变体成麦芽六糖α-淀粉酶变体的制作方法
【专利摘要】本发明所公开的是涉及变体成麦芽六糖α-淀粉酶的组合物和方法。所述变体α-淀粉酶可用于例如淀粉液化和糖化、用于清洁衣物、餐具和其他应用中的含淀粉污渍、用于纺织物处理(例如退浆)、在动物饲料中用于改善消化率以及用于烘培和酿造。
【专利说明】变体成麦芽六糖Cl -淀粉酶变体
[0001]优先权
[0002]本专利申请要求于2011年10月28日提交的序列号为61/552，910的美国临时申请和于2012年7月5日提交的序列号为61/668，359的美国临时申请的优先权，特此将这两个临时专利申请以引用的方式全文并入。
【技术领域】
[0003]所公开的是涉及成麦芽六糖变体α -淀粉酶。该变体α _淀粉酶可用于例如淀粉液化和糖化、清洁含淀粉污溃、纺织物退浆、烘焙和酿造。
[0004] 背景
[0005]淀粉由直链淀粉(15-30% w/w)和支链淀粉(70-85% w/w)的混合物组成。直链淀粉由α-1,4-连接的葡萄糖单元的直链组成，分子量(MW)为约60，000至约800，000。支链淀粉是每24-30个葡萄糖单元含有α -1, 6分支点的支链聚合物；其MW可高达一亿。
[0006]浓缩右旋糖浆形式的得自淀粉的糖目前通过酶催化法制备，该方法涉及:(1)用α -淀粉酶将固体淀粉液化(或降低粘度)成平均聚合度为约7-10的糊精，以及(2)用淀粉葡糖苷酶(也称为葡糖淀粉酶或GA)将所得的液化淀粉(即淀粉水解物)糖化。所得的糖浆具有高葡萄糖含量。大部分商业生产的葡萄糖浆随后通过酶法异构化为称为异糖浆(isosyrup)的右旋糖/果糖混合物。所得的糖浆也可用微生物(如酵母)发酵以产生商品，包括例如乙醇、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、衣康酸、谷氨酸一钠、葡糖酸盐、赖氨酸、其他有机酸、其他氨基酸和其他生物化学品。可同时进行发酵和糖化(即SSF工艺)来实现更大的经济性和效率。
[0007]α -淀粉酶通过随机裂解内部的α -1, 4_糖苷键来水解淀粉、糖原和相关的多糖。α-淀粉酶(特别是来自杆菌(Bacilli)的α-淀粉酶)已被用于各种不同的目的，包括淀粉液化和糖化、纺织物退浆、造纸和纸浆工业中的淀粉改性、酿造、烘焙、用于食品工业的糖浆的生产、用于发酵工艺的原料的生产以及用于动物饲料中来增加可消化率。这些酶也可用于在餐具洗涤和衣物洗涤过程中除去含淀粉污垢和污溃。
【发明内容】
[0008]本发明组合物和方法涉及成麦芽六糖变体淀粉酶多肽以及其使用方法。在以下分别带编号的段落中概述了本发明组合物和方法的各方面和实施例。
[0009]1.在一个方面，提供源自亲本α-淀粉酶多肽的变体α-淀粉酶多肽，其在有效氨基酸位置(productive amino acid position)包含至少一个可组合突变。其中:(i)所述可组合突变是用一不同的氨基酸残基置换亲本α-淀粉酶中存在的氨基酸残基，与该亲本α-淀粉酶相比，该置换改善了变体α-淀粉酶的至少一种期望的特性，而与该亲本α-淀粉酶相比，未显著降低该变体α-淀粉酶的表达、活性或稳定性，(ii)所述有效位置(productive position)是可用多个不同的氨基酸残基置换的氨基酸位置,该置换的每一者可导致符合(i)的要求的变体α-淀粉酶，并且(iii)所述可组合突变对应于列表A、B、C或D中或表C或D中列出的突变，所述列表和表使用SEQ ID NO:3进行编号。
[0010]2.在段落I的变体淀粉酶的一些实施例中，所述至少一个可组合突变的每一者产生变体淀粉酶，其中关于(i)蛋白质表达、(ii)活性和(iii)洗涤剂稳定性或热稳定性，相对于亲本淀粉酶的最低性能指数(PD大于或等于0.9，并且关于(i)、(ii)或(iii)中的任一者的PI大于或等于1.0。
[0011]3.在段落I的变体淀粉酶的一些实施例中，所述至少一个可组合突变的每一者产生变体淀粉酶，其中关于(i)蛋白质表达、(ii)活性和(iii)洗涤剂稳定性或热稳定性，相对于亲本淀粉酶的最低性能指数(PD大于或等于0.8，并且关于(i)、(ii)或(iii)中的任一者的PI大于或等于1.2。
[0012]4.在段落I的变体淀粉酶的一些实施例中，所述至少一个可组合突变的每一者产生变体淀粉酶，其中关于(i)蛋白质表达、(ii)活性和(iii)洗涤剂稳定性或热稳定性，相对于亲本淀粉酶的最低性能指数(PD大于或等于0.5，并且关于(i)、(ii)或(iii)中的任一者的PI大于或等于1.5。
[0013]5.在前述段落任一者的变体淀粉酶的一些实施例中，所述至少一个可组合突变的每一者具有适宜性得分+++、++++或+++++,参见表B。
[0014]6.在前述段落任一者的变体淀粉酶的一些实施例中，所述至少一个可组合突变的每一者具有适宜性得分++++或+++++,参见表B。
[0015]7.在前述段落任一者的变体淀粉酶的一些实施例中，所述至少一个可组合突变的每一者具有适宜性得分+++++，参见表B。
[0016]8.在前述段落任一者的变体淀粉酶的一些实施例中，所述至少一个可组合突变的每一者具有有效性得分I或2。
[0017]9.在一些实施例中，前述段落任一者的变体淀粉酶包括多个可组合突变。
[0018]10.在一些实施例中，前述段落任一者的变体淀粉酶还包含对应于选自Arg-181、Gly-182、His-183和Gly-184的残基的缺失，这些残基使用SEQ ID N0:3进行编号。
[0019]11.在一些实施例中，前述段落任一者的变体淀粉酶还包含对应于残基Arg-181和Gly-182的缺失，这些残基使用SEQ ID N0:3进行编号。
[0020]12.在前述段落任一者的变体淀粉酶的一些实施例中，亲本α-淀粉酶或变体α-淀粉酶与SEQ ID Ν0:3或SEQ ID Ν0:4的氨基酸序列具有至少60%的氨基酸序列同一性，或者其中所述亲本α-淀粉酶或变体α-淀粉酶由在严格条件下与SEQ ID NO:1或SEQID NO:5的核酸杂交的核酸编码。
[0021]13.在前述段落任一者的变体淀粉酶的一些实施例中，亲本α-淀粉酶或变体α-淀粉酶与SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性，或者其中所述亲本α-淀粉酶或变体α-淀粉酶由在严格条件下与SEQ ID NO:1或SEQID NO:5的核酸杂交的核酸编码。
[0022]14.在前述段落任一者的变体淀粉酶的一些实施例中，亲本α-淀粉酶或变体α-淀粉酶与SEQ ID Ν0:3或SEQ ID Ν0:4的氨基酸序列具有至少80%的氨基酸序列同一性，或者其中所述亲本α-淀粉酶或变体α-淀粉酶由在严格条件下与SEQ ID NO:1或SEQID NO:5的核酸杂交的核酸编码。
[0023]15.在前述段落任一者的变体淀粉酶的一些实施例中，亲本α-淀粉酶或变体α-淀粉酶与与SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4的氨基酸序列具有至少90%的氨基酸序列同一性，或者其中所述亲本α -淀粉酶或变体α -淀粉酶由在严格条件下与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的核酸杂交的核酸编码。
[0024]16.在另一方面，提供包含段落1-15中任一者的变体淀粉酶的组合物。
[0025]17.在段落16的组合物的一些实施例中，所述组合物可有效用于从衣物、餐具或纺织品移除含淀粉污溃。
[0026]18.在一些实施例中，段落16或17的组合物还包含表面活性剂。
[0027]19.在段落16-18的组合物的一些实施例中，所述组合物为洗涤剂组合物。
[0028]20.在段落16-19的组合物的一些实施例中，所述组合物是衣物洗涤剂或衣物洗涤剂添加剂。
[0029]21.在段落16-20的组合物的一些实施例中，所述组合物是手动或自动餐具洗涤剂。
[0030]22.在一些实施例中，段落16-21的组合物还包含一种或多种另外的酶，所述另外的酶选自:蛋白酶、半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、脂解酶、金属脂解酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β -葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和除了段落1-15中任一者的淀粉酶之外的淀粉酶。
[0031]23.在一些实施例中，段落16的组合物是用于液化淀粉。
[0032]24.在一些实施例中，段落16的组合物是用于糖化包含淀粉的组合物、用于液化后的SSF或用于无预先液化的直接SSF。
[0033]25.在一些实施例中，段落16的组合物是用于制备发酵饮料。
[0034]26.在一些实施例中，段落16的组合物是用于制备烘培食品。
[0035]27.在一些实施例中，段落16的组合物是用于纺织物退浆。
[0036]28.在另一方面，提供一种用于从表面移除含淀粉污溃或污垢的方法，所述方法包括:在包含有效量的段落1-15任一者的变体淀粉酶的含水组合物的存在下接触所述表面，以及让所述多肽水解所述含淀粉污溃中存在的淀粉组分以产生溶解于所述含水组合物中的较小淀粉衍生分子，以及清洗所述表面，从而从所述表面移除所述含淀粉污溃。
[0037]29.在段落28的方法的一些实施例中，所述含水组合物还包含表面活性剂。
[0038]30.在段落28-29的方法的一些实施例中，所述表面是纺织物表面。
[0039]31.在段落28-29的方法的一些实施例中，所述表面是在餐具上。
[0040]32.在段落28-29的方法的一些实施例中，所述表面为有污垢的硬质表面。
[0041]33.在段落28-32的方法的一些实施例中，所述组合物还包含至少一种另外的酶，所述另外的酶选自蛋白酶、半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、脂解酶、金属脂解酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase, β -葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和除了段落1_15中任一者的淀粉酶之外的淀粉酶。
[0042]34.在另一方面，提供糖化包含淀粉的组合物以制备包含葡萄糖的组合物的方法，其中所述方法包括:(i)使所述溶液与有效量的段落1-15任一者的变体淀粉酶接触；以及
(ii)糖化包含淀粉的溶液以制备包含葡萄糖的组合物；其中所述变体淀粉酶催化所述淀粉溶液到葡萄糖的糖化。
[0043]35.在段落34的方法的一些实施例中，包含淀粉的组合物包含液化淀粉、糊化淀粉或颗粒淀粉。
[0044]36.在段落34或35的方法的一些实施例中，在约30°C至约75°C的温度范围下进行糖化。
[0045]37.在段落36的方法的一些实施例中，所述温度范围为47°C - 74°C。
[0046]38.在段落34-37任一者的方法的一些实施例中，在pH2.0-7.5的pH范围内进行糖化。
[0047]39.在段落38的方法的一些实施例中，所述pH范围是pH3.5 - 5.5。
[0048]40.在段落39的方法的一些实施例中，所述pH范围是ρΗ3.5 - 4.5。 [0049]41.在一些实施例中，段落34-40任一者的方法还包括使所述葡萄糖组合物发酵以制备发酵最终(end of fermentation, EOF)产物。
[0050]42.在段落41的方法的一些实施例中，所述发酵是同时糖化和发酵(SSF)反应。
[0051]43.在段落41或42的方法的一些实施例中，在pH2-8下并且在25°C _70°C的温度范围内进行所述发酵48 - 70小时。
[0052]44.在段落41-43任一者的方法的一些实施例中，所述EOF产物包含乙醇。
[0053]45.在段落41-44任一者的方法的一些实施例中，所述EOF产物包含8-18% (v/v)的乙醇。
[0054]46.在段落41-45的方法的一些实施例中，所述方法还包括使麦芽衆和/或麦芽汁与淀粉酶接触。
[0055]47.在段落46的方法的一些实施例中，所述方法还包括:(a)制备麦芽浆；(b)过滤所述麦芽浆以获得麦芽汁；以及(C)使所述麦芽汁发酵以获得发酵饮料，其中将段落1-16和74-80中的任一者的变体淀粉酶添加至:(i)步骤(a)的麦芽浆和/或(ii)步骤
(b)的麦芽汁和/或(iii)步骤(C)的麦芽汁。
[0056]48.在段落41-47任一者的方法的一些实施例中，所述EOF产物包含代谢物。
[0057]49.在段落48的方法的一些实施例中，所述代谢物是柠檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一钠、葡糖酸、葡糖酸钠、葡糖酸钙、葡糖酸钾、葡糖酸S-内酯、异抗坏血酸钠、Ω-3脂肪酸、丁醇、氨基酸赖氨酸、衣康酸、1，3-丙二醇或异戊二烯。
[0058]50.在一些实施例中，段落34-49任一者的方法还包括将葡糖淀粉酶、己糖激酶、木聚糖酶、葡萄糖异构酶、木糖异构酶、磷酸酶、植酸酶、支链淀粉酶、β -淀粉酶、不是所述变体α-淀粉酶的α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、异淀粉酶、氧化还原酶、酯酶、转移酶、果胶酶、α-葡糖苷酶、β_葡糖苷酶或它们的组合添加至所述淀粉溶液。
[0059]51.在段落50的方法的一些实施例中，添加所述葡糖淀粉酶达到0.1 -2葡糖淀粉酶单位(GAU)/g dso
[0060]52.在段落34-51任一者的方法的一些实施例中，所述淀粉酶由宿主细胞表达和分泌。[0061]53.在段落52的方法的一些实施例中，使所述包含淀粉的组合物与所述宿主细胞接触。
[0062]54.在段落52或53的方法的一些实施例中，所述宿主细胞还表达和分泌葡糖淀粉酶或其他酶。
[0063]55.在段落52-54任一者的方法的一些实施例中，所述宿主细胞能使所述组合物发酵。
[0064]56.在另一方面，提供通过段落34-55中任一者的方法制备的包含葡萄糖的组合物。
[0065]57.在另一方面，提供通过段落34-55中任一者的方法制备的液化淀粉。
[0066]58.在另一方面，提供通过段落34-55中任一者的方法制备的发酵饮料。
[0067]59.在另一方面，提供段落1-15任一者的淀粉酶在制备包含葡萄糖的组合物中的用途。
[0068]60.在另一方面，提供段落1-15任一者的淀粉酶在制备液化淀粉中的用途。
[0069]61.在另一方面，提供段落1-15任一者的淀粉酶在制备发酵饮料中的用途。
[0070]62.在另一方面，提供段落1-15任一者的淀粉酶在清洁含淀粉污溃中的用途。
[0071]63.在另一方面，提供段落1-15任一者的淀粉酶在纺织物退浆中的用途。
[0072]64.在根据段落34-55中任一者的方法、段落58的发酵饮料或段落61的用途的一些实施例中，所述发酵饮料或发酵最终产物选自(i)啤酒，所述啤酒选自全麦芽啤酒、根据“Reinheitsgebot(纯净法)”酿造的啤酒、爱尔啤酒、IPA、拉格啤酒、苦啤酒、低麦芽啤酒(Happoshu)(第二啤酒)、第三啤酒、干啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低酒精啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、司陶特啤酒(stout)、麦芽酒、无酒精啤酒和无酒精麦芽酒；和(ii)谷物或麦芽饮料，选自水果味麦芽饮料、酒味麦芽饮料和咖啡味麦芽饮料。
[0073]65.在另一方面，提供制备食品组合物的方法，包括将:(i) 一种或多种食品成分与(ii)段落1-15任一者的变体α-淀粉酶合并，其中其变体α-淀粉酶催化所述食品成分中存在的淀粉组分水解而产生葡萄糖。
[0074]66.在段落65的方法的一些实施例中，所述食品组合物选自食品、烘焙组合物、食品添加剂、动物食品、饲料产品、饲料添加剂、油、肉和猪油。
[0075]67.在段落65-66中任一者的方法的一些实施例中，所述一种或多种食品成分包含烘培成分或添加剂。
[0076]68.在段落65-67中任一者的方法的一些实施例中，所述一种或多种食品成分选自:面粉；抗变陈淀粉酶；磷脂酶；磷脂；生麦芽α -淀粉酶或其具有生麦芽α -淀粉酶活性的变体、同源物或突变体；烘培食品用木聚糖酶；和脂肪酶。
[0077]69.在段落65的方法的一些实施例中，所述一种或多种食品成分选自:(i)来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophi lus)的生麦芽α_淀粉酶、(ii)来自芽孢杆菌(Bacillus)、曲霉(Aspergillus)、嗜热丝抱菌(Thermomyces)或木霉(Trichoderma)的烘焙食品用木聚糖酶、(iii)来自异孢镰孢菌(Fusarium heterosporum)的糖脂酶。
[0078]70.在段落65-69中任一者的方法的一些实施例中，所述食品组合物包含生面团或生面团产品，优选经加工的生面团产品。
[0079]71.在一些实施例中，段落65-70中任一者的方法还包括烘焙所述食品组合物以制备烘焙物。
[0080]72.在一些实施例中，段落65-70中任一者的方法还包括:(i)提供淀粉介质；
(ii)向所述淀粉介质添加淀粉酶；以及(iii)在步骤(b)期间或之后给所述淀粉介质加热以制备烘焙产品。
[0081 ] 73.在另一方面，提供使纺织物退浆的方法，包括使退浆组合物与上浆纺织物接触足以使所述纺织物退浆的时间，其中所述退浆组合物包含段落1-15中任一者的变体α -淀粉酶。
[0082]74.在另一方面，提供分离的编码段落1-15任一者的多肽的多核苷酸。
[0083]75.在另一方面，提供包含段落74的多核苷酸的表达载体。
[0084]76.在另一方面，提供包含段落75的表达载体的宿主细胞。
[0085]通过本发明的描述和附图，所述组合物和方法的这些方面和其他方面以及实施例将显而易见。
【专利附图】
【附图说明】 [0086]图1是使用默认参数进行的Amy707淀粉酶和AA560淀粉酶的Clustal比对。
[0087]图2是包含Amy707基因的pHPLT载体(pHPLT_Amy707)的图谱。
[0088]序列的简要i兑明
[0089]SEQ ID NO:1列出了质粒pHPLT_Amy707中编码芽孢杆菌707 a -淀粉酶的成熟形式的经密码子修饰的核苷酸序列。编码LAT信号肽的序列标有下划线。
[0090]SEQ ID NO: 2列出了从质粒pHPLT_Amy707产生的芽孢杆菌707 a -淀粉酶的前体形式的氨基酸序列。LAT信号肽标有下划线。
[0091]SEQ ID NO: 3列出了从质粒pHPLT-Amy707产生的芽孢杆菌707 α -淀粉酶的成熟
形式的氨基酸序列。
[0092]SEQ ID NO:4 列出了源自芽孢杆菌 DSMl2649 的 ΑΑ560 α -淀粉酶(即 STAINZYME?的亲本)的成熟形式的氨基酸序列。
[0093]SEQ ID NO:5列出了 Genebank登录号Μ18862,其编码芽孢杆菌707 α -淀粉酶。【具体实施方式】
[0094]所描述的是涉及成麦芽六糖变体淀粉酶的组合物和方法。所述变体是综合各种实验方法发现的，如所附的“实例”中详细描述的。方法包括利用位点评价文库(SEL)和基于结构的分析。变体淀粉酶的示例性应用是用于淀粉液化和糖化、用于清洁衣物、餐具和其他应用中的含淀粉污溃、用于纺织物处理(例如退浆)、在动物饲料中用于改善消化率以及用于烘培和酿造。所述组合物和方法的这些及其他方面在下文详细描述。
[0095]在描述本发明组合物和方法的各个方面和实施例之前，描述了如下定义和缩写。
[0096]1.定义和缩写
[0097]根据此详细描述，应用下面的缩写和定义。注意，除非上下文另有明确指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指代物。因此，例如，提及“酶”包括多个此种酶，而提及“剂量”，包括提及一个或多个剂量以及本领域技术人员已知的其等同物，等等。
[0098]本文档被组织成多个章节，以便于阅读；然而，读者将会知道，在一个章节中进行的陈述可以应用到其他章节。因此，本公开不同章节使用的标题不应理解为限制性的。
[0099]除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。下面提供如下的术语。
[0100]1.1.缩写首字母缩略词
[0101]如下缩写/首字母缩写具有如下含义，除非另外规定:
[0102]
【权利要求】
1.一种衍生自亲本α -淀粉酶多肽的变体α -淀粉酶多肽，所述变体α _淀粉酶多肽在有效氨基酸位置处包含至少一个可组合突变；其中: (i)所述可组合突变是用一不同的氨基酸残基置换所述亲本淀粉酶中存在的氨基酸残基，与所述亲本α-淀粉酶相比，所述置换可改善所述变体α-淀粉酶的至少一种期望的特性，而与所述亲本α-淀粉酶相比，未显著降低所述变体α-淀粉酶的表达、活性或稳定性， (ii)所述有效位置是可用多个不同的氨基酸残基置换的氨基酸位置，所述置换的每一者可导致符合(i)的要求的变体α-淀粉酶，并且 (iii)所述可组合突变对应于列表A、B、C或D中或表C或D中列出的突变，所述列表和表使用SEQ ID N0:3进行编号。
2.根据权利要求1所述的变体淀粉酶，其中所述可组合突变产生变体淀粉酶，其中关于(i)蛋白质表达、(ii)活性和(iii)洗涤剂稳定性或热稳定性，相对于所述亲本淀粉酶的最低性能指数(PI)大于或等于0.9，并且关于(i)、(ii)或(iii)中的任一者的所述PI大于或等于1.0。
3.根据权利要求1所述的变体淀粉酶，其中所述可组合突变产生变体淀粉酶，其中关于(i)蛋白质表达、(ii)活性和(iii)洗涤剂稳定性或热稳定性，相对于所述亲本淀粉酶的最低性能指数(PI)大于或等于0.8，并且关于(i)、(ii)或(iii)中的任一者的所述PI大于或等于1.2。
4.根据权利要求1所述的变体淀粉酶，其中所述可组合突变产生变体淀粉酶，其中关于(i)蛋白质表达、(ii)活性和(iii)洗涤剂稳定性或热稳定性，相对于所述亲本淀粉酶的最低性能指数(PI)大于或等于0.5，并且关于(i)、(ii)或(iii)中的任一者的所述PI大于或等于1.5。
5.根据前述权利要求任一项所述的变体淀粉酶，其中所述可组合突变具有适宜性得分+++、++++ 或 +++++,参见表 B ο
6.根据前述权利要求任一项所述的变体淀粉酶，其中所述可组合突变具有适宜性得分++++或+++++,参见表B 0
7.根据前述权利要求任一项所述的变体淀粉酶，其中所述可组合突变具有适宜性得分+++++，参见表B。
8.根据前述权利要求任一项所述的变体淀粉酶，其中所述可组合突变具有有效性得分I或2。
9.根据前述权利要求任一项所述的变体淀粉酶，所述变体淀粉酶具有多个可组合突变。
10.根据前述权利要求任一项所述的变体淀粉酶，所述变体淀粉酶还包含对应于选自Arg-181、Gly-182、His-183和Gly-184的残基的缺失，所述残基使用SEQ ID NO:3进行编号。
11.根据前述权利要求任一项所述的变体淀粉酶，所述变体淀粉酶还包含对应于残基Arg-181和Gly-182的缺失，所述残基使用SEQ ID NO:3进行编号。
12.根据前述权利要求任一项所述的变体淀粉酶，其中所述亲本α-淀粉酶或所述变体α-淀粉酶与SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列具有至少60%的氨基酸序列同一'丨生，或者其中所述亲本α -淀粉酶或所述变体α -淀粉酶由在严格条件下与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的核酸杂交的核酸编码。
13.根据前述权利要求任一项所述的变体淀粉酶，其中所述亲本α-淀粉酶或所述变体α-淀粉酶与SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一'丨生，或者其中所述亲本α -淀粉酶或所述变体α -淀粉酶由在严格条件下与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的核酸杂交的核酸编码。
14.根据前述权利要求任一项所述的变体淀粉酶，其中所述亲本α-淀粉酶或所述变体α-淀粉酶与SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列具有至少80%的氨基酸序列同一'丨生，或者其中所述亲本α -淀粉酶或所述变体α -淀粉酶由在严格条件下与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的核酸杂交的核酸编码。
15.根据前述权利要求任一项所述的变体淀粉酶，其中所述亲本α-淀粉酶或所述变体α-淀粉酶与SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列具有至少90%的氨基酸序列同一'丨生，或者其中所述亲本α -淀粉酶或所述变体α -淀粉酶由在严格条件下与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的核酸杂交的核酸编码。
16.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1-15中任一项所述的变体淀粉酶。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述组合物对于从衣物、餐具或纺织物除去含淀粉污溃是有效的。
18.根据权利要求16或17所述的组合物，所述组合物还包含表面活性剂。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的组合物，其中所述组合物为洗涤剂组合物。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的组合物，其中所述组合物为衣物洗涤剂或衣物洗涤剂添加剂。
21.根据权利要求16-20中任一项所述的组合物，其中所述组合物是人工或自动餐具洗涤剂。
22.根据权利要求16-21中任一项所述的组合物，所述组合物还包含一种或多种另外的选自如下的酶:蛋白酶、半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、脂解酶、金属脂解酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β -葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和除了权利要求1_15中任一项所述的淀粉酶之外的淀粉酶。
23.根据权利要求16所述的组合物，其中所述组合物是用于液化淀粉。
24.根据权利要求16所述的组合物，其中所述组合物是用于糖化包含淀粉的组合物、用于液化后的SSF或用于无预先液化的直接SSF。
25.根据权利要求16所述的组合物，其中所述组合物是用于制备发酵饮料。
26.根据权利要求16所述的组合物，其中所述组合物是用于制备烘培食品。
27.根据权利要求16所述的组合物，其中所述组合物是用于纺织物退浆。
28.一种从表面除去含淀粉污溃或污垢的方法，所述方法包括: 在包含有效量的根据权利要求1-15任一项所述的变体淀粉酶的含水组合物的存在下接触所述表面， 让所述多肽水解所述含淀粉污溃中存在的淀粉组分以产生溶解于所述含水组合物中的较小淀粉衍生分子，以及清洗所述表面， 从而从所述表面上移除所述含淀粉污溃。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述水性组合物还包含表面活性剂。
30.根据权利要求28-29中任一项所述的方法，其中所述表面为纺织物表面。
31.根据权利要求28-29中任一项所述的方法，其中所述表面是在餐具上。
32.根据权利要求28-29中任一项所述的方法，其中所述表面为有污垢的硬质表面。
33.根据权利要求28-32中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含至少一种另外的选自如下的酶:蛋白酶、半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、脂解酶、金属脂解酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β -葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和除了根据权利要求1-15中任一项所述的淀粉酶之外的淀粉酶。
34.一种糖化包含淀粉的组合物以制备包含葡萄糖的组合物的方法，其中所述方法包括: (i)使所述包含淀 粉的溶液与有效量的根据权利要求1-15任一项所述的变体淀粉酶接触；以及 (ii)糖化所述包含淀粉的溶液以制备所述包含葡萄糖的组合物；其中所述变体淀粉酶催化所述淀粉溶液到葡萄糖的糖化。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述包含淀粉的组合物包含液化淀粉、糊化淀粉或颗粒淀粉。
36.根据权利要求34-35中任一项所述的方法，其中所述糖化在约30°C至约75°C的温度范围内进行。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述温度范围为47°C_74°C。
38.根据权利要求34- 37中任一项所述的方法，其中所述糖化在pH2.0-7.5的pH范围内进行。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述pH范围为pH3.5 - 5.5。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述pH范围为pH3.5 - 4.5。
41.根据权利要求34-40中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述葡萄糖组合物发酵以制备发酵最终(EOF)产物。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述发酵是同时糖化和发酵(SSF)反应。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述发酵在pH2-8下并且在25°C- 70°C的温度范围内进行48-70小时。
44.根据权利要求41-43中任一项所述的方法，其中所述EOF产物包含乙醇。
45.根据权利要求41- 44中任一项所述的方法，其中所述EOF产物包含8-18% (v/v)乙醇。
46.根据权利要求41- 45中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使麦芽浆和/或麦芽汁与淀粉酶接触。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述方法还包括: (a)制备麦芽衆；(b)过滤所述麦芽浆以得到麦芽汁；以及 (c)使所述麦芽汁发酵以获得发酵饮料， 其中将根据权利要求1-16和74-80中任一项所述的变体淀粉酶添加至: (i)步骤(a)的麦芽浆和/或 (ii)步骤(b)的麦芽汁和/或 (iii)步骤(c)的麦芽汁。
48.根据权利要求41-47中任一项所述的方法，其中所述EOF产物包含代谢物。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述代谢物是柠檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一钠、葡糖酸、葡糖酸钠、葡糖酸钙、葡糖酸钾、葡糖酸S-内酯、异抗坏血酸钠、Ω-3脂肪酸、丁醇、氨基酸、赖氨酸、衣康酸、1，3-丙二醇或异戊二烯。
50.根据权利要求34- 49中任一项所述的方法，所述方法还包括将葡糖淀粉酶、己糖激酶、木聚糖酶、葡萄糖异构酶、木糖异构酶、磷酸酶、植酸酶、支链淀粉酶、β -淀粉酶、不是所述变体α-淀粉酶的α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、异淀粉酶、氧化还原酶、酯酶、转移酶、果胶酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶或它们的组合添加至所述淀粉溶液。
51.根据权利要求50所述的方法，其中添加所述葡糖淀粉酶达到0.1 -2个葡糖淀粉酶单位(GAU)/g dso
52.根据权利要求34-51中任一项所述的方法，其中所述淀粉酶由宿主细胞表达和分泌。
53.根据权利要求52所述的方法，其中使所述包含淀粉的组合物与所述宿主细胞接触。
54.根据权利要求52或53所述的方法，其中所述宿主细胞还表达和分泌葡糖淀粉酶或其他酶。
55.根据权利要求52-54中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞能使所述组合物发酵。
56.一种组合物，所述组合物包含通过根据权利要求34-55中任一项所述的方法制备的葡萄糖。
57.一种液化淀粉，所述液化淀粉通过根据权利要求34-55中任一项所述的方法制备。
58.一种发酵饮料，所述发酵饮料通过根据权利要求34-55中任一项所述的方法制备。
59.根据权利要求1-15中任一项所述的淀粉酶的用途，其用于制备包含葡萄糖的组合物。
60.根据权利要求1-15中任一项所述的淀粉酶的用途，其用于制备液化淀粉。
61.根据权利要求1-15中任一项所述的淀粉酶的用途，其用于制备发酵饮料。
62.根据权利要求1-15中任一项所述的淀粉酶的用途，其用于清洁含淀粉污溃。
63.根据权利要求1-15中任一项所述的淀粉酶的用途，其用于纺织物退浆。
64.根据权利要求34-55中任一项所述的方法、根据权利要求58所述的发酵饮料或根据权利要求61所述的用途，其中所述发酵饮料或发酵最终产物选自 (i)选自如下的啤酒:全麦芽啤酒、根据“纯净法”酿造的啤酒、爱尔啤酒、IPA、拉格啤酒、苦啤酒、低麦芽啤酒(第二啤酒)、第三啤酒、干啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低酒精啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、司陶特啤酒、麦芽酒、无酒精啤酒和无酒精麦芽酒；和 (ii)选自如下的谷物或麦芽饮料:水果味麦芽饮料、酒味麦芽饮料和咖啡味麦芽饮料。
65.—种制备食品组合物的方法，所述方法包括:将如下物质合并: (i)一种或多种食品成分，和 (ii)根据权利要求1-15中任一项所述的变体α-淀粉酶， 其中所述变体淀粉酶催化所述食品成分中存在的淀粉组分的水解而产生葡萄糖。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述食品组合物选自食品、烘焙组合物、食品添加剂、动物食品、饲料产品、饲料添加剂、油、肉和猪油。
67.根据权利要求65-66中任一项所述的方法,其中所述一种或多种食品成分包含烘培成分或添加剂。
68.根据权利要求65-67中任一项所述的方法,其中所述一种或多种食品成分选自:面粉；抗变陈淀粉酶；磷脂酶；磷脂；生麦芽α-淀粉酶或其具有生麦芽α-淀粉酶活性的变体、同源物或突变体；烘培食品用木聚糖酶；和脂肪酶。
69.根据权利要求65所述的方法，其中所述一种或多种食品成分选自: (i)来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的生麦芽糖α-淀粉酶， (ii)来自芽孢杆菌属(Bacillus)、曲霉属(Aspergillus)、嗜热丝孢菌属(Thermomyces)或木霉属(Trichoderma)的烘焙食品用木聚糖酶， (iii)来自异孢镰孢菌(Fusariumheterosporum)的糖脂酶。
70.根据权利要求65-69中任一项所述的方法，其中所述食品组合物包含生面团或生面团产品，优选经加工的生面团产品。
71.根据权利要求65-70中任一项所述的方法，所述方法还包括烘焙所述食品组合物以制备烘焙物。
72.根据权利要求65-70中任一项所述的方法，其中所述方法还包括: (i)提供淀粉介质； (ii)向所述淀粉介质添加淀粉酶；以及 (iii)在步骤(b)期间或之后给所述淀粉介质加热以制备烘焙产品。
73.一种使纺织物退浆的方法，所述方法包括使退浆组合物与上浆纺织物接触足以使所述纺织物退浆的时间，其中所述退浆组合物包含根据权利要求1-15中任一项所述的变体α -淀粉酶。
74.—种分离的多核苷酸,所述多核苷酸编码根据权利要求1-15中任一项所述的多肽。
75.—种表达载体,所述表达载体包含根据权利要求74所述的多核苷酸。
76.—种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求75所述的表达载体。
【文档编号】C11D3/386GK103917642SQ201280052976
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2012年10月26日 优先权日:2011年10月28日
【发明者】L·G·卡斯康-佩雷拉, D·A·埃斯特尔, M·科尔克曼, H·穆尔德 申请人:丹尼斯科美国公司