专利名称：一种具有环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶活性的酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码一种新型碱性环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶(CGT酶)的DNA序列，这种新型碱稳定的CGT酶，一种含有该CGT酶的酶组合物，以及该酶和酶组合物在若干工业应用中的用途。
背景技术：
环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶(E.C.2.4.1.19)，也被称为环糊精葡聚糖转移酶或环糊精糖基转移酶，在后面称之为CGT酶，它催化淀粉和类似底物经过一个分子内的转糖基反应而变为环麦芽糖糊精的转化，由此形成不同大小的环麦芽糖糊精，在后面称之为环糊精(或CD)。商业上最重要的是6、7和8个葡萄糖单位的环糊精，分别命名为α-,β-和γ-环糊精。商业上重要性较小的是9、10和11个葡萄糖单位的环糊精，分别命名为δ-,ε-和ζ-环糊精。
因此环糊精是具有一个疏水内部洞穴的环状葡萄糖寡聚体。它们能够在水溶液中与许多小的疏水分子形成包涵体复合物，导致物理性质的改变，例如溶解性和稳定性增加，而化学反应性和挥发性降低。发现环糊精尤其可应用于食品、化妆品、化学和制药工业。
大多数CGT酶具有降解淀粉活性和转糖基反应活性。虽然一些CGT酶产生α-环糊精，一些CGT酶分别主要产生β-环糊精或γ-环糊精，CGT酶通常形成α-,β-和γ-环糊精的混合物。用有机溶剂进行选择性沉淀步骤可用于分离单独的α-,β-和γ-环糊精。为避免昂贵的和有害环境的方法，需要能够产生比例增加的一种特定类型的环糊精的CGT酶。
本发明的目的是提供一种热碱稳定的，具有宽pH范围的环糊精环化活性并主要产生α-CD的CGT酶。
同样期望的是找到一种在相对高的温度和pH值下保持稳定的CGT酶。
这使得此酶适合于许多需要在高pH值和高温下进行的工业应用。CGT酶的结构CGT酶功能上与α-淀粉酶相关。CGT酶与α-淀粉酶均通过水解α-(1,4)-糖苷键降解淀粉，但各自产生本质不同的环状和线性产物。
CGT酶家族成员具有高度的全部氨基酸序列一致性，高于CGT酶的60％。而且，CGT酶与α-淀粉酶具有30％的氨基酸序列一致性。已表征过的CGT酶下面提到的是描述了目前表征过的CGT酶的性质的参考文献。
目前认为下面提到的CGT酶中没有任何一个具有本发明的CGT酶所具有的特异性特点，尤其是主要产生α-CD的能力。
不同细菌来源的CGT酶，包括从芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、微球菌属(Micrococcus)、热厌氧杆菌属(Thermonanaerobacter和Thermonanaerobacterium)得到的CGT酶已在文献中描述。
Kimura等人[Kimura K,Kataoka S,Ishii Y,Takano T和YamaneK；细菌学杂志(J.Bacteriol.)1987 169 4399-4402]描述了一种芽孢杆菌属种1011的CGT酶，Kaneko等人[Kaneko T,Hamamoto T和Horikoshi K；普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.),1988 134 97-105]描述了一种芽孢杆菌属种菌株38-2的CGT酶，Kaneko等人[Kaneko T,Song K B,Hamamoto T,Kudo T和Horikoshi K；普通微生物学杂志，1989 1353447-3457]描述了一种芽孢杆菌属种菌株17-1的CGT酶，Itkor等人[Itkor P,Tsukagoshi N和Udaka S；生物化学生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)1990 166 630-636]描述了一种芽孢杆菌属种菌株B1018的CGT酶，Schmid等人[Schmid G,Englbrecht A,Schmid D；第四届国际环糊精研讨会汇编(Proceedings of the FourthInternational Symposium on Cyclodextrins)(Huber O,Szejtli J，编)]描述了一种芽孢杆菌属1-1的CGT酶，Kitamoto等人[Kitamoto N,KimuraT,Kito Y,Ohmiya K；发酵生物工程学杂志(J.Ferment.Bioeng.)1992 74345-351]描述了一种芽孢杆菌属种菌株KC201的CGT酶，Salai等人[Sakai S,Kubota M,Nakada T,Torigoe K，和o O和Sugimoto T；日本淀粉科学协会杂志(J.Jpn.Soc.Starch.Sci)1987 34 140-147]描述了一种嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stear othermophilus)的CGT酶和一种浸麻类芽孢杆菌(Bacillus macerans)的CGT酶，Takano等人[rakano T,Fukuda M,Monma M,Kobayashi S,Kainuma K和Yamane K；细菌学杂志1986 166(3) 118-1122]描述了一种浸麻类芽孢杆菌的CGT酶，Sin等人[Sin K A,Nakamura A,Kobayashi K,Masaki H和Uozumi T；微生物生物技术应用(Appl.Microbiol.Biotechnol.)1991 35 600-605]描述了一种Bacillus ohbensis的CGT酶，Nitschke等人[Nitschke L,HeegerK,Bender H和Schultz G；微生物生物技术应用1990 33 542-546]描述了一种环状芽孢杆菌的(Bacillus circulans)CGT酶，Hill等人[Hill D E,Aldape R和Rozzell J D；核酸研究(Nucleic Acids Res.)1990 18 199]描述了一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的CGT酶，Tomita等人[Tomita K,Kaneda M,Kawamura K和Nakanishi K；发酵生物工程学杂志1993 75(2)89-92]描述了一种Bacillus autolyticus的CGT酶，Jamuna等人[Jamuna R,Saswathi N,Sheela R和Ramalrishna S V；微生物生物技术应用1993 43 163-176]描述了一种蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)的CGT酶，Akimaru等人[Akimaru K,Yagi T和Yamamoto S；发酵生物工程学杂志1991 71(5)322-328]描述了一种凝结芽孢杆菌菌(Bacilluscoagulans)的CGT酶，Schmid G[Schmid G；环糊精和衍生物的新趋向(New Trends in Cyclodextrins and Derivatives)(Duchene D，编)Editionsde Sante,Paris,1991,25-54]描述了一种坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)的CGT酶，Abelian等人[Abelian V A,Adamian M O,Abelian L A A,Balayan A M和Afrikian E K；生物化学(Biochememistry)(Moscow)199560(6)665-669]描述了一种Bacillus halophilus的CGT酶，以及Kato等人[Kato T和Horikoshi K；日本淀粉科学协会杂志1986 33(2)137-143]描述了一种枯草芽孢杆菌的CGT酶。
EP 614971描述了一种短杆菌属的CGT酶，Haeckel和Bahl[HaeckelK,Bahl H；(FEMS Microbiol.Lett.)1989 60 333-338]描述了热产硫磺梭状芽孢杆菌(Clostridium thermosulfurogenes)的CGT酶，Podkovyrov&Zeikus[Podkovyrov S M,Zeikus J G；细菌学杂志(J.Bacteriol.)1992 1745400-5405]描述了一种热硫化氢梭状芽孢杆菌(Clostridiumthermohydrosulfuricum)的CGT酶，JP 7000183公开了一种棒杆菌属的CGT酶，Binder等人[Binder F,Huber O和Bock A；基因(Gene)198647 269-277]描述了一种肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoiae)的CGT酶，US 4,317,881描述了一种微球菌属的CGT酶，以及Wind等人[Wind R D,Liebl W,Buitelaar R M,Penninga D,Spreinat A,DijkhuizenL,Bahl H；应用环境微生物1995 61(4)1257-1265]描述了热产硫磺热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes)的CGT酶。
Norman和Jorgensen[Norman B E,Jorgensen S T；(DenpunKagaku)1992 39 99-106,以及WO 89/03421]已经报道了热厌氧杆菌属种产生的一种CGT酶。
并且，还报道了来自于嗜热放线菌的一种CGT酶[Abelian V A,AfvanK B,Avakian Z G,Melkumyan A G和Afrikian E G；生物化学(Moscow)1995 60(10)1223-1229]。
近来已经应用蛋白质工程来修饰特定的CGT酶以选择性地产生更多或更少的某一特定的环糊精。
WO 96/33267(Novo Nordisk)描述了新的CGT酶变体，与前体酶相比，此变体具有增加的产物选择性和/或降低的产物抑制作用。
发明概述本发明者意外地鉴定了一种环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶(CGT酶)，它来自于一种新的称为Thermoalcalibacter bogoriae的属于梭状芽孢杆菌/芽孢杆菌亚门的中等热嗜碱性厌氧菌菌株。
本发明中的CGT酶已被充分表征，并表明它主要产生α-环糊精(相对于β-和γ-环糊精)。
更进一步，部分DNA序列已经被克隆、分离和测序并进行了异源表达。
因此，本发明第一方面涉及一种分离的CGT酶，其特征在于与支链淀粉在65℃,pH8.0下温育2小时后产生至少75％的α-环糊精(相对于β-和γ-环糊精)。换句话说，是在环糊精的总量，即α-,β-和γ-环糊精的基础上计算的75％的α-环糊精。
本发明中CGT酶在相对高温下(65℃)产生至少75％的α-环糊精的能力非常有利于若干工业上的应用。
已表征的CGT酶和CGT酶的变体或者产生相对于β或γ-CD的占较少部分的α-环糊精(WO 96/33267)，或者当能产生相对高数量的α-环糊精时不是热稳定的(即不能在65℃下表现出任何实际的活性)(Kitahata,S.和Okada,S.1982.来自于巨大芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和浸麻类芽孢杆菌的环糊精葡聚糖转移酶作用的比较，日本淀粉科学协会杂志29,1:13-18；和Lee,J.-H等人1992)。
此外，目前相信本发明中的CGT酶是第一个描述并表征的来源于热嗜碱性厌氧菌的细胞外淀粉分解酶。
因而，本发明第二方面涉及从Thermoalcalibacter属种菌株获得的分离的细胞外CGT酶。
因而，本发明第三方面涉及同源地产生本发明的CGT酶的方法，此方法包含在允许产生此酶的条件下培养Thermoalcalibacter bogoriae菌株，以及从培养物中回收此酶。
此外，本发明涉及一种酶或酶组合物，以及这种酶或酶组合物在若干工业应用中的用途。
本发明还涉及编码表现CGT酶活性的酶的分离的DNA序列，包含SEQ ID No.13所示的部分序列；包含编码具有SEQ ID No.13所示序列的该CGT酶的表达载体；导入了本发明的表达载体的一种宿主细胞，此细胞表达包含SEQ ID No.13所示DNA序列的DNA序列所编码的CGT酶。附图简述本发明进一步参考附图加以说明，其中
图1多种纯化步骤的SDS-PAGE。图1显示了在淀粉上生长的Thermoalcalibacter bogoriae的蛋白质的电泳分离。经过PD-10处理的浓缩上清液(泳道1+2),α-淀粉酶(泳道3、4、5)，纯化的α-淀粉酶(泳道5),CGT酶(泳道6+7)，银染(泳道1、3、5、6)，活性染色(泳道2、4、7)。
图2显示了来自于Thermoalcalibacter bogoriae的CGT酶的最适pH。为确定最适pH，用含有0.5％(重量/体积)可溶性淀粉的通用缓冲液(Britton&Robinson),pH 4.0-11.0，在65℃下温育30分钟。确定了CGT酶所示水解活性(J)和环化活性(C)。100％残留活性分别相当于0.12U/ml的转化为低聚糖(·)或500U/ml的环化活性(Δ)。
图3显示了来自于Thermoalcalibacter bogoriae的CGT酶的最适温度。在含有0.5％(重量/体积)可溶性淀粉的pH8.0的100mM磷酸钠缓冲液中进行30分钟的温育。100％残留活性相当于0.11U/ml测得的转化为低聚糖的活性。
图4显示了来自于Thermoalcalibacter bogoriae的CGT酶与可溶性淀粉(A)，及支链淀粉(B)在pH9.0温育长达16小时后水解产物的HPLC分析。预纯化的CGT酶与不同底物在pH8.0及65℃下温育长达16小时。
图5显示了预纯化的CGT酶作用产生的环糊精的比例。定义在更具体地讨论本发明之前，首先需要限定下列术语。
“一段克隆的DNA序列”术语“一段克隆的DNA序列”是指经用于基因工程的标准克隆步骤进行克隆的DNA序列，以使其从自身天然位点转移到它可以被复制的另一位点的一段DNA序列。克隆过程包括所需DNA片段的切除和分离，或者用PCR扩增制备，将DNA片段插入载体分子，以及重组载体整合入此DNA片段的多拷贝或克隆可以复制的细胞的过程。
本发明中“克隆的DNA序列”也可以称为“DNA构件”或“分离的DNA序列”。
“获自”为本发明的目的，术语“获自”用于此处与特定的微生物来源相关联，表示此酶由特定来源产生，或由已插入了来自该来源的基因的细胞产生。
“一段经分离的多肽”用于本发明中的关于CGT酶的术语“一段经分离的多肽”或“经分离的CGT酶”，如此处所限定的那样，是指本质上不含非CGT酶多肽的一种CGT酶或CGT酶的部分，即它经SDS-PAGE测定至少约20％纯度，优选地至少约40％纯度，更优选地约60％纯度，更更优选地约80％纯度，最优选地约90％纯度，进一步最优选地约95％纯度。术语“经分离的多肽”或者可以称为“纯化的多肽”。
“同源杂质”术语“同源杂质”用于此处表示本发明中的酶最初获自的同源细胞所产生的任何杂质(例如，不同于本发明中的酶的另一种多肽)。在本发明中同源细胞可以例如是Thermoalcalibacter bogoriae菌株。
“环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶(CGT酶)”在本文中CGT酶是按IUB酶命名法命名为EC2.4.1.19。其它名称环糊精转糖基转移酶。环糊精葡聚糖转移酶通过形成1,4-α-D-糖苷键将淀粉降解为环糊精。
“分解淀粉的”在本文中，术语“分解淀粉的”或“淀粉分解活性”是用来表示所指的酶具有淀粉降解能力。具有淀粉水解活性的酶的特定实例即淀粉分解酶，包括α-淀粉酶，支链淀粉酶，新支链淀粉酶，异淀粉酶，β-淀粉酶，CGT酶，产麦芽糖酶(maltogenase)以及G-4和G-6淀粉酶。
“中等热嗜碱性”术语“中等热嗜碱性”涉及能在相对高的温度下，即高于55℃例如高于60℃或65℃，并且在相对高的pH水平高于8.5，例如高于9或10时能够生存的细胞。
“细胞外的”术语“细胞外的”用于此处与一种酶相联系，此酶是一种由产生此酶的细胞排出的酶，即它被分泌或扩散出此细胞外。这种酶通常包含一段信号肽来引导此酶的分泌(即排出细胞)。
“序列比较”术语“序列比较”用于此处与一系列DNA序列和/或氨基酸序列比较相关联，表示将目标序列排列在一起，以鉴定目标序列之间的同源/等同的共同/共有的序列。此过程用于确定目标序列之间的共有“保守区域”。序列比较适合运用本领域已知的计算机程序进行测定，例如GCG程序包中提供的ClusterW或PILEUP(Wisconsin程序包的程序手册，第8版，1994年8月，Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wisconsin，美国53711)(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology),48,443-453)。
术语“保守区域”用于此处与位于目标DNA序列和/或氨基酸序列之间的“保守区域”相关联，表示目标序列的一个共同的共有序列区域，其中目标序列之间具有相对高度的序列一致性。本文中一段保守序列优选地至少10个碱基对(bp)/3个氨基酸(a.a)，更优选地至少20bp/7a.a，甚至更优选地至少30bp/10a.a.。使用计算机程序GAP(Wisconsin程序包的程序手册，第8版，1994年8月，Genetics Computer Group,575 ScienceDrive,Madison,Wisconsin，美国53711)(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物学杂志，48,443-453)(参见上文)，用下列设置进行DNA序列比较GAP产生罚5.0,GAP延伸罚0.3，保守区域内的DNA序列一致性优选地至少为80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％，甚至更优选地至少95％。
术语“引物”用于此处尤其是与PCR反应相关联，它是按照本领域已知的通用的标准规范来限定和构建的一段寡核苷酸(尤其是“PCR-引物”)(“PCR实践入门”(“PCR A practical approach”)IRL Press,(1991))。
术语“针对一段序列的引物”表示此引物(优选地应用于PCR反应)被构建以表现出与目标序列部分至少80％的一致性，更优选地与目标序列部分至少90％的一致性，因而该引物可以“针对”此序列。此引物被设计使其在其所针对的区域和给定的温度下发生特异性的退火。尤其是在引物3’末端的一致性对聚合酶的功能，即聚合酶延伸经退火的引物的能力是很重要的。
术语“表达载体”表示一个线性或环状的DNA分子，此分子含有编码目标多肽的片段，此片段有效地与供其转录的附加片段相连接。此附加片段可以包含启动子和终止子序列，也可以选择性地包含一或多个复制起点，一或多个选择性标记，一个增强子，一个多聚腺苷酸化信号等。表达载体通常衍生于质粒或病毒DNA，或可以包含两者的元件。本发明的表达载体可以是任何方便于进行重组DNA操作的表达载体，载体的选择通常依赖于载体所要导入的宿主细胞。因而，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外单位存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒。载体也可以是这样的载体，当它导入宿主细胞后，整合到宿主细胞基因组中并随它整合进的染色体一起复制。
术语“重组性表达”或“重组性地表达”用于此处与按照本领域的标准定义进行限定的多肽或蛋白质的表达相关联。通常用上面刚描述的表达载体进行蛋白质的重组性表达。
术语“经分离的”，当用于DNA时，表示此DNA已经从它原来的遗传环境转移出来，因而没有其它外来或不需要的编码序列，并且以适合应用于遗传工程蛋白质制备系统的形式存在。此分离的DNA是那些从其天然环境分离出来的，包括cDNA和基因组克隆。本发明中分离的DNA分子没有它们通常与之相连的其它基因，但可以包含天然存在的5’和3’非翻译区例如启动子和终止子。相关区域的确定对于一个本领域的普通专业人员是显而易见的。(例如参见，Dynan和Tijan，自然(Nature)316:774-78,1985)。术语“经分离的多聚核苷酸”也可以称为“克隆的多聚核苷酸”。
当应用于蛋白质时，术语“经分离的”表示此蛋白质是在不同于它的天然环境的条件下得到的。经分离的蛋白质的优选形式是基本上没有其它蛋白质，尤其是其它同源蛋白质(即“同源杂质”(见下面))。优选的是提供高于40％纯度形式的蛋白质，更优选的是高于60％纯度的形式。甚至更优选的是提供高度纯化形式的蛋白质，即高于80％纯度，更优选的是高于95％纯度，甚至更优选的是高于99％纯度，纯度用SDS-PAGE测定。
术语“经分离的蛋白质/多肽”也可以被称为“经纯化的蛋白质/多肽”。
术语“部分DNA序列”表示包含在一段更长的DNA序列中的一部分DNA序列，该更长的DNA序列包含编码具有目标活性的多肽的足够信息。
术语“部分多肽序列”表示包含在一段更长的多肽序列中的部分多肽序列，其中该更长的多肽序列具有目标活性。
术语“同源杂质”指本发明中的多肽最初所获自的同源细胞产生的任何杂质(例如不同于本发明中的多肽的另一种多肽)。
术语“获自”用于此处与特定的微生物来源相关联，表示此多聚核苷酸和/或多肽由特定来源产生，或由已插入了来自此来源的基因的细胞产生。
术语“有效地连接”，当指DNA片段时，表示排列这些片段以使它们的功能符合所需的目的，例如转录从启动子开始，沿编码片段进行直到终止子。发明详述获自Thermoalcalibaeter bogoriae的CGT酶此处的有效实施例(参见下文)中描述了用于测定本发明的CGT酶产生的α-环糊精相对量的方法，并且图5显示了实验结果。
简言之，为测定CGT酶活性的水解产物，将酶与不同底物(例如支链淀粉)在65℃和pH8.0温育1、2以及直至16小时。测定环化活性，定性地确定底物的特异性，从定量HPLC分析中阐明产生的CD之间的比例。
当支链淀粉被用作底物且在65℃,pH8.0温育2小时时，本发明的CGT酶优选地产生至少75％的α-环糊精(相对于β或γ-环糊精)，更优选地至少80％的α-环糊精(相对于β或γ-环糊精)，或者甚至更优选地至少85％的α-环糊精(相对于β或γ-环糊精)。
应当理解，除了主要为α-环糊精之外，本发明的CGT酶能产生少量的β或γ-环糊精。
在另一实施方案中，本发明的CGT酶具有的分子量优选为67±10kD(即57-77kD)，更优选分子量67±5kD(即62-72kD)，甚至更优选分子量67±3kD(即64-70kD)，并且最优选分子量67±2kD(即65-69kD)。通过下面“材料和方法”部分(见下)描述的SDS-PAGE电泳来测定分子量。
在另一实施方案中，本发明的CGT酶具有的最适温度优选为65±10℃(即55-75℃)，更优选最适温度65±5℃(即60-70℃)，并且更更优选65±2℃(即63-67℃)。通过将酶与溶于100mM磷酸钠缓冲液的0.5％(重量/体积)的底物溶液(可溶性淀粉；Merck)在pH8.0时共同温育来测定最适温度。在30-80℃之间的温度下进行30分钟的温育。进一步的细节见此处的有效实施例(见下)。微生物来源本发明的CGT酶或编码本发明的CGT酶的DNA序列可获自相应于梭状芽孢杆菌/芽孢杆菌亚门内的Thermoalcalibacter系的细菌，尤其是如下描述的Thermoalcalibacter bogoriae菌株Thermoalcalibacter bogoriae的表征细胞为杆状，宽0.3-0.5μm且长3-5μm。菌落直径3-5mm，苍白色，透镜状。专性厌氧菌。生长温度范围30℃到65℃，最适约为50℃到55℃。生长pH范围从pH6到10.5，最适为pH9.5；在从0到4％的NaCl中生长，最适为1％的NaCl，表明最适Na+浓度为230mM。有蛋白胨时异养生长。在硫酸盐、硫代硫酸盐或硫存在时生长。硫代硫酸盐增强在可发酵底物诸如葡萄糖和淀粉上的生长，导致H2S的形成。在淀粉和硫代硫酸盐上的发酵产物为乙酸盐和乙醇。细胞壁类型为革兰氏阳性，但细胞壁为非典型的较薄。细胞分隔部分有片状结构。经常出现分枝的细胞，可以观察到外表层的部分。
16S rRNA分析显示Thermoalcalibacter bogoriae为梭状芽孢杆菌/芽孢杆菌亚门的一个新品系。在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)进行16S rRNA的测序分析。
本发明的CGT酶或编码本发明的CGT酶的DNA序列所来源的Thermoalcalibacter bogoriae菌株的一种分离物，已经被发明者按照以专利申请为目的的关于微生物保藏的国际公约的布达佩斯条约。在德意志微生物及细胞培养物保藏中心保藏(DSMZ),Mascheroder Weg 1b,D-38124Braunschweic，德国。
保藏日期1996年9月11日保藏人代号NN049260DSM No.:Thermoalcalibacter bogoriae DSM No.9380.制备CGT酶的方法本发明的CGT酶可通过培养同源菌株来生产，例如在合适培养基中培养上面所述的保藏菌株，形成允许产生此酶的条件。
用于培养该菌株的培养基可为任何适合于该菌生长的传统培养基。分泌到培养基中的CGT酶可以用众所周知的方法从中回收，包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，通过诸如硫酸铵的盐沉淀培养基的蛋白质组分，随后进行层析步骤，诸如离子交换层析、亲和层析或类似方法。CGT酶的克隆从Thermoalcalibacter bogoriae中能克隆编码本发明CGT酶的DNA序列。
若干合适的标准DNA克隆方法已经被例如Sambrook等人进行了描述(分子克隆实验手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，冷泉港实验室；冷泉港，纽约，(1989)。
DNA序列的克隆可以通过纯化酶(例如此处有效实施例所描述的(见下))，测定氨基酸序列，以及依据此氨基酸序列制备适合的探针或PCR引物来进行。
本发明的CGT酶可以通过任何常用方法克隆，包括-在合适的载体上从任何期望产生目标CGT酶的微生物中克隆DNA文库，-用该载体转化合适的宿主细胞，-在合适的条件下培养宿主细胞，以表达由DNA文库中的一个克隆编码的CGT酶，-通过测定这些克隆产生的酶的任何CGT酶活性筛选阳性克隆，以及-从这种克隆中分离编码CGT酶的DNA。
如以下实施例3和4中将要描述的那样，一段部分DNA序列(见包含SEQ ID No.10的SEQ ID No.13)被分离、克隆和测序。通过比较SEISSPROT数据库公开结构域的若干已知CGT酶确定了已知CGT酶的前三个保守区域。根据对这些保守区域的认识设计了三个引物。然后以获自Thermoalcalibacter bogoriae DSM No.9380的纯化的基因组DNA进行PCR扩增，得到1.15kb的PCR产物并对其测序。SEQ ID No.10显示了上述编码CGT酶的部分DNA序列。
然后该显示于SEQ ID No.10的部分序列被作为确定CGT酶序列的下一部分的出发点。通过用反向PCR(见M.J.MCPherson等人“PCR实践入门”(“PCR A practical approach”)Information Press Ltd.,Oxford，英国)延伸SEQ ID No.10得到SEQ ID No.13所示序列。
依据SEQ ID No.10或SEQ ID No.13中所示部分DNA序列，本领域的技术人员能很容易地克隆编码本发明的完整CGT酶的DNA序列。
一旦知道了基因的全序列，可以通过PCR扩增步骤将全部基因克隆进合适的表达载体，例如源自pUB110(Gryczan，等人(1978)，细菌学杂志134,318-329),pE194(Horinouchi等人(1982)细菌学杂志150,815-825)或pC194(Horinouchi等人(1982)细菌学杂志150,804-814)的用于芽孢杆菌类的质粒。
依据此处公开的序列信息(SEQ ID No.13和SEQ ID No.14)，对于本领域技术人员来说，通过利用获自相关微生物的基因文库，尤其是获自其它梭状芽孢杆菌/芽孢杆菌亚门的基因文库，尤其是Thermoalcalibacter，以类似策略来分离编码本发明的同源CGT酶的同源多聚核苷酸序列只是常规工作。
期待编码同源酶的DNA序列(即类似的DNA序列)可以从其它细菌获得，例如下列属中的菌株芽孢杆菌属，短小杆菌属，梭状芽孢杆菌属，棒杆菌属，克雷伯氏杆菌属，微球菌属，热厌氧杆菌属，诸如前面“已表征过的CGT酶”部分提到的种类。DNA构件本发明也涉及包含一种DNA序列的DNA构件，该DNA序列包含a)包含了SEQ ID No.13所示部分DNA序列的编码CGT酶的DNA序列，或b)a)中定义的DNA序列的类似物，其ⅰ)与包含SEQ ID No.13所示部分序列的a)中定义的DNA序列至少70％同源，或ⅱ)与和包含SEQ ID No.13所示部分序列的a)中定义的DNA序列相同的寡核苷酸探针杂交，或ⅲ)编码一段与包含SEQ ID No.13所示部分序列的a)中定义的DNA序列编码的多肽至少70％同源的多肽，或ⅳ)编码与一种抗体发生免疫反应的多肽，此抗体抗纯化的源自Thermoalcalibacter bogoriae DSM No.9380的CGT酶，其由包含SEQ ID No.13所示部分序列的a)中定义的DNA序列编码。
在本文中，包含SEQ ID No.13所示部分序列的所定义之DNA序列“类似物”这一说法意在表示编码具有上述ⅰ)至ⅳ)特性的多肽之DNA序列。典型地，此类似的DNA序列-以包含SEQ ID No.13所示部分序列所定义之DNA序列为依据，用此处描述的方法被从另一种或相关的(例如相同的)已知或推定为产生具有CGT酶活性的生物中分离出来，或-以包含SEQ ID No.13所示部分序列所定义之DNA序列为依据进行构建，例如通过引入核苷酸替换，这不会产生与包含SEQ ID No.13所示部分序列的DNA序列编码的CGT酶的另一种氨基酸序列，但这与用于产生此酶的宿主生物的密码子选择相对应，或者通过引入核苷酸替换导致产生不同的氨基酸序列，并且因此可能产生不同的蛋白质结构，这可能导致产生具有与天然不同特性的变体。其它可能的修改实例是将一或多个核苷酸插入序列中，在序列的任一末端加上一或多个核苷酸，或在序列的任一末端或序列内部缺失一或多个核苷酸。例如，类似的DNA序列可以是SEQ ID No.13所示部分DNA序列的亚序列。
上述ⅰ)中提到的同源性用两个序列之间的相同程度确定，表明第一个序列衍生自第二个。通过利用本领域已知的计算机程序例如GCG程序包中提供的GAP(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物学杂志，48,443-453)，可以合适地测定同源性。用GAP按照下列设置进行DNA序列比较GAP产生罚5.0,GAP延伸罚0.3,DNA序列的编码区与SEQ ID No.13所示部分DNA序列的编码区的一致性优选地至少为70％，更优选地至少80％，更更优选地至少85％，更更优选地至少90％，甚至更更优选地至少95％，尤其至少99％。
上述ⅱ)中提到的杂交意在指出类似的DNA序列与和该DNA序列相同的探针杂交，此序列包含SEQ ID No.13所示部分序列，在特定的特异性条件下编码本发明的CGT酶，这些条件在此处之后的材料和方法部分中有详细描述。
通常，类似的DNA序列与该DNA序列高度同源，例如与上述定义的包含SEQ ID No.13所示部分序列的DNA序列至少70％同源，例如至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或甚至至少99％同源。
上述ⅲ)中提到的同源程度用两个序列之间的相同程度确定，表明第一个序列衍生自第二个。通过利用本领域已知的计算机程序可以合适地测定同源性。典型地，由类似的DNA序列编码的多肽与上述定义的包含了一段含有SEQ ID No.13所示部分DNA序列之DNA序列的DNA构件所编码的酶表现出至少70％的同源性，例如至少80％、85％、90％、95％、99％的同源性。
用下面材料和方法部分描述的方法可以确定免疫反应性。表达载体随后可以将上述定义的包含了一段含有SEQ ID No.13所示部分DNA序列的DNA序列插入到重组表达载体中。其可以是任何方便于进行重组DNA步骤的载体，而且载体的选择常常依赖于它将要导入的宿主细胞。因此，载体可以为自主复制载体，即作为染色体外单位存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒。或者，载体可以为当导入宿主细胞时，整合进宿主细胞基因组并与其整合进的染色体一起复制的载体。
在载体中，编码本发明的CGT酶的DNA序列应当有效地连接于合适的启动子和终止子序列。启动子可以为在所选宿主细胞中表现转录活性的任何DNA序列，并且可以衍生自编码与宿主细胞同源或者异源的蛋白质基因。
优选使用受获自地衣芽孢杆菌和/或地衣芽孢杆菌信号的产麦芽糖α-1,4-淀粉酶的启动子控制的载体。
分别连接编码酶/蛋白质、启动子和终止子的DNA序列并且将它们插入到合适载体的步骤，对于本领域的技术人员是众所周知的(参见，例如Sambrook等人(1989)，(分子克隆实验手册，冷泉港，纽约)。宿主细胞能被编码本发明的CGT酶的DNA序列转化的宿主细胞可以为真核或原核细胞。
合适的原核宿主细胞为细菌细胞。
经培养能产生本发明的新型酶的细菌宿主细胞的例子为革兰氏阳性菌，例如芽孢杆菌属的菌株，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，迟缓芽孢杆菌(B.lentus)，短芽孢杆菌(B.brevis)，嗜热脂肪芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，凝结芽孢杆菌(B.coagulans)，环状芽孢杆菌(B.circulans)，灿烂芽孢杆菌(B.lautus)，巨大芽孢杆菌(B.megaterium)或苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)，或者链霉菌属(Streptomyces)的菌株，如浅青紫链霉菌(S.lividans)或鼠灰链霉菌(S.murinus)，或者革兰氏阴性菌如大肠杆菌。用原生质体转化或按照自知的方法利用感受态细胞(参见Sambrook等人，(1989)出处同前)可以有效地进行细菌的转化。
当在诸如大肠杆菌的细菌中表达CGT酶时，多肽一般作为不溶性颗粒(已知为包涵体)保留在细胞质中，或可被细菌的分泌序列引导到胞质间隙。在前一种情况下，裂解细胞并且回收和变性颗粒，然后稀释变性剂使多肽重新折叠。在后一种情况下，通过破裂细胞可以从胞质间隙回收多肽，例如通过超声波处理或渗透压冲击以释放胞质间隙的内容物并回收多肽。
合适的真核细胞尤其为真菌细胞，例如酵母或丝状真菌细胞。
合适的酵母细胞的例子包括酵母属(Saccharomyces)的细胞，尤其是酿酒酵母(S.cerevisiae)，克鲁维酵母(S.kluyveri)，葡萄汁酵母(S.uvarum)，或者裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的细胞，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharumyces pomb)。用异源DNA转化酵母细胞和由其生产异源多肽的方法在以下出处中描述，例如在US 4,599,311,US 4,931,373,US 4,870,008,5,037,743，和US 4,845,075，所有这些在此引入作为参考。被转化细胞通过选择性标记决定的表型来筛选，通常是抗药性或能在缺乏特定的营养成分如亮氨酸存在时生长的能力。用于酵母的一种优选载体是US 4,931,373公开的POT1载体。信号序列或者任选地前导序列可位于编码本发明多肽的DNA序列之前，例如如前所述。合适的酵母细胞的其它例子有克鲁维酵母菌属，例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)，或者汉逊酵母属(Hansenulla)，例如多形汉逊酵母(H.polymorpha)，或者毕氏酵母属(Pichia)，例如巴斯德毕氏酵母(P.pastoris)，或者Yarrowia spp.，例如Yarrowia lipolytica(参见，Gleeson等人(1986)，普通微生物学杂志132,p.3459-3465；US 4,882,279)。
其它真菌细胞的例子有丝状真菌细胞，例如曲霉属(Aspergillus)，脉孢菌属(Neurospora)，镰孢属(Fusarium)或木霉属(Trichoderma)，尤其是米曲霉(A.oryzae)，构巢曲霉(A.nidulans)或黑曲霉(A.niger)。用于蛋白质表达的曲霉属用途在例如EP 272 277,EP 238 023和EP 184 438中进行了描述。例如，可依据Malardier等人(1989)基因(Gene)78,p.147-156的描述进行尖镰孢霉(F.oxysporum)的转化。
当丝状真菌用作宿主细胞时，可以被本发明的DNA构件转化，即通过将此DNA构件整合入宿主染色体可方便地获得重组宿主细胞。这一整合通常被认为具有优势，因为此DNA序列更易于稳定维持于细胞中。可以依据传统方法，例如同源或异源重组将DNA构件整合进宿主染色体。本发明的CGT酶的重组或异源表达然而另一方面，本发明涉及一种生产本发明的CGT酶的方法，在此方法中，在允许产生CGT酶的条件下，培养用编码CGT酶的DNA序列转化的合适的宿主细胞，并且从培养物中回收产生的CGT酶。
用于培养细胞的培养基可以是任何适合生长宿主细胞的传统培养基，例如基本培养基或含适宜补充物的复合培养基。合适的培养基可以从供应商得到或按照公开的配方进行制备(例如在美国典型培养物保藏中心的目录中)。
细胞产生的所表达的CGT酶可再通过传统步骤从培养基中获取，根据目标多肽的类型，包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞，通过用盐如硫酸铵来沉淀上清或滤液的蛋白质组分，通过不同的层析步骤，诸如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析或类似方法进行纯化。CGT酶的重组表达在又一方面，本发明涉及一种CGT酶，其a)由本发明的DNA构件编码，b)利用本发明的方法生产，并且/或者c)与抗经纯化的CGT酶的抗体发生免疫反应，此CGT酶由包含有源自Thermoalcalibacter bogoriae DSM No.9380的SEQ ID No.13所示DNA序列的DNA序列编码。酶组合物另一方面，本发明涉及一种含有上述同源或异源表达的CGT酶的酶组合物。
根据本领域已知方法可制备酶组合物，它可以为流体或干燥复合物的形式。例如，酶组合物可为颗粒或微粒的形式(US 4106991,US5324649)。组合物中包含的酶可以按照本领域已知的方法稳定。
下面给出了本发明的酶组合物优选的应用例子。根据本领域中已知方法来确定本发明的酶组合物的剂量以及此组合物应用的其它条件。
按照本发明此酶和/或酶组合物至少可应用于下列目的之一。本发明的CGT酶的工业应用本发明的CGT酶在用于不同工业用途的环糊精生产过程中得到应用，尤其是食品、化妆品、化学、农业化学和制药工业。
因此，另一方面，本发明涉及在生产环糊精，尤其是α-环糊精过程中本发明的CGT酶的用途。
本发明的CGT酶也可用于生产线性寡糖，尤其是2到12个葡萄糖单位的线性寡糖，优选2到9个葡萄糖单位的线性寡糖的过程中。
在另一优选实施方案中，本发明的CGT酶可用于环糊精的原位产生。在此方法中，可将本发明的CGT酶加到含底物的培养基中，其中酶能产生期望的环糊精。此用途尤其适合于应用在生产焙烤产品的方法中，应用在化学产物生产过程中稳定化学产物的方法中，以及应用在去污剂组合物中。
已知特定的环糊精可提高焙烤产品的质量。因此本发明的CGT酶可用于加入到面包改良的添加剂中，例如面团组合物，面团添加剂，面团软化剂，预制粉(premixes)，以及在制作面包或其它焙烤产品过程中加入到面粉和/或面团的传统生产过程中的类似的制剂。
因此，一方面本发明涉及面包改良和/或面团改良组合物，还涉及在这些组合物中本发明的CGT酶的使用，还涉及包含有本发明的面包改良和/或面团改良组合物的面团或焙烤产物。
在本文中术语“面包改良组合物”和“面团改良组合物”意在表示这样一种组合物，它除了酶组分外，可包括焙烤中传统应用的用于提高面团和/或焙烤产品品质的其它物质。后面给出了这些组分的例子。
在本文中术语“改善的品质”意在表示经CGT酶酶作用后得以改善的任何性质。尤其是，应用CGT酶使体积增加，面包结构改善和焙烤产品软化，以及面团的强度、稳定性增加和黏度降低，因而改善了它的机器生产性能。发现使用质量较差的面粉时对面团的效果尤其好。机器生产性能的改善对工业化生产的面团尤其重要。
通过与未加入按照本发明的CGT酶的面团和/或焙烤产品比较，评价了品质的改善。
本发明的面包改良和/或面团改良组合物还可包括其它酶。其它酶的例子有纤维素酶，半纤维素酶，戊聚糖酶(用于部分水解戊聚糖来提高面团的伸展性)，葡萄糖氧化酶(用于强化面团)，脂酶(用于修饰面团或面团成分中存在的脂质以软化面团)，过氧化物酶(用于面团改良的密度)，蛋白质酶(用于弱化面筋，尤其是使用硬小麦面粉时)，肽酶和/或淀粉酶，例如α-淀粉酶(用于提供可供酵母发酵的糖)。
除了其它酶组分之外，或者作为其它酶组分的替代物，面包改良和/或面团改良组合物可以包括传统使用的焙烤剂，例如下列成分中的一或多个奶粉(产生外表的颜色)，面筋(用于改善软面粉的气体保留能力)，乳化剂(用于面团改良的伸展性和一定程度地增加生产的面包的密度)，颗粒化脂质(用于面团软化和面包的密度)，氧化剂(加入以增强面筋的结构，例如抗坏血酸、溴化钾、偶氮二酰胺、过氧化钙、碘化钾或过硫酸铵)，氨基酸(例如半胱氨酸)，糖以及盐(例如氯化钠、乙酸钙、硫酸钠或硫酸钙，用于使面团更坚固)，面粉或淀粉。
合适的乳化剂的例子有甘油单酯和甘油二酯，甘油单酯和甘油二酯的二乙酰基酒石酸酯，脂肪酸的糖酯，脂肪酸的多甘油酯，甘油单酯的乳酸酯，甘油单酯的乙酸酯，多氧乙烯硬脂酸酯，磷酯，卵磷脂和溶血卵磷脂。
本文中术语“焙烤产品”意在包括由面团或(做糕饼时用鸡蛋、面粉等制成的)糊状物制备的具有或软或脆的特点的任何产品。用本发明方法有利的生产的白色、浅色或深色焙烤产品的例子有面包(尤其是白面包、全麦面粉面包、黑麦面包或混合物)，典型的形式是面包条或面包卷、法式狭长方形面包、过水面包圈、皮塔饼、炸玉米卷、玉米面饼、蛋糕、薄煎饼、pannetone、饼干、比萨饼、香脆面包、馒头等等。
本发明的面团可以是上面讨论的任何一类并且可以是新鲜的、预焙烤的(par-baked)或冷冻的。
从上述公开内容可以明显看出，本发明的面团通常是发酵过的面团或糊状物或者将要发酵的面团或糊状物。面团或糊状物可利用多种方式来发酵，例如用化学发酵试剂，酸性培养物/面团，和/或酵母，但优选通过加入合适的酵母培养物如酿酒酵母(面包酵母)培养物来发酵面团。可以使用任何商业途径获取的酿酒酵母菌株。
进一步考虑可以利用本发明有效地制备糊剂(pasta)面团，优选地用硬粒小麦面粉或质量类似的面粉制备。利用传统技术以及类似上述方法中采用的CGT酶制备面团。相信当用于糊剂的制备时，CGT酶导致面筋结构的增强和因而引起的面团粘性的降低和面团强度的增加。
环糊精具有包括稳定作用及增溶作用等等的能力，因而环糊精能使氧化剂和光解物质稳定，使挥发性物质不挥发，使难溶物质溶解，并且使有味物质无味等等，因此可用于胶囊香水、维生素、染料、药物、杀虫剂和杀真菌剂。环糊精也能结合亲脂性物质诸如胆固醇，以将它们从蛋黄、黄油等中去除。
环糊精也在有关塑料和橡胶产品和其生产过程中得到应用，其中它们被用于塑料薄片、胶片、膜等不同的目的。环糊精还被用于生物可降解塑料的生产。
本发明以下列实施例进一步详细描述，其不意在限制所要求的本发明的范围。材料与方法保藏的生物Thermoalcalibacter bogoriae DSM No.9380含有本发明的CGT酶。电泳及分子量的测定按照Laemmi(Laemmi等人)用11.5％的聚丙烯酰胺凝胶在Mini ProteanⅡ电泳系统(Bio-Rad)中以24mA的稳定电流和高电压进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。蛋白质按照Blum等人(Blum等人)的方法进行银染。为测定分子量，用宽范围的分子量蛋白质混合物(Bio-Rad)作为标准。SDS-PAGE上的淀粉分解酶活性的活性染色活性染色之前，在2.5％Triton X-100溶液中将SDS凝胶温育30分钟以除去SDS。通过在补加0.5％可溶性淀粉(Merck)的100mM,pH8.0的磷酸钠缓冲液中，在65℃下将凝胶温育10分钟来检测分解淀粉的蛋白质区带。通过用KJ-J2(每升aquadest.3g KJ,2g J2)将凝胶染色使有分解淀粉活性的蛋白质区带可见，产生棕色背景中的白色活性区带。淀粉分解鉴定用分别预纯化的酶和溶于pH9.0,100mM磷酸钠缓冲液中的含0.5％的可溶性淀粉(Merck,Darmstadt，德国)或0.2％的直链淀粉或0.2％的支链淀粉(均为重量/体积)的底物溶液达到0.1ml的终体积，由此得到的酶溶液经常规的酶分析。如果无另外说明，在65℃下进行30分钟的温育。用Somogyi-Nelson方法(Somogyi,M.生物化学杂志(J.Biol.Chem.)(1945)160:61-68；Nelson,N.生物化学杂志(1944)153:375-380)估计还原糖的量，使用以0-1％(重量/体积)麦芽糖制作的标准曲线计算酶活性。一个单位(U)的淀粉分解活力定义为在标准条件下(pH9.0；65℃)每分钟释放1μmol还原糖的酶量。CGT酶(环麦芽糖糊精糖基转移酶)鉴定为测定CGT酶的活性，采用了一个度量环化活性的β-CD产生特异性实验(Vikmon,1982)。用含有预纯化的CGT酶溶液和溶于pH8.0,100mM磷酸钠缓冲液中的含0.5％的可溶性淀粉(Merck,Darmstadt，德国)或0.2％的直链淀粉或0.2％的支链淀粉(均为重量/体积)的底物溶液以达到0.1ml的终鉴定体积。在65℃下进行30分钟的温育。由于β-CD能与通常紫色的酚酞形成稳定的无色包合配合物，可据此检测到β-CD。紫色的减少与由于CGT酶活性产生的β-CD成正比。1单位(U)的CGT酶活性在标准条件下(pH8.0；65℃)每分钟催化1μmol β-CD形成。由HPLC，还原糖也作为CGT酶作用的产物被检测到(见下)。因此，由还原糖的量可阐明CGT酶的水解活性。蛋白质测定用Lowry方法测定蛋白质浓度。进行微量分析并以牛血清白蛋白为标准蛋白质。pH和温度的影响为研究pH和温度对淀粉酶和CGT酶活性的影响，使用预先纯化的酶溶液。将10ml酶溶液和90ml pH4.0-11.0，溶于120mM通用缓冲液(Britton&Robinsson)中的0.5％(重量/体积)的底物溶液(可溶性淀粉；Merck)相混合。测量由于酶溶液和底物溶液相混合而导致的pH的变化。此混合物在冰上预温育30分钟后，在65℃进行30分钟酶鉴定。以产生的还原糖对各自的pH值作图。使用预先纯化的酶研究温度对淀粉酶和CGT酶活性的影响。将10ml酶溶液和90ml分别在最适pH9.0或8.0，溶于100mM磷酸钠缓冲液中的0.5％(重量/体积)的底物溶液(可溶性淀粉；Merck)相混合。在30℃和80℃之间的温度下温育30分钟。为检测温度稳定性，带螺旋盖的Eppendorf管中的酶溶液在60℃、70℃和80℃温育长达21小时，并且在一定的时间间隔取出样品用于检测残留淀粉酶或CGT酶活性。底物特异性为检测α-淀粉酶或CGT酶的底物特异性，将酶与含有可溶性淀粉(Merck)(0.5％)、直链淀粉(0.2％)、支链淀粉(0.2％)、普鲁兰(0.2％)、麦芽三糖、麦芽四糖和麦芽五糖(均为0.2％)(均为重量/体积)的底物溶液一起温育。在标准条件下(pH8.0；65℃)温育30分钟。通过测定酶作用产生的环糊精的量来确定酶活性。水解产物的分析用带有Aminex-HPX-42 A柱(300×7.8mm；Bio-Rad,Hercules,Calif.)的高效液相色谱(HPLC)(Knauer GmbH,Berlin，德国)分析淀粉酶和CGT酶对不同底物作用的水解模式。1份预先纯化的特定酶与9份pH8.0的底物溶液在65℃一起温育长达16上时。温育后，将样品保存于-20℃直到进行分析。使用按照重量/体积溶于100mM磷酸钠缓冲液中的(对于淀粉酶和CGT酶分别为pH9.0和pH8.0)，可溶性淀粉(0.5％)，普鲁兰(0.5％)直链淀粉(0.2％)，支链淀粉(0.2％)，麦芽寡糖DP1到DP5(DP=多聚化程度)，环糊精混合物(0.1％)和纯环糊精(α,β,γ)作为底物溶液。
由于γ-CD和DP2滞留时间相同，为区别它们进行如下实验。在标准条件下(pH8.0；65℃)将作为底物的可溶性淀粉(0.5％)与CGT酶一起温育60分钟，然后100℃煮5分钟。分析液冷却并与0.125U的酵母α-葡萄糖苷酶(Boehringer,Mannheim，德国)在25℃温育30分钟，以将麦芽糖和麦芽三糖降解为葡萄糖。在约30分钟保留时间的提示检测信号此时仅为γ-CD，可以正确地测定CD之间的比例。化学试剂普鲁兰环糊精和麦芽寡聚糖获自Sigma(St.Louis,Mo.)。用于电泳的化学试剂购自Serva(Heidelberg，德国)。其它化学试剂获自Merck(Darmstadt，德国)。Southern印迹杂交分析条件依据Sambrook等人(1989)，出处同前描述的方法，在尼龙滤膜(Hybond-N,Amersham)上进行与32P标记的PCR探针的Southern印迹杂交。将膜置于塑料袋中，在50％(v/v)甲酰胺，6×SSC,0.05×BLOTTO,1mM EDTA中，42℃预杂交1-2小时。然后将膜与放射性标记的变性DNA探针在50％(v/v)甲酰胺，6×SSC,0.5％(w/v)SDS,1mM EDTA中，42℃杂交过夜(杂交溶液中无甲酰胺的，相应温度为68℃)。杂交后，在50℃首先用2×SSC,0.5％(w/v)SDS,然后用0.1×SSC,0.5％(w/v)SDS在50℃洗膜。然后将膜包在Saran Wrap中，按照所要求的时间在-70℃进行X-射线胶片曝光。免疫交叉反应性利用经纯化的CGT酶可以制备用于确定免疫交叉反应性的抗体。更具体地，按照N.Axelsen等人在定量免疫电泳手册BlackwellScientific Publications,1973,23章，或A.Johnstone和R.Thorpe，实用免疫化学，Blackwell Scientific Publications,1982(更具体地p.27-31)中描述的步骤，通过免疫兔可以产生抗本发明的CGT酶的抗血清。纯化的免疫球蛋白质可以获自抗血清，例如通过盐沉淀((NH4)2SO4)，然后进行透析和例如用DEAE-Sephadex的离子交换层析。蛋白质的免疫化学特性可以用正交双扩散分析(O.Ouchterlony在实验免疫学手册，(D.M.Weir，编)Blackwell Scientific Publications,(1967),p.655-706)，或者交叉免疫电泳(N.Axelsen等人，出处同前，3和4章)，或者火箭免疫电泳(N.Axelsen等人，2章)来完成。实施例1包含本发明的CGT酶的Thermoalcalibacter bogoriae DSM No.9380在厌氧条件下在下面的培养基中培养(NH4)2SO4,1.0；NH4Cl,0.4；Na2S2O4,0.1；K2HPO4,0.5；MgSO4,0.1；CaCl2,0.05；NaCl,10.0；胰化蛋白质胨，0.25；酵母提取物，0.25；FeCl3,0.01；刃天青，0.001；NaHCO3,2.2；Na2CO3,2.2；Cystein,0.5；淀粉，5.0，均以克/升为浓度单位。微量元素溶液141,10ml/l和维生素溶液141,10ml，均按1993年DSM的菌株目录描述来制备。
大规模培养在19升发酵罐(Bioengineering,Wald，瑞士)，pH调节在9.0,50℃条件下进行。培养物以300转/分搅动，并以10升/小时的量通入N2。发酵罐接种需用1升在50℃,2升摇瓶中不振摇生长8小时的预培养物。淀粉分解酶的纯化除非有其它说明，所有纯化步骤都在室温进行。在19升发酵罐中经过8小时培养，16升培养液在41℃,12,000转/分转速的连续流动离心头(Heraeus,Osterode，德国)中离心，直到细胞由培养基上清中分离出来。然后培养基上清用10kD的过滤器(Filtron)错流过滤使终体积浓缩至1升。再用带10kD滤膜的Amicon滤室(Amicon)进一步完成浓缩。为了去除产生干扰的H2S并改变缓冲液，将浓缩的上清液过PD-10的离子交换柱(Pharmacia)，并用100mM,PH 9.0的磷酸钠缓冲液洗脱。收集包含淀粉分解活性的洗脱液并用Amicon滤室(10kD滤膜Amicon)浓缩10倍。将这种溶液样品用于经100mM,pH 9.0的磷酸钠缓冲液预平衡的Q-Sepharose阴离子交换层析柱(15×2.5cm)(Pharmacia)。柱子用90ml平衡缓冲液洗.酶溶液用含1M NaCl的平衡缓冲液洗脱，所用NaCl浓度梯度0到300mM及300到500mM，流速0.2ml/分钟。收集各级分(每管2ml)并依照前面“材料和方法”部分测定它们的淀粉水解活性。将活性级分收集，合并然后用Amicon滤室浓缩10倍。将这种预提纯的淀粉酶样品加到经50mM,pH 9.0的磷酸钠缓冲液预平衡的Superose 75凝胶过滤柱(Pharmacia)中。酶用流速0.1ml/分钟的平衡缓冲液洗脱。收集各级分(1ml/管)，合并活性级分，然后用带有10kDa膜的Amicon滤室浓缩。CGT酶的纯化/分离培养后浓缩70倍的培养液上清中淀粉酶/CGT酶的特异性活性经测定为0.096U/mg。如前所述，由于发酵过程中产生H2S，为了去除H2S、硫化物和其它活性干扰物质，必须应用PD-10离子交换柱进行纯化。经过这步处理，检测出的活性提高到0.48U/mg。在以前检测还原糖的方法中这种影响未被考虑(数据没有给出)。浓缩的培养液上清经活性染色在SDS-PAGE电泳胶上呈现三个活性区带(图1，泳道2)。具有57±3kDa表观分子量的最低活性带显示出α-淀粉酶活性。将浓缩10倍的PD-10洗脱液样品用于Q-Sepharose阴离子交换层析柱(Pharmacia，瑞典；25×200mm)，此柱子用Bio-Rad Econo系统以1.0ml/分钟速度用平衡缓冲液(100mM,pH 8.0的磷酸钠)洗脱。将这种含淀粉酶的浓缩10倍的样品(图1，泳道3)用于Superdex 75凝胶过滤柱(Pharmacia，瑞典；15×300mm)并用Bio-Rad Econo系统以0.1ml/分钟流速，用100mM,pH 8.0的磷酸钠缓冲液洗脱。在NaCl浓度约400mM时洗脱下CGT酶的活性，混合包含活性酶的级分，然后用带有10kDa排阻体积膜的Amicon滤室浓缩10倍。这种预提纯的具有2443U/mg环化活性的CGT酶溶液被用于酶的进一步表征。银染的单一蛋白质区带与经活性染色测定的活性淀粉酶区带的迁移率相一致(图1，泳道6和7)。实施例2CGT酶的表征；分子量的测定CGT酶的分子量用活性染色的SDS-PAGE凝胶测定，显示为67±2kDa(图1，泳道6+7)。pH和温度对CGT酶活性的影响当用淀粉为底物分别检测还原糖(水解作用)或环糊精产生(环化作用)时，预提纯的CGT酶显示不同的最适pH值。在标准分析条件(65℃,pH 8.0,30分钟)下温育后，由水解活性得到的数据显示出在pH 8.0时的最适pH值(图2)。在pH范围pH 6.0到pH 9.2之间可检测出大于40％的残留活性。如果将CGT酶的环化活性数据对各自的pH值作图，则显示出活性的宽pH范围(图2)。显示出在pH 4.0到pH 10.0之间产生CD。观察发现，于pH 5到pH7之间由CGT酶活性产生几乎相同的最高水平的CD产物，在高pH值时产生更高产量的CD。
CGT酶的最适温度在pH 8.0，温育60分钟内测量为65℃(图3)。分别在50℃和75℃检测50％残留活性，表明CGT酶活性具有宽的温度范围。在65℃，即它的最适温度，酶可保持稳定2小时以上，但在70℃,1小时内酶失活(数据没有给出)。水解产物分析。为了测定预提纯的CGT酶作用的水解产物，在65℃,pH 8.0时将酶与不同底物温育至16小时。通过检测环化活性可定量测定底物特异性，且用定量HPLC分析可阐明产生的CD的比例。在本发明的CGT酶作用下，淀粉(Merck)和支链淀粉(图4)均被充分水解。当淀粉由CGT酶作用水解时，经20分钟温育时间作为主产物的α-CD被检测出(图4A)，与经120分钟温育时间一样；用支链淀粉温育120分钟也可得到同样的结果(图4B)。16小时的温育时间将产生不同的CD-寡聚物比率，这是除图5之外又经HPLC分析(图4,B)证明的，表明CD-比例的不同是由于温育时间。经过2小时温育后每一种分析液的优势水解产物是α-CD，而在延长温育时间后，主水解产物为α-CD和β-CD，两者产生比例大致相同。仅极少量产生γ-CD。实施例3测定T.bogoriae DMS No.9380的部分CGT酶序列为了制备T.bogoriae DSM No.9380 CGT酶的PCR产物，对许多由SWISS PROT数据库获得的已知CGT酶进行序列比较以确定CGT酶的保守区域。在已确定的相互之间具有合适距离的保守区域(见下)的基础上，设计了3个针对编码保守区域的序列的引物(引物1-3见下)。
基于已确定的保守区域的知识设计P1:TDVIYQI(SEQ ID No.1)。P1是一种N-末端引物。设计P1以掩盖CGT酶序列的一些不同处。这通过整合入脱氧肌苷或简并的碱基实现。相对于蛋白质序列P1在下游。
基于已确定的保守区域的知识设计P2:RWINNDV(SEQ ID No.2)。相对于蛋白质序列P2在上游。P2引物亦被简并化以掩盖一定程度的序列多样性。
基于已确定的保守区域的知识设计P3:TSYHGYWA(SEQ IDNo.3)。P3类似P1，在蛋白质序列的下游。
第一轮测序后，在引物P1-P3基础上设计了另外3个命名为P4-P6的引物。
P15′ACNGAYGTGATITAYCARAT′3(SEQ ID NO.4)P25′ACRTCRTTRTTDATCCANCG′3(SEQ ID NO.5)P35′CATCNTAYCAYGGNTAYTGGGC′3(SEQ ID NO.6)P45′CTTTATTCTGAGGACGGGGCTGATTTGC′3(SEQ ID NO.7)P55′GTTCTCTAAAATCATTTACATCCCC′3(SEQ ID NO.8)P65′GCATTTTTACTAACATCAAGGGG′3(SEQ ID NO.9)D=A、G或T；R=A或G；Y=T或C；N=A、C、T或G；I=脱氧肌苷用引物对P1和P2或引物对P2和P3，用依实施例4(见下)描述的方法对从T.bogoriae提纯的基因组DNA进行PCR。根据生产商说明在缓冲液条件下应用Ampli-Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer inc.)。在94℃变性2分钟，以退火温度35℃,2分钟延伸时间进行5轮反应，再以退火温度50℃，2分钟延伸时间进行25轮反应。
用P1-P2引物对得到1.2kb的一段PCR带，而用P2-P3引物对得到0.9kb的一段PCR带。这与期望得到的CGT酶大小相符。
PCR产物的测序通过应用染料-终止子混合物(Perkin-Elmer，美国)进行循环测序和应用P1-P6引物的自动测序完成。此法可测定P1到P2引物间的1.15kb DNA序列。
SEQ ID NO.10显示了由T.bogoriae CGT酶内部的PCR片段测序获得的DNA序列。
进一步序列测定由实施例4中描述的反向PCR完成。实施例4CGT酶进一步测序在实施例3中，测定了一段由T.bogoriae DSM No.9380 CGT酶编码基因经PCR扩增得到的长1.15kb的DNA序列片段。这段序列作为应用反向PCR方法测定CGT酶基因序列其它部分的起点。由此，制备了如下两个相应于已测序的1.15kb DNA序列的两个末端附近的区域，且从各自读起的寡聚核苷酸引物。引物101304:5‘-TCGTAAGCCTATGTCGTC-3’(SEQ ID NO.11)引物101305:5‘-ACCTCTCCAATCTCCACC-3’(SEQ ID NO.12)从T.bogoriae细胞中提取染色体DNA(溶菌酶处理/酚抽提)。在第一次尝试时，酚抽提后用限制性酶PstⅠ消化这部分DNA，并连接，然后此样品的一部分再用BglⅡ消化。以此物作为应用引物101304和引物101305(退火温度49℃)进行PCR扩增的模板。未见扩增产物。
然后用PstⅠ+BamHⅠ+EcoRⅠ+HindⅢ+NsiⅠ+SaⅡ酶消化连接混合物，并将消化后的样品连接。连接后，用Bg1Ⅱ进行消化。这一产物用作PCR反应的模板。这次获得1kb、1.4kb和2kb的片段。这些片段经过凝胶提纯，用作新的PCR反应的模板。再次获得1kb和1.4kb的片段。将这些片段进行凝胶提纯，DNA测序，应用与PCR扩增相同的引物进行测序。
1kb片段的DNA序列揭示出这个片段衍生自CGT酶基因，所获得的序列可用于延伸实施例3中确定的序列。
所确定的总DNA序列，以及它翻译成的氨基酸序列见SEQ ID NO:13和14。
应用GCG版本9的程序软件包中的BLASTP和FASTA程序将推导出的氨基酸序列SEQ ID NO.14与数据库序列相比较。应用任一种程序均确定同样的三段序列得分最高。它们是SW:AMY-THETU！P26827(热产硫磺热厌氧杆菌)SW:CDGT-BACST！P31797(嗜热脂肪芽孢杆菌)SW:CDGT-BACOH！P27036(Bacillus ohbensis)应用GCG版本8程序软件包的程序区间测定SEQ ID 14与这些序列的同源性。测得百分比一致性如下图。
应用GCG版本9的程序软件包中的BLASTP和FASTA程序将DNA序列SEQ ID NO.13与数据库序列相比较。用任一研究中发现三个得分最高的序列在以下四段序列之间GB-BA:TTPULSA！M57692(热产硫磺热厌氧杆菌基因)GB-BA:BSCGT5！X59043(嗜热脂肪芽孢杆菌)GB-BA:BSCGT232！X59044(嗜热脂肪芽孢杆菌)GB-BA:BSCGT1！X59042(嗜热脂肪芽孢杆菌)应用GCG版本8程序软件包的程序区间测定SEQ ID 13与这些序列的同源性。测得百分比一致性如下图。
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序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人(A)姓名Novo Nordisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsvaerd(E)国家丹麦(F)邮政编码(ZIP):DK 2880(G)电话+45 4444 8888(H)传真+45 44493256(ⅱ)发明名称一种具有CGT酶活性的酶(ⅲ)序列数目14(ⅳ)计算机可读信息(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0,Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ⅱ)分子类型其它核酸(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)其它信息/desc“保守区”(ⅹⅰ)SEQ ID NO:1的序列描述Tnr Asp Val Ile Tyr GlnIle1 5(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ⅱ)分子类型其它核酸(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)其它信息/desc“保守区”(ⅹⅰ)SEQ ID NO:2的序列描述Arg Trp Ile Asn Asn Asp Val1 5(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ⅱ)分子类型其它核酸(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)其它信息/desc“保守区”(ⅹⅰ)SEQ ID NO:3的序列描述Thr Ser Tyr His Gly Tyr Trp Ala1 5(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ⅱ)分子类型其它核酸(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)其它信息/desc“引物1”(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)位置3,6,12,15,18(C)其它信息R=A或G；Y=T或C；N=A,C,T或G；I=脱氧肌苷(ⅹⅰ)SEQ ID NO:4的序列描述ACNGAYGTGA TITAYCARAT 20(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ⅱ)分子类型其它核酸(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature
(B)其它信息/desc“引物2”(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)位置3,6,12,18(C)其它信息D=A,G或T；R=A或G；N=A,C,T或G；(ⅹⅰ)SEQ ID NO:5的序列描述ACRTCRTTRT TDATCCANCG 20(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ⅱ)分子类型其它核酸(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)其它信息/desc“引物3”(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)位置5,8,11,14,17(C)其它信息Y=T或C；N=A,C,T或G；(ⅹⅰ)SEQ ID NO:6的序列描述CATCNTAYCA YGGNTAYTGG GC 22(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度28个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ⅱ)分子类型其它核酸(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)其它信息/desc“引物4”(ⅹⅰ)SEQ ID NO:7的序列描述CTTTATTCTG AGGACGGGGC TGATTTGC28(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度25个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ⅱ)分子类型其它核酸(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)其它信息/desc“引物5”(ⅹⅰ)SEQ ID NO:8的序列描述GTTCTCTAAA ATCATTTACA TCCCC 25(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)长度23个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ⅱ)分子类型其它核酸(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)其它信息/desc“引物6”(ⅹⅰ)SEQ ID NO:9的序列描述GCATTTTTAC TAACATCAAG GGG 23(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)长度1155个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅵ)初始来源(B)菌株Thermoalcalibacter bogoriae DSM No.9380(ⅹⅰ)SEQ ID NO:10的序列描述CCACCGATGT GATGTATCAG ATTGTAACAG ATCGTTTTTT AGATGGCGAT AAATATAATA 60ATCCAACTTG TGAAAACCTT TATTCTGAGG ACGGGGCTGA TTTGCGTAAA TATTTAGGTG 120GAGATTGGAG AGGTATTATA CAAAAAATTG AGGATGGATA TTTACCTGAT ATGGGAATTT 180CAGCTATTTG GATTTCTTCA CCAGTAGAAA ATATATATGC TGTTCATCCG CAATTTGGAA 240CATCTTATCA TGGTTATTGG GCAAGGGATT TTAAAAGAAA TAATCCTTTT TTTGGGGATC 300TAAATGATTT TAGAGAACTT ATAGCGGTTG CTAATGAACA TGATATAAAA GTAATTATTG 360ATTTTGCACC TAATCATACT TCTCCAGCAG AAGTTAATAA TCCTAACTAT GCTGAAGATG 420GTAATTTGTA TAATAACGGA GAATTTGTAG CTTCTTATTC TAATGATTTA AATGAAATTT 480TTTACCATTT TGGAGGAACT GATTTTTCAA CTTATGAAGA TAGTATATAT AGAAACCTGT 540TTGATTTAGC AGGATTAAAT TTAAATAATA ATTTTGTTGA TCAATATTTA CGTGATTCGA 600TAAAATTTTG GTTAGATCTC GGTGTTGATG GTATTAGAGT GGATGCTGTT AAACATATGC 660CGTTAGGATG GCAAAAATCT TTTGTGGATA CCATTTATAA TCATAAACCT GTATTTGTTT 720TTGGTGAGTG GTATTTAGGT AAAGATGAAT ATGATCCTAA TTATTATCAT TTTGCAAATA 780ATAGTGGTAT GAGTTTATTA GACTTTGAAT TTGCTCAAAC AACACGTAGT GTGTTTCGAA 840ATCATGAAAA AAATATGTTT GACTTATATG ACATGCTAAA AAATACGGAA AACAACTATG 900AACGTGTTGT AGATCAGGTA ACTTTTATTG ATAATCATGA TATGGATCGC TTTCACTATG 960ATGGAGCAAC TAAAAGAAAT GTAGAAATTG GATTAGCATT TTTACTAACA TCAAGGGGAG 1020TTCCAACTAT TTATTATGGT ACTGAACAAT ATTTAACAGG AAATGGTGAT CCATATAATC 1080GTAAGCCTAT GTCGTCTTTT GATCAAAATA CAAAAGCATA TAAAATTATT CAAAAATTAG 1140CACCTTTAAG GAAGT1155(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ⅱ)分子类型其它核酸(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)其它信息/desc“引物101304”(ⅹⅰ)SEQ ID NO:11的序列描述TCGTAAGCCT ATGTCGTC 18(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ⅱ)分子类型其它核酸(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)其它信息/desc“引物101305”(ⅹⅰ)SEQ ID NO:12的序列描述ACCTCTCCAA TCTCCACC18(2)SEQ ID NO:13的信息
(ⅰ)序列特征(A)长度1580个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅵ)初始来源(B)菌株Thermoalcalibacter bogoriae DSM No.9380(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..1580(ⅹⅰ)SEQ ID NO:13的序列描述GAT GTG ATG TAT CAG ATT GTA ACA GAT CGT TTT TTA GAT GGC GAT AAA 48Asp Val Met Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Leu Asp Gly Asp Lys1 5 10 15TAT AAT AAT CCA ACT TGT GAA AAC CTT TAT TCT GAG GAC GGG GCT GAT 96Tyr Asn Asn Pro Thr Cys Glu Asn Leu Tyr Ser Glu Asp Gly Ala Asp20 25 30TTG CGT AAA TAT TTA GGT GGA GAT TGG AGA GGT ATT ATA CAA AAA ATT 144Leu Arg Lys Tyr Leu Gly Gly Asp Trp Arg Gly Ile Ile Gln Lys Ile35 40 45GAG GAT GGA TAT TTA CCT GAT ATG GGA ATT TCA GCT ATT TGG ATT TCT 192Glu Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Met Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Ser50 55 60TCA CCA GTA GAA AAT ATA TAT GCT GTT CAT CCG CAA TTT GGA ACA TCT 240Ser Pro Val Glu Asn Ile Tyr Ala Val His Pro Gln Phe Gly Thr Ser65 70 75 80TAT CAT GGT TAT TGG GCA AGG GAT TTT AAA AGA AAT AAT CCT TTT TTT 288Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Arg Asn Asn Pro Phe Phe85 90 95GGG GAT CTA AAT GAT TTT AGA GAA CTT ATA GCG GTT GCT AAT GAA CAT 336Gly Asp Leu Asn Asp Phe Arg Glu Leu Ile Ala Val Ala Asn Glu His100 105 110GAT ATA AAA GTA ATT ATT GAT TTT GCA CCT AAT CAT ACT TCT CCA GCA 384Asp Ile Lys Val Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala115 120125GAA GTT AAT AAT CCT AAC TAT GCT GAA GAT GGT AAT TTG TAT AAT AAC 432Glu Val Asn Asn Pro Asn Tyr Ala Glu Asp Gly Asn Leu Tyr Asn Asn130 135 140GGA GAA TTT GTA GCT TCT TAT TCT AAT GAT TTA AAT GAA ATT TTT TAC 480Gly Glu Phe Val Ala Ser Tyr Ser Asn Asp Leu Asn Glu Ile Phe Tyr145 150 155 160CAT TTT GGA GGA ACT GAT TTT TCA ACT TAT GAA GAT AGT ATA TAT AGA 528His Phe Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Tyr Glu Asp Ser Ile Tyr Arg165 170 175AAC CTG TTT GAT TTA GCA GGA TTA AAT TTA AAT AAT AAT TTT GTT GAT 576Asn Leu Phe Asp Leu Ala Gly Leu Asn Leu Asn Asn Asn Phe Val Asp180 185 190CAA TAT TTA CGT GAT TCG ATA AAA TTT TGG TTA GAT CTC GGT GTT GAT 624Gln Tyr Leu Arg Asp Ser Ile Lys Phe Trp Leu Asp Leu Gly Val Asp195 200 205GGT ATT AGA GTG GAT GCT GTT AAA CAT ATG CCG TTA GGA TGG CAA AAA 672Gly Ile Arg Val Asp Ala Val Lys His Met Pro Leu Gly Trp Gln Lys210 215 220TCT TTT GTG GAT ACC ATT TAT AAT CAT AAA CCT GTA TTT GTT TTT GGT 720Ser Phe Val Asp Thr Ile Tyr Asn His Lys Pro Val Phe Val Phe Gly225 230 235 240GAG TGG TAT TTA GGT AAA GAT GAA TAT GAT CCT AAT TAT TAT CAT TTT768Glu Trp Tyr Leu Gly Lys Asp Glu Tyr Asp Pro Asn Tyr Tyr His Phe245 250 255GCA AAT AAT AGT GGT ATG AGT TTA TTA GAC TTT GAA TTT GCT CAA ACA 816Ala Asn Asn Ser Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Glu Phe Ala Gln Thr260 265 270ACA CGT AGT GTG TTT CGA AAT CAT GAA AAA AAT ATG TTT GAC TTA TAT 864Thr Arg Ser Val Phe Arg Asn His Glu Lys Asn Met Phe Asp Leu Tyr275 280 285GAC ATG CTA AAA AAT ACG GAA AAC AAC TAT GAA CGT GTT GTA GAT CAG 912Asp Met Leu Lys Asn Thr Glu Asn Asn Tyr Glu Arg Val Val Asp Gln290 295 300GTA ACT TTT ATT GAT AAT CAT GAT ATG GAT CGC TTT CAC TAT GAT GGA960Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe His Tyr Asp Gly305 310 315 320GCA ACT AAA AGA AAT GTA GAA ATT GGA TTA GCA TTT TTA CTA ACA TCA1008Ala Thr Lys Arg Asn Val Glu Ile Gly Leu Ala Phe Leu Leu Thr Ser325 330 335AGG GGA GTT CCA ACT ATT TAT TAT GGT ACT GAA CAA TAT TTA ACA GGA1056Arg Gly Val Pro Thr Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Leu Thr Gly340 345 350AAT GGT GAT CCA TAT AAT CGT AAG CCT ATG TCG TCT TTT GAT CAA AAT1104Asn Gly Asp Pro Tyr Asn Arg Lys Pro Met Ser Ser Phe Asp Gln Asn355 360 365ACA AAA GCA TAT AAA ATT ATT CAA AAA TTA GCA CCT TTA AGG AAG TCT1152Thr Lys Ala Tyr Lys Ile Ile Gln Lys Leu Ala Pro Leu Arg Lys Ser370 375 380AAC CCA GCC CTT GCT TAC GGA ACA ACA CAA CAA CGC TGG TTG AAT AAT1200Asn Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Thr Thr Gln Gln Arg Trp Leu Asn Asn385 390 395 400GAT GTT ATT ATT TAT GAA CGT AAA TTT GGA AAT AAT ATT GTT TTA GTG1248Asp Val Ile Ile Tyr Glu Arg Lys Phe Gly Asn Asn Ile Val Leu Val405 410 415GCA ATA AAT AGA AAT TTA AGT CAA TCT TAC TCT ATA ACT GGT CTC AAT1296Ala Ile Asn Arg Asn Leu Ser Gln Ser Tyr Ser Ile Thr Gly Leu Asn420 425 430ACC AAA CTT CCT GAG GGT TAT TAT TAT GAT GAG CTA GAC GGA TTG TTA1344Thr Lys Leu Pro Glu Gly Tyr Tyr Tyr Asp Glu Leu Asp Gly Leu Leu435 440 445TCA GGT AAA AGT ATT ACT GTT AAC CCT GAT GGT TCA GTG AAT CAA TTT1392Ser Gly Lys Ser Ile Thr Val Asn Pro Asp Gly Ser Val Asn Gln Phe450 455 460ATA ATT AAT CCT GGA GAA GTA AGT ATA TGG CAA TTT GCA GGG GAA ACT1440Ile Ile Asn Pro Gly Glu Val Ser Ile Trp Gln Phe Ala Gly Glu Thr465 470 475 480ATT ACT CCA CTT ATT GGG CAA GTT GGA CCT ATT ATG GGT CAA GTA GGC1488Ile Thr Pro Leu Ile Gly Gln Val Gly Pro Ile Met Gly Gln Val Gly485 490 495AAT AAA GTG ACT ATT AAT GGT GTT GGT TTT GGT GAT AAA AAA GGT ACA1536Asn Lys Val Thr Ile Asn Gly Val Gly Phe Gly Asp Lys Lys Gly Thr500 505 510GTA AAT TTT GGA CAA ATA GAT GCA ACA ATT ATT AGT TGG ACT AA1580Val Asn Phe Gly Gln Ile Asp Ala Thr Ile Ile Ser Trp Thr515 520 525(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)长度526个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑类型线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)SEQ ID NO:14的序列描述Asp Val Met Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Leu Asp Gly Asp Lys1 5 10 15Tyr Asn Asn Pro Thr Cys Glu Asn Leu Tyr Ser Glu Asp Gly Ala Asp20 25 30Leu Arg Lys Tyr Leu Gly Gly Asp Trp Arg Gly Ile Ile Gln Lys Ile35 40 45Glu Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Met Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Ser50 55 60Ser Pro Val Glu Asn Ile Tyr Ala Val His Pro Gln Phe Gly Thr Ser65 70 75 80Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Arg Asn Asn Pro Phe Phe85 90 95Gly Asp Leu Asn Asp Phe Arg Glu Leu Ile Ala Val Ala Asn Glu His100 105 110Asp Ile Lys Val Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala115 120 125Glu Val Asn Asn Pro Asn Tyr Ala Glu Asp Gly Asn Leu Tyr Asn Asn130 135 140Gly Glu Phe Val Ala Ser Tyr Ser Asn Asp Leu Asn Glu Ile Phe Tyr145 150 155 160His Phe Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Tyr Glu Asp Ser Ile Tyr Arg165 170 175Ash Leu Phe Asp Leu Ala Gly Leu Asn Leu Asn Asn Asn Phe Val Asp180 185 190Gln Tyr Leu Arg Asp Ser Ile Lys Phe Trp Leu Asp Leu Gly Val Asp195 200 205Gly Ile Arg Val Asp Ala Val Lys His Met Pro Leu Gly Trp Gln Lys210 215 220Ser Phe Val Asp Thr Ile Tyr Asn His Lys Pro Val Phe Val Phe Gly225 230 235 240Glu Trp Tyr Leu Gly Lys Asp Glu Tyr Asp Pro Asn Tyr Tyr His Phe245 250 255Ala Asn Asn Ser Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Glu Phe Ala Gln Thr260 265 270Thr Arg Ser Val Phe Arg Asn His Glu Lys Asn Met Phe Asp Leu Tyr275 280 285Asp Met Leu Lys Asn Thr Glu Asn Asn Tyr Glu Arg Val Val Asp Gln290 295 300Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe His Tyr Asp Gly305 310 315 320Ala Thr Lys Arg Asn Val Glu Ile Gly Leu Ala Phe Leu Leu Thr Ser325 330 335Arg Gly Val Pro Thr Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Leu Thr Gly340 345 350Asn Gly Asp Pro Tyr Asn Arg Lys Pro Met Ser Ser Phe Asp Gln Asn355 360 365Thr Lys Ala Tyr Lys Ile Ile Gln Lys Leu Ala Pro Leu Arg Lys Ser370 375 380Asn Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Thr Thr Gln Gln Arg Trp Leu Asn Asn385 390 395 400Asp Val Ile Ile Tyr Glu Arg Lys Phe Gly Asn Asn Ile Val Leu Val405 410 415Ala Ile Asn Arg Asn Leu Ser Gln Ser Tyr Ser Ile Thr Gly Leu Asn420 425 430Thr Lys Leu Pro Glu Gly Tyr Tyr Tyr Asp Glu Leu Asp Gly Leu Leu435 440 445Ser Gly Lys Ser Ile Thr Val Asn Pro Asp Gly Ser Val Asn Gln Phe450 455 460Ile Ile Asn Pro Gly Glu Val Ser Ile Trp Gln Phe Ala Gly Glu Thr465 470 475 480Ile Thr Pro Leu Ile Gly Gln Val Gly Pro Ile Met Gly Gln Val Gly485 490 495Asn Lys Val Thr Ile Asn Gly Val Gly Phe Gly Asp Lys Lys Gly Thr500 505 510Val Asn Phe Gly Gln Ile Asp Ala Thr Ile Ile Ser Trp Thr515 520 52权利要求
1．一种经分离的CGT酶，其特征为在与支链淀粉于65℃,pH8.0条件下温育2小时后产生至少75％的α-环糊精(相对于β和γ-环糊精)。
2．根据权利要求1的CGT酶，其中CGT酶获自Thermoalcalibacter属种的菌株。
3．一种获自Thermoalcalibacter属种菌株的经分离的胞外CGT酶。
4．根据权利要求2或3的CGT酶，其中Thermoalcalibacter属种菌株是一种中等热嗜碱性厌氧菌。
5．根据权利要求4的CGT酶，其中菌株是Thermoalcalibacterbogoriae，尤其是Thermoalcalibacter bogoriae DSM No.9380。
6．根据权利要求1-5中任一项的CGT酶，其中CGT酶具有ⅰ)由SDS-PAGE测定的67±10kD的分子量，和/或ⅱ)于pH8.0测量的65±10℃的最适温度。
7．一种制备根据权利要求1-4中任一项的CGT酶的方法，该方法包含在允许该酶产生的条件下培养Thermoalcalibacter属种的菌株，并从培养物中回收该酶。
8．根据权利要求7的方法，其中Thermoalcalibacter属种是菌株Thermoalcalibacter bogoriae，尤其是Thermoalcalibacter bogoriae DSMNo.9380。
9．一种DNA构件，包含编码CGT酶的DNA序列，此DNA序列包含a)包含SEQ ID No.13中所示部分DNA序列的编码CGT酶之DNA序列，或b)a)中定义的DNA序列的类似物，其ⅰ)与包含SEQ ID No.13所示部分序列的a)中定义的DNA序列至少70％同源，或ⅱ)与和包含SEQ ID No.13所示部分序列的a)中定义的DNA序列相同的寡核苷酸探针杂交，或ⅲ)编码一段与包含SEQ ID No.13所示部分序列的a)中定义的DNA序列编码的多肽至少70％同源的多肽，或ⅳ)编码与一种抗体发生免疫反应的多肽，此抗体抗源自Thermoalcalibacter bogoriae DSM No.9380的纯化的CGT酶，其由包含SEQ ID No.13所示部分序列的a)中定义的DNA序列编码。
10．根据权利要求9的DNA构件，其中该DNA序列是从一种Thermoalcalibacter属种菌株，如Thermoalcalibacter bogoriae，尤其是Thermoalcalibacter bogoriae DSM No.9380获得。
11．一种重组表达载体，其包含根据权利要求9或10的任一项DNA构件。
12．一种细胞，其包含根据权利要求1-8中任一项的DNA构件，或一种根据权利要求9至12中任一项的重组表达载体。
13．根据权利要求12的细胞，该细胞是微生物细胞，如细菌细胞，真菌细胞，如丝状真菌细胞或酵母细胞。
14．根据权利要求13的细胞，其中细胞是细菌细胞，是芽孢杆菌属的一种菌株，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌，或链霉菌属的一种菌株，如浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌，或肠杆菌属的菌株，如大肠杆菌。
15．一种制备CGT酶的方法，其包括在允许该酶产生的条件下培养根据权利要求12至14中任一项的细胞，并从培养物中回收该酶。
16．一种经分离的CGT酶，其a)是由根据权利要求9至10中任一项的DNA构件所编码的，b)根据权利要求15的方法生产。
17．一种包含根据权利要求1-6或16中任一项的CGT酶的酶组合物。
18．一种面包改良和/或面团改良组合物，包括根据权利要求1-6或权利要求16的任一项的一种CGT酶。
19．一种根据权利要求1-6或权利要求16中任一项的CGT酶或一种根据权利要求17的酶组合物在生产环糊精，特别是α-环糊精的方法中的用途。
20．一种根据权利要求1-6或权利要求16中任一项的CGT酶或一种根据权利要求17的酶组合物在面包改良或面团改良组合物中的用途。
21．一种面团或焙烤产品，其包括根据权利要求18的面包改良和/或面团改良组合物。
全文摘要
本发明涉及一种新型碱稳定的CGT酶,其主要产生α－环糊精,一种包含该CGT酶的酶组合物,以及该酶和酶组合物用于多数工业应用,如面团改良组合物中的用途。
文档编号C12N9/10GK1231691SQ97198278
公开日1999年10月13日 申请日期1997年9月26日 优先权日1996年9月26日
发明者C·斯约霍穆, S·普罗威, G·安特拉尼吉安 申请人:诺沃挪第克公司