专利名称：用于皮肤化妆应用和治疗应用的水溶性的酚类衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及制备酚类化合物O-α-葡萄糖苷的方法，该方法包括将蔗糖和得自明串珠菌、优选得自肠膜明串珠菌NRRL B-512F的葡聚糖蔗糖酶，在具有适于酶活性的pH下的经过缓冲的水(本领域技术人员公知的)中或在具有适于酶活性-共溶剂混合物的pH下的经过缓冲的水中，与具有下式所示结构的酚类化合物温育
其中 R2是H或OH；和 R1选自
其中R3和R4独立地是H或OH，前提条件是R3和R4中至少一个表示OH；和，
其中R7选自H，-OH或-OCOR且R8是H或OH，前提条件是R7和R8中至少一个表示OH；
其中R5是OH或OCH3；R6是H或OH，R9是H或OH，R10是H，OCH3或C6H11O5，和R11是H，OH或C6H11O5，前提条件是当R5和R6同时是OH时R10和R11不能同时是H，和当R10是C6H11O5时R11是H； --(CH2)n-COOR或-(CH2)n-CONHR，n是0-2的整数； --(CR12＝CH)-COOR或-(CR12＝CH)-CONHR，R12是H或C1-C6直链、支链或环状的烷基或烯基，优选甲基，乙基，丙基，环己基或苯基，更优选甲基或苯基； --(CH2)n-OR或-(CH2)n-NHR，n是0-2的整数； --(CH2)n-COR或-(CH＝CH)n-COR，n是0-2的整数； --H；
-C1-C10烃基，其与式(I)中所示的环以及R1的邻位碳一起形成稠合芳环(双环或三环)； 其中R是H或直链、支链或环状的，芳香或非芳香的，饱和或不饱和的C1-C10烃基，任选地被至少一个杂原子中断，其中所述烃基包括烷基，烯基，或炔基，优选烷基或烯基，其可被一个或几个选自以下的取代基取代(C5-C9)芳基，(C4-C9)杂环，(C1-C3)烷氧基，(C2-C3)酰基，(C1-C3)醇，羧基(-COOH)，(C2-C3)酯，(C1-C3)胺，氨基(-NH2)，酰胺(-CONH2)，(C1-C3)亚胺，腈，羟基(-OH)，醛基(-CHO)，卤素，(C1-C3)卤代烷基，硫醇(-SH)，(C1-C3)硫烷基，(C1-C3)砜，(C1-C3)亚砜及其组合。
在第一实施方案中，R2是H。在该实施方案中，酚类化合物可以是例如表儿茶素没食子酸酯，圣草酚，七叶亭，表儿茶素，漆黄素，黄颜木素，高原儿茶酸，原儿茶酸，原儿茶酸乙酯，羟基酪醇，桑橙素，去甲二氢愈创木酸，橄榄苦苷，焦儿茶酚，鼠李亭，迷迭香酸，花旗松素，3-羟基大豆苷元，3，4-二羟基二苯甲酮，咖啡酸，二氢咖啡酸，咖啡酸苯乙酯，儿茶酚，5，3’，4’-三羟基-6，7-二甲氧基黄酮，绿原酸，棉皮皮素，荭草素，异荭草素，3，4-二羟基苯甲醛，紫铆花素，3，4-二羟基苯乙酮，马里苷，金鸡菊甙，圣草酚查耳酮，4-甲基七叶亭，去甲黄檀素，去甲猪毛菜碱，菊苣酸，松果菊苷，毛蕊花苷和脱氧茜素。
在备选实施方案中，R2是OH。在该实施方案中，酚类化合物可以是例如表焙儿茶素，双氢刺槐亭，焙儿茶素，没食子酸，没食子酸丙酯，表焙儿茶素没食子酸酯，金缕梅丹宁和刺槐亭。
在本发明方法的具体实施方案中，酚类化合物如下式所示
其中 R2是H或OH；和 R1是
其中R3和R4独立地是H或OH，前提条件是R3和R4中至少一个表示OH。
在优选的实施方案中，R3和R4是OH。在另外的优选实施方案中，R3是H和R4是OH。在另外的优选实施方案中，R3是OH和R4是H。在特别优选的实施方案中，R2是H和R3/R4选自以下组合OH/OH；H/OH；OH/H。在另外的优选实施方案中，R2是OH和R3/R4选自以下组合OH/OH；H/OH；OH/H。优选地，酚类化合物选自花旗松素，圣草酚，双氢刺槐亭和黄颜木素。
在本发明方法的另一个具体实施方案中，酚类化合物如下式所示
其中 R2是H或OH；和 R1是
其中R7选自H，-OH或-OCOR且R8是H或OH，前提条件是R7和R8中至少一个表示OH。在优选的实施方案中，R8是OH和R7是OH或OCOR。在更优选的实施方案中，R7和R8都是OH。在另外的优选实施方案中，R7是-OCOR和R8是OH。在特别优选的实施方案中，R2是H和R3/R4选自以下组合H/OH，OH/H，OH/OH和OCOR/OH。在另外的特别优选的实施方案中，R2是OH和R3/R4选自以下组合H/OH，OH/H，OH/OH和OCOR/OH。更优选地，R是
优选地，酚类化合物选自儿茶酚，表儿茶素，儿茶素没食子酸酯，表儿茶素没食子酸酯，焙儿茶素，表焙儿茶素，焙儿茶素没食子酸酯和表焙儿茶素没食子酸酯。
在本发明方法的另一个具体实施方案中，酚类化合物如下式所示
其中 R2是H或OH；和 R1是
其中R5是OH或OCH3；R6是H或OH，R9是H或OH，R10是H，OCH3或C6H11O5，和R11是H，OH或C6H11O5，前提条件是当R5和R6同时是OH时R10和R11不能同时是H，和当R10是C6H11O5时R11是H。特别地，R6，R5和R11可以选自以下组合 a)R6是OH和R5是OCH3和R11是H； b)R6是OH和R5是OH和R11是OH； c)R6是OH和R5是OH和R11是C6H11O5；和， d)R6是H和R5是OH和R11是H；和 R9是H或OH，和R10是H或OCH3或C6H11O5， 前提条件是当R10是C6H11O5时，R11是H。
在优选的实施方案中，R9是OH，R10是H和R11是H，而R6是OH和R5是OCH3，或者R6是H和R5是OH。优选地，R2是H。或者，R2是OH。
在另外的优选实施方案中，R9是H和R10是OCH3或C6H11O5。
在本实施方案的具体方面，R9和R11是H，R10和R5是OCH3，和R6是OH。
在另外的优选实施方案中，R5和R6都是OH，R9是H或OH，R10是OH或C6H11O5，和R11是H，OH或C6H11O5，前提条件是当R10是C6H11O5时R11是H。在另外的优选实施方案中，R5和R6都是OH，R9是H或OH，R10是H，和R11是OH或C6H11O5。
在另外的优选实施方案中，R9是H和R10是H。在另外的优选实施方案中，R9是H，R10和R5是OCH3，和R6是OH。
在具体实施方案中，R2，R5，R6，R9，R10和R11可以选自上述的组合。
优选地，酚类化合物选自鼠李亭，漆黄素，刺槐亭，棉皮皮素，荭草素，异荭草素和5，3’，4’-三羟基-6，7-二甲氧基黄酮。
在本发明方法的另一个具体实施方案中，酚类化合物如下式所示
其中 R2是H或OH；和R1是-(CH2)n-COOR或-(CH2)n-CONHR，n是0-2的整数。在优选的实施方案中，R2是H。或者，R2是OH。优选地，R选自H，C1-C3烷基，优选甲基，乙基或丙基，和
在第一更优选的实施方案中，n是0和R优选是H。在第二更优选的实施方案中，n是1和R优选是H。在第三更优选的实施方案中，n是2和R优选是H。在另外的优选实施方案中，n是0和R是C1-C3烷基，优选甲基，乙基或丙基，或
在优选的实施方案中，R1是-(CH2)n-COOR。在优选的实施方案中，R是H。
优选地，酚类化合物选自高原儿茶酸，二氢咖啡酸，原儿茶酸乙酯，没食子酸丙酯，没食子酸，金缕梅丹宁(2’，5-二-O-没食子酰基-金缕梅糖)和原儿茶酸。
在本发明方法的另外的具体实施方案中，酚类化合物如下式所示
其中 R2是H或OH；和R1是-(CR12＝CH)-COOR或-(CR12＝CH)-CONHR，R12是H或C1-C6直链或环状的烷基或烯基，优选甲基，乙基，丙基，环己基或苯基，更优选甲基或苯基。优选地，R1是-(CH＝CH)-COOR或-(CH＝CH)-CONHR。在优选的实施方案中，R2是H。或者，R2是OH。在优选的实施方案中，R1是-(CH＝CH)-COOR。在优选的实施方案中，R选自H；
和，在R1的邻位碳上与式(I)的苯基连接的键。
当R是在R1的邻位碳上与式(I)的苯基连接的键时，R12可以具体选自H；甲基和苯基。则酚类化合物可以如下式所示
R12是H或C1-C6直链或环状的烷基或烯基，优选甲基，乙基，丙基，环己基或苯基，更优选甲基或苯基。
优选地，酚类化合物选自咖啡酸，迷迭香酸，七叶亭，4-甲基七叶亭，去甲黄檀素(6，7-二羟基苯基香豆素)，绿原酸，咖啡酸苯乙酯，菊苣酸(二咖啡酰基酒石酸)，松果菊苷(2-(3，4-二羟基苯基)乙基O-6-脱氧-α-L-吡喃甘露糖基-(1→3)-O-(β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6))-，4-(3-(3，4-二羟基苯基)-2-丙烯酸酯)，β-D-吡喃葡萄糖苷)和毛蕊花苷。
在本发明方法的另外的具体实施方案中，酚类化合物如下式所示
其中 R2是H或OH；和R1是-(CH2)n-OR，n是0-2的整数。在优选实施方案中，n是2。优选地，酚类化合物是羟基酪醇。
在本发明方法的另外的具体实施方案中酚类化合物如下式所示
其中 R2是H或OH；和R1是-(CH2)n-COR或-(CH＝CH)n-COR，n是0-2的整数。
在优选的实施方案中，n是0或1和R选自 H；C1-C3烷基，优选甲基，乙基或丙基，更优选甲基；
苯基；
优选地，n是0。或者，n是1。
优选地，酚类化合物选自桑橙素，3，4-二羟基苯甲醛，3，4-二羟基二苯甲酮，紫铆花素(2’，3，4，4’-四羟基查耳酮)，3，4-二羟基苯乙酮，马里苷(2’，3，3’，4，4’-五羟基-4’-葡糖基查耳酮)和圣草酚查耳酮(2’，4’，6’，3，4-五羟基查耳酮)。
在本发明方法的另外的具体实施方案中，酚类化合物如下式所示
其中 R2是H或OH；和R1选自
优选地，酚类化合物选自焦儿茶酚，去甲二氢愈创木酸，3-羟基大豆苷元，橄榄苦苷和金鸡菊甙(3’，4’，6，7-四羟基-6-O-葡糖基噢哢)。
在该实施方案中，酚类化合物的R1是C1-C10烃基，其与式(I)中所示的环以及R1的邻位碳一起形成稠合芳环(双环或三环)。特别地，酚类化合物可以选自
所述稠环可以任选地被至少一个杂原子中断并且可以被一个或多个选自以下的取代基取代(C1-C3)烷氧基，(C2-C3)酰基，(C1-C3)醇，羧基(-COOH)，(C2-C3)酯，(C1-C3)胺，氨基(-NH2)，酰胺(-CONH2)，(C1-C3)亚胺，腈，羟基(-OH)，醛基(-CHO)，卤素，(C1-C3)卤代烷基，硫醇(-SH)，(C1-C3)硫烷基，(C1-C3)砜，(C1-C3)亚砜及其组合。在特别优选的实施方案中，酚类化合物是
酶的性质和来源 可用于该缩合反应的酶是糖基转移酶，更优选是己糖基转移酶(EC2.4.1)，优选为葡聚糖蔗糖酶(EC 2.4.1.5)。
在优选的实施方案中，用于这些酚类化合物与葡萄糖进行所需的缩合反应的酶是得自细菌的葡聚糖蔗糖酶，更确切地说得自明串珠菌，更优选得自肠膜明串珠菌NRRL B-512F。
酶的可供选择的来源可以是得自肠膜明串珠菌NRRL B-742，肠膜明串珠菌NRRL B-1299，肠膜明串珠菌NRRL B-1355或肠膜明串珠菌NRRL B-23192的葡聚糖蔗糖酶。
这些酶可以如下获得对产酶菌株进行自然发酵，然后进行细胞处理和酶回收以及纯化。因为葡聚糖蔗糖酶主要是在培养肉汤中的溶液形式的或与细胞结合的细胞外的大型酶，因此可用于酶回收的技术包括但是不限于离心作用和切向微量过滤，并且如果葡聚糖蔗糖酶是与细胞结合的酶，则针对细胞离解的技术包括但是不限于法氏压滤均化，玻璃珠，超声处理或任何等价方法。针对酶浓缩的技术包括但是不限于使用10kDa到300kDa的分子量截断值的超滤，可用于酶纯化的技术包括但是不限于使用聚乙二醇的相分离，凝胶渗透色谱法。可供选择的方案是所述酶在公知的表达宿主如大肠杆菌(E.coli)，酿酒酵母菌(S.cerevisiae)，杆状病毒(Baculovirus)，脂耶氏酵母(Y.lipolytica)，黑胸败血菌(Bacillus sp.)，假单胞菌(Pseudomonas sp.)，多形汉逊酵母(H.polymorpha)或哺乳动物细胞等中的重组表达(参见参考文献″Production of Recombinant ProteinsNovel Microbial and EukaryoticExpression Systems″Wiley 2004-Gerd Gellissen Ed.)，然后任选地使用本领域技术人员公知方法进行纯化的步骤。
酶还可通过本领域公知的随机诱变、定向诱变或直接演变方法获得(MIYAZAKI K，ARNOLD FH，(2004)，In vitro DNA recombination.InPhage DisplayA practical approach(体外DNA重组。在噬菌体展示文库中实用方法)，Clarkson T和Lowman H编辑.New YorkOrxfordUniversity Press Inc.，43-60)。这些技术还能够获得具有更高比放射性、更低的产物抑制、专有区(dedicated region)、化学和立体选择性、更高的稳定性或其任何组合的酶。
因此，本发明的方法可以使用完整细胞，或使用天然的或重组的粗制酶或纯化酶进行。酶可以“游离”形式，或以固定催化剂形式被使用。这种固定过程包括但是不限于凝胶密封(海藻酸钙，…)，树脂吸附，戊二醛网组化，在存在最终的适当助剂的条件下喷雾干燥，从而获得不溶形式的酶，膜反应器或其任何组合，并且是本领域技术人员公知的。固定过程的选择根据其经济成本并根据牵涉所述固定化酶的方法的最终收率的不同而异。
酶制剂中酶活性的量可以使用蔗糖水解并通过比色法(诸如牵涉3，5-二硝基-水杨酸的比色法)测量释放的还原糖(果糖)进行评价；SUMNER JB，HOWELL SF(1935)，A method for determination ofinvertase activity).J Biol Chem 10851-4(用于测定转化酶活性的方法)。该酶活性用单位表示，其中一个单位(U)相当于在30℃，pH 5.2(蔗糖100g/L；乙酸钠缓冲剂50mM；氯化钙二水合物10mg/L)下，每分钟释放1μmole果糖的酶的量。
反应条件 反应可以在经过缓冲的水或经过缓冲的水/共溶剂混合物中实现。实际上，本发明人令人惊讶地注意到酶能够在不存在共溶剂的条件下进行葡糖基化。
优选地，未与共溶剂一起使用或与共溶剂混合使用的具有处在适于酶活性的pH下的经过缓冲的水由在水中的浓度为20到500mM的乙酸钠或乙酸钾的缓冲剂组成，但是可以使用任何其它的对酶活性没有消极作用的缓冲物质。优选地，具有处在适于酶活性-共溶剂混合物的pH下的经过缓冲的水由水(优选前面所述的经过缓冲的水)和二甲基(DMSO)以低于35％的DMSO(体积/体积)，优选15-25％的DMSO，更优选约15％的DMSO的比例组成。
反应可以在水/共溶剂混合物中实现，所述水/共溶剂混合物能够允许酶发挥适当的活性以及允许酚类化合物和葡萄糖供体即蔗糖的可溶性达到更好水平。这些共溶剂可以是以下的在不同的重量/体积比下使用的可与水混溶的有机溶剂二甲基亚砜，二氧杂环己烷，二甲基甲酰胺，乙醇，正丙醇，异丙醇，乙二醇，甘油，1，2-丙二醇，环丁砜，四甲基脲，乳酸乙酯，二甘醇二乙醚，三甘醇二甲醚。除了这些简单的有机溶剂之外，还可设计使用离子性液体(咪唑鎓盐，吡啶鎓盐，磷鎓和铵盐)。共溶剂还可是以下的与水不混溶的有机溶剂乙酸乙酯，甲基乙基酮，甲基-2丁醇-2，以及可与水混溶的有机溶剂以及与水不溶混的有机溶剂的组合。
在优选的实施方案中，混合物由水和二甲基亚砜(DMSO)组成，DMSO的浓度为5到70％(体积/体积)。在优选的实施方案中，DMSO的浓度为5到50％(体积/体积)。在最优选方案中，DMSO的浓度为10-35％(体积/体积)。实际上，本发明人令人惊讶地发现，当在DMSO比率低于40％的条件下进行反应时，反应更加高度有效。产物的更高比率可达15％比率。因此，本发明方法的优选比率为15-25％，优选约15％(+/-3％)。
每个酚类化合物与蔗糖和酶在该反应混合物中温育，在允许酶发挥活性并合成出尽可能多的所需葡萄糖苷的pH和温度的条件下进行。优选地，反应介质另外包含氯化钙形式的钙阳离子(或钙的任何水溶性盐的形式)以改善酶的稳定性。缩合反应可以在pH 4到8，优选pH 5到7下进行，通过在反应介质中引入少量乙酸盐缓冲剂进行。合成介质的温度保持在10-40℃，优选约25-33℃下。
使用得自肠膜明串珠菌NRRL B-512F的葡聚糖蔗糖酶的典型的反应条件包括以下的混合物10mM到100mM的乙酸盐缓冲剂，10到35％(体积/体积)的DMSO，100mM到900mM的蔗糖和2到200mM的酚类化合物，0.5mg到1g/l的钙盐和最终浓度为0.5到5U/ml的酶。该反应在30℃温育几小时(如10到48小时)，酚类化合物衍生物的合成以及所述酚类化合物的消失在这一时间之后进行HPLC分析。对产物的更好表征可以通过与质谱仪联用的结合有光二极管矩阵检测器的高效液相色谱法进行，以直接评价与酚类化合物连接的葡萄糖部分，并因此对合成的衍生物进行良好的分析表征。
在本发明的一个方案中，允许对合成的衍生物进行分析表征的这些条件可如下所示 合成介质可以通过与质谱仪(Micromass ZQ 2000，
)联用并结合有光二极管矩阵检测器(PDA
996)的高效液相色谱法进行分析。
i)色谱法的操作条件 -柱KROMASIL C18 5μ，250mm×4.6mm(参考K2185；A.I.T.Chromato；117rue de Stalingrad；78800Houilles) -洗脱(方法1) ·溶剂A包含1％v/v乙酸的去离子水 ·溶剂B包含1％v/v乙酸的HPLC级甲醇 ·0到10分钟90％到80％(线性)；10％到20％B(线性)；1ml/分钟 ·10到25分钟80％到50％(线性)；20％到50％B(线性)；1ml/分钟 ·25到30分钟50％A；50％B；1ml/分钟 ·30到35分钟50％到90％(线性)；50％到10％B(线性)；1ml/分钟 ·45分钟下次注射 -柱温30℃ -注射体积10μL ii)光二极管矩阵检测器 -起始波长210nm -终止波长400nm -分辨率1.2nm -进样速率1谱/秒 iii)LC质谱仪(一级四极杆质谱仪) -离子化阴离子方式的电喷射 -喷射电压3.0kV -源温150℃ -锥电压20或40V -提取器3.0V -去溶剂化温度300℃ -锥气流30L/小时 -去溶剂化气流600L/小时 -全扫描质谱m/z，从100到2000 纯化 合成之后，酚类化合物O-α-葡萄糖苷，根据未转化酚类化合物、糖、酶和共溶剂的残留程度可以直接或经过纯化以达到所需纯度。
例如，利用物质吸收能力的差异，酚类化合物O-α-葡萄糖苷可被吸附到人造大孔吸附树脂上。由于在间隙体积内存在保留物质，带有被吸附的酚类物质的树脂用水洗涤以完全洗去酶，糖和多糖以及共溶剂。然后，树脂可用适当的溶剂进行洗脱以回收合成的产物。适当的溶剂是纯的甲醇，乙醇，正丙醇，异丙醇，丙酮或其混合物，或其与不超过20％的体积/体积的水的混合物。包含合成产物的溶液可以在适当温度(不高于50℃)下真空蒸发或者使用适合的薄膜设备进行浓缩用于进一步纯化，或直接用于进一步的纯化。可使用另外的纯化步骤如液/液提取，制备性HPLC，或其它回合的树脂纯化以获得所需的纯度用于最终应用。可用于液-液提取的有机溶剂是乙酸乙酯，乙酸丁酯，甲基乙基酮，根据酚类化合物和酚类化合物葡萄糖苷的可溶性的差异而异。
最后，包含所需物质的浆料可以通过在适当温度(不高于50℃)下真空蒸发或使用适合的薄膜设备除去溶剂(水或有机溶剂)并将得到的溶液浓缩以获得指定浓度。该浆料可进行干燥(冷冻干燥，喷雾干燥或任何其它的干燥方式，其将保留分子的完整性)以获得粉末。
可使用在容器(可使用具有根据树脂粒度测定法的不同而具有适当的筛目的筛来回收树脂)中的或借助于泵被填充到柱中的人造大孔吸附树脂。关于人造大孔吸附树脂，可以理解为是非离子的和多孔的合成树脂，其具有相对大的表面积，诸如包括苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、酚醛聚合物、和甲基丙酸烯系聚合物的那些。这些树脂的例子是XAD型的Amberlite(Rohm and Haas Company，USA)，HP系列的Diaion(Mitsubishi Chemical Industries，Japan)。
本发明涉及包含儿茶酚结构并例如选自以下的酚类化合物的O-α-葡萄糖苷原儿茶酸及其酯衍生物，咖啡酸及其酯衍生物，特别是迷迭香酸，绿原酸和咖啡酸苯乙酯以及氢化咖啡酸或3，4-二羟基氢化肉桂酸，3，4-二羟基苯基乙酸和3，4-二羟基苯基二醇，七叶亭，花旗松素，黄颜木素，圣草酚，漆黄素和鼠李亭。特别地，本发明涉及包含儿茶酚结构并选自以下的酚类化合物的O-α-葡萄糖苷表儿茶素没食子酸酯，圣草酚，七叶亭，漆黄素O-α-葡萄糖苷，黄颜木素，高原儿茶酸，原儿茶酸，原儿茶酸乙酯，羟基酪醇，桑橙素，去甲二氢愈创木酸，橄榄苦苷，焦儿茶酚，鼠李亭，迷迭香酸，花旗松素，3-羟基大豆苷元，3，4-二羟基二苯甲酮，咖啡酸，二氢咖啡酸，咖啡酸苯乙酯，5，3’，4’-三羟基-6，7-二甲氧基黄酮，绿原酸苷，脱氧茜素，表焙儿茶素，双氢刺槐亭，焙儿茶素，没食子酸，没食子酸丙酯和刺槐亭。这些新的酚类化合物衍生物通过具有改善的水溶性和/或该衍生物在使用期间，被人类天然微生物水解，并且更具体地说被人类皮肤的微生物水解，或被诸如由酿酒酵母产生的α-葡糖苷酶的所选α-葡糖苷酶水解，原地释放糖苷配基，而具有更好的生物利用度。
特别地，本发明涉及具有下式所示结构的酚类化合物O-α-葡萄糖苷
其中 A和B，相同或不同，是H或-α-葡糖基残基，前提条件是A和B中至少一个是-α-葡糖基残基； R2是H或OH；和， R1选自
其中R3和R4独立地是H或OH，前提条件是R3和R4中至少一个表示OH；
其中R7选自H，-OH或-OCOR且R8是H或OH，前提条件是，当R2是H时，R7和R8不同时是OH，并且R7和R8中至少一个是OH；
其中R5是OH或OCH3；R6是H或OH，R9是H或OH，R10是H，OCH3或C6H11O5，和R11是H，OH或C6H11O5，前提条件是当R5和R6同时是OH时R10和R11不能同时是H，和当R10是C6H11O5时R11是H； --(CH2)n-COOR或-(CH2)n-CONHR，n是0-2的整数； --(CR12＝CH)-COOR或-(CR12＝CH)-CONHR，R12是H或C1-C6直链、支链或环状的烷基或烯基，优选甲基，乙基，丙基，环己基或苯基，更优选甲基或苯基； --(CH2)n-OR或-(CH2)n-NHR，n是0-2的整数； --(CH2)n-COR或-(CH＝CH)n-COR，n是0-2的整数； -H；
-C1-C10烃基，其与式(I)中所示的环以及R1的邻位碳一起形成稠环(双环或三环)，所述环任选地被至少一个杂原子中断； 其中R是H或直链、支链或环状的，芳香或非芳香的，饱和或不饱和的C1-C10烃基，任选地被至少一个杂原子中断，其中所述烃基包括烷基，烯基，或炔基，优选烷基或烯基，其可被一个或几个选自以下的取代基取代(C5-C9)芳基，(C4-C9)杂环，(C1-C3)烷氧基，(C2-C3)酰基，(C1-C3)醇，羧基(-COOH)，(C2-C3)酯，(C1-C3)胺，氨基(-NH2)，酰胺(-CONH2)，(C1-C3)亚胺，腈，羟基(-OH)，醛基(-CHO)，卤素，(C1-C3)卤代烷基，硫醇(-SH)，(C1-C3)硫烷基，(C1-C3)砜，(C1-C3)亚砜及其组合。
在第一实施方案中，R2是H。在该实施方案中，酚类化合物O-α-葡萄糖苷可以是例如表儿茶素没食子酸酯O-α-葡萄糖苷，圣草酚O-α-葡萄糖苷，七叶亭O-α-葡萄糖苷，漆黄素O-α-葡萄糖苷，黄颜木素O-α-葡萄糖苷，高原儿茶酸O-α-葡萄糖苷，原儿茶酸O-α-葡萄糖苷，原儿茶酸乙酯O-α-葡萄糖苷，羟基酪醇O-α-葡萄糖苷，桑橙素O-α-葡萄糖苷，去甲二氢愈创木酸O-α-葡萄糖苷，橄榄苦苷O-α-葡萄糖苷，焦儿茶酚O-α-葡萄糖苷，鼠李亭O-α-葡萄糖苷，迷迭香酸O-α-葡萄糖苷，花旗松素O-α-葡萄糖苷，3-羟基大豆苷元O-α-葡萄糖苷，3，4-二羟基二苯甲酮O-α-葡萄糖苷，咖啡酸O-α-葡萄糖苷，二氢咖啡酸O-α-葡萄糖苷，咖啡酸苯乙酯O-α-葡萄糖苷，5，3’，4’-三羟基-6，7-二甲氧基黄酮O-α-葡萄糖苷，绿原酸O-α-葡萄糖苷和脱氧茜素O-α-葡萄糖苷。
在备选实施方案中，R2是OH。在该实施方案中，酚类化合物O-α-葡萄糖苷可以是例如表焙儿茶素O-α-葡萄糖苷，双氢刺槐亭O-α-葡萄糖苷，焙儿茶素O-α-葡萄糖苷，没食子酸O-α-葡萄糖苷，没食子酸丙酯O-α-葡萄糖苷和刺槐亭O-α-葡萄糖苷。
在本发明的具体实施方案中，酚类化合物O-α-葡萄糖苷如下式所示
其中 A和B，相同或不同，是H或-α-葡糖基残基，前提条件是A和B中至少一个是-α-葡糖基残基； R2是H或OH；和 R1是
其中R3和R4独立地是H或OH，前提条件是R3和R4中至少一个表示OH。
在具体实施方案中，R2是H。在另一个实施方案中，R2是OH。
在优选的实施方案中，R3和R4是OH。在另外的优选实施方案中，R3是H和R4是OH。在另外的优选实施方案中，R3是OH和R4是H。在特别优选的实施方案中，R2是H和R3/R4选自以下组合OH/OH；H/OH；OH/H。在另外的优选实施方案中，R2是OH和R3/R4选自以下组合OH/OH；H/OH；OH/H。
特别地，R2是H，R3是H和R4是OH(得到圣草酚O-α-葡萄糖苷)。或者，R2是H，R3是OH和R4是H(得到黄颜木素O-α-葡萄糖苷)。在优选的实施方案中，R2是H，并且R3和R4都是OH(得到花旗松素O-α-葡萄糖苷)。
优选地，酚类化合物O-α-葡萄糖苷选自花旗松素O-α-葡萄糖苷，圣草酚O-α-葡萄糖苷，双氢刺槐亭O-α-葡萄糖苷和黄颜木素O-α-葡萄糖苷。
在本发明的另一个具体实施方案中，酚类化合物O-α-葡萄糖苷如下式所示
其中 A和B，相同或不同，是H或-α-葡糖基残基，前提条件是A和B中至少一个是-α-葡糖基残基； R2是H或OH；和 R1是
其中R7选自H，-OH或-OCOR且R8是H或OH，前提条件是，当R2是H时，R7和R8不同时是OH，和R7和R8中至少一个表示OH。
在具体实施方案中，R2是H。在另一个实施方案中，R2是OH。
在优选的实施方案中，R2是OH，R8是OH和R7是OH或OCOR。在更优选的实施方案中，R7和R8都是OH。在另外的优选实施方案中，R2是H，R8是OH和R7是OCOR。在另外的优选实施方案中，R2是H或OH，R7是-OCOR和R8是OH。更优选地，R是
优选地，酚类化合物O-α-葡萄糖选自表焙儿茶素O-α-葡萄糖，焙儿茶素O-α-葡萄糖和表儿茶素没食子酸酯O-α-葡萄糖。
在本发明的另一个具体实施方案中，酚类化合物O-α-葡萄糖如下式所示
其中 A和B，相同或不同，是H或-α-葡糖基残基，前提条件是A和B中至少一个是-α-葡糖基残基； R2是H或OH；和 R1是
其中R5是OH或OCH3；R6是H或OH，R9是H或OH，R10是H，OCH3或C6H11O5，和R11是H，OH或C6H11O5，前提条件是当R5和R6同时是OH时R10和R11不能同时是H，和当R10是C6H11O5时R11是H。特别地，R6，R5和R11可以选自以下组合 a)R6是OH和R5是OCH3和R11是H； b)R6是OH和R5是OH和R11是OH； c)R6是OH和R5是OH和R11是C6H11O5；和， d)R6是H和R5是OH和R11是H；和 R9是H或OH和R10是H或OCH3或C6H11O5， 前提条件是当R10是C6H11O5时，R11是H。
在具体实施方案中，R2是H。在另一个实施方案中，R2是OH。
在优选的实施方案中，R9是OH，R10是H和R11是H，而R6是OH和R5是OCH3，或者R6是H和R5是OH。优选地，R2是H。或者，R2是OH。
在另外的优选实施方案中，R9是H和R10是OCH3或C6H11O5。在该实施方案的具体方面，R9和R11是H，R10和R5是OCH3和R6是OH。
在另外的优选实施方案中，R5和R6都是OH，R9是H或OH，R10是OH或C6H11O5，和R11是H，OH或C6H11O5，前提条件是当R10是C6H11O5时R11是H。在另外的优选实施方案中，R5和R6都是OH，R9是H或OH，R10是H，和R11是OH或C6H11O5。
在另外的优选实施方案中，R9是H和R10是H。在另外的优选实施方案中，R9是H，R10和R5是OCH3和R6是OH。
在具体实施方案中，R2，R5，R6，R9，R10和R11可以选自上述的组合。
在具体实施方案中，R2是H和R1是
其中R6是OH和R5是OCH3(得到鼠李亭O-α-葡萄糖苷)，或者R6是H和R5是OH(得到漆黄素O-α-葡萄糖苷)。
优选地，酚类化合物O-α-葡萄糖选自鼠李亭O-α-葡萄糖，漆黄素O-α-葡萄糖，刺槐亭O-α-葡萄糖，棉皮皮素O-α-葡萄糖，荭草素O-α-葡萄糖，异荭草素O-α-葡萄糖和5，3’，4’-三羟基-6，7-二甲氧基黄酮O-α-葡萄糖。
在本发明的另一个具体实施方案中，酚类化合物O-α-葡萄糖如下式所示
其中 A和B，相同或不同，是H或α-葡糖基残基，前提条件是A和B中至少一个是α-葡糖基残基； R2是H或OH；和 R1是-(CH2)n-COOR或-(CH2)n-CONHR，n是0-2的整数。
在具体实施方案中，R2是H。在另一个实施方案中，R2是OH。
优选地，R选自H，C1-C3烷基，优选甲基，乙基或丙基，和
在第一更优选的实施方案中，n是0和R优选是H。在第二更优选的实施方案中，n是1和R优选是H。在第三更优选的实施方案中，n是2和R优选是H。在另外的优选实施方案中，n是0和R是C1-C3烷基，优选甲基，乙基或丙基，或者
在优选的实施方案中，R1是-(CH2)n-COOR。在优选的实施方案中，R是H。
优选地，酚类化合物选自高原儿茶酸，二氢咖啡酸，原儿茶酸乙酯，没食子酸丙酯，没食子酸，金缕梅丹宁(2’，5-二-O-没食子酰基-金缕梅糖)和原儿茶酸。
在具体实施方案中，R2是H和R1是-COOH(得到原儿茶酸O-α-葡萄糖苷)。在另一个具体实施方案中，R2是H和R1是-(CH2)2-COOH(得到氢化咖啡酸O-α-葡萄糖苷)。
本发明涵盖了其酯及其可药用盐。
优选地，酚类化合物选自高原儿茶酸O-α-葡萄糖苷，二氢咖啡酸O-α-葡萄糖苷，原儿茶酸乙酯O-α-葡萄糖苷，没食子酸丙酯O-α-葡萄糖苷，没食子酸O-α-葡萄糖苷，金缕梅丹宁(2’，5-二-O-没食子酰基-金缕梅糖)O-α-葡萄糖苷和原儿茶酸O-α-葡萄糖苷。
在本发明的另外的具体实施方案中，酚类化合物O-α-葡萄糖如下式所示
其中 A和B，相同或不同，是H或α-葡糖基残基，前提条件是A和B中至少一个是α-葡糖基残基； R2是H或OH；和 R1-(CR12＝CH)-COOR或-(CR12＝CH)-CONHR，R12是H或C1-C6直链或环状的烷基或烯基，优选甲基，乙基，丙基，环己基或苯基，更优选甲基或苯基。优选地，R1是-(CH＝CH)-COOR或-(CH＝CH)-CONHR。在优选的实施方案中，R2是H。或者，R2是OH。在优选的实施方案中，R1是-(CH＝CH)-COOR。在优选的实施方案中，R选自H；
和，在R1的邻位碳处与式(I)的苯基连接的键。
在具体实施方案中，R2是H和R1是-(CH＝CH)-COOH(得到咖啡酸O-α-葡萄糖苷)。本发明涵盖了其酯及其可药用盐。特别地，当R1是-(CH＝CH)-COOR时，R选自1，3，4，5-四羟基环己烷羧酸并连接到3位(得到绿原酸O-α-葡萄糖苷)，(R)-1-羧基-2-(3，4-二羟基苯基)乙基(得到迷迭香酸O-α-葡萄糖苷)，和苯乙基(得到咖啡酸苯乙酯O-α-葡萄糖苷)。特别地，当R1是-(CR12＝CH)-COOR时，R是通过OB的间位碳连接到式(II)的苯基的键给出下式
(即，当R12是H时，则得到七叶亭O-α-葡萄糖苷，当R12是甲基时，则得到4-甲基七叶亭O-α-葡萄糖苷，和当R12是苯基时，则得到去甲黄檀素O-α-葡萄糖苷)。在具体实施方案中，R12是H。
优选地，酚类化合物O-α-葡萄糖选自咖啡酸O-α-葡萄糖苷，迷迭香酸O-α-葡萄糖苷，七叶亭O-α-葡萄糖苷，4-甲基七叶亭O-α-葡萄糖苷，去甲黄檀素(6，7-二羟基苯基香豆素)O-α-葡萄糖苷，绿原酸O-α-葡萄糖苷，咖啡酸苯乙酯O-α-葡萄糖苷，菊苣酸(二咖啡酰基酒石酸)O-α-葡萄糖苷，松果菊苷(2-(3，4-二羟基苯基)乙基O-6-脱氧-α-L-吡喃甘露糖基-(1→3)-O-(β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6))-，4-(3-(3，4-二羟基苯基)-2-丙烯酸酯)O-α-葡萄糖苷，β-D-吡喃葡萄糖苷O-α-葡萄糖苷和毛蕊花苷O-α-葡萄糖苷。
在本发明的另外的具体实施方案中，酚类化合物O-α-葡萄糖如下式所示
其中 A和B，相同或不同，是H或α-葡糖基残基，前提条件是A和B中至少一个是α-葡糖基残基； R2是H或OH；和 R1是-(CH2)n-OR，n是0-2的整数。
在具体实施方案中，R2是H。在另一个实施方案中，R2是OH。
在优选的实施方案中，n是2。优选地，酚类化合物O-α-葡萄糖苷是羟基酪醇O-α-葡萄糖苷。
在本发明的另外的具体实施方案中，酚类化合物O-α-葡萄糖苷如下式所示
其中 A和B，相同或不同，是H或α-葡糖基残基，前提条件是A和B中至少一个是α-葡糖基残基； R2是H或OH；和 R1是-(CH2)n-COR或-(CH＝CH)n-COR，n是0-2的整数。
在具体实施方案中，R2是H。在另一个实施方案中，R2是OH。
在优选的实施方案中，n是0或1和R选自 H；C1-C3烷基，优选甲基，乙基或丙基，更优选甲基；
苯基；
优选地，n是0。或者，n是1。
优选地，酚类化合物O-α-葡萄糖苷选自桑橙素O-α-葡萄糖苷，3，4-二羟基苯甲醛O-α-葡萄糖苷，3，4-二羟基二苯甲酮O-α-葡萄糖苷，紫铆花素(2’，3，4，4’-四羟基查耳酮)O-α-葡萄糖苷，3，4-二羟基苯乙酮O-α-葡萄糖苷，马里苷(2’，3，3’，4，4’-五羟基-4’-葡糖基查耳酮)O-α-葡萄糖苷和圣草酚查耳酮(2’，4’，6’，3，4-五羟基查耳酮)O-α-葡萄糖苷。
在本发明的另外的具体实施方案中，酚类化合物O-α-葡萄糖苷如下式所示
其中 A和B，相同或不同，是H或α-葡糖基残基，前提条件是A和B中至少一个是α-葡糖基残基； R2是H或OH；和 R1选自
优选地，酚类化合物O-α-葡萄糖苷选自橄榄苦苷O-α-葡萄糖苷，去甲二氢愈创木酸O-α-葡萄糖苷，焦儿茶酚O-α-葡萄糖苷，3-羟基大豆苷元O-α-葡萄糖苷和金鸡菊甙(3’，4’，6，7-四羟基-6-O-葡糖基噢哢)O-α-葡萄糖苷。
在本发明的另外的具体实施方案中，酚类化合物O-α-葡萄糖苷如下式所示
其中 A和B，相同或不同，是H或α-葡糖基残基，前提条件是A和B中至少一个是α-葡糖基残基； R2是H或OH；和 R1是C1-C10烃基，其与式(I)中所示的环以及R1的邻位碳一起形成稠合芳环(双环或三环)。特别地，酚类化合物O-α-葡萄糖苷可以选自
所述稠环可以任选地被至少一个杂原子中断并且可以被一个或多个选自以下的取代基取代(C1-C3)烷氧基，(C2-C3)酰基，(C1-C3)醇，羧基(-COOH)，(C2-C3)酯，(C1-C3)胺，氨基(-NH2)，酰胺(-CONH2)，(C1-C3)亚胺，腈，羟基(-OH)，醛基(-CHO)，卤素，(C1-C3)卤代烷基，硫醇(-SH)，(C1-C3)硫烷基，(C1-C3)砜，(C1-C3)亚砜及其组合。在特别优选的实施方案中，酚类化合物O-α-葡萄糖苷是
本文所述的O-α-葡糖基残基是指葡萄糖单体，二聚体，三聚体，四聚体，五聚体或多聚体。优选地，O-α-葡糖基残基是葡萄糖单体，二聚体或三聚体，即，葡糖基，二葡糖基或三葡糖基。仍旧优选地，O-α-葡糖基残基是葡萄糖单体。在具体实施方案中，O-α-葡糖基残基通过1位的碳连接到酚类化合物。在优选的实施方案中，OA是OH和OB是O-α-葡糖基残基。在其它优选的实施方案中，OB是OH和OA是O-α-葡糖基残基。
在具体实施方案中，R可以是单糖。在其它的具体实施方案中，R是(C1-C6)烷基或(C1-C3)烷基。
这种盐包括可药用的酸加成盐，可药用的碱加成盐，可药用的金属盐、铵盐和烷基化铵盐。酸加成盐包括无机酸以及有机酸的盐。适当的无机酸的代表性例子包括盐酸，氢溴酸，氢碘酸，磷酸，硫酸，高氯酸等等。适当的有机酸的代表性例子包括甲酸，乙酸，三氯乙酸，三氟乙酸，丙酸，苯甲酸，肉桂酸，柠檬酸，富马酸等等。可药用无机酸或有机酸的加成盐的其它例子包括在如下中所列的可药用的盐J.Pharm.Sci.1977，66，2，和Handbook of Pharmaceutical SaltsProperties，Selection，and Use，P.Heinrich Stahl和Camille G.编，Wermuth 2002。金属盐的例子包括锂、钠、钾、镁的盐等。铵盐和烷基化铵盐的例子包括铵盐，甲铵盐，二甲铵盐，三甲铵盐，乙铵盐，羟乙铵盐，二乙铵盐，丁铵盐，四甲铵盐等等。有机碱的例子包括赖氨酸，精氨酸，胍，diethanolamineoline等。
糖苷配基的原地释放 令人惊讶地，发明人发现本发明的酚类化合物O-α-葡萄糖苷可通过α-葡糖苷酶裂解，导致原地释放酚类化合物。
本发明的所有的酚类化合物O-α-葡萄糖苷含至少一个O-α-葡萄糖苷键。该键可特别地通过酶如α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20)水解，以释放葡糖基残基和糖苷配基部分。当原地实现时，这种释放具有几个优点 -其能够在可溶糖苷形式下在给用/注射/施用后释放溶解性较差的糖苷配基(其可比糖苷衍生物更具有活性)，和/或 -原地释放可以是时间依赖性的(如果通过由微生物表达的酶完成，则释放酶的量将与微生物的数量有关菌落越密集，则发生越多的糖苷配基释放，和/或 -原地释放可以通过给用/注射/施用α-葡糖苷酶或表达这种酶活性的微生物来控制。
这些优点在化妆品或皮肤化妆品制剂中的酚类化合物的配制中是重要的。在本发明的优选的实施方案中，所述酚类化合物O-α-葡萄糖苷可以通过被与人结合的微生物表达的酶原地激活，更优选通过被与人皮肤结合的微生物表达的酶原地激活。这种与人共生的或非共生的的微生物的已知的和非详尽的例子包括链球菌，葡萄球菌，肠球菌，大肠埃希氏杆菌，杆菌，棒杆菌，丙酸杆菌。当施用到皮肤上时，本发明的酚类化合物O-α-葡萄糖苷通过与人皮肤结合的微生物被转化为糖苷配基部分和葡糖基残基。这些细菌在人的口、肠道、生殖道和上呼吸系统中被发现。
在本发明的另外的优选实施方案中，所述酚类化合物O-α-葡萄糖苷可以被α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20)如得自酿酒酵母的α-葡糖苷酶原地激活。
因此，本发明的酚类化合物O-α-葡萄糖苷具有前体药物状态，因为分子的活性部分(糖苷配基)可以被原地释放。
因此，本发明涉及包括本发明的酚类化合物O-α-葡萄糖苷或其可药用盐的药物组合物或化妆品组合物。本发明还涉及作为药物的本发明的酚类化合物O-α-葡萄糖苷或其可药用盐。该药物可以是治疗药或预防药。本发明的的酚类化合物O葡萄糖苷具有一些活性，其中所述活性为抗病毒、抗菌、免疫刺激、抗过敏、抗高血压、抗缺血、抗心率不齐、抗血栓形成、降胆固醇、抗脂质过氧化、肝保护、抗炎、抗癌、抗诱变、抗肿瘤、抗血栓和血管舒张作用。
在具体实施方案中，组合物可另外包含O-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20)或表达O-α-葡糖苷酶活性的微生物。优选地，O-α-葡糖苷酶来自酿酒酵母。特别地，O-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20)或表达O-α-葡糖苷酶活性的微生物存在于灭活形式的组合物中并且O-α-葡糖苷酶仅在给药时被激活。例如，组合物可配制成干燥形式，水的不存在导致葡糖苷酶的钝化；在加入水后，酶将变得有活性，并然后能够水解糖苷键。酶和酚类化合物O-α-葡萄糖苷可被置入两种不同的液体制剂中，两种液体制剂仅在给药时才被混合。如果酶和酚类化合物O-α-葡萄糖苷被置于相同的溶液中时，有可能使用酶可逆性抑制剂，其在给药后被稀释，从而允许酶挥发能力以水解酚类化合物O-α-葡萄糖苷。本发明的酚类化合物O-α-葡萄糖苷和O-α-葡糖苷酶或表达O-α-葡糖苷酶活性的微生物还可被物理分离(例如微胶囊)。
本发明涉及本发明的酚类化合物O-α-葡萄糖苷或其可药用盐在制备用于治疗或预防癌、心血管疾病、细菌感染、UVB诱导的红斑、变态反应、炎性或免疫病症的药物中的应用。特别地，癌是实体瘤，例如乳癌或结肠癌。特别的，变态反应可以是过敏性鼻结膜炎。因此，本发明还涉及治疗或预防癌、心血管疾病、细菌感染、UVB诱导的红斑、变态反应、炎性或免疫病症的方法，该方法包括给用本发明的酚类化合物O-α-葡萄糖苷或其可药用盐。另外，该方法可以进一步包括顺序地或同时地给用O-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20)或表达O-α-葡糖苷酶活性的微生物的步骤。优选地，O-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20)或表达O-α-葡糖苷酶活性的微生物可以相同途径给药。
在具体实施方案中，本发明涉及本发明的酚类化合物O-α-葡萄糖苷在制备用于局部给药(即给药到皮肤)上的药物组合物或化妆品组合物中的应用，其中由与皮肤结合的微生物产生的酶使相应的糖苷配基释放。另外，本发明涉及本发明的酚类化合物O-α-葡萄糖苷在制备用于经口给药的药物组合物或化妆品组合物中的应用，其中由与口和肠道结合的微生物产生的酶使相应的糖苷配基释放。本发明还涉及本发明的酚类化合物O-α-葡萄糖苷在制备用于经直肠给药的药物组合物或化妆品组合物中的应用，其中由与肠道结合的微生物产生的酶使相应的糖苷配基释放。本发明还涉及本发明的酚类化合物O-α-葡萄糖苷在制备用于经鼻给药的药物组合物或化妆品组合物中的应用，其中由与上呼吸系统结合的微生物产生的酶使相应的糖苷配基释放。本发明还涉及本发明的酚类化合物O-α-葡萄糖苷在制备用于经阴道给药的药物组合物或化妆品组合物中的应用，其中由与阴道结合的微生物产生的酶使相应的糖苷配基释放。
本发明还涉及本发明的酚类化合物O-α-葡萄糖苷或其可药用盐与O-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20)或表达O-α-葡糖苷酶活性的微生物的组合用于同时或顺序给药。当进行同时给药时，本发明的酚类化合物O-α-葡萄糖苷或其可药用盐和O-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20)或表达O-α-葡糖苷酶活性的微生物在相同的或不同的组合物中被给药。
这种组合物可以包括可药用的载体、稳定剂或赋形剂。
酚类化合物作为开发其它衍生物的关键中间体的应用 本发明的酚类化合物O葡萄糖苷可单独作为化妆品或作为活性物质被直接用作活性成分，或者与其他产品(包括其它的具有协同或互补活性的活性分子)组合使用，或与稳定剂或赋形剂组合使用。这些酚类化合物的衍生物还可用作起始材料，用于另外的化学、物理或酶促改进以产生第二代衍生物。因为本发明中使用的酶促反应涉及酚类化合物的儿茶酚环上的特定的羟基位置，因此其它羟基可用在例如化学反应中以产生酯键、酰基键、硫酸酯或磷酸酯键。这种改性可改进本发明的酚类化合物O-α-葡萄糖苷的已有活性，或者为具体应用提供了新的性质(治疗效力更高，细胞毒性更低，在由微生物释放糖苷配糖基部分后稳定性更高，……)。
所述用于化妆品应用或治疗应用的衍生物的配制 本发明的组合物可经口、非肠道、通过吸入喷雾、局部、经直肠、经鼻、经颊、经阴道或借助植入的储库形式被给药。本文使用的术语“非肠道”包括皮下，静脉内，肌肉内，关节内，滑液内，胸骨内，鞘内，肝内，病灶内和颅内的注射或输注技术。优选地，本发明的组合物经口、通过吸入喷雾、局部、经直肠、经鼻、经颊或经阴道给药。在优选的实施方案中，药物组合物或化妆品组合物被局部给药。
新型的化妆品产品是不断地发展的，并且将新型原材料加入到化妆品化学师选择的个人护理成分中。本发明所述的酚类化合物O-α-葡萄糖苷可容易地被并入到化妆品产品的大清单中。这种制剂是该领域技术人员公知的其可以是霜剂、棒剂、洗发剂、淋浴凝胶剂、洗液、皂剂、乳剂、凝胶剂。这些制剂可包括其它成分，诸如但不限于去离子水，镁，硅酸铝，黄原胶，尼龙-12，PCA钠，丙二醇，氧化铁红颜料，滑石，氧化铁黄颜料，氧化铁黑颜料，二氧化钛，硬脂酸甘油酯，硬脂酸，DEA-磷酸鲸蜡酯，羟苯甲酯，羟苯丁酯，羟苯乙酯，羟苯丙酯，异硬脂醇新戊酸酯，棕榈酸异丙酯，乙烯/丙烯/苯乙烯共聚物，丁烯/乙烯/苯乙烯共聚物，棕榈酸异丙酯，苯氧乙醇醋酸生育酚，甘油，三乙醇胺，硬脂酸，硬脂酸丙二醇酯，矿物油，丁烯/乙烯/苯乙烯共聚物，重氮咪唑烷基，氢化聚异丁烯，棕榈酸辛酯，新戊酸十三烷基酯，异硬脂酸异硬脂醇酯，羟苯异丙酯，羟苯异丁酯，辛基十二烷醇新戊酸酯，醋酸生育酚，香料，辛基甲氧基肉硅酸酯，二苯甲酮，水杨酸辛酯，异硬脂酸异丙酯，丙二醇异鲸蜡醇聚醚-3乙酸酯，或它们的任何组合。
对于本发明的酚类化合物O-α-葡萄糖苷在治疗应用中的应用，其可被并入到不同的医学制剂如丸剂、片剂、糖浆剂、霜剂、洗液、凝胶剂中，使用例如包装，标准化，混合/均质化，无菌和非无菌微粉化，造粒/压实，过筛或其任何组合进行。所述酚类化合物O-α-葡萄糖苷的制备可包括如下的非详细列举的一些赋形剂滑石，乳糖，硬脂酸镁，单硬脂酸甘油酯，胶体二氧化硅，沉淀二氧化硅，交联的聚乙烯基吡咯烷酮，磷酸氢钙二水合物，微晶纤维素，玉米淀粉，聚维酮，羧基甲基纤维素钠，聚山梨酯80，乳酸，卡波姆，鲸蜡醇，肉豆蔻酸异丙酯，棕榈酸异丙酯，葡萄糖，葡萄糖，三乙醇胺，甘油，果糖，蔗糖，聚合物，纳米结构。
本发明的组合物可以任何可口服剂型经口给药，所述剂型包括但不限于胶囊，片剂，水悬浮剂或溶液剂。在用于口服的片剂中，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还加入润滑剂诸如硬脂酸镁。对于胶囊形式口服给药，有用的稀释剂包括乳糖和干燥玉米淀粉。当水悬浮剂需要用于口服应用时，活性成分与乳化剂或助悬剂混合。如果需要，还可加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。
或者，本发明的组合物可以用于直肠给药的栓剂形式被给药。这些剂型可通过将药物与在室温下是固体但是在直肠温度下是液体并因此在直肠中熔融以释放药物的适当的无刺激性的赋形剂混合。这种材料包括可可脂，蜂蜡和聚乙二醇。
本发明的组合物还可局部给药，特别是当治疗目标包括可容易通过局部施用而到达的区域或器官，包括眼睛、皮肤或下肠道的疾病。适当的局部制剂可容易地被制备用于这些区域或器官之一。
对于局部应用，组合物可被配制在包含悬浮在或溶解在一种或多种载体中的活性组分的适当的膏剂中。用于本发明化合物的局部给药的甾类包括但是不限于矿物油，液体矿脂，白矿脂，丙二醇，聚环氧乙烷，聚环氧丙烷化合物，乳化蜡和水。或者，组合物可被配制在包含悬浮在和溶解在一种或多种可药用载体中的活性组分的适当的洗液或霜剂中。适当的载体包括但是不限于矿物油，单硬脂酸山梨糖醇酐酯，聚山梨酯60，鲸蜡基酯蜡，十六十八醇，2-辛基十二醇，苯甲醇和水。
对于眼科应用，组合物可被配制成在等渗的、经pH调节的无菌盐水中的微粒化悬浮液，优选地，被配制成在等渗的、经pH调节的无菌盐水中的溶液，所述盐水有或者没有防腐剂诸如苄扎氯铵。或者，对于眼科应用，组合物可被配制成膏剂如矿脂。
本发明的组合物还可通过鼻气雾剂或吸入被给药。该组合物根据制药领域公知技术制备并且可被制备为在盐水中的溶液剂，采用苯甲醇或其它适当的防腐剂，增强生物利用度吸收促进剂，氟碳化合物和/或其它常规的增溶剂或分散剂。
本发明组合物的无菌可注射形式可是水悬浮液或油悬浮液。这些悬浮剂可根据本领域已知的技术采用适当的分散剂或润湿剂和助悬剂进行配制。无菌的可注射制剂还可是在无毒的非肠道可接受的稀释剂或溶剂中的无菌的可注射溶液剂或悬浮剂，例如在1，3-丁二醇中的溶液剂。在可接受的媒介物和溶剂中，可采用水，林格溶液和等渗氯化钠溶液。另外，通常使用无菌的固定油类作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可采用任何温和的固定油类，包括合成的甘油一酯和甘油二酯。脂肪酸如油酸及其甘油衍生物可用于可注射制剂中，其以原态的天然的可药用的油类如橄榄油和蓖麻油的形式，特别是其聚氧乙基化形式被使用。这些油溶液剂或悬浮液还可包含长链醇稀释剂或分散剂，如羧甲基纤维素或类似的通常用在包括乳剂和悬浮剂的可药用剂型配制中的分散剂。为了制剂配制目的，其它通常使用的表面活性剂，诸如土温、司盘和其它乳化剂或通常用于制造可药用的固体、液体或其它剂型中的生物利用度增强剂也可被使用。
本发明的优点 本发明的方法优于现有方法的优点似乎从上面的描述和具体实施方式
变得清楚。本发明的其它优点详细描述如下。
本发明描述了新的原始的酚类化合物O-α-的葡萄糖苷 -原儿茶酸及其酯衍生物， -咖啡酸及其酯衍生物，特别是迷迭香酸，绿原酸和咖啡酸苯乙酯和氢化咖啡酸或3，4-二羟基氢化肉桂酸，3，4-二羟基苯基乙酸和3，4-二羟基苯基二醇， -七叶亭， -花旗松素， -黄颜木素， -圣草酚， -漆黄素， -和鼠李亭。
优选地，本发明的新的原始的酚类化合物O-α-葡萄糖苷选自表儿茶素没食子酸酯O-α-葡萄糖苷，圣草酚O-α-葡萄糖苷，七叶亭O-α-葡萄糖苷，漆黄素O-α-葡萄糖苷，黄颜木素O-α-葡萄糖苷，高原儿茶酸O-α-葡萄糖苷，原儿茶酸O-α-葡萄糖苷，原儿茶酸乙酯O-α-葡萄糖苷，羟基酪醇O-α-葡萄糖苷，桑橙素O-α-葡萄糖苷，去甲二氢愈创木酸O-α-葡萄糖苷，橄榄苦苷O-α-葡萄糖苷，焦儿茶酚O-α-葡萄糖苷，鼠李亭O-α-葡萄糖苷，迷迭香酸O-α-葡萄糖苷，花旗松素O-α-葡萄糖苷，3-羟基大豆苷元O-α-葡萄糖苷，3，4-二羟基二苯甲酮O-α-葡萄糖苷，咖啡酸O-α-葡萄糖苷，二氢咖啡酸O-α-葡萄糖苷，咖啡酸苯乙酯O-α-葡萄糖苷，5，3’，4’-三羟基-6，7-二甲氧基黄酮O-α-葡萄糖苷，绿原酸O-α-葡萄糖苷，脱氧茜素O-α-葡萄糖苷，表焙儿茶素O-α-葡萄糖苷，双氢刺槐亭O-α-葡萄糖苷，焙儿茶素O-α-葡萄糖苷，没食子酸O-α-葡萄糖苷，没食子酸丙酯O-α-葡萄糖苷和刺槐亭O-α-葡萄糖苷。
这些酚类化合物O的葡萄糖苷在化妆品和治疗领域中很令人感兴趣，并表现出改善的水溶性。实际上，在相同的生理条件，与相应的糖苷配基相比，水溶性增加至少20、30或50倍。
这些酚类化合物O-α-葡萄糖苷具有增加的生物利用度。这些酚类化合物O-α-葡萄糖苷可通过被与人共生的微生物水解形成最初的酚结构而被“原地活化”，给出了在化妆品和治疗应用中很令人感兴趣的“前体药物”状态。它们还可使用诸如由酿酒酵母产生的α-葡糖苷酶的α-葡糖苷酶激活。
这些以被证实的、可靠的、低成本的、“绿色化学”的酶促方法获得的新的酚类化合物O葡萄糖苷确保了这些产物的高质量(由于所用酶的专一性和选择性)。
实施例 本发明的任何其它实施方案和优点可从以下的实施例清楚地了解，以下实施例是本发明实施方案的例证，不构成对权利要求所要求保护的本发明的范围的限制。
实施例1葡糖基化花旗松素的合成；非常纯的葡糖基化花旗松素的水溶性和葡糖基化衍生物分子在4℃到45℃温度下的稳定性 用于合成葡糖基化花旗松素的条件如下(对于1升反应介质而言的量) 通过以表中所示顺序混合各种溶液首先获得不含酶的反应介质。在足够达到所需的30℃(+/-0.2℃)温度的时段内将混合物在30℃温育。然后通过引入酶制备物使反应开始。反应介质可适度地被搅拌。
酶制备物如下获得将用滴定法测量的酶活性为4到6U/ml的肠膜明串珠菌NRRL B512-F的培养肉汤进行离心以将微生物细胞与含酶液体完全分离。然后通过切向超滤作用将离心上清液浓缩4到10倍(分子量截断值为100kDa)。然后将残余物用20mM的乙酸盐缓冲剂(包含10mg/L的氯化钙二水合物)稀释4倍，然后浓缩4倍，以广泛地除去含酶细胞培养基中的残留的低分子量组分。然后将纯化的酶制备物以冷冻形式储存(-20℃)或进行冷冻干燥达数月而无活性损失。作为一般程序，酶制备物的活性通过增加保留物的浓度进行调节，从而酶制备物的体积不高于合成反应介质的最终体积的20％。
将反应介质在30℃(+/-0.2℃)下温育22小时。从反应介质中取出小份的反应介质并用含40/60的比的甲醇和水的溶液稀释50倍。然后通过HPLC分析甲醇溶液。
分析条件如前所述，除了甲醇浓度如下所示(方法2) -溶剂A包含1％v/v乙酸的除去离子水 -溶剂B包含1％v/v乙酸的HPLC级甲醇 -0到10分钟60％A；40％B；1ml/分钟 -10到12分钟60％到20％(线性)；40％到80％B(线性)；1ml/分钟 -12到14分钟20％A；80％B；1ml/分钟 -14到16分钟20％到60％(线性)；80％到40％B(线性)；1ml/分钟 -16到25分钟60％A；40％B；1ml/分钟 -25分钟下次注射。
图7表示在刚好开始温育时，包含花旗松素作为葡萄糖苷受体的反应介质的HPLC色谱图(289nm)。在8.15分钟的主要峰相当于花旗松素。
图8表示在温育22小时后，包含花旗松素作为葡萄糖苷受体的反应介质的HPLC色谱图(289nm)。观察到保留时间为6.15分钟的峰。
图9表示在约8.15分钟洗脱的峰的质谱，
图10表示紫外线吸收光谱；该物质是花旗松素(m/z[M-H]302,96和m/z[M-H-H2O]284.96)其分子量是304。
图11表示在约6.15分钟洗脱的峰的质谱，图12表示紫外线吸收光谱；相应物质是花旗松素葡萄糖苷(m/z[M-H]464.98)因为其分子量是466。
在9.33和12.75分钟洗脱的物质是在花旗松素制备中发现的多酚化合物。
图13表示在进行纯化以除去酶、右旋糖酐、果糖和DMSO和残留的花旗松素级分之后，包含花旗松素和花旗松素葡萄糖苷的含水溶液的HPLC色谱图。洗脱条件如前所述，其中甲醇的初始含量为10％(方法1)。花旗松素在24.01分钟被洗脱，和花旗松素葡萄糖苷在22.33分钟被洗脱。
花旗松素葡萄糖苷已经进行深入地纯化以尽可能地降低花旗松素的浓度。最终获得用滴定法测量具有高于93mM的花旗松素葡萄糖苷，花旗松素残余浓度低于2mM的溶液。(图14；花旗松素在8.95分钟被洗脱，和花旗松素葡萄糖苷在6.55分钟被洗脱)。
花旗松素葡萄糖苷的浓度如下测定在使用被精确表征的花旗松素制备物(SIGMA)确立花旗松素的摩尔浓度和峰面积之间的关系后，通过将面积和浓度之间的关系应用到花旗松素葡萄糖苷上而测定花旗松素葡萄糖苷的浓度，因为花旗松素和花旗松素葡萄糖苷具有相同的UV光谱。然后，用花旗松素葡萄糖苷的分子量值(466)乘摩尔浓度得到用g/L表示的浓度。而花旗松素在25℃水中的溶解度经过测量为1.19g/L(3.91mM)，花旗松素葡萄糖苷在25℃水中的溶解度高于43.5g/L(93.2mM)。
因此根据所述方法可合成新的物质，即，花旗松素葡萄糖苷，其分子量为466，在约25℃水中的溶解度高于93mM，相当于与花旗松素残余物有关的水溶解度增加高于23倍。花旗松素葡萄糖苷可以根据上述技术(树脂吸附，洗脱，浓缩，液-液提取，除去溶剂和浓缩并最终干燥)进行纯化。
花旗松素葡萄糖苷溶液可在较长时段内储存而不损失糖苷键，并且具有相当令人满意的抗氧化性。
使用在4℃、22℃、37℃和45℃的恒温箱进行加速储存期限研究4个月。频繁地测量花旗松素葡萄糖苷的含量，并粗略地对比颜色和气味。花旗松素葡萄糖苷含量如前所述通过HPLC测定(将小份溶液500倍稀释并使用方法2进行分析；检测波长210-400nm)。
下表描述了在不同的储存温度下花旗松素葡萄糖苷的量的测量值-存储时间。
在无论那种贮藏温度下都未观察到颜色和气味改变。
因此，在花旗松素和葡萄糖部分之间的葡萄糖苷在上述的试验条件下是稳定的。在37℃和45℃下，观察到花旗松素葡萄糖苷的轻微降解大概是由于氧化所致实际上，在相应的溶液中没有观察到表明糖苷键水解的花旗松素浓度的增加。在上述条件下，花旗松素葡萄糖苷的半衰期估计为在37℃下为1.6年，在45℃下为0.67年。
本实施例证明了花旗松素葡萄糖苷在苛刻的储存条件下具有高的化学稳定性。
实施例2DMSO浓度对花旗松素葡萄糖苷的合成效率的影响 花旗松素葡萄糖苷的酶促合成如实施例1所述进行，但是存在以下例外 ·酶浓度是1U/ml ·DMSO浓度是35％、25％、15％或5％。
在温育22小时后，在四种反应介质中的花旗松素葡萄糖苷的相对浓度如下表所示。
对于花旗松素葡萄糖苷的合成，最佳的DMSO浓度似乎处在显著低于30％并接近于15％的值。
实施例3花旗松素葡萄糖苷被人皮肤菌群的活化 皮肤菌群单独地从5个供体被收集。每个供体的前臂和前额用饱和有NaCl溶液(v＝5mL，8g/l)的棉-毛拭子挂擦。在每次挂擦之后，将拭子分配在剩余的NaCl溶液中并积压以释放被采样的材料。在两个前臂上进行挂擦/挤压和在前额上进行三次挂擦/挤压进行两轮后，获得的题述(trouble)制备物经过过滤(40μm)以除去鳞片并最终进行离心(4℃，5000g，15min)。将微生物小球再悬浮在NaCl溶液(v＝1mL，8g/l)中并在600nm下通过OD进行表征。
将5个微生物样品混合形成最终的微生物悬浮液以供测试。使用Hickey-Tresner培养基(1.0g/L的酵母抽提物，1.0g/L的肉类抽提物，2.0g/L的酪蛋白胨，10.0g/L的淀粉，20mg/l的六水合氯化钴；pH＝6)对微生物细胞进行培养。微生物生长在100毫升的锥形依氏烧瓶中在37℃下在连续搅拌(100rpm)下进行。无菌培养肉汤(20ml)被掺入0.1毫升的悬浮液。通过在600nm下测量OD控制微生物生长。
花旗松素葡萄糖苷如实施例1所述获得(相当于图14报导的HPLC色谱的高纯度制备物)。在第0天加入或不加入花旗松素葡萄糖(V＝0.5mL的0.20μm无菌溶液)，通过在缺乏花旗松素葡萄糖苷的条件下生长最终的微生物悬浮液制备对照。
在将小份细胞培养基离心后，上清液用比例为40/60的甲醇和水的溶液稀释4倍，并且通过HPLC测定上清液中的花旗松素葡萄糖苷和花旗松素的浓度(方法2)。
图15表示在Hickey-Tresner培养基中1周后有表观细菌生长。从第3天到第7天，在花旗松素葡萄糖苷存在时的表观生物质产生高于不存在花旗松素葡萄糖苷时的表观生物质产生。这可被解释为在细菌水解条件下，由于葡萄糖从花旗松素葡萄糖苷中的释放所导致的更高浓度的碳和能源。
在图16中，在前三天检测不到花旗松素葡萄糖苷的水解。在温育三天后，大概是当碳和能源变得有限时，花旗松素葡萄糖苷的浓度以显著方式减少并且附随地出现糖苷配基类黄酮花旗松素。来自人皮肤菌群的菌落所经历的营养应激可能刺激葡糖基残基经由分泌的酶的作用而发生的释放。
本实施例说明了人皮肤菌群识别并且能够以高产量水解类黄酮糖苷键，为递送活性成分提供了新型路径。
实施例4花旗松素葡萄糖苷通过α-葡糖苷酶制备物的活化 花旗松素葡萄糖苷在α-葡糖苷酶酶存在的条件下在以下条件下进行温育 -花旗松素葡萄糖苷如实施例1所述获得(相当于图14报道的HPLC色谱的高纯度制备物)0.25毫升； -α-葡糖苷酶(得自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；FLUKA 70797；批号0641337/1；活性5.8U/mg)50.1mg在5ml的磷酸钾缓冲液(0.1M，pH 7.3)中；在对照反应介质中没有酶； -温度30℃； -适度搅拌。
小份用甲醇稀释2倍后，通过HPLC分析反应介质(方法2)。
在温育18小时后，在不含α-葡糖苷酶酶的反应介质中，花旗松素葡萄糖苷分子保持不变，而在α-葡糖苷酶的酶存在的条件下，花旗松素葡萄糖苷分子完全变成花旗松素。
这些结果表明了被分离的特异性水解α-葡糖苷键的酶能够水解花旗松素葡萄糖苷分子这说明了花旗松素葡萄糖苷分子包含花旗松素和葡萄糖，葡萄糖通过α-葡糖苷键与花旗松素的羟基连接。为此，合成的新的葡萄糖苷衍生物是要求保护的O-α-D-葡萄糖苷衍生物。
实施例5焦儿茶酚，原儿茶酸和原儿茶酸乙酯的O-α-D-糖苷的酶促合成。
反应介质如实施例1所述制备，花旗松素用焦儿茶酚(SIGMA，reference C 9510)代替，或用原儿茶酸(ALDRICH，reference D10，980-0)代替或用原儿茶酸乙酯(ALDRICH，reference E 2,485-9)代替。
在温育21小时后，将每个反应介质的样品用包含比例为40/60的甲醇和水的溶液稀释5倍，并然后通过HPLC进行分析(方法1)。
结果如下表所示。
因此有可能根据上述方法合成新的焦儿茶酚、原儿茶酸和原儿茶酸乙酯的葡糖基化衍生物得到的产物是一组包含至少一葡糖基化、二葡糖基化、三葡糖基化和四葡糖基化衍生物的物质。
实施例6咖啡酸、3，4-二羟基氢化肉桂酸(氢化咖啡酸)和迷迭香酸的O-α-D-糖苷的酶促合成。
反应介质如实施例1所述制备，花旗松素用咖啡酸(SIGMA，reference C 0625)代替，或用3，4-二羟基氢化肉桂酸(ALDRICH，reference D10,980-0)代替或用迷迭香酸(FLUKA，reference 44699；迷迭香酸在反应介质中的浓度是1g/L)代替。
在温育21小时后，将每个反应介质的样品用包含比例为40/60的甲醇和水的溶液稀释5倍，并然后通过HPLC进行分析(方法1)。
结果如下表所示。
因此有可能根据上述方法合成新的咖啡酸、氢化咖啡酸和迷迭香酸的葡糖基化衍生物得到的产物是一组包含至少一葡糖基化、二葡糖基化、三葡糖基化和四葡糖基化衍生物的物质。就氢化咖啡酸而言，其明显显示两个羟基都被取代实际上，可看到至少两个系列的衍生物，这两个系列的衍生物都包含至少一葡糖基化(344)、二葡糖基化(506)、三葡糖基化(668)、四葡糖基化(830)和五葡糖基化(992)的衍生物。这表明，在本领域技术人员不可预测的某些情况下，被羟基化的两个基团都可接受葡萄糖部分。
实施例73，4-二羟基扁桃酸、七叶亭和七叶苷的O-α-D-糖苷的酶促合成。
反应介质如实施例1所述制备，花旗松素用3，4-二羟基扁桃酸(ALDRICH，reference 151610)代替，或用七叶亭(ALDRICH，reference24,657-3)或七叶苷(SIGMA，reference E 8250)代替。
在温育21小时后，将每个反应介质的样品用包含比例为40/60的甲醇和水的溶液稀释5倍，并然后通过HPLC进行分析(方法1)。
结果如下表所示。
3，4-二羟基扁桃酸包含焦儿茶酚结构，花旗松素，焦儿茶酚，原儿茶酸，咖啡酸然而，在本发明条件下没有合成出3，4-二羟基扁桃酸的葡糖基化衍生物。
令人意外的是，6，7-二羟基香豆素骨架也是得到一系列葡糖基化七叶亭的葡萄糖苷受体。必需强调的是，合成的七叶亭一葡萄糖苷的保留时间为15.65分钟，而天然的葡糖基化七叶亭(七叶苷或七叶亭6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)的保留时间为13.69分钟这毫无疑问地是由于在天然分子的情况下苷键是α-型，而在七叶苷中的苷键是β-型。
令人意外的是，七叶苷葡萄糖苷受体大概是由于其葡萄糖部分所致。
实施例8没食子酸、没食子酸丙酯和表焙儿茶素没食子酸酯的O-α-D-糖苷的酶促合成。
反应介质如实施例1所述准备，花旗松素用没食子酸(FLUKA，reference 48630)代替，或用没食子酸丙酯(SIGMA，reference P3130)或用表焙儿茶素没食子酸酯(SIGMA，reference 44699)代替，并且DMSO浓度减少至15％v/v。
在温育6小时后，每个反应介质的样品用包含比例为40/60的甲醇和水的溶液稀释5倍，然后使用前述的HPLC设备并结合后文所述的洗脱液A(含1％v/v的乙酸的去离子水)和洗脱液B(含1％v/v的乙酸的HPLC级甲醇)进行分析。
结果如下表所示。
分析条件 G1流速1ml/min；从0-10分钟B线性增加，从10％到20％；10到25分钟；B线性增加，从20％到50％；25到30分钟B在50％稳定；30到35分钟B线性降低，从50％到10％。
G6流速1ml/min；0到20分钟B线性增加，从2.5％到25％；20到25分钟B在25％稳定；25到28分钟B线性降低，25％到2.5％。
因此有可能根据上述方法合成新的没食子酸、没食子酸丙酯和表焙儿茶素没食子酸酯的葡糖基化衍生物得到的产物是一组包含至少一葡糖基化衍生物的物质。
实施例9咖啡酸苯乙酯、绿原酸和3，4-二羟基二苯甲酮的O-α-D-糖苷的酶促合成。
反应介质如实施例1所述准备，花旗松素用咖啡酸苯乙酯(SIGMA，reference C8221)代替，或用绿原酸(SIGMA，reference C3878)或用3，4-二羟基二苯甲酮(ALDRICH，reference 579815)代替，并且DMSO浓度是15％和25％v/v。
在温育6小时后，每个反应介质的样品用包含比例为40/60的甲醇和水的溶液稀释5倍，然后使用前述的HPLC设备并结合后文所述的洗脱液A(含1％v/v的乙酸的去离子水)和洗脱液B(含1％v/v的乙酸的HPLC级甲醇)进行分析。
结果如下表所示。
分析条件 G1参见实施例8 G2流速1ml/min；0到20分钟B线性增加，从40％到80％；20到22分钟B在80％稳定；22到27分钟B线性降低，80％到40％。
因此有可能根据上述方法合成新的咖啡酸苯乙酯、绿原酸和3，4-二羟基二苯甲酮的葡糖基化衍生物得到的产物是一组包含至少一葡糖基化衍生物的物质。
实施例10儿茶素、圣草酚、漆黄素、橄榄苦苷和去甲二氢愈创木酸的O-α-D-糖苷的酶促合成。
反应介质如实施例1所述准备，花旗松素用儿茶素(FLUKA，reference 22110)代替，或用圣草酚(EXTRASYNTHESE，reference 0056)代替，或用漆黄素(SIGMA，reference F4043)代替，或用橄榄苦苷(EXTRASYNTHESE，reference 0204)或用去甲二氢愈创木酸(EXTRASYNTHESE，reference6135)代替，并且DMSO浓度是15％和25％v/v。
在温育6小时后，每个反应介质的样品用包含比例为40/60的甲醇和水的溶液稀释5倍，然后使用前述的HPLC设备并结合后文所述的洗脱液A(含1％v/v的乙酸的去离子水)和洗脱液B(含1％v/v的乙酸的HPLC级甲醇)进行分析。
结果如下表所示。
分析条件 G1参见实施例8 G2参见实施例9 因此有可能根据上述方法合成新的儿茶素、圣草酚、漆黄素、橄榄苦苷和去甲二氢愈创木酸的葡糖基化衍生物得到的产物是一组包含至少一葡糖基化衍生物的物质。
实施例11在严格的含水介质中儿茶素、3，4-二羟基苯甲酸、没食子酸、迷迭香酸、咖啡酸和绿原酸的O-α-D-糖苷的酶促合成 反应介质如实施例1所述制备，花旗松素用7.5g/L浓度的儿茶素(FLUKA，reference 22110)代替，或用9.0g/L浓度的3，4-二羟基苯甲酸(ALDRICH，reference D10,980-0)代替，或用9.0g/L浓度的没食子酸(FLUKA，reference 48630)代替，或用7.5g/L浓度的迷迭香酸(FLUKA，reference 44699)代替，或用9.0g/L浓度的咖啡酸(SIGMA，referenceC0625)或用7.5g/L浓度的绿原酸(SIGMA，reference C3878)代替。省略了DMSO的使用，而乙酸钠缓冲剂浓度增加到100mM并且酶活性降低至1.0U/ml。
在温育6小时后，每个反应介质的样品用包含比例为40/60的甲醇和水的溶液稀释5倍，然后使用前述的HPLC设备并结合后文所述的洗脱液A(含1％v/v的乙酸的去离子水)和洗脱液B(含1％v/v的乙酸的HPLC级甲醇)进行分析。
结果如下表所示。
分析条件 G1参见实施例8 因此有可能根据上述方法在缺乏有机溶剂的条件下合成新的儿茶素、没食子酸、咖啡酸、3，4-二羟基苯甲酸、迷迭香酸和绿原酸的葡糖基化衍生物得到的产物是一组包含至少一葡糖基化衍生物的物质。
实施例12关于柔花酸、茜素、肾上腺素、芦丁和黄芩素的O-α-D-糖苷的酶促合成的尝试。
反应介质如实施例1所述准备，花旗松素用柔花酸(FLUKA，reference 45140)代替，或用芦丁(SIGMA，reference R5143)代替，或用茜素(EXTRASYNTHESE，reference 0411)代替，或用肾上腺素(SIGMA，reference E4250)代替，或用黄芩素(FLUKA，reference 11712)代替。DMSO浓度是25％v/v。
在温育6小时和21小时后，每个反应介质的样品用包含比例为40/60的甲醇和水的溶液稀释5倍，然后使用前述的HPLC设备并结合后文所述的洗脱液A(含1％v/v的乙酸的去离子水)和洗脱液B(含1％v/v的乙酸的HPLC级甲醇)进行分析。
结果如下表所示。
分析条件 G1参见实施例8 G2参见实施例9 G6参见实施例8 G4流速1ml/min；从0-10分钟B线性增加，从40％到80％；10到15分钟B在80％稳定；15到20分钟B线性降低，80％到40％。
尽管供试物质包含焦儿茶酚结构，但是环的取代基不允许它们被酶所识别。在芦丁的情况中，3-O-芸香苷的糖部分似乎对于酶识别非常重要，因为槲皮素在3’和/或4’位被葡糖基化(BERTRAND等)，而芦丁无此作用。
柔花酸
芦丁
茜素
肾上腺素
黄芩素
权利要求
1.制备酚类化合物O-α-葡萄糖苷的方法，该方法包括将蔗糖与得自明串珠菌(Leuconostoc species)、优选得自肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)NRRL B-512F的葡聚糖蔗糖酶以及具有下式所示结构的酚类化合物温育
其中
R2是H或OH；和
R1选自
其中R3和R4独立地是H或OH，前提条件是R3和R4中至少一个表示OH；
其中R7选自H，-OH或-OCOR且R8是H或OH，前提条件是R7和R8中至少一个表示OH；
其中R5是OH或OCH3；R6是H或OH，R9是H或OH，R10是H，OCH3或C6H11O5，和R11是H，OH或C6H11O5，前提条件是当R5和R6同时是OH时R10和R11不能同时是H，和当R10是C6H11O5时R11是H；
- -(CH2)n-COOR或-(CH2)n-CONHR，n是0-2的整数；
- -(CR12＝CH)-COOR或-(CR12＝CH)-CONHR，R12是H或C1-C6直链或环状的烷基或烯基，优选甲基，乙基，丙基，环己基或苯基；
- -(CH2)n-OR或-(CH2)n-NHR，n是0-2的整数；
- -(CH2)n-COR或-(CH＝CH)n-COR，n是0-2的整数；
--H；
- C1-C10烃基，其与式(I)中所示的环以及R1的邻位碳一起形成稠环(双环或三环)，所述环任选地被至少一个杂原子中断；
其中R是H或直链、支链或环状的，芳香或非芳香的，饱和或不饱和的C1-C10烃基，任选地被至少一个杂原子中断，其中所述烃基包括烷基，烯基或炔基，优选烷基或烯基，其可被一个或几个选自以下的取代基取代(C5-C9)芳基，(C4-C9)杂环，(C1-C3)烷氧基，(C2-C3)酰基，(C1-C3)醇，羧基(-COOH)，(C2-C3)酯，(C1-C3)胺，氨基(-NH2)，酰胺(-CONH2)，(C1-C3)亚胺，腈，羟基(-OH)，醛基(-CHO)，卤素，(C1-C3)卤代烷基，硫醇(-SH)，(C1-C3)硫烷基，(C1-C3)砜，(C1-C3)亚砜及其组合。
2.权利要求1的方法，其中酚类化合物的R1是
其中R3和R4独立地是H或OH，前提条件是R3和R4中至少一个表示OH。
3.权利要求2的方法，其中酚类化合物选自花旗松素，圣草酚，双氢刺槐亭和黄颜木素。
4.权利要求1的方法，其中酚类化合物的R1是
其中R7选自H，-OH或-OCOR且R8是H或OH，前提条件是R7和R8中至少一个表示OH。
5.权利要求4的方法，其中酚类化合物选自儿茶素，表儿茶素，儿茶素没食子酸酯，表儿茶素没食子酸酯，焙儿茶素，表焙儿茶素，焙儿茶素没食子酸酯和表焙儿茶素没食子酸酯。
6.权利要求1的方法，其中酚类化合物的R1是
其中R5是OH或OCH3；R6是H或OH，R9是H或OH，R10是H，OCH3或C6H11O5，和R11是H，OH或C6H11O5，前提条件是当R5和R6同时是OH时R10和R11不能同时是H，和当R10是C6H11O5时R11是H。
7.权利要求6的方法，其中酚类化合物选自鼠李亭，漆黄素，刺槐亭，棉皮皮素，荭草素，异荭草素和5，3’，4’-三羟基-6，7-二甲氧基黄酮。
8.权利要求1的方法，其中酚类化合物的R1是
-(CH2)n-COOR或-(CH2)n-CONHR，n是0-2的整数。
9.权利要求8的方法，其中酚类化合物选自高原儿茶酸，二氢咖啡酸，原儿茶酸乙酯，没食子酸丙酯，没食子酸，金缕梅丹宁(2’，5-二-O-没食子酰基-金缕梅糖)和原儿茶酸。
10.权利要求1的方法，其中酚类化合物的R1是-(CR12＝CH)-COOR或-(CR12＝CH)-CONHR，R12是H或C1-C6直链、支链或环状的烷基或烯基，优选甲基，乙基，丙基，环己基或苯基，更优选甲基或苯基。
11.权利要求10的方法，其中酚类化合物选自咖啡酸，迷迭香酸，七叶亭，4-甲基七叶亭，去甲黄檀素(6，7-二羟基苯基香豆素)，绿原酸，咖啡酸苯乙酯，菊苣酸(二咖啡酰基酒石酸)，松果菊苷(2-(3，4-二羟基苯基)乙基O-6-脱氧-α-L-吡喃甘露糖基-(1→3)-O-(β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6))-，4-(3-(3，4-二羟基苯基)-2-丙烯酸酯)，β-D-吡喃葡萄糖苷)和毛蕊花苷。
12.权利要求1的方法，其中酚类化合物的R1是
-(CH2)n-OR或-(CH2)n-NHR，n是0-2的整数，例如酚类化合物是羟基酪醇。
13.权利要求1的方法，其中酚类化合物的R1是
-(CH2)n-COR或-(CH＝CH)n-COR，n是0-2的整数。
14.权利要求13的方法，其中酚类化合物选自桑橙素，3，4-二羟基苯甲醛，3，4-二羟基二苯甲酮，紫铆花素(2’，3，4，4’-四羟基查耳酮)，3，4-二羟基苯乙酮，马里苷(2’，3，3’，4，4’-五羟基-4’-葡糖基查耳酮)和圣草酚查耳酮(2’，4’，6’，3，4-五羟基查耳酮)。
15.权利要求1的方法，其中酚类化合物的R1是H，例如酚类化合物是焦儿茶酚。
16.权利要求1的方法，其中酚类化合物的R1是
例如酚类化合物是去甲二氢愈创木酸。
17.权利要求1的方法，其中酚类化合物的R1是
例如酚类化合物是3-羟基大豆苷元。
18.权利要求1的方法，其中酚类化合物的R1是
例如酚类化合物是橄榄苦苷。
19.权利要求1的方法，其中酚类化合物的R1是
例如酚类化合物是金鸡菊甙(3’，4’，6，7-四羟基-6-O-葡糖基噢哢)。
20.权利要求1的方法，其中酚类化合物的R1是C1-C10烃基，其与式(I)中所示的环以及R1的邻位碳一起形成稠环(双环或三环)，所述环任选地被至少一个杂原子中断。
21.权利要求20的方法，其中酚类化合物选自
优选酚类化合物是脱氧茜素或去甲猪毛菜碱(1-甲基-6，7-二羟基-1，2，3，4-四氢异喹啉)。
22.如下式所示的酚类化合物O-α-葡萄糖苷
其中
A和B，相同或不同，是H或α-葡糖基残基，前提条件是A和B中至少一个是α-葡糖基残基；
R2是H或OH；和，
R1选自
其中R3和R4独立地是H或OH，前提条件是R3和R4中至少一个表示OH；
其中R7选自H，-OH或-OCOR且R8是H或OH，前提条件是，当R2是H时，R7和R8不同时是OH，并且R7和R8中至少一个是OH；
其中R5是OH或OCH3；R6是H或OH，R9是H或OH，R10是H，OCH3或C6H11O5，和R11是H，OH或C6H11O5，前提条件是当R5和R6同时是OH时R10和R11不同时是H，和当R10是C6H11O5时R11是H；
- -(CH2)n-COOR或-(CH2)n-CONHR，n是0-2的整数；
- -(CR12＝CH)-COOR或-(CR12＝CH)-CONHR，R12是H或C1-C6直链、支链或环状的烷基或烯基，优选甲基，乙基，丙基，环己基或苯基，更优选甲基或苯基；
- -(CH2)n-OR或-(CH2)n-NHR，n是0-2的整数；
- -(CH2)n-COR或-(CH＝CH)n-COR，n是0-2的整数；
-H；
-C1-C10烃基，其与式(I)中所示的环以及R1的邻位碳一起形成稠环(双环或三环)，所述环任选地被至少一个杂原子中断；
其中R是H或直链、支链或环状的，芳香或非芳香的，饱和或不饱和的C1-C10烃基，任选地被至少一个杂原子中断，其中所述烃基包括烷基，烯基或炔基，优选烷基或烯基，其可被一个或几个选自以下的取代基取代(C5-C9)芳基，(C4-C9)杂环，(C1-C3)烷氧基，(C2-C3)酰基，(C1-C3)醇，羧基(-COOH)，(C2-C3)酯，(C1-C3)胺，氨基(-NH2)，酰胺(-CONH2)，(C1-C3)亚胺，腈，羟基(-OH)，醛基(-CHO)，卤素，(C1-C3)卤代烷基，硫醇(-SH)，(C1-C3)硫烷基，(C1-C3)砜，(C1-C3)亚砜及其组合。
23.权利要求22的酚类化合物O-α-葡萄糖苷，其中R1是
并且优选地，酚类化合物O-α-葡萄糖苷选自花旗松素O-α-葡萄糖苷，圣草酚O-α-葡萄糖苷，双氢刺槐亭O-α-葡萄糖苷和黄颜木素O-α-葡萄糖苷。
24.权利要求22的酚类化合物O-α-葡萄糖苷，其中R1是
并且优选地，酚类化合物O-α-葡萄糖苷选自儿茶素没食子酸酯O-α-葡萄糖苷，表儿茶素没食子酸酯O-α-葡萄糖苷，焙儿茶素O-α-葡萄糖苷，表焙儿茶素O-α-葡萄糖苷，焙儿茶素没食子酸酯O-α-葡萄糖苷和表焙儿茶素没食子酸酯O-α-葡萄糖苷。
25.权利要求22的酚类化合物O-α-葡萄糖苷，其中R1是
并且优选地，酚类化合物O-α-葡萄糖苷选自鼠李亭O-α-葡萄糖苷，漆黄素O-α-葡萄糖苷，刺槐亭O-α-葡萄糖苷，棉皮皮素O-α-葡萄糖苷，荭草素O-α-葡萄糖苷，异荭草素O-α-葡萄糖苷和5，3’，4’-三羟基-6，7-二甲氧基黄酮O-α-葡萄糖苷。
26.权利要求22的酚类化合物O-α-葡萄糖苷，其中R1是
-(CH2)n-COOR或-(CH2)n-CONHR，n是0-2的整数，并且优选地，酚类化合物O-α-葡萄糖苷选自高原儿茶酸O-α-葡萄糖苷，二氢咖啡酸O-α-葡萄糖苷，原儿茶酸乙酯O-α-葡萄糖苷，没食子酸丙酯O-α-葡萄糖苷，没食子酸O-α-葡萄糖苷，金缕梅丹宁O-α-葡萄糖苷和原儿茶酸O-α-葡萄糖苷。
27.权利要求22的酚类化合物O-α-葡萄糖苷，其中R1是
-(CR12＝CH)-COOR或-(CR12＝CH)-CONHR，R12是H或C1-C6直链或环状的烷基或烯基，优选甲基，乙基，丙基，环己基或苯基，并且优选地，酚类化合物O-α-葡萄糖苷选自咖啡酸O-α-葡萄糖苷，迷迭香酸O-α-葡萄糖苷，七叶亭O-α-葡萄糖苷，4-甲基七叶亭O-α-葡萄糖苷，去甲黄檀素(6，7-二羟基苯基香豆素)O-α-葡萄糖苷，绿原酸O-α-葡萄糖苷，咖啡酸苯乙酯O-α-葡萄糖苷，菊苣酸(二咖啡酰基酒石酸)O-α-葡萄糖苷，松果菊苷(2-(3，4-二羟基苯基)乙基O-6-脱氧-α-L-吡喃甘露糖基-(1→3)-O-(β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6))-，4-(3-(3，4-二羟基苯基)-2-丙烯酸酯)O-α-葡萄糖苷，β-D-吡喃葡萄糖苷O-α-葡萄糖苷和毛蕊花苷O-α-葡萄糖苷。
28.权利要求22的酚类化合物O-α-葡萄糖苷，其中R1是
-(CH2)n-OR或-(CH2)n-NHR，n是0-2的整数，并且优选地，酚类化合物O-α-葡萄糖苷是羟基酪醇O-α-葡萄糖苷。
29.权利要求22的酚类化合物O-α-葡萄糖苷，其中R1是
-(CH2)n-COR或-(CH＝CH)n-COR，n是0-2的整数，并且优选地，酚类化合物O-α-葡萄糖苷选自桑橙素O-α-葡萄糖苷，3，4-二羟基苯甲醛O-α-葡萄糖苷，3，4-二羟基二苯甲酮O-α-葡萄糖苷，紫铆花素(2’，3，4，4’-四羟基查耳酮)O-α-葡萄糖苷，3，4-二羟基苯乙酮O-α-葡萄糖苷，马里苷(2’，3，3’，4，4’-五羟基-4’-葡糖基查耳酮)O-α-葡萄糖苷和圣草酚查耳酮(2’，4’，6’，3，4-五羟基查耳酮)O-α-葡萄糖苷。
30.权利要求22的酚类化合物O-α-葡萄糖苷，其中R1选自
并且优选地，酚类化合物O-α-葡萄糖苷选自焦儿茶酚O-α-葡萄糖苷，去甲二氢愈创木酸O-α-葡萄糖苷，3-羟基大豆苷元O-α-葡萄糖苷，橄榄苦苷O-α-葡萄糖苷和金鸡菊甙(3’，4’，6，7-四羟基-6-O-葡糖基噢哢)O-α-葡萄糖苷。
31.权利要求22的酚类化合物O-α-葡萄糖苷，其中R1是C1-C10烃基，其与式(I)中所示的环以及R1的邻位碳一起形成稠环(双环或三环)，所述环任选地被至少一个杂原子中断，并且优选地，酚类化合物O-α-葡萄糖苷选自脱氧茜素O-α-葡萄糖苷和去甲猪毛菜碱(1-甲基-6，7-二羟基-1，2，3，4-四氢异喹啉)O-α-葡萄糖苷。
32.权利要求22-31中任一项的酚类化合物O-α-葡萄糖苷，其中所述O-α-葡糖基残基是葡萄糖单体。
33.权利要求22-32中任一项的酚类化合物O-α-葡萄糖苷，其在相同的生理条件下具有的溶解度比相应的糖苷配基的溶剂度高20倍。
34.权利要求22-33中任一项的酚类化合物O-α-葡萄糖苷，其中所述酚类化合物O-α-葡萄糖苷可通过酶裂解以释放相应的糖苷配基。
35.权利要求34的酚类化合物O-α-葡萄糖苷，其中所述酶由与人结合的微生物、特别是与人皮肤结合的微生物产生。
36.权利要求22-35中任一项的酚类化合物O-α-葡萄糖苷，其作为药物。
37.药物组合物或化妆品组合物，其包括权利要求22-35中任一项的酚类化合物O-α-葡萄糖苷。
38.权利要求22-35中任一项的酚类化合物O-α-葡萄糖苷在制备要通过局部、经口、经直肠、经鼻或经阴道给药的药物组合物或化妆品组合物中的应用，其中与皮肤、口、肠道、上呼吸系统或雌性生殖道结合的微生物产生的酶使相应的糖苷配基释放。
39.权利要求22-35中任一项的酚类化合物O-α-葡萄糖苷在制备用于治疗或预防癌、心血管疾病、细菌感染、UVB诱导的红斑、变态反应、炎性或免疫病症的药物组合物或化妆品组合物中的应用。
全文摘要
本发明涉及通过选自焦儿茶酚或其衍生物的酚类化合物与蔗糖的葡萄糖部分进行酶促缩合制备酚类化合物的衍生物。所述酚类化合物的衍生物的制备使用糖基转移酶(EC 2.4.1.5)完成。这些被选择的酚类化合物的葡萄糖苷是新的，在水中的溶解度高于其母体多酚在水中的溶解度，并且可用在化妆品组合物和药物组合物中，诸如用在抗氧化、抗病毒、抗菌、免疫刺激、抗过敏、抗高血压、抗缺血、抗心率不齐、抗血栓形成、降胆固醇、抗脂质过氧化、肝保护、抗炎、抗癌、抗诱变、抗肿瘤、抗血栓和血管舒张的制剂，和任何其它的应用领域中。
文档编号C12P17/02GK101611148SQ200780022307
公开日2009年12月23日 申请日期2007年6月13日 优先权日2006年6月14日
发明者丹尼尔·奥里奥尔, 雷诺·纳林, 帕特里克·罗布, 法布里斯·勒菲弗 申请人:利布莱根公司