专利名称：新型肌醇六磷酸酶及其制造方法
技术领域：
本发明涉及对肌醇六磷酸具有低米氏常数(这里缩写为Km)的廉价肌醇六磷酸酶，该酶降解饲料中所含的阻碍营养因子肌醇六磷酸，从而提高饲料的营养价值，同时还使由所说降解释放出来的磷酸得到有效利用。
背景技术：
磷是所有有机体的基本元素。磷包含在饲养家养动物的植物来源的饲料中，并且50至70％的磷以肌醇六磷酸的形式存在。植物种子中所含的大量肌醇六磷酸是磷酸酯的一种主要贮存物质。但是，肌醇六磷酸在单胃动物如猪、鸡等的消化器官中没有被消化和吸收而被排泄了，因此，虽然它是磷酸酯的一种主要贮存物质，但它一点也没被利用。因此，为了促进其生长，人们在单胃动物的饲料中加入无机磷酸盐，但是，在饲料中加入磷酸盐导致了粪便中磷含量的增加。近年来，由于家养动物的产量不断增加，家养动物的粪便也增加了，从而在全世界引起环境问题。具体来说，粪便中所含的磷是湖泊和沼泽中富营养现象的一个原因，排泄磷的数量达到要控制的地步，因而必须处理这个问题。
而且，肌醇六磷酸与作为重要的营养来源的二价金属如镁、钙、锌、铁等螯合，使它们难以被动物吸收，从而导致饲料营养价值的降低，因此，肌醇六磷酸被认为是一种阻碍营养因子。
由前所述，使用将肌醇六磷酸水解为肌醇和无机磷酸盐的酶处理饲料，从而使肌醇六磷酸释放磷酸盐来代替传统上添加的磷酸盐，同时降低粪便中的含磷量，并将作为阻碍营养因子的肌醇六磷酸降解，这种努力能提高饲料的营养价值(美国专利No.3,297,548(1967)《营养杂志》101卷，1289-1294(1971))。已知能产生肌醇六磷酸酶(降解肌醇六磷酸的酶)的微生物包括细菌如枯草芽孢杆菌和假单胞菌、酵母如酿酒酵母、丝状真菌如土曲霉、无花果曲霉和泡盛曲霉，关于来自无花果曲霉的肌醇六磷酸酶，其纯化和生物特征在《制备生物化学》18卷，443-458(1988)中介绍，其基因和氨基酸序列描述于《基因》127卷，87-94(1993)。来自泡盛曲霉的肌醇六磷酸酶的核苷酸序列和氨基酸序列描述于《基因》133卷，55-62(1992)。
为证明该酶具有的能力，需要使其底物浓度高于米氏常数(Km)，在具有相同最大反应速率(Vmax)的酶的情况下，具有较低Km值的酶，与具有较高Km值的酶相比较，即使在较低底物浓度时也不降低反应速率。也就是说，具有较低Km值的酶即使在较低底物浓度时也能维持足够的降解速率，而且与具有较高Km值的酶相比未降解底物的量也能减少。
来自丝状真菌的已知肌醇六磷酸酶的米氏常数对无花果曲霉(WO91/05053)来说为250uM，对米曲霉来说为330uM(《生物科学、生物技术和生物化学》57卷，1364-1365(1993)。
在一个方面，酸性磷酸酶纯化自不同的微生物，它们的特性已有报道，例如，来自无花果曲霉的酸性磷酸酶已被纯化，它们的特性已被检测(《制备生物化学》18卷，37-65(1988)。但是，酸性磷酸酶不能将肌醇六磷酸用作底物。因此，将它们按前述用来提高饲料中的营养价值是不可行的。
就前述而言，我们需要一种肌醇六磷酸酶，它能降解饲料中所含的、作为阻碍营养因子的肌醇六磷酸，从而提高饲料中的营养价值，并同时使所说降解释放的磷酸盐得到有效利用。
发明内容
因此本发明的目的是提供对肌醇六磷酸具有较低Km值的肌醇六磷酸酶以及制造该肌醇六磷酸酶的方法。
作为上述对解决这种难题所做的广泛研究的结果，从属于红曲霉属的微生物中，发明人发现了当以肌醇六磷酸为底物时Km值为10至110uM的新型肌醇六磷酸酶，揭示了它们的特性，并建立了制造所说肌醇六磷酸酶的方法，至此本发明完成。
即，本发明涉及具有Km值为10至110uM的新型肌醇六磷酸酶以及制造所说肌醇六磷酸酶的方法。
本发明的新型肌醇六磷酸酶的具体实例包括具有如下理化特性的3种肌醇六磷酸酶。
1．肌醇六磷酸酶Ⅰ
1)Km当肌醇六磷酸用作底物时为27uM；2)最适pH:pH5.5；3)pH稳定性在pH5.5至6.5的范围内稳定；4)最适温度50℃；5)温度稳定性至35℃稳定6)底物特异性在以肌醇六磷酸、对硝基苯磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、D-肌醇-2-磷酸、D-肌醇-1-磷酸、D-肌醇-1、4-二磷酸和三磷酸腺苷为底物时有活性；7)分子量约80至100KDa(凝胶过滤法)；及8)等电点pI5.7(层析聚焦法)。
2．肌醇六磷酸酶Ⅱ1)Km当肌醇六磷酸用作底物时为20uM；2)最适pH:pH6.0；3)pH稳定性在pH6.0至7.0的范围内稳定；4)最适温度50℃；5)温度稳定性至50℃稳定；6)底物特异性在以肌醇六磷酸、对硝基苯磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、D-肌醇-2-磷酸、D-肌醇-1-磷酸、D-肌醇-1、4-二磷酸和三磷酸腺苷为底物时有活性；7)分子量约120KDa(凝胶过滤法)；及8)等电点pI4.8(层析聚焦法)。
3．肌醇六磷酸酶Ⅲ1)Km当肌醇六磷酸用作底物时为107uM；2)最适pH:pH2.5；3)pH稳定性在pH2.0至8.0的范围内稳定；4)最适温度45℃；5)温度稳定性至60℃稳定；6)底物特异性在以对硝基苯磷酸、肌醇六磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、D-肌醇-2-磷酸、D-肌醇-1-磷酸、D-肌醇-1、4-二磷酸和三磷酸腺苷为底物时有活性；7)分子量约140KDa(凝胶过滤法)；及8)等电点pI5.2(层析聚焦法)；
9)N末端氨基酸序列示于SEQ ID NO:1。
用于本发明的微生物可以是任何能产生在肌醇六磷酸用作底物时Km值为10-110uM的新型肌醇六磷酸酶。其例子为属于红曲霉属的微生物，特别提到的是亚克红曲霉IFO3087。并且，能够制造在以肌醇六磷酸为底物时Km值为10至110uM的新型肌醇六磷酸酶的动物细胞也可用于本发明。
能够制造新型肌醇六磷酸酶的微生物用传统培养方法培养到肌醇六磷酸酶形成并积累。由培养物中回收肌醇六磷酸酶，从而制得新型肌醇六磷酸酶。以下，用于制造新型肌醇六磷酸酶的微生物称为新型肌醇六磷酸酶制备有机体。
如果新型肌醇六磷酸酶制备微生物是一种原核生物如大肠杆菌或真核生物如丝状真菌、酵母等，用来培养所说微生物的培养基可以是一种天然或合成培养基，只要培养基含有能被微生物同化的碳源、氮源、无机盐等，在培养基中微生物能有效生长。
碳源可以是任何能被微生物同化的碳源，包括葡萄糖、果糖、蔗糖、含有这些糖的糖浆、碳水化合物如淀粉、淀粉水解物等、有机酸如乙酸、丙酸等、以及醇类如乙醇、丙醇等。
氮源包括氨、各种无机酸和有机酸的铵盐如氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵等、和其它含氮化合物，以及蛋白胨、肉抽提物、酵母抽提物、玉米浆、酪素水解物、豆饼、豆饼水解物、以及由发酵而来的多种微生物及其降解物。
无机物质包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、硫酸钙等。
而且，含有小麦麸皮、大米麸皮等作为碳源、氮源和无机盐来源并补加合适盐的培养基可以在培养丝状真菌中用作培养基。
培养可在有氧环境下振荡培养中进行，或在通气条件下深层培养来进行。培养温度优选是15至40℃，培养期通常为16至96小时。在培养中，pH维持在3.0至9.0的范围内。培养基pH的调节用无机或有机的酸、碱溶液、尿素、碳酸钙或氨来进行。
在培养时，可以在培养基中加入氨苄青霉素、四环素等抗生素。
如果丝状真菌在含有固体物质如小麦麸皮等的培养基中培养时，丝状真菌的接种方法为，将其与固体成分有效混合，在小室中的多个铝质或不锈钢培养架上铺成薄薄一层，然后在控制温度、湿度和通气的条件下进行培养。具体来说，真菌在100％湿度、25℃至35℃下在培养箱内静止培养3至10天。
如果新型肌醇六磷酸酶制备有机体是动物细胞，培养动物细胞的培养基包括通常使用的RPMI1640培养基、Eagle’s MEM培养基、以及在上述培养基中含有胎牛血清的培养基等。
培养在存在5％CO2等的条件下进行。培养温度优选为35至37℃，培养期通常为3至7天。
在培养中，可在培养基中加入抗生素如卡那霉素、氨苄青霉素等。
为从新型肌醇六磷酸酶制备有机体的培养物中分离和纯化新型肌醇六磷酸酶，可以采用传统的酶分离和纯化技术。
例如，如果新型肌醇六磷酸酶在新型肌醇六磷酸酶制备有机体的细胞中积累，通过离心从培养物中收集细胞，然后洗涤并用超声仪、弗氏压碎器、Manton-Gaulin匀浆器、dynomill等破碎，从而得到无细胞抽提物。由无细胞抽提物离心得来的上清用诸如硫酸铵盐析、去盐、用一种有机溶剂沉淀、在诸如二乙基氨基乙基(DEAE)-Sepharose和DIAIONHPA-75(Mitsubishi Chemical Industries Ltd)树脂上进行阴离子交换层析、在诸如S-Sepharose FF(Pharmacia)树脂上进行阳离子交换层析、在诸如丁基-Sepharose和苯基-Sepharose上进行疏水层析、在分子筛上凝胶过滤、层析聚焦和电泳如等电聚焦。如此能够获得纯化的酶制备物。
对纯化酶制备物的结构分析可用常用于蛋白化学的技术来完成，例如“基因克隆中所用的蛋白结构分析”，作者为Hisashi Hirano,TokyoKagaku Dojin(1993)出版。
如果新型肌醇六磷酸酶是细胞外分泌的，将培养物通过诸如离心得到可溶性级份，如果培养基成分中存在固体组分如小麦麸皮等，就用热水等抽提新型肌醇六磷酸酶，然后用诸如离心等技术获得可溶性级份。由此可溶性级份，用上面介绍的从无细胞抽提物上清中分离和纯化的技术就能获得新型肌醇六磷酸酶的纯化酶制备物。
在本发明中，新型肌醇六磷酸酶的活性可按标准的活性测量方法确定(参见下面的参考实施例)。
而且，新型肌醇六磷酸酶的Km值可用Lineweaver-Burk作图来确定，其中，用标准活性测量方法确定的新型肌醇六磷酸酶的活性对不同的底物浓度作图。
本发明的新型肌醇六磷酸酶可用于所需的将一种肌醇六磷酸盐转化为肌醇和无机磷酸的不同步骤中，例如生产动物饲料、大豆加工、猪和家禽的液体饲料、以及由肌醇六磷酸盐生产肌醇和肌醇单磷酸。
含有本发明的新型肌醇六磷酸酶的动物饲料可按如下方法生产，将所说的酶与载体如小麦麸皮混合，在一个喷洒柱或流动床中干燥，然后在干燥物中加入渗透压稳定剂如山梨糖醇和防腐剂如苯甲酸。动物饲料中新型肌醇六磷酸酶的量为每公斤动物饲料中10至5000U，优选100至1000U。
附图简述
图1显示肌醇六磷酸酶Ⅰ的最适pH。
图2显示肌醇六磷酸酶Ⅱ的最适pH。
图3显示肌醇六磷酸酶Ⅲ的最适pH。
图4显示肌醇六磷酸酶Ⅰ的pH稳定性。
图5显示肌醇六磷酸酶Ⅱ的pH稳定性。
图6显示肌醇六磷酸酶Ⅲ的pH稳定性。
图7显示肌醇六磷酸酶Ⅰ的最适温度。
图8显示肌醇六磷酸酶Ⅱ的最适温度。
图9显示肌醇六磷酸酶Ⅲ的最适温度。
图10显示肌醇六磷酸酶Ⅰ的温度稳定性。
图11显示肌醇六磷酸酶Ⅱ的温度稳定性。
图12显示肌醇六磷酸酶Ⅲ的温度稳定性。
实施本发明的最佳模式在下文中，通过参考实施例来详细介绍本发明。但是，本发明并不限于实施例。
参考实施例(测量肌醇六磷酸酶活性的方法)
在本发明中，肌醇六磷酸酶的标准活性测量按下面方式进行。
0.5ml含有2.5mM肌醇六磷酸钠(Sigma)的0.2M乙酸缓冲液pH5.5(或者在检测降解肌醇六磷酸的酸性磷酸酶活性时为甘氨酸-HCl缓冲液pH2.5)在37℃保温5分钟，加入0.5ml的酶溶液使反应开始(终浓度为1.25mM肌醇六磷酸钠、0.1M乙酸钠pH5.5或0.1M甘氨酸-HCl缓冲液pH2.5)。在37℃保温20分钟后，加入2ml的酶反应终止缓冲液(即含有10mM钼酸铵、5N硫酸和丙酮的1∶1∶2混合物)，加入0.1ml的1M柠檬酸，并与反应溶液混合。用分光光度计(Hitachi U-2000)测量380nm处溶液的吸收值。1个单位的肌醇六磷酸酶活性定义为每分钟释放1umol无机磷酸的酶量。
实施例1(肌醇六磷酸酶的制备)在一个2000ml三角瓶中加入200ml肌醇六磷酸酶生产培养基(1％蔗糖、0.2％NaNO3、0.05％MgSO4·7H2O、0.05％KCl、0.01％FeSO4·7H2O、0.1％玉米浆(C.S.L)pH5.5)，盖上硅化的海绵塞，在120℃灭菌20分钟。在其中接种亚克红曲霉IFO30873的菌丝，并静止培养10天以产生肌醇六磷酸酶。作为粗制的肌醇六磷酸酶溶液，使用980ml所获得的培养物，并由此获得约6单位的肌醇六磷酸酶。
实施例2(肌醇六磷酸酶的纯化)将粗制肌醇六磷酸酶溶液通过超滤(排阻分子量为10,000,Advantec)去盐。所获得的酶溶液上预先用20 mM MES缓冲液(pH6.0)(Katayama Kagaku)平衡的DEAE-Sepharose F.F.(Pharmacia)柱。用20mM MES缓冲液(pH6.0)洗涤后，肌醇六磷酸酶Ⅰ和酶Ⅲ用含有0.05MNaCl的20mM MES缓冲液(pH6.0)洗脱。然后肌醇六磷酸酶Ⅱ用含有0.1M NaCl的20mM MES缓冲液(pH6.0)洗脱。将如此分离的每种酶脱盐，并用超滤(排阻分子量为10,000,Advantec)分别浓缩约20倍，然后将每种酶上预先用20mM MES缓冲液(pH6.0)平衡的DEAE-Sepharose F.F.(Pharmacia)柱，在用20 mM MES缓冲液(pH6.0)洗涤后，蛋白用0-0.3M线性梯度的NaCl洗脱，从而获得肌醇六磷酸酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的级份。每种由此获得的酶溶液用超滤(排阻分子量为10,000,Advantec)分别浓缩约20倍，并上预先用含有0.05M KCl的20mM MES缓冲液(pH6.0)平衡的TOYO-pearl HW-55F(Tosoh公司)柱。肌醇六磷酸酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分别用含有0.05M KCl的20mM MES缓冲液(pH6.0)洗脱。
肌醇六磷酸酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分别按前述步骤纯化。
实施例3(肌醇六磷酸酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的Km值测量)纯化后的肌醇六磷酸酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ按照标准活性测量方法进行测量，其中以不同浓度的肌醇六磷酸作为底物，范围为0.00625至0.8mM。将结果的Lineweaver-Burk倒数作图以确定Km。肌醇六磷酸酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ对肌醇六磷酸的Km值为27,20和107uM。
实施例4(肌醇六磷酸酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的理化特性)①最适pH标准活性测量方法中的缓冲液被下列0.2M缓冲液取代，每一pH的活性按标准的活性测量方法测量。
甘氨酸-HCl缓冲液 pH2.0-3.5乙酸-乙酸钠缓冲液 pH3.5-5.5MES-缓冲液(优选缓冲液)pH5.5-7.0Tris-HCl缓冲液pH7.0-9.0结果示于图1、2和3。
肌醇六磷酸酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分别在pH5.5、6.0和2.5显示最大活性。
②pH稳定性当酶溶液在50mM的下列缓冲液中在30℃保温60分钟后，活性按标准活性测量方法测量。
甘氨酸-HCl缓冲液 pH2.0-4.0乙酸-乙酸钠缓冲液 pH4.0-5.5MES-缓冲液(优选缓冲液)pH5.5-7.0Tris-HCl缓冲液pH7.0-9.0结果示于图4、5和6。
肌醇六磷酸酶Ⅰ在pH5.5至6.5的范围内稳定，肌醇六磷酸酶Ⅱ在pH6.0至7.0的范围内稳定，肌醇六磷酸酶Ⅲ在pH2.0至8.0的范围内稳定。
③最适温度当用于测量酶活性的温度在30至70℃范围内改变时，每一温度的活性按标准的活性测量方法测量。
结果示于图7、8和9。
肌醇六磷酸酶Ⅰ和Ⅱ都在50℃显示最大活性，肌醇六磷酸酶Ⅲ在45℃显示最大活性。
④温度稳定性当酶溶液在4-70℃、在20mM MES缓冲液(pH6.0)中保温10分钟后，活性按标准活性测量方法测量。
结果示于图10、11和12。
肌醇六磷酸酶Ⅰ在高至35℃时稳定，肌醇六磷酸酶Ⅱ在高至50℃时稳定，肌醇六磷酸酶Ⅲ在高至60℃时稳定。
⑤底物特异性活性按标准活性测量方法测量，使用均制备为2.5mM的底物，结果示于表Ⅰ。
肌醇六磷酸酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ均具有低底物特异性。
表1肌醇六磷酸酶的底物特异性
⑥分子量分子量用在TOYO-pearl HW-55 F(柱大小为1.0×119cm,93.4ml)柱上凝胶过滤进行测量。标准用RNA酶A(M.W.15500)、卵清蛋白(M.W.42700)、白蛋白(M.W.63300)及醛缩酶(M.W.163000)作为标准制备。
肌醇六磷酸酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的分子量分别为80-100、120和140KDa。
⑦等电点将肌醇六磷酸酶上预先用20mM MES(pH6.0)平衡的Polybufferexchanger PBE 94柱(Pharmacia)，然后用10％Polybuffer 74-HCl(pH4.0)洗脱，肌醇六磷酸酶的等电点通过用pH计测量洗脱级份的pH值来确定。
结果显示，肌醇六磷酸酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的等电点分别为pI5.7、4.8和5.2。
实施例5(肌醇六磷酸酶Ⅲ的N-末端氨基酸序列分析)为用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定肌醇六磷酸酶的分子量，将该酶高度纯化，在12.5％multi-gel(Daiichi Kagaka K.K)中，将按照实施例2中纯化的50ul酶按B.J.Davis的方法(《Ann.N.Y.Acad.Sci》121卷，404-427(1964))进行非变性PAGE。电泳后，将凝胶切成5mm宽的胶条，并浸入1ml、20mM的MES(pH6.0)缓冲液中，并在4℃保存12小时，使酶浸出。将浸出物在旋转蒸发器中浓缩15至20倍后，用参考实施例中介绍的标准测量方法鉴定肌醇六磷酸酶级份。用巯基乙醇还原后，将10uL活性级份进行SDS-PAGE来获得高纯度的肌醇六磷酸酶Ⅲ。由此结果，用SDS-PAGE得到的肌醇六磷酸酶Ⅲ的分子量测定为约65KDa。
肌醇六磷酸酶Ⅲ的N末端氨基酸序列分析按下面方法进行。即，将实施例2中纯化的肌醇六磷酸酶Ⅲ在用2-巯基乙醇还原下进行SDS-PAGE，然后按照P.Matsudaira《J.B.C.》262卷，10035-10038(1987))电转移至PVDF膜上(ProBlott,Perkin Elmer)，转移了该酶的膜用考马斯亮蓝染色，将其上分子量约为65KDa的带切下，在气相蛋白测序仪(PDSQ-10,Shimadzu公司)上按厂家指示推荐的方法分析其N-末端氨基酸序列，由此获得的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:1。将这里介绍的氨基酸序列通过使用蛋白数据库检测同源性，结果发现它是一个新序列。
工业实用性根据本发明，可以提供对肌醇六磷酸有低Km值的肌醇六磷酸酶和通过使用具有生产和积累肌醇六磷酸酶能力的微生物来生产肌醇六磷酸酶的方法。
肌醇六磷酸酶可加入到饲料中来降解饲料中含有的作为阻碍营养因子的肌醇六磷酸，从而提高饲料的营养价值，同时使由所说的降解释放的磷酸得到充分利用。
序列表SEQ ID NO:1长度17类型氨基酸链型单链拓扑构型线型分子类型肽序列描述Phe Gln Ser Val Ile Ser Glu Lys Gln Phe Ser Gln Glu Phe Leu Asp Asn1 5 10 1权利要求
1．当肌醇六磷酸用作底物时，具有10至100uM米氏常数(以下Km)的肌醇六磷酸酶。
2．权利要求1的肌醇六磷酸酶，其中肌醇六磷酸酶Ⅰ具有以下理化特性1)Km当肌醇六磷酸用作底物时为27uM；2)最适pH:pH5.5；3)pH稳定性在pH5.5至6.5的范围内稳定；4)最适温度50℃；5)温度稳定性至35℃稳定；6)底物特异性在以肌醇六磷酸、对硝基苯磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、D-肌醇-2-磷酸、D-肌醇-1-磷酸、D-肌醇-1、4-二磷酸和三磷酸腺苷为底物时有活性；7)分子量约80至100KDa(凝胶过滤法)；及8)等电点pI5.7(层析聚焦法)。
3．权利要求1的肌醇六磷酸酶，其中肌醇六磷酸酶Ⅱ具有以下理化特性1)Km当肌醇六磷酸用作底物时为20uM；2)最适pH:pH6.0；3)pH稳定性在pH6.0至7.0的范围内稳定；4)最适温度50℃；5)温度稳定性至50℃稳定；6)底物特异性在以肌醇六磷酸、对硝基苯磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、D-肌醇-2-磷酸、D-肌醇-1-磷酸、D-肌醇-1、4-二磷酸和三磷酸腺苷为底物时有活性；7)分子量约120KDa(凝胶过滤法)；及8)等电点pI4.8(层析聚焦法)。
4．权利要求1的肌醇六磷酸酶，其中肌醇六磷酸酶Ⅲ具有以下理化特性1)Km当肌醇六磷酸用作底物时为107uM；2)最适DH:pH2.5；3)pH稳定性在pH2.0至8.0的范围内稳定；4)最适温度45℃；5)温度稳定性至60℃稳定；6)底物特异性在以对硝基苯磷酸、肌醇六磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、D-肌醇-2-磷酸、D-肌醇-1-磷酸、D-肌醇-1、4-二磷酸和三磷酸腺苷为底物时有活性；7)分子量约140KDa(凝胶过滤法)；8)等电点pI5.2(层析聚焦法)；9)N末端氨基酸序列示于SEQ ID NO:1。
5．权利要求1、2、3或4的肌醇六磷酸酶，其中肌醇六磷酸酶是来自属于红曲霉属的微生物的肌醇六磷酸酶。
6．权利要求5的肌醇六磷酸酶，其中属于红曲霉属的微生物是亚克红曲霉IFO30873。
7．生产肌醇六磷酸酶的方法，该方法包括培养能够形成和积累肌醇六磷酸酶的微生物直至肌醇六磷酸酶酶形成和积累，其中所说的肌醇六磷酸酶在以肌醇六磷酸为底物时，其米氏常数为10至100uM，然后从培养物中回收肌醇六磷酸酶。
8．权利要求7的方法，其中肌醇六磷酸酶Ⅰ是具有以下理化特性的肌醇六磷酸酶1)Km当肌醇六磷酸用作底物时为27uM；2)最适pH:pH5.5；3)pH稳定性在pH5.5至6.5的范围内稳定；4)最适温度50℃；5)温度稳定性至35℃稳定；6)底物特异性在以肌醇六磷酸、对硝基苯磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、D-肌醇-2-磷酸、D-肌醇-1-磷酸、D-肌醇-1、4-二磷酸和三磷酸腺苷为底物时有活性；7)分子量约80至100KDa(凝胶过滤法)；及8)等电点pI5.7(层析聚焦法)。
9．权利要求7的方法，其中肌醇六磷酸酶Ⅱ是具有以下理化特性的肌醇六磷酸酶1)Km当肌醇六磷酸用作底物时为20uM；2)最适pH:pH6.0；3)pH稳定性在pH6.0至7.0的范围内稳定；4)最适温度50℃；5)温度稳定性至50℃稳定；6)底物特异性在以肌醇六磷酸、对硝基苯磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、D-肌醇-2-磷酸、D-肌醇-1-磷酸、D-肌醇-1、4-二磷酸和三磷酸腺苷为底物时有活性；7)分子量约120KDa(凝胶过滤法)；及8)等电点pI4.8(层析聚焦法)。
10．权利要求7的方法，其中肌醇六磷酸酶Ⅲ是具有以下理化特性的肌醇六磷酸酶1)Km当肌醇六磷酸用作底物时为107uM；2)最适pH:pH2.5；3)pH稳定性在pH2.0至8.0的范围内稳定；4)最适温度45℃；5)温度稳定性至60℃稳定；6)底物特异性在以对硝基苯磷酸、肌醇六磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、D-肌醇-2-磷酸、D-肌醇-1-磷酸、D-肌醇-1、4-二磷酸和三磷酸腺苷为底物时有活性；7)分子量约140KDa(凝胶过滤法)；8)等电点pI5.2(层析聚焦法)；9)N末端氨基酸序列示于SEQ ID NO:1。
11．权利要求7、8、9或10的方法，其中肌醇六磷酸酶来自属于红曲霉属的微生物。
12．权利要求11的方法，其中属于红曲霉属的微生物是亚克红曲霉IFO30873。
13．含有当肌醇六磷酸作为底物时米氏常数为10至110uM的肌醇六磷酸酶的动物饲料。
全文摘要
本发明涉及一种对肌醇六磷酸具有低Km值的肌醇六磷酸酶,使用能够产生和积累该肌醇六磷酸酶的微生物制备肌醇六磷酸酶的方法,以及含有肌醇六磷酸酶的饲料。该新型肌醇六磷酸酶能水解饲料中所含的肌醇六磷酸(作为阻碍营养因子),从而能增加饲料的营养价值,并使水解产生的磷酸得到有效利用。
文档编号C12N9/16GK1231692SQ97198221
公开日1999年10月13日 申请日期1997年9月25日 优先权日1996年9月25日
发明者长岛直, 畔柳聪, 山村直纪, 穴泽秀治, 加藤容子, 杉本整治, 矢野敬一 申请人:协和发酵工业株式会社, 新日本化学工业株式会社 被以下专利引用 (2),