废酵母成本较低，传统方法直接将废酵母泥，经除杂脱苦得干净酵母泥，干制酵母粉；或将干净酵母泥加自溶剂(甚至强酸强碱)自溶，自溶后离心得沉淀用来生产以葡聚糖为主的多糖，自溶后离心的上清一般直接放掉，内含海藻糖，既浪费资源又造成了环境污染，有些虽然提取了海藻糖但得率较低。从酵母细胞内提取海藻糖，大都采用乙醇回流提取工艺。但是该传统方法大多表现为提取时间太长、海藻糖收率很低、杂质溶出过多等诸多问题。
[0004]由于海藻糖酶同样存在于酵母内，且为代谢应激物，因此提高海藻糖提取率的关键是给酵母菌一定的胁迫条件，使其产生大量的海藻糖，同时抑制海藻糖酶的活性。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法，为解决现有技术中海藻糖的提取时间长、提取率低、杂质溶出过多不易提纯的问题。
[0006]本发明的技术方案为:。
[0007]—种利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法，包括以下步骤:
1)微波处理
将脱苦纯化的酵母泥置于微波炉中处理广5min ；
2)热处理
向经微波处理的酵母泥中加入纯水以悬浮酵母细胞，在1 (Tl 5 (TC下热处理30~90min ；
3)蜗牛酶处理
冷却步骤2)所得酵母悬浮液后，加入蜗牛酶，并在3(T45°C下搅拌2飞小时，以破坏酵母细胞的细胞膜；4)超声波破碎处理
对步骤3)所得酵母悬浮液进行超声波破碎处理至酵母细胞裂解，释放出海藻糖；
5)海藻糖的提取与纯化
离心步骤4)所得溶液，离心所得上清液采用超滤膜超滤，超滤透过液过酸碱柱，通过酸碱柱的液体为海藻糖收集液，在所述海藻糖收集液中抽提海藻糖并进行纯化，得纯化的海藻糖。
[0008]其中，步骤I)中微波处理的目的在于提供一种胁迫条件，以促进生产更多海藻糖；步骤2)中10(Tl50°C下热处理3(T90min，热处理的早期有利于海藻糖的产生(高温也是一种胁迫条件)，但是长时间高温可破坏酵母细胞结构，杀死酵母细胞，使海藻糖酶失活，该步骤中温度和时间的选择非常关键，一方面要在酵母细胞被破坏前产生更多的海藻糖，另一方面要及时抑制海藻糖酶的活性；步骤3)中加入蜗牛酶，可以破坏酵母细胞的细胞膜，便于海藻糖的释放，提高得率；步骤4)中超声波破碎处理有利于细胞破裂，溶出海藻糖；步骤5)中离心所得沉淀可用于制备酵母膏；步骤5)中超滤膜超滤除去大分子，过酸碱柱去除离子、小分子物质和离子型色素。
[0009]优选的，步骤I)中脱苦纯化的酵母泥的获得包括以下步骤:向啤酒废酵母泥中加纯水，经80-100目筛过滤得酵母悬浮液；向所得酵母悬浮液中加入酒石酸或碳酸氢钠，使酒石酸的质量分数为疒8%或碳酸氢钠的质量分数为0.1~0.5%，搅拌3(T90min脱苦，离心弃上清液；水洗脱苦后的酵母泥并过300目筛，再次水洗，离心得纯化脱苦的酵母泥。水洗脱苦后的酵母泥并过300目筛既避免了粘度过大不方便过滤，又能滤除残留的部分固型物。
[0010]优选的，所述微波炉的功率为300W~600W。使用功率相对较低的微波炉，可给予一定的应激刺激时间，以防止酵母菌快速失活降低海藻糖的产量。
[0011]作为优选，步骤2)中酵母泥与纯水的质量比为1:3。
[0012]优选的，按照每克脱苦纯化的酵母泥中加入0.5~2mg蜗牛酶的标准加入蜗牛酶。
[0013]作为优选，步骤3)中加入蜗牛酶后，在37 °C下搅拌3~4小时，搅拌速度为100~200rpmo
[0014]优选的，步骤4)中超声波破碎处理采用功率为20(T800W的超声波细胞裂解仪，间歇式超声波破碎处理。间歇式超声波破碎处理有利于细胞破裂，充分溶出海藻糖。
[0015]进一步的，所述间歇式超声波破碎处理具体为超声波细胞裂解仪工作1s后间歇5s,依此循环，超声波破碎处理的总时间为2(T40min。
[0016]作为优选方案，步骤5)中所述的超滤膜为3KDa分子量的超滤膜。3KDa分子量的超滤膜除去蛋白质、脂肪、核酸等大分子物质，超滤浓缩液(含蛋白质、脂肪、核酸等大分子物质)用以制备酵母膏。
[0017]作为优选，步骤5)中所述的抽提是在7(T85°C条件下采用质量分数为30-50%的乙醇溶液抽提8(T100min ;所述的纯化是旋转蒸发海藻糖抽提液至体积减少55~70%，然后喷雾干燥或采用无水乙醇醇沉干燥。
[0018]本发明的有益效果为:
本发明方法让酵母菌处于胁迫条件下，使其应激产生大量的海藻糖，同时抑制海藻糖酶的活性，并通过蜗牛酶处理和超声破破碎处理使得酵母细胞破裂，从而使得海藻糖几乎全部溶出，处理时间短、海藻糖易提纯且得率高。另外，本发明方法未使用强酸、强碱及有毒的有机溶剂，做到了清洁环保，且本发明方法中所产生的废弃液和废渣可用来生产酵母膏，几乎无排放。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0020]图1为本发明利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法的一种工艺流程图。
【具体实施方式】
[0021]实施例1
如图1所示，一种利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法，包括以下步骤:
1)微波处理
首先对啤酒废酵母泥进行脱苦纯化，啤酒废酵母泥的脱苦纯化包括以下步骤:向啤酒废酵母泥中加纯水(啤酒废酵母泥与纯水的重量比为1:3)，经80-100目筛过滤得酵母悬浮液；向所得酵母悬浮液中加入酒石酸，使酒石酸的质量分数为5%，搅拌60min脱苦，离心弃上清液；水洗脱苦后的酵母泥并过300目筛，再次水洗，离心得纯化脱苦的酵母泥；然后将脱苦纯化的酵母泥置于500W的微波炉中处理5min ；
2)热处理
向经微波处理的酵母泥中加入纯水(微波处理后的酵母泥与纯水的重量比为1:3)以悬浮酵母细胞，在100°C下热处理90min ；
3)蜗牛酶处理
冷却步骤2)所得酵母悬浮液后，加入蜗牛酶(按照每克脱苦纯化的酵母泥中加入Img蜗牛酶为标准加入)，并在37°C下搅拌3小时，搅拌速度为200rpm以破坏酵母细胞的细胞膜；
4)超声波破碎处理
采用功率为300W的超声波细胞裂解仪对步骤3)所得酵母悬浮液进行间歇式超声波破碎处理，具体的:超声波细胞裂解仪工作1s后间歇5s，依此循环，超声波破碎处理的总时间为50min，酵母细胞裂解，释放出海藻糖；
5)海藻糖的提取与纯化
以4500rpm的转速离心步骤4)所得溶液1min,离心所得上清液采用3KDa分子量的超滤膜超滤，超滤透过液过酸碱柱，通过酸碱柱的液体为海藻糖收集液，在82°C条件下采用质量分数为50%的乙醇溶液抽提海藻糖收集液10min得海藻糖抽提液；旋转蒸发(旋转蒸发时，温度为70°C，压力0.1Mpa，转速为200rpm)海藻糖抽提液至体积减少60%，然后喷雾干燥得乳白色纯化的海藻糖(该工艺条件下，100 g脱苦纯化的酵母泥得15.68g海藻糖)。
[0022]实施例2如图1所示，一种利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法，包括以下步骤:
1)微波处理
首先对啤酒废酵母泥进行脱苦纯化，啤酒废酵母泥的脱苦纯化包括以下步骤:向啤酒废酵母泥中加纯水(啤酒废酵母泥与纯水的重量比为1:3)，经80-100目筛过滤得酵母悬浮液；向所得酵母悬浮液中加入酒石酸，使酒石酸的质量分数为5%，搅拌60min脱苦，离心弃上清液；水洗脱苦后的酵母泥并过300目筛，再次水洗，离心得纯化脱苦的酵母泥；然后将脱苦纯化的酵母泥置于500W的微波炉中处理5min ；
2)热处理
向经微波处理的酵母泥中加入纯水(微波处理后的酵母泥与纯水的重量比为1:3)以悬浮酵母细胞，在100°C下热处理90min ；
3)蜗牛酶处理
冷却步骤2)所得酵母悬浮液后，加入蜗牛酶(按照每克脱苦纯化的酵母泥中加入Img蜗牛酶为标准加入)，并在37°C下搅拌3小时，搅拌速度为200rpm以破坏酵母细胞的细胞膜；
4)超声波破碎处理
采用功率为300W的超声波细胞裂解仪对步骤3)所得酵母悬浮液进行间歇式超声波破碎处理，具体的:超声波细胞裂解仪工作1s后间歇5s，依此循环，超声波破碎处理的总时间为50min，酵母细胞裂解，释放出海藻糖；
5)海藻糖的提取与纯化
以4500rpm的转速离心步骤4)所得溶液1min,离心所得上清液采用3KDa分子量的超滤膜超滤，超滤透过液过酸碱柱，通过酸碱柱的液体为海藻糖收集液，在82°C条件下采用质量分数为50%的乙醇溶液抽提海藻糖收集液10min得海藻糖抽提液；旋转蒸发(旋转蒸发时，温度为70°C，压力0.1Mpa，转速为200rpm)海藻糖抽提液至体积减少60%，然后用无水乙醇醇沉干燥得乳白色纯化的海藻糖(该工艺条件下，100 g脱苦纯化的酵母泥得14.32g海藻糖)，本实施例与实施例1相比，只是海藻糖的干燥条件不同，实施例1中采用喷雾干燥，本实施例采用醇沉干燥，实验证明，喷雾干燥为更优选的干燥条件，醇沉干燥海藻糖损失较多，影响收率)。
[0023]实施例3
如图1所示，一种利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法，包括以下步骤:
1)微波处理
首先对啤酒废酵母泥进行脱苦纯化，啤酒废酵母泥的脱苦纯化包括以下步骤:向啤酒废酵母泥中加纯水(啤酒废酵母泥与纯水的重量比为1:3)，经80-100目筛过滤得酵母悬浮液；向所得酵母悬浮液中加入酒石酸，使酒石酸的质量分数为8%，搅拌30min脱苦，离心弃上清液；水洗脱苦后的酵母泥并过300目筛，再次水洗，离心得纯化脱苦的酵母泥；然后将脱苦纯化的酵母泥置于600W的微波炉中处理Imin ；
2)热处理
向经微波处理的酵母泥中加入纯水(微波处理的酵母泥与纯水的重量比为1:3)以悬浮酵母细胞，在120°C下热处理60min ；
3)蜗牛酶处理
冷却步骤2)所得酵母悬浮液后，加入蜗牛酶(按照每克脱苦纯化的酵母泥中加入
0.5mg蜗牛酶为标准加入),并在45°C下搅拌2小时,搅拌速度为10rpm以破坏酵母细胞的细胞膜；
4)超声波破碎处理
采用功率为200W的超声波细胞裂解仪对步骤3)所得酵母悬浮液进行间歇式超声波破碎处理，具体的:超声波细胞裂解仪工作1s后间歇5s，依此循环，超声波破碎处理的总时间为40min，酵母细胞裂解，释放出海藻糖；
5)海藻糖的提取与纯化
以4500rpm的转速离心步骤4)所得溶液1min,离心所得上清液采用3KDa分子量的超滤膜超滤，超滤透过液过酸碱柱，通过酸碱柱的液体为海藻糖收集液，在70°C条件下采用质量分数为30%的乙醇溶液抽提海藻糖收集液80min得海藻糖抽提液；旋转蒸发(旋转蒸发时，温度为50°C，压力0.1Mpa，转速为200rpm)海藻糖抽提液至体积减少55%，然后喷雾干燥得乳白色纯化的海藻糖(该工艺条件下，100 g脱苦纯化的酵母泥得10.12g海藻糖)，由于温度70°C、浓度30%的乙醇不利于海藻糖的扩散和提取，所以虽然有胁迫刺激，得率仍然偏低)。
[0024] 实施例4
如图1所示，一种利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法，包括以下步骤:
1)微波处理
首先对啤酒废酵母泥进行脱苦纯化，然后将脱苦纯化的酵母泥置于500W的微波炉中处理3min ;啤酒废酵母泥的脱苦纯化包括以下步骤:向啤酒废酵母泥中加纯水(啤酒废酵母泥与纯水的重量比为1:3)，经80-100目筛过滤得酵母悬浮液；向所得酵母悬浮液中加入碳酸氢钠，使碳酸氢钠的质量分数为0.2%，搅拌60min脱苦，离心弃上清液；水洗脱苦后的酵母泥并过300目筛，再次水洗，离心得纯化脱苦的酵母泥；
2)热处理
向经微波处理的酵母泥中加入纯水(微波处理的酵母泥与纯水的重量比为1:3)以悬浮酵母细胞，在121°C下热处理80min ；
3)蜗牛酶处理
冷却步骤2)所得酵母悬浮液后，加入蜗牛酶(按照每克脱苦纯化的酵母泥中加入
1.2mg蜗牛酶为标准加入)，并在37°C下搅拌4小时，搅拌速度为150rpm以破坏酵母细胞的细胞膜；
4)超声波破碎处理
采用功率为400W的超声波细胞裂解仪对步骤3)所得酵母悬浮液进行间歇式超声波破碎处理，具体的:超声波细胞裂解仪工作1s后间歇5s，依此循环，超声波破碎处理的总时间为55min，酵母细胞裂解，释放出海藻糖；
5)海藻糖的提取与纯化
以4500rpm的转速离心步骤4)所得溶液1min,离心所得上清液采用3KDa分子量的超滤膜超滤，超滤透过液过酸碱柱，通过酸碱柱的液体为海藻糖收集液，在80°C条件下采用质量分数为55%的乙醇溶液抽提海藻糖收集液80min得海藻糖抽提液；旋转蒸发(旋转蒸发时，温度为60°C，压力0.1Mpa，转速为200rpm)海藻糖抽提液至体积减少60%，然后喷雾干燥(该工艺条件下，100 g脱苦纯化的酵母泥得14.77g海藻糖)。
[0025]实施例5
如图1所示，一种利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法，包括以下步骤:
1)微波处理
首先对啤酒废酵母泥进行脱苦纯化，然后将脱苦纯化的酵母泥置于500W的微波炉中处理4min ;啤酒废酵母泥的脱苦纯化包括以下步骤:向啤酒废酵母泥中加纯水(啤酒废酵母泥与纯水的重量比为1:3)，经80-100目筛过滤得酵母悬浮液；向所得酵母悬浮液中加入碳酸氢钠，使碳酸氢钠的质量分数为0.3%，搅拌60min脱苦，离心弃上清液；水洗脱苦后的酵母泥并过300目筛，再次水洗，离心得纯化脱苦的酵母泥；
2)热处理
向经微波处理的酵母泥中加入纯水(微波处理的酵母泥与纯水的重量比为1:3)以悬浮酵母细胞，在121°C下热处理80min ；
3)蜗牛酶处理
冷却步骤2)所得酵母悬浮液后，加入蜗牛酶(按照每克脱苦纯化的酵母泥中加入
0.8mg蜗牛酶为标准加入)，并在37°C下搅拌5小时，搅拌速度为120rpm以破坏酵母细胞的细胞膜；
4)超声波破碎处理
采用功率为400W的超声波细胞裂解仪对步骤3)所得酵母悬浮液进行间歇式超声波破碎处理，具体的:超声波细胞裂解仪工作1s后间歇5s，依此循环，超声波破碎处理的总时间为30min，酵母细胞裂解，释放出海藻糖；
5)海藻糖的提取与纯化
以4500rpm的转速离心步骤4)所得溶液1min,离心所得上清液采用3KDa分子量的超滤膜超滤，超滤透过液过酸碱柱，通过酸碱柱的液体为海藻糖收集液，在75°C条件下采用质量分数为50%的乙醇溶液抽提海藻糖收集液80min得海藻糖抽提液；旋转蒸发(旋转蒸发时，温度为50°C，压力0.1Mpa，转速为200rpm)海藻糖抽提液至体积减少60%，然后喷雾干燥或采用无水乙醇醇沉干燥乳白色纯化的海藻糖(该工艺条件下，100 g脱苦纯化的酵母泥得13.52g海藻糖)。
[0026]实施例6
如图1所示，一种利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法，包括以下步骤:
I)微波处理
首先对啤酒废酵母泥进行脱苦纯化，啤酒废酵母泥的脱苦纯化包括以下步骤:向啤酒废酵母泥中加纯水(啤酒废酵母泥与纯水的重量比为1:3)，经80-100目筛过滤得酵母悬浮液；向所得酵母悬浮液中加入酒石酸，使酒石酸的质量分数为2%，搅拌90min脱苦，离心弃上清液；水洗脱苦后的酵母泥并过300目筛，再次水洗，离心得纯化脱苦的酵母泥；然后将脱苦纯化的酵母泥置于500W的微波炉中处理5min ；
2)热处理
向经微波处理的酵母泥中加入纯水(微波处理后的酵母泥与纯水的重量比为1:3)以悬浮酵母细胞，在100°C下热处理90min ；
3)蜗牛酶处理
冷却步骤2)所得酵母悬浮液后，加入蜗牛酶(按照每克脱苦纯化的酵母泥中加入2mg蜗牛酶为标准加入)，并在30°C下搅拌5小时，搅拌速度为200rpm以破坏酵母细胞的细胞膜；
4)超声波破碎处理
采用功率为400W的超声波细胞裂解仪对步骤3)所得酵母悬浮液进行间歇式超声波破碎处理，具体的:超声波细胞裂解仪工作1s后间歇5s，依此循环，超声波破碎处理的总时间为20min，酵母细胞裂解，释放出海藻糖；
5)海藻糖的提取与纯化
以4500rpm的转速离心步骤4)所得溶液1min,离心所得上清液采用3KDa分子量的超滤膜超滤，超滤透过液过酸碱柱，通过酸碱柱的液体为海藻糖收集液，在85°C条件下采用质量分数为50%的乙醇溶液抽提海藻糖收集液10min得海藻糖抽提液；旋转蒸发(旋转蒸发时，温度为70°C，压力0.1Mpa，转速为200rpm)海藻糖抽提液至体积减少70%，然后喷雾干燥或采用无水乙醇醇沉干燥乳白色纯化的海藻糖(该工艺条件下，100 g脱苦纯化的酵母泥得
10.27g海藻糖)。
[0027]实施例7
如图1所示，一种利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法，包括以下步骤:
1)微波处理
首先对啤酒废酵母泥进行脱苦纯化，啤酒废酵母泥的脱苦纯化包括以下步骤:向啤酒废酵母泥中加纯水(啤酒废酵母泥与纯水的重量比为1:1)，经80-100目筛过滤得酵母悬浮液；向所得酵母悬浮液中加入酒石酸，使酒石酸的质量分数为8%，搅拌30min脱苦，离心弃上清液；水洗脱苦后的酵母泥并过300目筛，再次水洗，离心得纯化脱苦的酵母泥；然后将脱苦纯化的酵母泥置于600W的微波炉中处理Imin ；
2)热处理
向经微波处理的酵母泥中加入纯水(微波处理的酵母泥与纯水的重量比为1:3)以悬浮酵母细胞，在150°C下热处理30min ；
3)蜗牛酶处理
冷却步骤2)所得酵母悬浮液后，加入蜗牛酶(按照每克脱苦纯化的酵母泥中加入
0.5mg蜗牛酶为标准加入),并在45°C下搅拌2小时,搅拌速度为10rpm以破坏酵母细胞的细胞膜；
4)超声波破碎处理
采用功率为200W的超声波细胞裂解仪对步骤3)所得酵母悬浮液进行间歇式超声波破碎处理，具体的:超声波细胞裂解仪工作1s后间歇5s，依此循环，超声波破碎处理的总时间为40min，酵母细胞裂解，释放出海藻糖；5)海藻糖的提取与纯化
以4500rpm的转速离心步骤4)所得溶液1min,离心所得上清液采用3KDa分子量的超滤膜超滤，超滤透过液过酸碱柱，通过酸碱柱的液体为海藻糖收集液，在70°C条件下采用质量分数为30%的乙醇溶液抽提海藻糖收集液80min得海藻糖抽提液；旋转蒸发(旋转蒸发时，温度为50°C，压力0.1Mpa，转速为200rpm)海藻糖抽提液至体积减少55%，然后喷雾干燥或采用无水乙醇醇沉干燥乳白色纯化的海藻糖(该工艺条件下，100 g脱苦纯化的酵母泥得
11.03g海藻糖)。
[0028]实施例8
如图1所示，一种利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法，包括以下步骤:
1)微波处理
首先对啤酒废酵母泥进行脱苦纯化，然后将脱苦纯化的酵母泥置于500W的微波炉中处理3min ;啤酒废酵母泥的脱苦纯化包括以下步骤:向啤酒废酵母泥中加纯水(啤酒废酵母泥与纯水的重量比为1:3)，经80-100目筛过滤得酵母悬浮液；向所得酵母悬浮液中加入碳酸氢钠，使碳酸氢钠的质量分数为0.2%，搅拌60min脱苦，离心弃上清液；水洗脱苦后的酵母泥并过300目筛，再次水洗，离心得纯化脱苦的酵母泥； 2)热处理
向经微波处理的酵母泥中加入纯水(微波处理的酵母泥与纯水的重量比为1:3)以悬浮酵母细胞，在121°C下热处理80min ；
3)蜗牛酶处理
冷却步骤2)所得酵母悬浮液后，加入蜗牛酶(按照每克脱苦纯化的酵母泥中加入
1.2mg蜗牛酶为标准加入)，并在37°C下搅拌4小时，搅拌速度为150rpm以破坏酵母细胞的细胞膜；
4)超声波破碎处理
采用功率为400W的超声波细胞裂解仪对步骤3)所得酵母悬浮液进行间歇式超声波破碎处理，具体的:超声波细胞裂解仪工作1s后间歇5s，依此循环，超声波破碎处理的总时间为25min，酵母细胞裂解，释放出海藻糖；
5)海藻糖的提取与纯化
以4500rpm的转速离心步骤4)所得溶液1min,离心所得上清液采用3KDa分子量的超滤膜超滤，超滤透过液过酸碱柱，通过酸碱柱的液体为海藻糖收集液，在80°C条件下采用质量分数为38%的乙醇溶液抽提海藻糖收集液80min得海藻糖抽提液；旋转蒸发(旋转蒸发时，温度为60°C，压力0.1Mpa，转速为200rpm)海藻糖抽提液至体积减少60%，然后喷雾干燥或采用无水乙醇醇沉干燥乳白色纯化的海藻糖(该工艺条件下，100 g脱苦纯化的酵母泥得10.82g海藻糖)。
[0029]实施例9
如图1所示，一种利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法，包括以下步骤:
I)微波处理
首先对啤酒废酵母泥进行脱苦纯化，然后将脱苦纯化的酵母泥置于550W的微波炉中处理4min ;啤酒废酵母泥的脱苦纯化包括以下步骤:向啤酒废酵母泥中加纯水(啤酒废酵母泥与纯水的重量比为1:2)，经80-100目筛过滤得酵母悬浮液；向所得酵母悬浮液中加入碳酸氢钠，使碳酸氢钠的质量分数为0.5%，搅拌SOmin脱苦，离心弃上清液；水洗脱苦后的酵母泥并过300目筛，再次水洗，离心得纯化脱苦的酵母泥；
2)热处理
向经微波处理的酵母泥中加入纯水(微波处理的酵母泥与纯水的重量比为1:3)以悬浮酵母细胞，在121°C下热处理70min ；
3)蜗牛酶处理
冷却步骤2)所得酵母悬浮液后，加入蜗牛酶(按照每克脱苦纯化的酵母泥中加入
1.5mg蜗牛酶为标准加入)，并在37°C下搅拌3小时，搅拌速度为120rpm以破坏酵母细胞的细胞膜；
4)超声波破碎处理
采用功率为200W的超声波细胞裂解仪对步骤3)所得酵母悬浮液进行间歇式超声波破碎处理，具体的:超声波细胞裂解仪工作1s后间歇5s，依此循环，超声波破碎处理的总时间为40min，酵母细胞裂解 ，释放出海藻糖；
5)海藻糖的提取与纯化
以4500rpm的转速离心步骤4)所得溶液1min,离心所得上清液采用3KDa分子量的超滤膜超滤，超滤透过液过酸碱柱，通过酸碱柱的液体为海藻糖收集液，在70°C条件下采用质量分数为40%的乙醇溶液抽提海藻糖收集液90min得海藻糖抽提液；旋转蒸发(旋转蒸发时，温度为60°C，压力0.1Mpa，转速为200rpm)海藻糖抽提液至体积减少60%，然后喷雾干燥或采用无水乙醇醇沉干燥乳白色纯化的海藻糖(该工艺条件下，100 g脱苦纯化的酵母泥得10.95g海藻糖)。
[0030]对比例
本对比例的利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法，包括以下步骤:
1)微波处理
首先对啤酒废酵母泥进行脱苦纯化，啤酒废酵母泥的脱苦纯化包括以下步骤:向啤酒废酵母泥中加纯水(啤酒废酵母泥与纯水的重量比为1:3)，经80-100目筛过滤得酵母悬浮液；向所得酵母悬浮液中加入酒石酸，使酒石酸的质量分数为5%，搅拌60min脱苦，离心弃上清液；水洗脱苦后的酵母泥并过300目筛，再次水洗，离心得纯化脱苦的酵母泥；然后将脱苦纯化的酵母泥置于500W的微波炉中处理5min ；
2)蜗牛酶处理
冷却步骤2)所得酵母悬浮液后，加入蜗牛酶(按照每克脱苦纯化的酵母泥中加入
1.0mg蜗牛酶为标准加入)，并在37°C下搅拌3小时，搅拌速度为200rpm以破坏酵母细胞的细胞膜；
3)超声波破碎处理
采用功率为300W的超声波细胞裂解仪对步骤3)所得酵母悬浮液进行间歇式超声波破碎处理，具体的:超声波细胞裂解仪工作1s后间歇5s，依此循环，超声波破碎处理的总时间为50min，酵母细胞裂解，释放出海藻糖；4)海藻糖的提取与纯化
以4500rpm的转速离心步骤4)所得溶液1min,离心所得上清液采用3KDa分子量的超滤膜超滤，超滤透过液过酸碱柱，通过酸碱柱的液体为海藻糖收集液，在80°C条件下采用质量分数为50%的乙醇溶液抽提海藻糖收集液90min得海藻糖抽提液；旋转蒸发(旋转蒸发时，温度为60°C，压力0.1Mpa，转速为200rpm)海藻糖抽提液至体积减少60%，然后喷雾干燥得乳白色纯化的海藻糖。(该工艺条件下，100 g脱苦纯化的酵母泥得9.26g海藻糖)。本对比例与实施例1、2条件基本一致，只是未进行热处理，得率降低较明显，因此热胁迫刺激为本发明方法的关键步骤， 必不可少。
【权利要求】
1.一种利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)微波处理 将脱苦纯化的酵母泥置于微波炉中处理f 5min ； 2)热处理 向经微波处理的酵母泥中加入纯水以悬浮酵母细胞，在10(Tl50 °C下热处理30~90min ； 3)蜗牛酶处理 冷却步骤2)所得酵母悬浮液后，加入蜗牛酶，并在3(T45°C下搅拌2飞小时，以破坏酵母细胞的细胞膜； 4)超声波破碎处理 对步骤3)所得酵母悬浮液进行超声波破碎处理至酵母细胞裂解，释放出海藻糖； 5)海藻糖的提取与纯化 离心步骤4)所得溶液，离心所得上清液采用超滤膜超滤，超滤透过液过酸碱柱，通过酸碱柱的液体为海藻糖收集 液，在所述海藻糖收集液中抽提海藻糖并进行纯化，得纯化的海藻糖。
2.如权利要求1所述的利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法，其特征在于，步骤I)中脱苦纯化的酵母泥的获得包括以下步骤:向啤酒废酵母泥中加纯水，经80-100目筛过滤得酵母悬浮液；向所得酵母悬浮液中加入酒石酸或碳酸氢钠，使酒石酸的质量分数为2~8%或碳酸氢钠的质量分数为0.1~0.5%，搅拌3(T90min脱苦，离心弃上清液；水洗脱苦后的酵母泥并过300目筛，再次水洗，离心得纯化脱苦的酵母泥。
3.如权利要求1所述的利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法，其特征在于:所述微波炉的功率为300W~600W。
4.如权利要求1所述的利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法，其特征在于:步骤2)中酵母泥与纯水的质量比为1:3。
5.如权利要求1所述的利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法，其特征在于:按照每克脱苦纯化的酵母泥中加入0.5^2mg蜗牛酶的标准加入蜗牛酶。
6.如权利要求1所述的利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法，其特征在于:步骤3)中加入蜗牛酶后，在37°C下搅拌3、小时，搅拌速度为10(T200rpm。
7.如权利要求1所述的利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法，其特征在于:步骤4)中超声波破碎处理采用功率为20(T800W的超声波细胞裂解仪，间歇式超声波破碎处理。
8.如权利要求7所述的利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法，其特征在于:所述间歇式超声波破碎处理具体为超声波细胞裂解仪工作1s后间歇5s，依此循环，超声波破碎处理的总时间为2(T40min。
9.如权利要求1所述的利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法，其特征在于:步骤5)中所述的超滤膜为3KDa分子量的超滤膜。
10.如权利要求1所述的利用胁迫条件提高啤酒废酵母海藻糖得率的环保生产方法，其特征在于:步骤5)中所述的抽提是在7(T85°C条件下采用质量分数为30-50%的乙醇溶液抽提80-100min ;所述的纯化是旋转蒸发海藻糖抽提液至体积减少55~70%，然后喷雾干燥或采用无水乙醇醇沉干燥。
【文档编号】C07H1/06GK104177449SQ201410352902
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年7月24日 优先权日:2014年7月24日
【发明者】王宜磊, 朱陶, 张海丽, 宋磊 申请人:菏泽学院