本发明是有关抗癌疫苗领域。具体来说，本发明涉及用作抗癌疫苗的癌胚抗原免疫原的优化多肽，增强T细胞免疫应答。
背景技术：
癌胚抗原(CEA)是一种酸性蛋白。癌旁正常粘膜CEA含量很少或为阴性。胃癌的CEA阳性率85.58％。其中粘液腺癌及印戒细胞癌(粘液细胞癌)为100％。及癌细胞内胞质内的蛋白合成及转运的细胞器(如核膜、内质网、高尔基器及其分泌小泡)中，提示癌细胞合成CEA增加，电镜下见CEA同时分布于癌细胞膜，因此进入腺腔的CEA也增加，由于CEA位于围绕细胞膜的糖包膜易于释入周围体液中，故体液及胃液中CEA浓度高于血清。癌细胞质内CEA含量较多的原因与癌细胞CEA合成增加及CEA排出受阻有关。当癌细胞变性坏死时，细胞内膜结构受损破裂，CEA可出现在胞质的基质内。免疫电镜观察，见粘液细胞癌CEA分布在整个细胞膜和胞浆的膜结构中，CEA抗原决定基为糖蛋白，而肿瘤细胞的浸润和转移均与细胞膜糖蛋白的糖基化改变有关。另外粘液细胞癌还能分泌释放大量蛋白水解酶，破坏癌细胞钙桥，溶解癌巢周围软组织。因此胃印戒细胞癌侵袭力强，转移率高。因此，癌胚抗原是一个广谱性肿瘤标志物，它能向人们反映出多种肿瘤的存在，对大肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展、监测和预后估计是一个较好的肿瘤标志物。
CEA可以作为肿瘤细胞免疫疗中的特异性肿瘤疫苗。肿瘤细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发，增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。肿瘤细胞免疫疗法是继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术。然而，CEA由702个氨基酸的蛋白，分子量较大，较难得到纯度高的CEA。这样，不仅会给后期的特异性T细胞免疫带来困难，而且会导致患者的自身免疫。因此，本发明提供了一种特异性强，纯度较高的小分子多肽作为免疫原。
技术实现要素：
发明目的
本发明提供一种CEA免疫原多肽，可用于肿瘤细胞免疫的免疫原，增强T细胞免疫应答，具有分子量小、特异性免疫原性强的特点。
技术方案
本发明的技术方案在于提供一种癌胚抗原免疫原多肽，序列为LRLGP YECGISSNLSVDHSDPVILNVLDDYPDDPTI PSYTYYR(SEQ ID NO：1)。该氨基酸序列为全新的序列，在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。尤其在制备用于肿瘤免疫细胞，增强T细胞免疫应答药物中的应用，以及在制备用于CAR-T细胞免疫治疗的应用。
有益效果
本发明的癌胚抗原免疫原多肽，为全新的序列，可用于肿瘤免疫细胞技术中的免疫原。有益效果在于(1)促进T细胞增殖，(2)促进CD8+免疫应答，(3)能与T细胞表面的MHC有效的特异性结合，(4)促进T细胞与肿瘤细胞的结合，(5)在荷瘤小鼠体内，能抑制肿瘤的生长。作为细胞疗法的靶标分子，应用于CAR-T等细胞疗法。
具体实施方式
多肽由上海生工吉尔合成。
实施例1
用肿瘤模型检测CEA免疫原多肽的体内活力。
6-8w龄C57BL/6小鼠，小鼠随机分成4组，雌雄各半，每组10只。(1)空白组；(2)多肽低剂量组；(3)多肽中剂量组；(4)多肽高剂量组。建立胃癌肿瘤模型，在接种肿瘤细胞后的第3、5、7天，分别进行免疫。方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组多肽设3个剂量：5、10、20mg/Kg，在肿瘤周围多点注射。21天后，观察小鼠存活数量，计算存活率。结果显示，多肽可有效地保护小鼠，提高荷瘤小鼠的生存率，20mg/Kg组的生存率达到91.2％。
实施例2
应用竞争性受体-配体亲和法测试多肽与MHC的结合能力：
将多肽与HLA各型的结合能力由竞争性受体-配体亲和法判断。将固定浓度为50μmol/L的标记125I的多肽以及不同浓度(1-50μmol/L)的多肽加入反应体系(磷酸盐缓冲液和MHC，所述的MHC试剂盒购自上海泛柯生物科技有限公司，试剂盒内有HLA-A1、A2、A3、A11和A24)，在反应体系中形成两种复合物，即待测多肽MHC复合物和125I标记多肽复合物。待测多肽与125I标记多肽竞争与MHC的结合。用超过滤(产品型号Microcon 30，Amicon公司)分离游离多肽和多肽MHC复合物，然后测定多肽MHC复合物的125I放射量，将此放射量与没有竞争性抑制的多肽MHC复合物(没有加待测多肽的样本)的放射量比较，求待测多肽在抑制50％标记多肽与MHC结合时的浓度，即IC50。由此得到，多肽对HLA-A1、A2、A3、A11和A24的IC50值分别为0.81、6.29、4.58、7.76和3.41μmol/L，均符合阳性多肽的标准(≤10μM)。因此，多肽为具有有效结合能力的免疫原多肽。
实施例3
T淋巴细胞的增殖作用：无菌取小鼠脾脏，1640培养基清洗3次，5ml注射器芯研磨，200目筛网过滤，制成单细胞悬液，离心(1000r/min，5min)，弃上清，Tris-NH4CL破解红细胞，冰水浴静置3-5min，离心(1000r/min,5min)，弃上清，用无菌冷PBS洗涤细胞两次。最后加入10％小牛血清的RPMI 1640培养液(5ml)悬浮细胞，细胞计数，调整细胞浓度为5×106个/ml，于96孔培养板中培养。
实验设空白对照组、模型组(刀豆蛋白A，sigma公司购买)、多肽各剂量(5、10、20mg/ml)组。各组分别加入脾脏淋巴细胞悬液100μl/孔后，空白对照组加入1640培养液100μl，模型组加入ConA(终浓度为5μg/ml)，多肽各剂量组在加入不同浓度的多肽基础上加ConA(终浓度为5μg/ml)。37℃细胞培养箱静止培养48h，培养结束后每孔加入20μl MTT，继续培养4h，最后弃掉每孔所有溶液，每孔加入100μlDMSO，震荡，用酶标仪检测570nm处OD值，每孔设5个平行。
表1多肽对T淋巴细胞的增殖作用
*P<0.05，**P<0.01与模型组相比。
实验结果见表1，与模型组比较，多肽能促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖，在剂量为5～20mg/ml的范围呈现很好的剂量依赖关系，以20mg/ml的增殖率最高，为72.70％。
实施例4
CEA免疫原多肽的免疫原性测定：采用流式细胞技术测定免疫原多肽对CD8+T细胞的影响。6-8w龄C57BL/6小鼠，雌雄各半，小鼠随机分成4组，每组10只。(1)空白组；(2)免疫原多肽低剂量组；(3)免疫原多肽中剂量组；(4)多肽高剂量组。在试验的第0、7、14天，分别进行免疫。方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组多肽设3个剂量：5、10、20mg/Kg，在小鼠背部淋巴结附近多点注射。30天后，眼球取血0.8ml，肝素抗凝，将血离心后取血细胞层，用红细胞裂解液破解红细胞，洗去裂解的红细胞，再用荧光标记的单克隆抗CD8+-FITC(购自北京华泰昕生物医疗技术有限公司)孵育、固定后，进行流式细胞技术测定，评价免疫原多肽对CD8+T细胞的影响。
表2多肽对CD8+T淋巴细胞的作用
*P<0.05，**P<0.01与空白组相比。
实验结果见表2，与空白组比较，多肽能促进小鼠CD8+T淋巴细胞，在剂量为5～20mg/Kg的范围呈现很好的剂量依赖关系。
实施例5
CEA免疫原多肽的T细胞结合试验：采用玫瑰花环试验评价T细胞与人胃癌细胞MKN28的结合能力。无菌取豚鼠胸腺，1640培养基清洗3次，5ml注射器芯研磨，200目筛网过滤，制成单细胞悬液，离心1000转/分，10分钟，弃上清，以Hank’s液调细胞浓度为3×106/ml。于96孔培养板中培养。
实验设空白对照组、多肽各剂量(5、10、20mg/ml)组。各组分别加入胸腺淋巴细胞悬液100μl/孔后，空白对照组加入1640培养液500μl，多肽各剂量组在加入不同浓度的多肽。37℃细胞培养箱，培养48h，培养结束后每孔中加入100μl/孔MKN28细胞(细胞浓度为1×106/ml，含10％胎牛血清)，混匀，500转/分，离心5分钟。弃上清，加少量戊二醛，轻轻晃动，使细胞悬浮，加甲紫染色，400倍显微镜观察。凡结合3个以上肿瘤细胞的T淋巴细胞为花环阳性细胞。记数100个T细胞中形成花环的淋巴细胞百分率，即为T细胞与MKN28细胞的结合率。每孔设5个平行。
实验结果显示，与空白组比较，CEA免疫原多肽可以显著性增加T细胞与MKN28细胞的结合率(P<0.01)，低中高剂量组的结合率分别为37.3、57.30和92.12％。在剂量为5～20mg/ml的范围呈现很好的剂量依赖关系。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州普罗达生物科技有限公司
<120> 一种癌胚抗原免疫原多肽及其用途
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Leu Arg Leu Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Ser Ser Asn Leu Ser Val
1 5 10 15
Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Asp Asp Tyr Pro Asp
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg
35 40