具有葡聚糖转移酶活性的多肽和编码该多肽的核酸的制作方法

专利名称：具有葡聚糖转移酶活性的多肽和编码该多肽的核酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有葡聚糖转移酶(glucanotransferase)活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的核酸序列。本发明还涉及含所述核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞以及生产和使用所述多肽的方法。
相关领域描述4-α-葡聚糖转移酶(EC.2.4.1.25)催化将α葡聚糖链从一个α-葡聚糖分子转移到另一个分子(或葡萄糖)的反应。葡聚糖转移酶广泛分布于微生物(例如大肠杆菌)和植物组织例如马铃薯块茎、发芽的大麦种子、甜马铃薯和菠菜中。
最近，已发现葡聚糖转移酶能够催化α葡聚糖的分子内反应。例如，已报道葡聚糖转移酶能够催化直链淀粉的分子内转糖基反应(环化反应)，由此合成具有17或更高聚合度(下文称为“DP”)的环直链淀粉。
葡聚糖转移酶可用于各种工业目的。例如，可利用葡聚糖转移酶加工α葡聚糖从而生产环葡聚糖。在将酶用于工业目的的情况下，理想的是在尽可能高的温度(约60℃或更高)完成反应，因为要防止α葡聚糖，即底物逆行，且同时避免，至少减少微生物对系统的污染。
已分离得到只在中等温度区间(通常从约30℃-约45℃)具有高活性的葡聚糖转移酶(麦芽糖转葡糖基酶)，参见例如Agric.Biol.Chem.53，2653-2659(1989)和J.Chem.Soc.，44-53(1956)。最近，在EP 0 884 384 A2中已描述了同样能够产生环葡聚糖的新型耐热葡聚糖转移酶(麦芽糖转葡糖基酶)。
发明简述因此，本发明的第一个方面涉及具有葡聚糖转移酶活性的分离的多肽，所述多肽选自(a)具有与SEQ ID NO2的氨基酸1-501所示氨基酸序列有至少65％同一性之氨基酸序列的多肽；
(b)由在低严紧度条件下与下列序列杂交的核酸序列编码的多肽(i)SEQ ID NO1的核苷酸1-1503所示核酸序列的互补链；或(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列；(c)(a)或(b)的等位基因变体；(d)由克隆到大肠杆菌DSM 13049中之质粒的编码葡聚糖转移酶的DNA序列编码的多肽，或与所述多肽有至少65％同一性的其变体；和(e)所述多肽的具有葡聚糖转移酶活性的片段。
本发明的第二个方面涉及含编码本发明之多肽的核酸序列的分离的核酸序列。
在第三个方面，本发明涉及编码具有葡聚糖转移酶活性之多肽的分离的核酸序列，所述核酸序列选自(a)与SEQ ID NO1的核苷酸1-1503所示之核酸序列有至少70％同一性的核酸序列；(b)在低严紧度条件下与下列序列杂交的核酸序列(i)SEQ ID NO1的核苷酸1-1503所示核酸序列的互补链；或(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列；(c)(a)或(b)的等位基因变体；(d)已克隆到大肠杆菌DSM 13049中之质粒内的编码葡聚糖转移酶的DNA序列，或与所述DNA序列有至少70％同一性的其变体；和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的亚序列，其中所述亚序列编码具有葡聚糖转移酶活性的多肽片段；或作为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)之互补链的分离的核酸序列。
在本发明的第四方面是核酸构建体，其含有本发明的核酸序列且所述序列与能够指导所述多肽在适宜的表达宿主中表达的一个或多个控制序列可操作相连。
在第五个方面，本发明涉及重组表达载体，其包含本发明的核酸构建体、启动子、转录和翻译终止信号。
在第六个方面，本发明涉及含本发明核酸构建体的重组宿主细胞。
本发明还涉及生产本发明多肽的方法；生产食物的方法和本发明多肽在生产食物方面的用途以及含本发明多肽的洗涤剂组合物。
附图简述


图1显示质粒pFUKU-Ruben。
图2显示当分别用乙酸缓冲液和磷酸缓冲液检测时，本发明多肽的pH图谱。
图3显示本发明多肽的温度图谱(从30℃-75℃)。
图4显示本发明多肽的热稳定性(从50℃-75℃)。
本发明详述定义本文所用的术语“α-葡聚糖”指α-1，4-葡聚糖(含麦芽糖作为组成型二糖单位的具有链结构的多糖)或具有α-1，6-支链结构的α-1，4-葡聚糖。所述α-葡聚糖的实例包括直链淀粉、支链淀粉、淀粉、糖原、蜡状淀粉、高直链淀粉、可溶性淀粉、糊精、水解的淀粉产物和用磷酸化酶酶促合成的支链淀粉。
在本发明上下文中，术语“环状葡聚糖”指仅具有α-1，4-糖苷键的环状α-1，4-葡聚糖和同时具有α-1，4-糖苷键及α-1，6-糖苷键的支链环状葡聚糖。术语“支链”指有至少一个不同于α-1，4-键的糖苷键的α-葡聚糖(无论是否环状)。支链环状葡聚糖的实例包括在环状结构中含具有α-1，6-键之支链结构的内支链环状葡聚糖，以及在环状结构外还含有非环状结构部分的外支链环状葡聚糖。
本文所用术语“葡聚糖转移酶活性”或“活性”指通过所述多肽在65℃作用于含0.86％(w/v)麦芽三糖和20mM磷酸钠(pH7.0)的溶液10分钟时所产生的葡萄糖量而测定的多肽活性。将1单位酶活性定义为用上述条件每分钟释放1μmol葡萄糖所需的多肽量。
如本文所定义的，“分离的多肽”是基本上没有其它多肽的多肽。因此，“分离的多肽”按SDS-PAGE测定，应至少约20％纯，优选至少约40％纯，更优选至少约60％纯，进一步优选至少约80％纯，最优选至少约90％纯，特别优选至少约95％纯。
本文所用术语“分离的核酸序列”指基本上没有其它核酸序列的核酸序列。因此，“分离的核酸序列”按琼脂糖电泳的测定，应至少约20％纯，优选至少约40％纯，更优选至少约60％纯，进一步优选至少约80％纯，最佳至少约90％纯。
在本发明上下文中，术语“表达”包括与多肽生产有关的任何步骤，包括，但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
“核酸构建体”在本文定义为单链或双链核酸分子，其分离自天然基因或已被修饰从而含有以天然情况下不存在的方式组合和相连的核酸片段。当所述核酸构建体含有表达本发明之编码序列所需的所有控制序列时，术语“核酸构建体”与“表达盒”是同义词。
本文将术语“编码序列”定义为直接说明其蛋白质产物之氨基酸序列的核酸序列。编码序列的界限通常由mRNA 5’末端紧邻开放阅读框上游的核糖体结合位点(原核细胞)或ATG起始密码子(真核细胞)和mRNA 3′末端紧邻开放阅读框下游的转录终止序列确定。编码序列可包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
本文所用的术语“控制序列”包括表达本发明多肽所必需的或有利的所有组分。
本文将术语“有效连接”定义为将控制序列放在相对于DNA序列中编码序列的适宜位置以便所述控制序列指导多肽表达的一种构型。
本文所用术语“宿主细胞”包括亲本细胞的因复制过程发生突变而与该亲本细胞不同的任何子代细胞。
具有葡聚糖转移酶活性之多肽改善食品的用途本发明多肽通过作用于食物中的淀粉而催化淀粉的环化反应。结果，降低了食物中淀粉分子的大小并产生环状葡聚糖。由该反应产生的环状葡聚糖有低粘度、高可溶性、抑制淀粉逆行的能力以及包括各种物质的能力。因此通过使用本发明多肽可改善食物。通常可以使本发明的多肽作用于食物中的淀粉以积累环状葡聚糖，由此，可改善食品的物理特性，例如贮存过程中的稳定性以及口感的改进。在生物体内环状葡聚糖很容易降解成葡萄糖，因此，环状葡聚糖具有良好的可降解性以及高能量转化效率。
将本发明多肽用于改善各种含淀粉食物，包括日本餐后甜点(例如，欧洲蕨大米饼、大米饼、大米果冻和大米豆饼)，点心(例如，日本薄脆饼干、马铃薯薄片和其它点心)，小麦食品(例如，面包、馅饼、比萨饼、蛋糕、小甜点、饼干和薄脆)，面条(例如，小麦面条、荞麦面条、奶酪面条和意大利面食例如意大利面条和通心面)，gyoza skins，shumai skins，加工的海味(例如鱼棒和鱼酱蛋糕)，冷冻的或冷藏的加工食品，断奶食品，婴儿食品，宠物食品，动物饲料，饮料(例如运动饮料)，运动食品和营养补充食品。
含大量淀粉的大米食品、日本餐后甜点、点心、小麦食品和面条是可应用本发明的优选食品的实例。其它优选食品的实例是其中在低温贮存过程中稳定性很重要的冷冻或冷藏的加工食品。
本文所用术语“食物材料”指产生上述食品的任何材料，以及在食品加工过程中提供的任何制品。
通过检测食品中淀粉的分子大小是否因环状葡聚糖的产生而降低，可确定应用了本发明多肽的食品是否得到改善。
分别含本发明多肽的食品材料、食品添加剂组合物和食品改善剂也在本发明范围内。食品添加剂包括调味品(例如酱油、酱油调味液(dip)、辣酱油(Worcester sauces)、肉汤基料(broth bases)、炖煮基料、咖哩基料、汤料基料、蛋黄酱、调味品、蕃茄酱和组合调味品)。食品改善剂的实例包括抗逆行剂(anti-retrogradation agents)和用于蒸过的米的改善剂。
含具有葡聚糖转移酶活性之多肽的洗涤剂组合物由于现有洗涤剂很难除去淀粉斑，例如直链淀粉斑，因此，设想本发明的多肽由于能催化已结晶的淀粉，例如直连淀粉改变为更易溶于水的环状化合物，而用于所述洗涤剂中。
因此，本发明还涉及含本发明多肽的清洁或洗涤剂组合物；本发明多肽用于除去淀粉斑、特别是用于除去直连淀粉斑的用途；以及用于从硬表面或衣物上除去淀粉斑，特别是除去直连淀粉斑的方法，所述方法包括将含直连淀粉斑的硬表面或含直连淀粉斑的衣物与本发明多肽或本发明的清洁或洗涤剂组合物接触。
这类清洁和洗涤剂组合物在本领域已有很多描述，对适宜清洁和洗涤剂组合物的进一步描述可参考WO 96/34946；WO 97/07202；WO 95/30011。
洗涤剂组合物可将本发明的酶加入洗涤剂组合物并因此使之成为其中的组分。
本发明的洗涤剂组合物可以例如配成手洗或机洗的洗涤剂组合物，该组合物包括一种适于脏织物预处理的洗衣添加剂组合物和一种增加织物柔软度的漂洗组合物，或者配成一种用于一般家用坚硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或者配成手或机器洗碗操作中使用的洗涤剂。
在一个具体方面，本发明提供一种含有本发明的酶的洗涤剂添加剂。所述洗涤剂添加剂和洗涤剂组合物可以含有一种或多种其它的酶如蛋白酶、脂肪酶、角质酶(cutinase)、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶和/或过氧化物酶。
通常所选酶的特性应当与所选洗涤剂相容，(即，pH最适值，同其它酶组分和非酶组分的相容性等)，并且所述酶应当以有效量存在。蛋白酶合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的蛋白酶。优选微生物来源。化学修饰型或蛋白质工程化的突变体也可包括在内。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草蛋白酶，尤其源自芽孢杆菌属的枯草蛋白酶，例如枯草蛋白酶Novo、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168(WO89/06279所述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是WO89/06270和WO94/25583中所述的胰蛋白酶(例如，来源于猪或牛)和镰孢属(Fusarium)蛋白酶。
有效蛋白酶的实例是WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116和WO98/34946中所述变体，尤其是在一个或多个下列位置具有置换的变体27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。
优选市售蛋白酶包括Alcalase、Savinase、Primase、Duralase、Esperase和Kannase(Novo Nordisk A/S)、Maxatase、Maxacal、Maxapem、Properase、Purafect、Purafect OxP、FN2、和FN3(Genencor InternationalInc.)。
脂肪酶合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的脂肪酶。化学修饰的或蛋白质工程化的突变体也包括在内。有效脂肪酶的实例有腐质霉属(Humicola)(同义词Thermomyces)的脂肪酶，如来自EP 258068和EP 305216所述H.lanuginosa(T.lanuginosus)或WO96/13580所述H.insolens；假单胞菌脂肪酶，如来自产碱假单胞菌或P.pseudoalcaligenes(EP 218272)、洋葱假单胞菌(EP331376)、司徒茨假单胞菌(GB 1372034)、荧光假单胞菌、假单胞菌属菌株SD705(WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)；芽孢杆菌脂肪酶，如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等，(1993)，Biochemica etBiophysica Acta，1131，253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短芽孢杆菌(WO 91/16422)。
其它实例是脂肪酶变体，如WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202所述的脂肪酶变体。
优选市售脂肪酶包括LipolaseTM和Lipolase UltraTM(Novo NordiskA/S)。
淀粉酶合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌和真菌来源的淀粉酶。化学修饰的或蛋白质工程化的突变体也包括在内。淀粉酶包括，例如从芽孢杆菌(如GB1296839所述地衣芽孢杆菌菌株)中获得的α-淀粉酶。有效的α-淀粉酶的实例是WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873和WO97/43424所述变体，尤其是在一个或多个下列位置上具有置换的变体15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。
市售淀粉酶有DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM和BANTM(NovoNordisk A/S)、RapidaseTM和PurastarTM(Genencor International Inc.)。
纤维素酶合适的纤维素酶包括细菌和真菌来源的纤维素酶。化学修饰的或蛋白质工程化的突变体也包括在内。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、草根霉属、支顶孢属的纤维素酶，例如产自US4435307、US5648263、US5691178、US5776757和WO89/09259中所公开的Humicola isolens、嗜热毁丝霉和尖孢镰孢的真菌纤维素酶。
特别合适的纤维素酶是具有颜色保护优点的碱性或中性纤维素酶。这种纤维素酶的实例是EP0495257、EP0531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中所述的纤维素酶。其它实例是纤维素酶变体如WO94/07998、EP0531315、US5457046、US5686593、US5763254、WO95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中所述的那些变体。
市售纤维素酶包括Celluzyme和Carezym(Novo Nordisk A/S)，Clazinase和Puradax HA(Genencor International Inc.)，及KAC-500(B)(KaoCorporation)。
过氧化物酶/氧化酶合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的过氧化物酶/氧化酶。化学修饰的或蛋白质工程化的突变体也包括在内。有效的过氧化物酶实例包括来自Coprinus，例如来自C.cinereus的过氧化物酶及其在WO93/24618、WO95/10602和WO98/15257中所述的变体。
市售过氧化物酶包括Guardzme(Novo Nordisk A/S)。
洗涤剂组合物中可包含去污酶，方式是加入分别含一或多种酶的不同添加剂，或加入含所有这些酶的组合添加剂。本发明的洗涤添加剂，即独立添加剂或组合添加剂可配制成颗粒、液体、浆等。优选的洗涤添加剂形式是颗粒(特别是不起尘的颗粒)，液体(特别是稳定的液体)，或浆。
不起尘的颗粒可以如US4106991和4661452中所公开的来生产，并可以任选通过本领域已知方法加涂层。蜡涂材料的实例是平均摩尔量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚；其中醇含有12至20个碳原子并且其中存在15至80个环氧乙烷单位的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；及脂肪酸的单-和双-和甘油三酯。适于通过流体床技术来应用的成膜涂层材料的实例在GB1483591中给出。液体酶预制剂可以按已有方法通过加入多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定。被保护的酶可以按照EP238216中的方法来生产。
本发明的洗涤剂组合物可以是任何适当的形状，例如条状、片状、粉状、颗粒状、糊状或液体。液体洗涤剂可以是含水型(通常含有高达70％的水和0-30％的有机溶剂)，或不含水型。
洗涤剂组合物含有一种或多种表面活性剂，其可以是非离子型(包括半极性形式)和/或阴离子型和/或阳离子型和/或两性离子型。表面活性剂通常占总重量的0.1％至60％。
当包含在其中时，所述洗涤剂通常含有约1％至约40％的阴离子表面活性剂如线性烷基苯磺酸盐、α-烯属磺酸酯、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸酯)、脂肪醇乙氧基硫酸盐、仲链烷磺酸盐(alkanesulfonate)、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或链烯基琥珀酸或(肥)皂。
当包括其中时洗涤剂通常含有约0.2％至40％的非离子表面活性剂如脂肪醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷(polyglycoside)、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基脂肪酸单乙醇胺、脂肪酸单乙醇胺、多羟基烷基脂肪酸胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“glucamide”)。
洗涤剂可含有0-65％的洗涤助洗剂或络合剂如沸石、二磷酸、三磷酸盐、膦酸酯、碳酸盐、柠檬酸盐、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或链烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或分层硅酸盐(例如来源于Hoechst的SKS-6)。
洗涤剂可含有一种或多种聚合物。实例是羧甲基纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯基醇)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧化物如聚丙烯酸类、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
所述洗涤剂可含有漂白系统，其可含有H2O2源如过硼酸盐或过碳酸盐，所述H2O2源可以同过酸-形成漂白激活剂如四乙酰基乙二胺或壬酰氧苯磺酸类进行混合。或者，漂白系统可以含有过氧酸的例如酰胺、亚胺或砜形式。
本发明的洗涤剂组合物中的酶可以采用传统的稳定剂来进行稳定，所述稳定剂是，例如多元醇如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香硼酸酯或苯基硼酸衍生物如4-甲酰苯基硼酸，并且所述组合物可以按照WO92/19709和WO92/19708中所述进行配制。
洗涤剂也可含有其它传统的洗涤剂成分如织物调节剂，这些有粘土、增泡剂、抑泡剂、抗腐蚀剂、污垢悬浮剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀菌剂、增白剂、水助溶剂、抑锈剂或香料。
根据本发明的设计，任何酶，特别是本发明的酶可以以相当于每升洗涤液0.01-100mg酶蛋白，优选每升洗涤液0.05-5mg酶蛋白，特别优选每升洗涤液0.1-1mg酶蛋白的量加到所述洗涤剂组合物中。
还可将本发明的酶加至WO97/07202(引入作为参考)中公开的洗涤剂配方中。
具有葡聚糖转移酶活性的多肽在本发明的第一个实施方案中，分离的多肽具有与SEQ ID NO2的氨基酸1-501(即成熟多肽)至少65％同一性的氨基酸序列。在本发明的一个令人感兴趣的实施方案中，所述多肽与SEQ ID NO2的氨基酸1-501有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性(下文称为“同源多肽”)。
在一优选的实施方案中，同源多肽具有与SEQ ID NO2的氨基酸1-501有5个氨基酸不同，例如4个氨基酸不同，例如3个氨基酸不同，如2个氨基酸不同或1个氨基酸不同的氨基酸序列。
用可有效进行蛋白质和DNA的对比排列的完整Smith-Waterman对比排列法完成序列排列和同一性分值的计算。分别将默认评分矩阵BLOSUM50和同一性矩阵用于蛋白质和DNA的对比排列。对于蛋白质来说，缺口中第一个残基的罚分为-12，对于DNA来说，则为-16。而对于蛋白质来说，缺口中其它残基的罚分为-2，而对于DNA来说，则为-4。对比排列使用fasta软件包v20u6版本(W.R.Pearson and D.J.Lipman(1988)，″Improved Tools forBiological Sequence Analysis″，PNAS 852444-2448，and W.R.Pearson(1990)″Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA″Methods inEnzymology 18363-98)。
将具有SEQ ID NO2的氨基酸1-501之氨基酸序列的葡聚糖转移酶与最接近的现有技术进行对比排列，即与具有EP 0 884 384中公开之序列的葡聚糖转移酶使用上述方法进行排列，得到下列同一性百分比氨基酸序列间的同一性％为62.5％，核酸序列间的同一性％为65.5％。
优选，本发明多肽含有SEQ ID NO2的氨基酸1-501，其等位基因变体或其具有葡聚糖转移酶活性的片段。显然，本发明多肽还可由SEQ ID NO2的氨基酸1-501所示氨基酸序列组成。
等位基因变体指占据相同染色体座位之基因的任何两种或多种不同形式。等位基因变体通常通过突变产生，导致种群内产生多样性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
在本发明的第二个实施方案中，分离的多肽是由在低严紧度条件下，优选，在中等严紧度条件下，更优选在高严紧度条件下与下列序列杂交之核酸编码的分离的多肽(i)SEQ ID NO1的核苷酸1-1503，或(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列(J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatus，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d edition，Cold Spring Harbor，NewYork)。
SEQ ID NO1中核苷酸1-1503所示核酸序列的互补链的亚序列可以至少是100个核苷酸或优选至少200个核苷酸。此外，所述亚序列应编码具有葡聚糖转移酶活性的多肽片段。所述多肽还可以是具有葡聚糖转移酶活性之多肽的等位基因变体或片段。
按照本领域熟知的方法，可以用SEQ ID NO1或其亚序列的核酸序列以及SEQ ID NO2或其片段的氨基酸序列设计核酸探针以鉴定和克隆编码来自不同属或种之菌株的具有葡聚糖转移酶活性之多肽的DNA。具体地说，可以用所述探针与所研究属或种的基因组或cDNA杂交，然后进行标准Southern印迹法，以便鉴定和分离其中相应的基因。所述探针可明显短于完整序列，但应为至少15个，优选至少25个，更优选至少35个核苷酸长。也可以施用较长的探针。DNA和RNA探针均可使用。通常将所述探针标记以检测相应的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白)。所述探针包括在本发明范围内。
因此，可以在从所述其它生物体制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选与上述探针杂交并编码具有葡聚糖转移酶活性之多肽的DNA。通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或本领域技术人员已知的其它分离技术可以从所述生物体中分离基因组DNA或其它DNA。将来自所述文库的DNA或分离的DNA转移并固定在硝酸纤维素或其它适宜的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO1或其亚序列同源的克隆或DNA，在Southern印迹中使用所述载体材料。就本发明目的而言，杂交指在低至高严紧度条件下，与对应于SEQ ID NO1所示核酸序列、其互补链、或其亚序列的标记型核酸探针杂交的核酸序列。用X-射线胶片检测在这些条件下与所述核酸探针杂交的分子。
在第二个令人感兴趣的实施方案中，所述核酸探针是编码SEQ ID NO2的(成熟)多肽或其亚序列的核酸序列。在第三个令人感兴趣的实施方案中，所述核酸探针是SEQ ID NO1。在第四个令人感兴趣的实施方案中，所述核酸探针是SEQ ID NO1的成熟多肽编码区。在第五个令人感兴趣的实施方案中，所述核酸探针是包含在质粒pFuKu-Ruben中的核酸序列，该质粒包含在大肠杆菌DSM 13049中，其中所述核酸序列编码具有葡聚糖转移酶活性的多肽。在第六个令人感兴趣的实施方案中，所述核酸探针是包含在质粒pFuku-Ruben中的成熟多肽的编码区，所述质粒包含在大肠杆菌DSM13049中。
对于至少100个核苷酸长的探针来说，将低至高严紧度条件定义为在42℃ 5×SSPE、0.3％ SDS，200μg/ml剪切并变性的鲑精DNA，以及对于低严紧度来说25％甲酰胺、对于中严紧度来说35％甲酰胺或对于高严紧度来说50％甲酰胺中，根据标准Southern印迹分析进行预杂交和杂交。
对于至少100个核苷酸长的探针来说，最终用2×SSC、0.2％ SDS，优选在至少50℃(低严紧度)，更优选在至少55℃(中严紧度)，最佳在至少65℃(高严紧度)下将载体材料洗涤3次，每次15分钟。
对于约15至约70个核苷酸长的短探针来说，将严紧度条件定义为在相对于按照Bolton和McCarthy(1962，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 481390)计算的理论Tm低5℃-10℃的温度下，在0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl pH7.6、6mM EDTA、0.5％ NP-40、1×Denhardt′s溶液、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸氢二钠、0.1mM ATP和0.2mg酵母RNA/ml中，根据标准Southern印迹分析进行预杂交，杂交，和杂交后洗涤。
对于约15至约70个核苷酸长的短探针来说，将载体材料在低于理论Tm5℃-10℃的温度下，在6×SCC+0.1％ SDS中洗涤1次，15分钟，然后用6×SSC洗涤2次，每次15分钟。
如上文所说明的，本发明的多肽可以是具有SEQ ID NO2之氨基酸序列的多肽或其成熟多肽，其中一个或多个氨基酸已由另一(或多个)氨基酸取代，其中已缺失和/或插入一个或多个氨基酸。
优选，氨基酸改变是微小性质的改变，即不会显著影响所述蛋白质折叠和/或活性的保守氨基酸取代；小缺失，通常缺失1-约30个氨基酸；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基-末端甲硫氨酸残基；最多约20-25个残基的小接头肽；有利于通过改变净电荷或另一功能，例如聚-组氨酸序列、抗原表位或结合结构域而纯化的小的延伸。
保守取代的实例是下组内的取代碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小分子氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的，如H.Neurath and R.L.Hill，1979，In，The Proteins，Academic Press，New York所述。最常发生的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly以及其相反的取代。
在本发明非常令人感兴趣的实施方案中，所述多肽是热稳定性的，即本发明多肽在升高的温度下仍保持了其酶活性。
因此，本发明人已开发了一种本领域技术人员很容易使用的适宜的初步检测以评估一种分离的多肽是否可以被认为是热稳定的。因此，当按本文所述检测时，特别优选的多肽是在67℃，优选在70℃，在20mM磷酸盐缓冲液，pH7.0中保温10分钟后仍保持了至少75％活性，例如至少80％活性，例如至少85％，优选至少90％，例如至少95％，特别是基本上全部活性的多肽。在这种意义上，应理解100％活性指前述的葡聚糖转移酶活性，即上述百分比值是在65℃，20mM磷酸盐缓冲液，pH7.0中保温10分钟后相对于所述多肽活性而测定的。
所述酶优选应有6-8的最佳pH，特别优选约6.5-约7.5，例如约6.75-约7.25，例如约7。
此外，本发明多肽优选通过作用于α葡聚糖，例如直链淀粉，而能通过分子内的转糖基反应产生环状葡聚糖。另外，本发明多肽优选应通过作用于包含支链结构，即具有α-1，6-键的α-葡聚糖，例如支链淀粉，而能够产生支链环状葡聚糖。
此外，同样被认为在本发明范围内的多肽是优选纯化形式的分离的多肽，其与具有SEQ ID NO2之氨基酸序列的多肽或其成熟多肽具有免疫化学同一性或部分免疫化学同一性。免疫化学特性通过熟知的Ouchterlony双向免疫扩散方法经免疫学交叉反应同一性试验确定。具体地说，按照Harboe和Ingild在In N.H.Axelsen，J.Krll，and B.Weeks，editors，A Manual ofQuantitative Immunoelectrophoresis，Blackwell Scientific Publications，1973，Chapter 23，or Johnstone and Thorpe，Immunochemistry in Practice，BlackwellScientific Publications，1982(更具体的页数为27-31)所述的方法免疫接种兔(或其它啮齿动物)制备含多克隆抗体的抗血清，所述多克隆抗体可与具有SEQ ID NO2之氨基酸序列的多肽或其成熟多肽的表位发生免疫反应性或与所述表位结合。具有免疫化学同一性的多肽是以相同的方式与所述抗血清反应的多肽，所述方式如沉淀物的完全融合、相同的沉淀物形态学和/或利用特定免疫化学技术的相同的电泳迁移率。免疫化学同一性的进一步解释见Axelsen，Bock和Kroll在In N.H.Axelsen，J.Krll，and B.Weeks，editors，A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis，Blackwell ScientificPublications，1973，Chapter 10。具有部分免疫化学同一性的多肽是以部分相同的方式与所述抗血清反应的多肽，如沉淀物的部分融合、部分相同的沉淀物形态学和/或利用特定免疫化学技术的部分相同的电泳迁移率。有关部分免疫化学同一性的解释见Bock和Axelsen在In N.H.Axelsen，J.Krll，and B.Weeks，editors，A Manual ofQuantitative Immunoelectrophoresis，BlackwellScientific Publications，1973，Chapter 11。
所述抗体还可以是单克隆抗体。可按照E.Harlow和D.Lane，editors，1988，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，New York所述的方法制备和使用单克隆抗体。
总之，本发明的多肽优选具有下述多肽的葡聚糖转移酶活性的至少20％，所述多肽具有SEQ ID NO2的氨基酸1-501所示氨基酸序列。
特别优选的是具有下述多肽的葡聚糖转移酶活性的至少30％，例如至少40％，例如至少50％，优选至少60％，例如至少70％，例如至少80％，更优选至少90％或至少95％的多肽，其中所述多肽含有SEQ ID NO2的氨基酸1-501所示氨基酸序列。
本发明多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明目的而言，本文所用术语“获得自”与给定来源联用时应指，由核酸序列编码的多肽是由已插入了来自所述来源的核酸序列的一种来源或细胞产生。在优选的实施方案中，所述多肽被分泌到细胞外。
在一本发明令人感兴趣的实施方案中，本发明多肽可衍生自栖热菌属(Thermus)，特别是衍生自红色栖热菌(Thermus rubens)，例如红色栖热菌ATCC 31556。
本发明人已从红色栖热菌ATCC 31556中分离出编码具有葡聚糖转移酶活性之多肽的基因并将其插入大肠杆菌DH12S中。按照用于专利程序目的的国际认可的微生物保藏的布达佩斯条约，在1999年9月20日将含所述基因的大肠杆菌菌株保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心，Mascheroder Weg 1 B，D-38124 Braunschweig，保藏号为DSM 13049。
因此，在本发明进一步的实施方案中，本发明的多肽是由克隆到大肠杆菌DSM 13049的质粒中的葡聚糖转移酶编码部分的DNA编码的多肽，或与所述多肽具有至少65％同一性的变体。就所述变体而言，优选所述变体多肽与由克隆到大肠杆菌DSM 13049中的质粒中的葡聚糖转移酶编码部分的DNA编码的多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性。
本发明多肽可以是细菌多肽。例如所述多肽可以是革兰氏阳性菌的多肽，例如芽孢杆菌属(Bacillus)的多肽，如嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophisus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的多肽；或链霉菌属(Streptomyces)的多肽，如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)的多肽；或革兰阴性细菌例如大肠杆菌(E.coli)或假单胞菌属细菌(Pseudomonas sp)的多肽。
本发明多肽可以是真菌多肽，更优选酵母多肽，如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或Yarrowia的多肽；或更优选丝状真菌多肽，如支顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短柄霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix、链孢霉属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、草根霉属(Thielavia)、Tolypocladium、或木霉属(Trichoderma)多肽。
在优选的实施方案中，所述多肽是卡尔斯伯糖酵母(Sccharomycescarlsbergensis)、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化糖酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克鲁维糖酵母(Saccharomyces Kluyveri)、Saccharomyces norbensis、或卵型糖酵母(Saccharomyces oviformis)的多肽。
在另一优选的实施方案中，所述多肽是棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、玫瑰色镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Trichodermaharzianum、康宁氏木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei、或绿色木霉(Trichoderma viride)的多肽。
应理解对于前述物种，本发明包括完美和不完美的状态以及其他分类学等同物，例如无性型，而不论它们是以何种种名已知。本领域技术人员很容易确定相应等同物的同一性。
这些种的菌株很容易从各种收集中心，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSM)、真菌菌种保藏中心(CBS)和农业研究服务专利培养物保藏中心(Agricultural Research ServicePatent Culture Collection)、北方地区研究中心(NRRL)获得。
此外，用上述探针可以从其他来源，包括分离自自然界(例如，土壤、堆肥、水等)的微生物中鉴定和获得所述多肽。从自然界分离微生物的技术是本领域熟知的。通过类似地筛选另一微生物的基因组或cDNA文库可一得到所述核酸序列。一旦用所述探针检测到了编码多肽的核酸序列后，用本领域技术人员熟知的技术(参见例如Sambrook等，1989，同上文)可以分离或克隆所述序列。
由本发明核酸序列编码的多肽还包括融合的多肽或可裂解的融合多肽，其中在所述多肽或其片段的N-末端或C-末端融合另一多肽。通过将编码另一多肽的核酸序列(或其部分)与本发明核酸序列(或其部分)融合生产融合的多肽。生产融合多肽的技术是本领域已知的，包括连接所述多肽的编码序列以便它们位于同一读码框中，然后在相同启动子和终止子控制下表达融合多肽。
核酸序列本发明还涉及编码本发明多肽的分离的核酸序列。
在一令人感兴趣的实施方案中，所述核酸序列与SEQ ID NO1的核苷酸1-1503所示的核酸序列有至少70％同一性。优选所述核酸序列与SEQ IDNO1的核苷酸1-1503所示的核酸序列有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在本发明另一令人感兴趣的实施方案中，所述核酸序列含有SEQ IDNO1的核苷酸1-1503所示的核酸序列或其等位基因变体，或其能够编码本发明多肽的片段。显然，所述核酸序列可由SEQ ID NO1的核苷酸1-1503所示的核酸序列组成。
在另一优选的实施方案中，所述核酸序列是已克隆到大肠杆菌DSM13049内质粒中之DNA序列的葡聚糖转移酶编码部分，或其与所述DNA序列有至少70％同一性的变体。就所述变体而言，优选所述变体DNA序列与已克隆到大肠杆菌DSM 13049内质粒中之DNA序列的葡聚糖转移酶编码部分有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％同一性。
本发明还包括编码具有SEQ ID NO2之氨基酸序列的多肽或其成熟多肽的核酸序列，所述核酸序列因遗传密码简并性而与SEQ ID NO1有所不同。本发明还涉及SEQ ID NO1的编码具有葡聚糖转移酶活性之SEQ IDNO2片段的亚序列。
SEQ ID NO1的一个亚序列是包含在SEQ ID NO1的核苷酸1-1503中，但已从5′和/或3′末端缺失了一个或多个核苷酸的核酸序列。
本发明还涉及编码本发明多肽的分离的核酸序列，所述核酸序列在低严紧度条件下，优选在中等严紧度条件下，更优选在高严紧度条件下与下列序列杂交(i)SEQ ID NO1的核苷酸1-1503所示核酸序列的互补链，或(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列。本发明还涉及(i)、(ii)和(iii)的互补链。
用于分离或克隆编码多肽之核酸序列的技术是本领域已知的，包括从基因组DNA分离、从cDNA制备或其组合。例如通过熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选以检测具有共同结构特征的克隆化DNA片段，可从所述基因组DNA克隆本发明的核酸序列。参见，例如Innis等，1990，PCRA Guide to Methods and Application，Academic Press，New York.。可以使用其它核酸扩增方法例如连接酶链反应(LCR)，连接激活转录(LAT)以及以核酸序列为基础的扩增(NASBA)。可从红色栖热菌ATCC 31556或另一或相关生物体中克隆所述核酸序列，所述核酸序列还可例如是所述核酸的多肽编码区的等位基因变体或种变体。
例如通过遗传工程中所用的标准克隆方法可获得分离的核酸序列，使其从其天然位置再定位到可被复制的不同位置。所述克隆方法涉及切割并分离含编码所述多肽之核酸序列所需的核酸片段，将所述片段插入载体分子中，然后将该重组载体插入到能复制多拷贝核酸序列或核酸序列克隆的宿主细胞中。所述核酸序列可以是基因组的、cDNA、RNA、半合成的、合成的或其任何组合。
为了达到本发明的目的，按上述方法确定两个核酸序列间的同一性程度。
修饰编码本发明多肽的核酸序列对于合成与所述多肽基本相似的多肽是必需的。“基本相似”于所述多肽指所述多肽的非天然形式。这些多肽经基因工程改造而在一定程度上不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、最佳pH等方面有所不同的变体。可根据SEQ ID NO1的多肽编码部分指示的核酸序列构建变体序列，如其亚序列，和/或通过导入核苷酸取代来构建所述变体序列，所述核苷酸取代不产生由所述核酸序列编码的另一多肽的氨基酸序列，但对应于用于生产所述酶的宿主生物所偏好的密码子使用特点，或通过导入可产不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建所述变体序列。有关核苷酸取代的一般描述参见例如Ford等1991，Protein Expression and Purification 295-107。
对于本领域技术人员显而易见的是，可以在对于所述分子的功能非常重要的区域外进行所述取代，这样仍得到活性多肽。按照本领域已知的方法，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(参见例如Cunningham and Wells，1989，Science 24410811085)可鉴定对于本发明分离的核酸序列所编码之多肽的活性至关重要的氨基酸残基，因此优选不经过取代即可完成所述鉴定。在后一种技术中，在分子的每个正电荷残基处诱导突变，然后检测所得突变分子的葡聚糖转移酶活性以鉴定对于分子活性至关重要的氨基酸残基。底物-酶作用位点可通过对核磁共振分析、晶体照相术或光亲和标记等技术所测定的三维结构的分析来确定(参见例如de Vos等1992，Science 255306-312；Smith et al.，1992，Journal of Molecular Biology 224899-904；Wlodaver et al.，1992，FEBS Letters 30959-64)。
核酸构建体本发明还涉及含有与能够在适宜宿主细胞中指导所述多肽表达的一种或多种控制序列可操作相连的本发明核酸序列的核酸构建体。
可以以多种方式操作编码本发明多肽的分离的核酸序列以提供所述多肽的表达。在将核酸序列插入到载体中之前对其操作是优选或必需的，这取决于表达载体。用重组DNA方法修饰核酸序列的技术是本领域熟知的。
控制序列包括表达本发明多肽所必需或有利于其表达的所有组分。每个控制序列可以是编码所述多肽之核酸序列的天然的或外源的。所述控制序列包括，但不限于前导序列、聚腺苷酸序列、原肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。所述控制序列可带有用于导入特异性限制位点的接头，以便于将控制序列与编码多肽之核酸序列的编码区相连。
控制序列可以是适宜的启动子序列，一种由宿主细胞识别的用于表达所述核酸序列的核酸序列。启动子含有介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中有转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且所述启动子可得自编码与所述宿主细胞同源或异源之细胞外或细胞内多肽的基因。
用于指导本发明核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的适宜启动子的实例得自大肠杆菌lac操纵子，天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)，枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penp)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因，和原核生物β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 753727-3731)以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 8021-25)的启动子。其它启动子描述于“Useful Proteins fromrecombinant bacteria”in Scientific American，1980，24274-94；和in Sambrook等，1989，同上文。
用于指导本发明核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的适宜启动子的实例是得自米曲霉TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)基因的启动子，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的一种杂合启动子)，及其突变、截短的和杂合启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子得自啤酒糖酵母烯醇化酶(ENO-1)、啤酒糖酵母半乳糖激酶(GAL1)、啤酒糖酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)和啤酒糖酵母3-磷酸甘油激酶基因。Romanos等1992，Yeast 8423-488描述了用于酵母宿主细胞的其它有用的启动子。
所述控制序列还可以是适宜的转录终止序列，即可被宿主细胞识别以终止转录的序列。将终止子序列与编码所述多肽之核酸序列的3’末端可操作相连。在宿主细胞中有功能的任何终止子均可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子得自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α糖苷酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因。
用于酵母宿主细胞的优选终止子得自啤酒糖酵母烯醇化酶、啤酒糖酵母细胞色素C(CYC1)和啤酒糖酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因。Romanos等1992(同上文)描述了用于酵母宿主细胞的其它有用的终止子。
控制序列还可以是适宜的前导序列，即mRNA上对细胞的翻译很重要的非翻译区。前导序列被可操作的连接到编码异源多肽的核酸序列的5’端。任何在该细胞中有功能的前导序列都可以在本发明中使用。。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列得自米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶。
用于酵母宿主细胞的适宜前导序列得自啤酒糖酵母烯醇化酶(ENO-1)、啤酒糖酵母3-磷酸甘油酸激酶、啤酒糖酵母α因子和啤酒糖酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因。
控制序列还可以是聚腺苷酸序列，即与所述核酸序列3’末端可操作相连，且转录后可被宿主细胞作为向已转录的mRNA上添加聚腺苷酸残基的信号而识别的序列。在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸序列均可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸序列得自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α葡萄糖苷酶的基因。
Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 155983-5990描述了用于酵母宿主细胞的有用的聚腺苷酸序列。
控制序列还可以是信号肽编码区，其编码与异源多肽的氨基端相连的氨基酸序列，并且指导该编码的多肽进入细胞分泌途径。核酸序列的编码序列的5’端可以天然包含信号肽编码区，该区天然地和编码分泌性多肽的编码区的片段在翻译阅读框架内连接在一起。或者，编码序列的5’端可以包含相对于该编码序列外来的信号肽编码区。在编码序列没有天然包含信号肽编码区的序列中，需要外来信号肽编码区。或者，可以简单地用外来信号肽编码区替代天然信号肽编码区以提高多肽的分泌。信号肽编码区可以从曲霉属的葡糖淀粉酶或淀粉酶基因、或从根毛霉(Rhizomucor)属的脂肪酶或蛋白酶基因中得到。然而，指导表达的异源多肽进入细胞分泌途径的任何信号肽编码区，都可以在本发明中使用。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码区是得自芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α淀粉酶、地衣形芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣形芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因。Simonen和Palva，1993，MicrobiologicalReviews 57109-137描述了其它信号肽。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码区是得自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纤维素酶和Humicola lanuginosa脂酶的基因。
用于酵母宿主细胞的有用信号肽得自啤酒糖酵母α因子和啤酒糖酵母转化酶的基因。Romanos等1992(同上文)描述了其它有用的信号肽编码区。
控制序列还可以是编码位于多肽氨基末端之氨基酸序列的多肽编码区。所得的多肽已知为酶原或多肽原(在某些情况下为酶原)。多肽原通常是无活性的并可从所述多肽原通过催化或自我催化裂解而转变为成熟有活性的多肽。所述多肽编码区可得自枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、啤酒糖酵母α因子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)的基因。
当信号肽和前肽区都存在于多肽的氨基端时，前肽区与多肽的氨基端紧邻，而信号肽区和前肽区的氨基端紧邻。
还优选加入能调节与细胞生长相关的异源多肽表达的调控序列。调控系统的实例包括应答化学或物理刺激(包括在有调控化合物存在的情况下)而导致基因表达的开启或关闭的那些。原核生物系统中的调节序列包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是可以是基因扩增的序列。在真核生物系统中，这些包括存在氨甲蝶呤时扩增的二氢叶酸还原酶基因，以及有重金属时可扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码所述多肽的核酸序列应与所述调节序列可操作相连。
表达载体本发明还涉及含有本发明的核酸序列、启动子和转录及翻译终止信号的重组表达载体。可将上述各种核酸和调控序列连接在一起以生产一种重组表达载体，使其包含一个或多个方便的限制位点，所述位点能允许编码多肽的核酸序列在这类位点插入或置换。或者，本发明的核酸序列可以通过将该核酸序列或含有该核酸序列的核酸构建体插入适当表达载体来表达。在创建表达载体的过程中，可使编码序列在表达载体中与适当调控序列可操作性地连接以便表达。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其可方便地进行重组DNA操作并且能使核酸序列表达。载体的选择将主要决定于载体与引入了该载体的宿主细胞之间的相容性。载体可以是线性或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即以染色体外实体形式存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如质粒，染色体外元件，小染色体(minichrmosome)或人工染色体。载体可含有任何确保自我复制的手段。或者，载体可以是引入宿主细胞后整合到基因组中并与其整合的染色体一起复制的那种。此外，可使用单个载体或质粒，或一起含有待引入宿主细胞基因组中的全长DNA的两个或更多个载体或质粒，或转座子。
本发明的载体优选含有一个或多个选择性标记，其能容易地选择出转化细胞。一个选择性标记是一种基因，其产物能提供对杀生物剂或病毒的抗性、对重金属的抗性、原养型至营养缺陷型的转变等。细菌选择性标记的实例是来源于枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予了抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的标记。适合于酵母宿主细胞的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌细胞中使用的可筛选标志可以选自，但不限于，amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)，及它们的等同物。优选用于曲霉细胞中的为构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本发明的载体优选含有使所述载体可以稳定整合到宿主细胞基因组中或者可以在细胞中不依赖于细胞的基因组而自我复制的元件。
为了整合到宿主细胞基因组中，所述载体可依赖于编码多肽的核酸序列或载体上任何其它元件来通过同源或非同源重组而稳定整合到基因组中。或者，载体可能含有其它核酸序列，这些序列可指导通过同源重组整合进入宿主细胞基因组。其它核酸序列能够在染色体的精确位置使载体整合到宿主细胞基因组中。为了提高在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够量的与相应靶序列高度同源的核酸，例如100-1500个碱基对，优选400-1500个碱基对，最佳800-1500个碱基对，以便提高同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。
此外，整合元件还可以是非编码的或编码的核酸序列。另一方面，通过非同源重组可将载体整合到宿主细胞的基因组中。
为了进行自主复制，所述载体还可含有能够使载体在所研究的宿主细胞中自主复制的复制起始点。细菌复制起始点是实例是使载体可以在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起始点，使载体可以在芽孢杆菌中复制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起始点。用于酵母细胞的复制起始点的实例是2μ复制起始点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合，ARS4和CEN6的组合。复制起始点可以是带有突变的复制起始点，所述突变可以使其在宿主细胞中发挥温度敏感性的作用(参见例如Ehrlich，1978，Proceedings of the National Academyof Sciences USA 751433)。
可将一个以上拷贝的本发明核酸序列插入到宿主细胞中以提高基因产物的产率。通过将至少一个以上其它拷贝的序列整合到宿主细胞基因组中或者通过包括可扩增选择性标记基因与所述核酸序列，其中通过在存在适宜选择性标记的条件下列培养含扩增拷贝的选择性标记基因，由此增加了核酸序列的拷贝数的细胞可筛选所述细胞，这样可以使核酸序列拷贝数增加。
用于连接上述元件以构建本发明重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见例如Sambrook等，1989，同上文)。
宿主细胞本发明还涉及含有本发明核酸序列的重组宿主细胞，其优选在多肽的重组生产中使用。
将含有本发明核酸序列的载体引入宿主细胞中，使载体以上述染色体整合体的形式或自主复制的染色体外载体的形式维持。对宿主细胞的选择很大程度上决定于编码所述多肽的基因和它的来源。
宿主细胞可以是单细胞微生物，例如原核生物，或非单细胞微生物，例如真核生物。
有用的单细胞是细菌细胞如革兰氏阳性细菌包括，但不限于，芽孢杆菌，例如嗜碱性芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、Bacillus clausii、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌；或链霉菌细胞，例如，浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌，或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌和假单胞菌。在一个优选的实施方案中，细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在另一个优选的实施方案中，芽孢杆菌细胞是嗜碱性芽孢杆菌。
将表达载体引入细菌宿主细胞可通过原生质体转化(例见，Chang和Cohen，1979，分子普通遗传学168111-115)，通过利用感受态细胞(例见，Young和Spizizin，1961，细菌学杂志81823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，分子生物学杂志56209-221)，通过电穿孔(例见，Shigekawa和Dower，1988，生物技术6742-751)，或通过接合作用(例见，Koehler和Thorne，1987，细菌学杂志1695771-5278)而实现。
宿主细胞可以是真核细胞例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。在优选的实施方案中，所述宿主细胞是真菌细胞。此处所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、接合菌门(Zygomycota)(Hawksworth等在Ainsworth和Bisby真菌词典，第8版，1995，CAB国际，大学出版社，Cambridge，UK中进行了定义)、以及卵菌门(Oomycota)(被Hawksworth等引用，1995，出处同上，171页)和全部的产有丝分裂孢子的真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等，1995，出处同上)。
在更优选的实施方案中，真菌细胞是酵母细胞。此处所用的“酵母”包括产囊孢子酵母(ascosporogenous yeast)(Endomycetales)、产担子孢子酵母(basidiosporogenous yeast)、以及属于半知菌(Fungi Imperfecti)的酵母(Blastomycetes)。因为将来酵母的分类可能会有变化，就本发明而言，酵母应该按照酵母的生物学和活性(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.和Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中描述的那样定义。
在更优选的实施方案中，所述酵母宿主细胞是假丝酵母属、汉森酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、糖酵母属、裂殖酵母属、或Yarrowia的细胞。
在最优选的实施方案中，所述酵母宿主细胞是卡尔斯伯糖酵母、啤酒糖酵母、糖化糖酵母、Saccharomyces douglasii、克鲁维糖酵母、Saccharomycesnorbensis、或卵型糖酵母的细胞。在另一最优选的实施方案中，所述酵母宿主细胞是乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)的细胞。在另一最优选的实施方案中，所述酵母宿主细胞是Yarrowia lipolytica的细胞。
在另一最优选的实施方案中，所述真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌亚门(Eumycota)和卵菌亚门(如Hawksworth等，1995，出处同上所定义)的所有丝状形式。丝状真菌的特征是，具有由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖以及其它复合多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝的延长进行营养生长，碳分解代谢为专性需氧型。相反，酵母例如啤酒糖酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽而碳分解代谢为发酵型。
在甚至更优选的实施方案中，所述丝状真菌宿主细胞是包括但不限于支顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、链孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、草根霉属(Thielavia)、Tolypocladium、或木霉属(Trichoderma)的细胞。
在最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一最优选的实施方案中，所述丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、玫瑰色镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusariumvenenatum的细胞。在甚至更优选的实施方案中，丝状真菌亲本细胞是Fusarium venenatum(Nirenberg sp.nov.)细胞。在另一最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢霉、产紫青霉、Trichoderma harzianum、康宁氏木霉、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei、或绿色木霉细胞。
真菌细胞可通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁以其本身已知的方式再生等的过程来转化。用于转化曲霉属宿主细胞的适宜方法描述于EP 238 023和Yelton等，1984，Proceedings of the National Academyof Sciences USA 811470-1474。用于转化镰孢属的适宜方法见Malardier等1989，Gene 78147-156和WO 96/00787。酵母可用Becker和Guarente在Abelson，J.N.and Simon，M.I.，editors，Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology，Methods in Enzymology，Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito et al.，1983，Journal of Bacteriology 153163；以及Hinnen等1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 751920描述的方法转化。
生产方法本发明还涉及产生本发明多肽的方法，所述方法包括(a)培养栖热菌属的菌株以生产含所述多肽的上清液；和(b)回收所述多肽。优选所述菌株是红色栖热菌的菌株，更优选是红色栖热菌ATCC 31556。
本发明还涉及产生本发明多肽的方法，所述方法包括(a)在可导致所述多肽产生的条件下培养上述重组宿主细胞；和(b)从所述细胞和/或培养基中回收所述多肽。
在本发明的生产方法中，使用本领域已知的方法，在适于生产该多肽的营养培养基中培养这些细胞。例如，该细胞可以在实验室或工业发酵罐中，用适当的培养基，在允许多肽表达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批、或固态发酵)进行培养。使用本领域已知的方法，在含有碳和氮源以及无机盐的适当培养基中进行培养。适当的培养基可以从供应商处得到，或者可以根据已经公布(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)的组成来制备。如果该多肽分泌至营养培养基中，可直接从该培养基回收多肽。如果该多肽未被分泌，可从细胞裂解物回收。
这些多肽可以用本领域已知的、对所述多肽特异的方法来检测。这些检测方法可以包括特异性抗体的使用、酶产物的形成、或酶底物的消失。例如，可以用酶试验测定此处所述的多肽的活性。
产生的多肽可以通过本领域已知的方法进行回收。例如，该多肽可以通过传统程序从培养基中回收，包括但不限于，离心、过滤、提取、喷雾干燥(spray-drying)、蒸发、或沉淀。
该多肽可以通过本领域已知的各种方法进行纯化，包括但不限于，层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦、和大小排阻层析)、电泳方法(例如，制备型等电聚焦)、差异溶解(differential solubility)(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见，例如，蛋白纯化，J.-C.Janson和Lars Ryden编辑，VCH出版社，纽约，1989)。
植物本发明还涉及用编码具有葡聚糖转移酶活性之多肽的核酸序列转化的转基因植物、植物部分或植物细胞以便以可回收的数量表达并生产所述多肽。可从植物或植物部分回收所述多肽。或可用含所述重组多肽的植物或植物部分例如改善食品或饲料的质量，例如提高营养价值、适口性和流变特性或破坏抗营养因子。
所述转基因植物可以是双子叶的(a dicot)或单子叶的(a monocot)。例如，单子叶植物的实例是草，例如草地早熟禾(蓝草、早熟禾属(Poa))、草料草例如festuca、lolium、温带草(temperate grass)，例如剪股颖属(Agrostis)和谷类植物，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、和玉米。
双子叶植物的实例是烟草、豆类，例如羽扇豆、马铃薯、甜菜、豌豆、黄豆和大豆，以及十字花科植物(芸苔科(Brassicaceae))，例如花椰菜、油菜籽和近亲模型植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子和块茎。特定植物组织，例如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧物酶体和胞质也被认为是植物部分。此外，无论什么组织来源的细胞均可被认为是植物部分。
本发明还包括所述植物、植物部分和植物细胞的子代。
按照本领域已知的方法可以构建表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞。简而言之，通过将编码本发明多肽的一种或多种构建体掺入植物宿主基因组，然后使所得的修饰的植物或植物细胞繁殖成转基因植物或植物细胞可构建所述植物或植物细胞。
方便地，所述表达构建体是核酸构建体，所述核酸构建体含有与在所选植物或植物部分中表达所述核酸序列所需的适宜调节序列可操作相连的、编码本发明多肽的核酸序列。此外，所述表达构建体可含有用于鉴定所述表达载体已整合至其中的那些宿主细胞的选择性标记以及将所述构建体导入目标植物中所需的DNA序列(后者取决于所用的DNA导入方法)。
调节序列，例如启动子和终止子序列和任选的信号或转位序列的选择取决于例如何时、何处以及如何表达所述多肽。例如，当若编码本发明多肽之基因的表达可以是组成型或诱导型，或是发育、阶段或组织特异性的，且可将所述基因产物靶向至特异性的组织或植物部分例如种子或叶。调节序列可参见Tague等1988，Plant Physiology 86506。
对于组成型表达，可使用35S-CaMV启动子(Franck等，1980，Cell 21285-294)。器官特异性启动子可以是例如来自贮存库(sink)组织例如种子、马铃薯块茎和果实(Edwards & Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24275-303)或来自代谢库(sink)组织例如分生组织(Ito等1994，Plant Mol.Biol.24863-878)的启动子，种子特异性启动子例如来自稻的谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白启动子(Wu等1998，Plant and Cell Physiology 39885-889)，来自蚕豆(Vicia faba)的豆球蛋白B4和未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等，1998，Journal of Plant Physiology 152708-711)，来自种子油体蛋白的启动子(Chen等，1998，Plant and Cell Physiology 39935-941)，来自Brassica napus的贮存蛋白napA启动子，或本领域已知的任何其它种子特异性启动子，例如WO 91/14772描述的那些。此外，所述启动子可以是叶特异性启动子例如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等，1993，Plant Physiology102991-1000)，小球藻病毒腺苷酸甲基转移酶基因启动子(Mitra和Higgins，1994，Plant Molecular Biology 2685-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，Molecular and General Genetics 248668-674)或创伤诱导型启动子例如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，Plant Molecular Biology 22573-588)。
还可将启动子增强元件用于在植物中使所述酶的表达水平更高。例如，所述启动子增强元件可以是位于所述启动子和编码本发明多肽之核苷酸序列间的内含子。例如Xu等，1993，同上文公开了稻肌动蛋白1基因的第一内含子提高表达的用途。
选择性标记基因和所述表达构建体的任何其它部分可选自本领域可获得的其它相应基因。
将核酸构建体导入植物基因组可按照本领域已知的常规方法，例如土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、生物弹射(biolistic)转化和电穿孔(Gasser等，1990，Science 2441293；Porykus，1990，BiolTechnology 8535；Shimamoto et al.，1989，Nature 338274)。
目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumegaciens)-介导的转移是用于产生转基因双子叶植物的方法(有关综述，参见Hooykas and Schilperoort，1992，Plant Molecular Biology 1915-38)。也可用其转化单子叶植物，但通常优选用其它转化方法转化单子叶植物。目前，用于产生转基因单子叶植物的方法是对胚胎愈伤组织或正在发育的胚胎进行粒子(用转化DNA包被的显微金或钨颗粒)轰击(Christou，1992，Plant Journal 2275-281；Shimamoto，1994，Current Opinion Biotechnology 5158-162；Vasil et al.，1992，BiolTechnology 10667-674)。用于转化单子叶植物的另一种方法是基于Omirulleh等1993，PlantMolecular Biology 21415-428所述的原生质体转化。
转化后，按照本领域熟知的方法筛选其中已掺入所述表达载体的转化体，然后再生成完整植株。
本发明还涉及用于生产本发明多肽的方法，所述方法包括(a)在可导致所述多肽生产的条件下，培养含编码具有葡聚糖转移酶活性之多肽的核酸序列的转基因植物或植物细胞；和(b)回收所述多肽。
进一步通过下列非限制性实施例说明本发明。
材料和方法分子克隆技术描述于J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor，NewYork.
使用下列市售质粒/载体pT7 Blue(Invitrogen，Netherlands)和pBAD/Myc-HisB(Invitrogen，Netherlands)。
将下列菌株用于转化和蛋白质表达大肠杆菌DH12S(GIBCO BRL，LifeTechnologies，U.S.A.)。
用作缓冲液和底物的化学物质是至少试剂级的市售产品。
葡聚糖转移酶活性的确定按照改进过的Takaha等，在J.Biol.Chem.268，1391-1396(1993)中所述的方法确定葡聚糖转移酶活性底物溶液溶解于pH调整到7.0的20mM磷酸钠中的1％(w/v)麦芽三糖。
活性测量(1)在65℃预保温300μl底物溶液。
(2)加入50μl酶溶液，并在65℃保温10分钟。
(3)加入50μl 0.04 N NaOH，以终止反应。
(4)使所述溶液在室温静置10分钟以便使α-和3-葡萄糖端基异构体以达平衡。
(5)用Glucose B-检测试剂盒(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，Japan)确定释放的葡萄糖的量。
将1单位酶活性定义为在上述条件下每分钟释放1μmol葡萄糖所需的酶量。
实施例实施例1红色栖热菌葡聚糖转移酶基因探针的制备根据其它已公开的葡聚糖转移酶基因设计引物gt-1和gt-5，然后与来自红色栖热菌的基因组DNA一起用于聚合酶链反应(PCR)。在下列来源的葡聚糖转移酶中鉴定了上述葡聚糖转移酶基因Solanum tuberosum，登记号(AC)q06801J.Biol.Chem.268，1391-1396(1993)；丁酸梭菌NCIMB7423，AC 137384Microbiology 143(10)，3287-3294(1997)；大肠杆菌K-12，AC p15977Mol.Microbiol.2，473-479(1988)；人(Homosapiens)，AC p35573J.Biol.Chem.267，9294-9299(1992)；流感嗜血杆菌，AC p45176Science 269，496-512(1995)；肺炎链球菌，AC p29851Cell 31，327-336(1982)；集胞蓝细菌属菌株，AC p72785DNA Res.3，109-136(1996)；水生栖热菌，AC AB016244Appl.Environ.Microbiol.65，910-915(1999)；和布氏疏螺旋体，AC AE001127Nature 390，580-586(1997)。
PCR引物gt-15′-GGI GAY ATI CCI ATH TAY RTI GS-3′gt-55′-RTT RTC RTG IGT ICC IGT RTA-3′I＝肌苷R＝A或GY＝C或TH＝A或T或CS＝G或C在下列条件下完成PCR70μl H2O10μl 10X反应缓冲液15μl 25mM MgCl2
2μl Taq聚合酶(Boehlinger)2μl 25mM dNTPs1μl 模板(＞1μg)步骤194℃，75秒步骤294℃，45秒步骤352℃，45秒步骤472℃，90秒(步骤2-431个循环)步骤572℃，180秒在琼脂糖凝胶上分离PCR反应混合物，从其它公开的数据(参见上数参考资料)计算所扩增PCR片段的预期大小，大约为600bp。将这些片段用SuprecTM-01(TAKARA)进行凝胶纯化，然后用Takara连接试剂盒版本2连接到pT7Blue载体中。然后通过电穿孔将连接的混合物转化到大肠杆菌DH12S中。用限制酶消化检测来自所得转化体的质粒以确定红色栖热菌葡聚糖转移酶插入片段的大小。
实施例2红色栖热菌葡聚糖转移酶基因的克隆用所述插入片段作为红色栖热菌葡聚糖转移酶探针，对来自红色栖热菌的消化的基因组DNA进行Southern杂交以筛选用于产生亚克隆的适宜的限制酶。选出杂交的1.8kb Kpn I和Sac II片段以及杂交的1.6kb Sca I和Kpn片段用于葡聚糖转移酶基因亚克隆。分别用Kpn I-Sac II和Sea I-KpnI消化红色栖热菌基因组DNA。然后将这两种分离的片段从琼脂糖凝胶中切出，然后克隆至pBluescript SK(-)中。通过将连接的克隆转化到大肠杆菌DH12S细胞中来制备这两个文库。用Hybond-N+膜(Amersham PharmaciaBiotech，Japan)对这两个文库的转化体进行菌落转移，然后与DIG-标记的探针杂交。捡出阳性菌落，用PCR检测插入片段。制备来自所选菌落的质粒，然后通过ABI PRISMETM310 Genetic Analyzer测序。
实施例3表达载体的构建通过使用分别包括Nco I和Xba I限制位点的引物ruben-Nco和ruben-Xba，从红色栖热菌基因组DNA扩增完整葡聚糖转移酶基因。用Nco I和Xba I切割PCR-扩增的片段使得可定向克隆到用Nco I和Xba I消化的pBAD/Myc-His A载体中。所得载体pFuku-ruben(示于
图1中)转化至TOP10大肠杆菌中并用阿拉伯糖诱导后，产生本发明的多肽。
引物ruben-Nco用于扩增红色栖热菌葡聚糖转移酶基因的PCR引物(正向)。下划线的核苷酸导入Nco I位点5′-GCGCCATGGAACTCCAACGCGCTTTTG-3′ruben-Xba用于扩增红色栖热菌葡聚糖转移酶基因的PCR引物(反向)。下划线的核苷酸导入Xba I位点5′-GCGTCTAGATCAAGCGCGCTGGCTGGCCTC-3′另将含完整红色栖热菌葡聚糖转移酶编码核苷酸序列的pBAD/Myc-HisB转化到保藏在德国有关微生物和细胞培养物保藏中心，保藏号为DSM13049(见下文)的大肠杆菌DH12S中。
实施例4本发明多肽的表达红色栖热菌葡聚糖转移酶在用pFuku-ruben转化的TOP10大肠杆菌中异源表达。在28℃，将大肠杆菌细胞在含100μlg/ml氨苄青霉素的SB培养基中培养过夜。然后加入0.1％阿拉伯糖诱导表达。将细胞通过离心沉淀，然后重悬在20mM磷酸缓冲液(pH6.0)中。缓冲液的量相当于1/20生长培养基。然后对细胞进行超声处理，离心除去碎片。
实施例5pH图谱按上述将细胞提取物70℃预热10分钟，除去碎片，然后在65℃分析预处理的细胞提取物的葡聚糖转移酶活性。将两种不同的缓冲液用于底物溶液的制备4.5≤pH≤6.0醋酸钠缓冲液5.5≤pH≤8.5磷酸钠缓冲液如图2所示，本发明多肽的最佳pH为6.5-7.5。
实施例6温度图谱为了确定所述酶的温度图谱，按上述将细胞提取物70℃预热10分钟，除去碎片，然后在30-75℃，pH7.0，分析预处理的细胞提取物的葡聚糖转移酶活性。如图3所示，该酶的最佳温度为50℃-70℃。
实施例7热稳定性为了确定所述酶的热稳定性，按上述将细胞提取物在50-75℃间，以不同的温度预热10分钟，除去碎片，然后在65℃分析预处理的细胞提取物的葡聚糖转移酶活性。如图4所示，在70℃所述酶是稳定的，但此后所述酶的稳定性急剧降低。
生物材料的保藏根据布达佩斯条约，下列生物材料已保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(Mascheroder Weg 1 B，D-38124 Braunschweig)并给出下列保藏号。
保藏物登记号保藏日大肠杆菌DH12S pFuku-Ruben DSM 13049 1999年9月20
序列表<110>诺沃挪第克公司(Novo Nordisk A/S)<120>具有葡聚糖转移酶活性的多肽和编码该多肽的核酸<130>6012.204-WO<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1503<212>DNA<213>红色栖热菌(Thermus rubens)<220><221>CDS<222>(1)..(1503)<400>1atg caa ctc caa cgc gct ttt gga att ttg ctc cac ccc acc agt ttt 48Met Gln Leu Gln Arg Ala Phe Gly Ile Leu Leu His Pro Thr Ser Phe1 5 10 15ccg ggt cgc tgg ggg att ggg gct ctg ggc cgc gag gcc gag cgg ttt 96Pro Gly Arg Trp Gly Ile Gly Ala Leu Gly Arg Glu Ala Glu Arg Phe20 25 30ttg gac tgg ctg gcc gat gcg gga gcc cgc tgg tgg cag gtc tta ccg 144Leu Asp Trp Leu Ala Asp Ala Gly Ala Arg Trp Trp Gln Val Leu Pro35 40 45ctg ggc cct acc agt tac ggc gac tcg ccg tac cag tcc ttc tcg gct 192Leu Gly Pro Thr Ser Tyr Gly Asp Ser Pro Tyr Gln Ser Phe Ser Ala50 55 60ttt gcc ggt aac ccg tat ttg gtt gac ccc gag atg ctg att gaa aaa 240Phe Ala Gly Asn Pro Tyr Leu Val Asp Pro Glu Met Leu Ile Glu Lys65 70 75 80ggc tgg ctg gaa caa agc gaa gcg ccc ccg ccg tat ccg acc cag cgc 288Gly Trp Leu Glu Gln Ser Glu Ala Pro Pro Pro 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Gln Arg Ala500
权利要求
1.具有葡聚糖转移酶活性的分离的多肽，选自下列(a)具有与SEQ ID NO2的氨基酸1-501所示氨基酸序列有至少65％同一性之氨基酸序列的多肽；(b)由在低严紧度条件下与下列序列杂交的核酸序列编码的多肽(i)SEQ ID NO1的核苷酸1-1503所示核酸序列的互补链；或(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列；(c)(a)或(b)的等位基因变体；(d)由克隆到大肠杆菌DSM 13049的质粒中的编码葡聚糖转移酶的DNA序列编码的多肽，或与所述多肽有至少65％同一性的其变体；和(e)所述多肽的具有葡聚糖转移酶活性的片段。
2.权利要求1的多肽，其具有与SEQ ID NO2中氨基酸1-501所示氨基酸序列至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
3.权利要求1的多肽，含有SEQ ID NO2的氨基酸1-501所示氨基酸序列。
4.权利要求3的多肽，由SEQ ID NO2的氨基酸1-501所示氨基酸序列组成。
5.权利要求1的多肽，其中所述多肽与克隆到大肠杆菌DSM 13049中质粒上的DNA序列的葡聚糖转移酶编码部分所编码的多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或99％的同一性。
6.权利要求1的多肽，其由在中等严紧度条件，优选高严紧度条件下与下列序列杂交的核酸序列编码，(i)SEQ ID NO1的核苷酸1-1503所示之核酸序列的互补链，或(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列。
7.权利要求1的多肽，其中所述多肽是具有SEQ ID NO2中氨基酸1-501所示氨基酸序列的多肽的变体，其包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。
8.权利要求1的多肽，其在20mM磷酸盐缓冲液pH7.0中于67℃、优选70℃保温10分钟后保留至少75％的活性，所述活性是相对于所述多肽在20mM磷酸盐缓冲液pH7.0中65℃保温10分钟后的活性而测定的。
9.权利要求8的多肽，其在20mM磷酸盐缓冲液pH7.0中于67℃、优选70℃保温10分钟后仍保留至少80％，例如至少85％，优选至少90％，例如至少95％，特别优选基本上全部的活性。
10.权利要求1的多肽，其能够通过分子内转糖基化反应产生环状葡聚糖，底物是α-葡聚糖。
11.权利要求1的多肽，其衍生自栖热菌属，优选红色栖热菌。
12.权利要求11的多肽，其衍生自红色栖热菌ATCC 31556。
13.权利要求1-12的任一多肽，其具有下述多肽的葡聚糖转移酶活性的至少20％，其中所述多肽含有SEQ ID NO2的氨基酸1-501所示氨基酸序列。
14.权利要求13的多肽，其具有下述多肽的葡聚糖转移酶的至少30％，例如至少40％，例如至少50％，优选至少60％，例如至少70％，例如至少80％，至少90％或至少95％，其中所述多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸1-501所示氨基酸序列。
15.含有编码权利要求1-14任一多肽之核酸序列的分离的核酸序列。
16.编码具有葡聚糖转移酶活性之多肽的分离的核酸序列，选自(a)与SEQ ID NO1的核苷酸1-1503所示之核酸序列有至少70％同一性的核酸序列；(b)在低严紧度条件下与下列序列杂交的核酸序列(i)SEQ ID NO1的核苷酸1-1503所示核酸序列的互补链；或(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列；(c)(a)或(b)的等位基因变体；(d)已克隆到大肠杆菌DSM 13049中之质粒内的编码葡聚糖转移酶的DNA序列，或与所述DNA序列有至少70％同一性的其变体；和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的亚序列，其中所述亚序列编码具有葡聚糖转移酶活性的多肽片段；或作为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)之互补链的分离的核酸序列。
17.权利要求16的核酸序列，含有与SEQ ID NO1中核苷酸1-1503所示核酸序列至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的核酸序列。
18.权利要求16的核酸序列，含有与克隆至大肠杆菌DSM 13049中之质粒上的编码葡聚糖转移酶的DNA序列至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的核酸序列。
19.一种核酸构建体，其含有权利要求15-18任一项的核酸序列且所述序列与能指导所述多肽在适宜表达宿主中表达的一或多个控制序列可操作地相连。
20.一种重组表达载体，含有权利要求19所述核酸构建体、启动子、以及转录和翻译终止信号。
21.含权利要求19之核酸构建体的重组宿主细胞。
22.用于生产权利要求1-14任一多肽的方法，所述方法包括(a)培养栖热菌属的菌株，优选红色栖热菌的菌株，例如红色栖热菌ATCC 31556以产生含所述多肽的上清液；和(b)回收所述多肽。
23.用于生产权利要求1-14任一多肽的方法，所述方法包括(a)在能导致所述多肽产生的条件下培养权利要求21中定义的重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。
24.权利要求1-14任一多肽用于生产食品的用途。
25.权利要求24的用途，其中所述食品选自日本餐后甜点，点心，小麦食品，面条，gyoza skins，shumai skins，加工的海味，冷冻的或冷藏的加工食品，断奶食品，婴儿食品，宠物食品，动物饲料，饮料，运动食品和营养补充食品。
26.用于生产食品的方法，所述方法包括将权利要求1-14定义的任一多肽在加热烹饪前或即刻后加到食品材料中，从而使所述多肽作用于食品材料中的淀粉以产生环状葡聚糖。
27.权利要求26的方法，其中所述食品选自日本餐后甜点，点心，小麦食品，面条，gyoza皮，shumai皮，加工的海味，冷冻的或冷藏的加工食品，断奶食品，婴儿食品，宠物食品，动物饲料，饮料，运动食品和营养补充食品。
28.含有权利要求1-14定义的任一多肽的清洁或洗涤剂组合物。
29.权利要求1-14定义的任一多肽用于除去淀粉斑，特别是除去直链淀粉斑的用途。
30.用于从硬表面或衣物上除去淀粉斑，特别是除去直链淀粉斑的方法，所述方法包括将含直链淀粉斑的硬表面或含直链淀粉斑的衣物与权利要求1-14定义的任一多肽接触或与权利要求28定义的组合物接触。
全文摘要
本发明涉及具有葡聚糖转移酶活性的分离的多肽以及编码所述多肽的分离的核酸序列。本发明还涉及含所述核酸序列的构建体、载体和宿主细胞以及生产和利用所述多肽的方法。
文档编号C12N1/21GK1384875SQ00814673
公开日2002年12月11日 申请日期2000年10月16日 优先权日1999年10月20日
发明者福山志朗 申请人:诺维信公司