一种左聚糖蔗糖酶融合蛋白及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学【技术领域】，涉及一种左聚糖蔗糖酶融合蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的左聚糖蔗糖酶融合蛋白，是具有序列表中SEQ?ID?NO:1氨基酸序列的蛋白质，或者是将SEQ?ID?NO:1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代且具有与SEQ?ID?NO:1的氨基酸序列相同活性的由SEQ?ID?NO:1衍生的蛋白质。本发明所提供的左聚糖蔗糖酶融合蛋白在以蔗糖为底物转糖苷聚合形成左聚糖反应中的最适反应温度从16℃提高到40℃，使得该酶在较高温度下还能保持良好活性对蔗糖进行转糖苷聚合反应，另外，提高反应温度有利于提高反应速度，节约反应时间，在我国南方气候较炎热地区生产时还能减少降温所需能耗，从而降低生产成本，更有利于产业化生产应用。
【专利说明】一种左聚糖蔗糖酶融合蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学【技术领域】，涉及一种左聚糖蔗糖酶融合蛋白及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002]左聚糖(Levan)是指以β _(2，6)糖苷键连接而成的高分子量果聚糖，分子量可高达200万以上，主要来源于微生物。研究表明，高分子量左聚糖具有抗病毒，抗肿瘤，增强免疫等多种生物功能，可广泛应用于低热减脂食品、减肥产品、益生元、膳食纤维、乳化剂、凝胶剂、保湿剂等领域。有研究表明左聚糖具有和透明质酸相当的保湿性能和生物相容性，因此在化妆品行业的应用前景非常广阔，目前韩国进口产品在该领域国内市场占据垄断地位。
[0003]左聚糖鹿糖酶(Ievansucrase)也被称为果糖基转移酶(EC2.4.1.10,FTase, Lls,FTF, fructosy I transferase, sucrose: 2, 6-D-fructan-6-D-fruct osy I transferase),是一类可以通过转糖苷反应，将蔗糖中的果糖聚合形成大分子量果聚糖即左聚糖的酶。
[0004]作为我国蔗糖大省，广西的蔗糖产量已经占全国产量的60%以上，然而广西的制糖产业一直存在产品单一、缺乏深加工和高附加值产品开发。开发高效左聚糖蔗糖酶，以蔗糖为底物生产高附加值的左聚糖产品，可以大幅提升广西制糖业的经济价值，扩增产品线，促进农民增收，具有很好的应用前景和社会效益。
[0005]国内关于利用微生物发酵方式产生左聚糖的研究报道较少，远未能成熟地实现产业应用。利用分子改造的左聚糖蔗糖酶转化蔗糖生产左聚糖的研究开展得更少。目前国内外已经报道的左聚糖蔗糖酶其最适反应温度大多为4-16°C，普遍存在着反应热稳定性不佳、最适反应温度低、高温下转化率降低等问题，严重制约了生产应用。
[0006]为了实现左聚糖生产的国产化和自主化，冲破进口产品的市场垄断，本专利研究利用现代微生物生物技术、蛋白质工程、分子酶工程等先进手段，通过融合蛋白的方式改造合成新的左聚糖蔗糖酶融合基因，并在原核或真核微生物中表达出最适反应温度显著提高的左聚糖蔗糖酶重组蛋白，为今后工业化大规模生产新型耐高温左聚糖蔗糖酶奠定良好基础。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种左聚糖蔗糖酶融合蛋白及其编码基因，以及该蛋白及其编码基因在制备左聚糖生产中的应用。
[0008]为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是:
[0009]本发明所提供的左聚糖蔗糖酶融合蛋白，名称为STHB6，是具有序列表中SEQ IDNO:1氨基酸序列的蛋白质，或者是将SEQ ID NO:1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代且具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相同活性的由SEQ ID NO:1衍生的蛋白质。
[0010] 序列表中序列I的氨基酸序列是由897个氨基酸残基组成的蛋白质。[0011]—种编码SEQ ID NO:1所不蛋白的基因，名称为sthb6,所述基因的核昔酸序列如SEQ ID NO:2 所示。
[0012]序列2的DNA序列由2694个碱基组成。
[0013]含有核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围。
[0014]上述所述蛋白、基因以及含有该基因的表达载体、细胞系在左聚糖制备及其他转糖苷反应、糖水解反应过程中的应用。
[0015]所述左聚糖蔗糖酶融合蛋白的制备方法，包括下列步骤:将融合蛋白编码基因与表达载体连接后导入基因工程菌进行融合蛋白的表达，将所得的融合蛋白进行纯化即可获得左聚糖蔗糖酶融合蛋白。
[0016]本发明的突出的实质性特点和技术效果在于:
[0017]本发明利用现代微生物生物技术、蛋白质工程、分子酶工程等先进手段，将来自嗜热栖热菌Thermus thermophilus TtHB-8的海藻糖合成酶C末端(该末端与海藻糖合成酶热稳定性相关)结构域的基因片段融合到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)编码左聚糖蔗糖酶的基因中，获得一个新的左聚糖蔗糖酶编码基因sthb6，并在原核或真核微生物中表达，获得融合蛋白。
[0018]新的左聚糖蔗糖酶融合蛋白STHB6在以蔗糖为底物转糖苷聚合形成左聚糖反应中的最适反应温度从16°C提高到40°C，使得该酶在较高温度下还能保持良好活性对蔗糖进行转糖苷聚合反应，为工业化大规模生产新型耐高温左聚糖蔗糖酶奠定良好基础。另外，提高反应温度有利于提高反应速度，节约反应时间。在我国南方，气温常年较高，若反应温度低则需要制冷，而且通常情况下，对生产企业而言，制冷比制热更难且能耗更多，因此本发明还能减少降温所需能耗，从而降低生产成本，更有利于产业化生产应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为枯草芽孢杆菌左聚糖蔗糖酶基因PCR扩增和嗜热栖热菌海藻糖合成酶C末端基因片段PCR扩增的琼脂糖电泳图。
[0020]图2为经镍亲和层析纯化后所得左聚糖蔗糖酶融合蛋白STHB6纯化产物的蛋白质SDS-PAGE电泳图。
[0021]图3为枯草芽孢杆菌左聚糖蔗糖酶野生型原酶在不同反应温度下将蔗糖转化为左聚糖的相对产率变化。
[0022]图4为左聚糖蔗糖酶融合蛋白STHB6在不同反应温度下将蔗糖转化为左聚糖的相
对产率变化。
【具体实施方式】
[0023]本发明采用的微生物培养、基因克隆、表达技术和相关的技术方案是本领域中常用的成熟技术，涉及的专业术语也是本领域中常见的专业术语。下面结合实施例对本发明的技术内容作进一步说明，该实施例是说明性的，而不是限定性的，不能被解释为限定本发明的保护范围。
[0024]本发明使用的枯草芽孢杆菌菌种可以通过野外采集，也可以从菌种保藏中心购买，或者经其他途径获得。
[0025]下面将通过实施例对本发明作详细描述:
[0026](1)枯草芽孢杆菌左聚糖蔗糖酶基因ss56a的获得
[0027]枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) sp.56A是本实验室从土壤中筛选所得,经过16S rRNA序列分析比对鉴定为枯草芽孢杆菌。根据Genbank已公布的枯草芽孢杆菌编码左聚糖蔗糖酶的基因SacB全长序列设计两端引物，其中上游引物Fl包含Nco I酶切位点，下游引物Rl包含Pst I酶切位点，并且为了便于融合，去除了该SacB基因末端终止子。通过PCR扩增，再将PCR产物经Nco I和Pst I双酶切后连接到同样双酶切处理的PSE380载体，转化到大肠杆菌，通过平板筛选获得重组子。
[0028]上游引物Fl 为:GATCCATGGTGAACATCAAAAAGITTGC
[0029]下游引物Rl 为:GATCTGCAGTTTGTTAATTGTTAATTGTC
[0030]PCR 扩增反应体系为:5 XPrimer STAR PCR buffer5.0L, 2.5mmol/L 的 dNTPs2.0L,50mmol/L的上下游引物各1.0 μ L，DNA模板0.5 μ L，Primer STAR?0.5 μ L，加超纯水至反应总体积为25 μ L0
[0031]PCR 扩增条件为:95°C 解链 3min，94°C 变性 30sec ;40°C 退火 30sec ;72°C 延伸3min ;共进行30个循环反应；然后于72°C继续延伸lOmin。
[0032]将所得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测到扩增产物大小与目的基因片段大小基本吻合(图1泳道I)。PCR产物用PCR产物纯化试剂盒(购于天泽公司)进行纯化，具体步骤参考试剂盒说明书。
[0033](2)嗜热栖热菌海藻糖合成酶C末端基因片段的获得
[0034]提取嗜热栖热菌Thermus thermophilus TtHB-8的基因组DNA,通过据Genbank已公布的嗜热栖热菌Thermus thermophilus TtHB-8的海藻糖合成酶Trehalosesynthase (TS)基因全长序列设计C端基因片段引物，其中上游引物包含Pst I酶切位点，下游引物包含6个组氨酸标签和Spe I酶切位点，引入组氨酸标签是为了方便后续纯化。
[0035]上游引物Fl为:
[0036]CGACTGCAGCCCGACTGGGCCGAGGAGCC
[0037]下游下游引物Rl为:
[0038]GACACTAGTCTAATGATGATGATGATGATGGGCTTTTCCGGCCTTGG
[0039]PCR 扩增反应体系为:5 XPrimer STAR PCR buffer5.0L, 2.5mmol/L 的 dNTPs2.0L,50mmol/L的上下游引物各1.0 μ L，DNA模板0.5 μ L，Primer STAR?0.5 μ L，加超纯水至反应总体积为25 μ L0
[0040]PCR 扩增条件为:95°C 解链 3min，94°C 变性 30sec ；60.8°C 退火 30sec ;72°C 延伸2min ;进行30次循环；72°C继续延伸lOmin。
[0041]将所得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测到扩增产物大小与目的基因片段大小基本吻合(图1泳道2)。PCR产物用PCR产物纯化试剂盒(购于天泽公司)进行纯化，具体步骤参考试剂盒说明书。
[0042](3)左聚糖蔗糖酶融合基因sthb6的构建
[0043] 第一步将所得ss56a基因连接入pSE380，然后用PstI和SpeI双酶切得到用于融合的克隆载体pSE_SS56Am ;第二步将所得TtHB-8C_terminal domains用PstI和SpeI双酶切作为插入片段，然后将它与先前制备的携带有ss56a的双酶切的pSE-SS56Am重组质粒于16°C连接过夜。转化到大肠杆菌E.coliXLlO-Gold并筛选重组子
[0044](4)重组质粒的验证
[0045]采用常规CaCl2化学法将连接产物转化到大肠杆菌E.coli XLlO-Gold感受态细胞，通过氨苄抗性平板筛选挑取重组子，进行活力验证和DNA测序分析确定正确的转化子。
[0046](5)基因工程菌株的构建及左聚糖蔗糖酶融合蛋白STHB6的表达
[0047]采用常规CaCl2化学法将验证正确的重组质粒转化E.coli XLlO-Gold感受态细胞，构建基因工程菌。将构建好的基因工程菌接种于5mL液体LB培养基(含100 μ g/mL氨苄青霉素)，37°C培养IOh。取2.0mL的液体种子接种200mL液体LB培养基(含100 μ g/mL氨苄青霉素)，37°C培养2~3h，当OD6tltl达到0.6~1.0之时，加入终浓度为0.5~1.0mmol/L的IPTG，于20°C、200r/min转速下进行诱导培养20h左右，收集细胞，采用超声波破胞制备粗酶液，经过镍亲和层析纯化，纯化重组蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，得到比较明显的单一条带(图2)，说明重组酶纯化效果较好，可用于酶活力测试。
[0048](6)本发明采用提取称重法测定左聚糖蔗糖酶将蔗糖转化为左聚糖的产率和活力。
[0049]测定的步骤为:取适量经SDS-PAGE验证达到电泳纯的左聚糖蔗糖酶纯化液，在一定体积的PH6-8的0.2mol/L PBS缓冲体系中与10-20%质量体积浓度的蔗糖反应24小时。反应结束后，在反应体系加入2-3倍体积的无水乙醇，于4°C静置过夜使多糖充分沉淀，同时使单糖尽量溶解在溶液里。然后在4°C用13000g离心30分钟，弃去上清，所得左聚糖沉淀在60°C真空烘干至恒重，称量左聚糖产物的重量，即可求出产率。以最高产率为100%，计算不同反应温度下的相对产率。此法也可根据需要进一步计算聚合(转糖苷)活力。
[0050]通过枯草芽孢杆菌左聚糖蔗糖酶野生型原酶、左聚糖蔗糖酶融合蛋白STHB6在不同反应温度下转化蔗糖的对比实验，枯草芽孢杆菌左聚糖蔗糖酶原酶在以蔗糖为底物时最适反应温度为16°C (图3所示)，之后随着反应温度升高产率逐步下降；而左聚糖蔗糖酶融合蛋白STHB6在以蔗糖为底物时最适反应温度为40°C (图4所示)，之后随着反应温度升高产率逐步下降。可见，新的左聚糖蔗糖酶融合蛋白STHB6聚合左聚糖的最适反应温度相较于野生型原酶有显著提高。
[0051]该发明具有重要应用前景，提高酶的最适反应温度意味着可以在较高的温度下保持酶的稳定性，提高反应速度和生产效率。该酶以蔗糖为原料转化生产左聚糖，而我国蔗糖产地集中在广西、云南等气温常年较高地区，因此本发明更适合在主要原料产区进行生产使用，相比于最适反应温度低的原酶，本发明可避免或减少生产中降温所需能耗。本发明的这些优点有利于降低生产成本，更适合工业化生产应用，有望产生显著的经济效益。
[0052]应该理解的是，对本领域技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，例如，所述的野生型左聚糖蔗糖酶除了来源于枯草芽孢杆菌之外，还可以来源于地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、类芽孢杆菌等菌株。所述的载体适于在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、毕赤酵母等宿主中表达。也可通过电转化法、原生质体转化法等将本发明的左聚糖蔗糖酶突变体转入原核或者真核宿主中，以实现左聚糖蔗糖酶突变体的表达。或者通过酶工程技术对所述的左聚糖蔗糖酶融合蛋白STHB6任一位点的氨基酸残基进行替换。而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。[0053]
_序列表_
SIiQUHNCH LISTING
<110〉广西大学
<120> 一种左聚糖蔗糖酶融合蛋白及其编码基因与应用<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> I<211> 897<212〉 PRT
〈213〉枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis);嗜热栖热菌(Thermus thermophilus )<400〉 I
Met Val Asn He Lys Lys Phe Ala Lys Gln Ala Thr Val Leu Thr Phe151015
Thr Thr Ala Leu Leu Ala Gly Gly Ala Thr Gln Ala Phe Ala Lys Glu
202530
Thr Asn Gln Lys Pro Tyr Lys Glu Thr Tyr Gly He Ser His He Thr
354045
Arg His Asp Met Leu Gln lie Pro Glu Gln Gln Lys Asn Glu Lys Tyr
505560
Gln Val Pro Glu Phe Asp Ser Ser Thr He Lys Asn He Ser Ser Ala
65707580
[0054]
【权利要求】
1.一种左聚糖蔗糖酶融合蛋白，其特征在于，所述蛋白是具有序列表中SEQ ID NO:1氨基酸序列的蛋白质，或者是将SEQ ID NO:1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代且具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相同活性的由SEQ ID NO:1衍生的蛋白质。
2.一种编码权利要求1所述蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
3.含有权利要求2所述基因的表达载体。
4.含有权利要求2所述基因的细胞系。
5.权利要求1所述蛋白在左聚糖制备及其他转糖苷反应、糖水解反应过程中的应用。
6.权利要求2所述基因在左聚糖制备及其他转糖苷反应、糖水解反应过程中的应用。
7.权利要求3所述表达载体在左聚糖制备及其他转糖苷反应、糖水解反应过程中的应用。
8.权利要求4所述细胞系在左聚糖制备及其他转糖苷反应、糖水解反应过程中的应用。
9.权利要求1所述左聚糖蔗糖酶融合蛋白的制备方法，包括下列步骤:将融合蛋白编码基因与表达载体连接后导入基因工程菌进行融合蛋白的表达，将所得的融合蛋白进行纯化即可获得左聚糖蔗 糖酶融合蛋白。
【文档编号】C12N15/63GK104017785SQ201410300091
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月27日 优先权日:2014年6月27日
【发明者】杨辉, 黄日波 申请人:广西大学