一种Cohn组分四血浆功能蛋白提纯的方法与流程

本发明涉及蛋白制备领域，尤其涉及综合利用Cohn组分四的方法。

背景技术：

Cohn组分四(Cohn Fraction IV)是常规工业化血浆蛋白生产过程中(低温乙醇法)的副产物，现在通常作为废弃物处理，其中含有多种功能血浆蛋白，如白蛋白、载脂蛋白、转铁蛋白等。

载脂蛋白A-I(ApolipoproteinA-I，apoA-I)是人体高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)的重要组成部分，维持HDL的正常结构，在人体内具有活化卵磷脂胆固醇转酰酶的作用，也可以直接作用于动脉壁，促进胆固醇从动脉壁流出，防止动脉硬化的发生。除此之外，apoA-I在人体中还具有抗炎抗内毒素的功能。另外apoA-I在药学领域应用越来越多，可提高药物纳米粒的靶向性，Simon Mathew等人通过应用HDL中apoA-I靶向SR-BI受体这一特点，将钆双(萘)复合物包载于HDL中，实现肿瘤光热疗效的作用(Mathew S，Murakami T，Nakatsuji H，et al.Exclusive photothermal heat generation by a gadolinium bis(naphthalocyanine)complex and inclusion into modified high-density lipoprotein nanocarriers for therapeutic applications.[J].Acs Nano，2013，7(10)：8908-16.)。在靶向药物研究中具有良好的应用前景。载脂蛋白B(Apolipoprotein B，apoB)存在于低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)表面，是结合其受体(LDLr)的决定因子。它通过与LDLr结合介导LDL代谢，对人体内的血脂平衡起到重要作用，临床中，apoB/apoA1比值是检测血脂的“金指标”。除此之外，apoB通过与LDLr受体结合达到药物载体的靶向效果。Jin-Ho Kim等人应用低密度脂蛋白固体脂质纳米粒包载紫杉醇靶向肿瘤组织。(Kim J H，KimY，Bae K H，et al.Tumor-targeted Delivery of Paclitaxel using Low Density Lipoprotein-mimetic Solid Lipid Nanoparticles.[J].Molecular Pharmaceutics，2015，12(4)：1230-41.)载脂蛋白E(Apolipoprotein E，apoE)主要存在于血浆的乳糜微粒(chylomicron，CM)和极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)中，能与LDLr结合，在血浆胆固醇和甘油三酯的代谢中发挥作用。大部分药物很难透过的血脑屏障(Blood-brain barrier，BBB)由于apoE能够与LDL受体结合，因此，以连接了apoE的脂质体作为载体，可以帮助药物透过BBB。Qingxiang Song等人通过载脂蛋白E3-重组高密度脂蛋白来靶向大脑，并透过BBB，来达到治疗阿尔茨海默病(Song Q，Huang M，Yao L，et al.Lipoprotein-based nanoparticles rescue the memory loss of mice with Alzheimer′s disease by acceleratingthe clearance of amyloid-beta.[J].AcsNano，2014，8(3)：2345-59.)。

白蛋白是血浆中含量最为丰富的蛋白，占血浆总蛋白量的60％。蛋白制剂给药的主要目的是保持循环血量，改善组织和器官的微循环，从而解除休克，也可用于因白蛋白浓度暂时低下而出现的病态。在手术后对患者进行白蛋白注射，可以减少水肿的出现，促进伤口的愈合。同时白蛋白降解为氨基酸，可以补充体内的营养需求。白蛋白能与血液中的金属离子如二价三价铁离子结合，阻止他们作为自由基对于组织的破坏，在脑中输入中等或大剂量的人血白蛋白可以有效保护脑皮层神经细胞，减少梗死面积。

转铁蛋白(Transferrin，TRF)主要参与铁在体内的运输，而由于自由铁参与催化氧化反应，导致组织损伤，这使得不带有铁的TRF具有治疗效果。已有报道采用TRF治疗先天性无转铁蛋白血症，从而减缓缺铁性贫血症状。Zhi-Lan Chen等人应用转铁蛋白修饰的脂质体中，透过BBB将α-倒捻子素递送到大脑中治疗阿尔茨海默病(Chen ZL，Huang M，Wang XR，等.Transferrin-modified liposome promotesα-Mangostin to penetrate the blood-brain barrier.[J].Nanomedicine Nanotechnology Biology&Medicine，2015，12(2)：421-430)。α1-蛋白酶抑制剂在体内主要由肝脏合成，是体内最重要的蛋白酶抑制物。70％的血浆总蛋白酶抑制活性来源于a1-蛋白酶抑制剂，主要抑制胰蛋白酶和弹性蛋白酶的活性，还可抑制糜蛋白酶、纤维蛋白溶酶、凝血酶和胶原酶等。现在已经有多个通过审批的a1-蛋白酶抑制剂浓缩剂，来补充肺气肿病人缺乏的a1-蛋白酶抑制剂。

综上，血浆功能蛋白具有的重要的临床价值和关键的临床疗效；另外，由于各自都能与特定的受体结合，具有高效的靶向性，对于靶向药物设计具有十分重要的作用；因此这四种蛋白是血浆蛋白中功能性极高的一部分蛋白。

目前利用Cohn组分四提纯蛋白质的报道主要为针对其中单一蛋白进行分离，中国专利CN 102731642A中公开了一种利用DEAE sepharose FF层析和Butyl疏水层析提取apoA-I的方法。该方法过程中大量使用尿素，吐温80及磷酸三丁酯等试剂，引入其他化学杂质。

此外还有报道是针对Cohn组分四中含量较高的几种蛋白质进行分离，中国专利CN 102977180A利用离子交换层析、疏水层析和亲和层析等方法分步骤提取白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白、结合珠蛋白、α2-巨球蛋白、α1-抗胰蛋白酶、铜蓝蛋白、抗凝血酶III、载脂蛋白A1、C1酯酶抑制剂等蛋白的方法。其一个完整的生产周期中，多次使用层析方法，步骤繁多，生产周期长，不适合工业放大。除此之外，层析使用较多，不仅降低了分离柱使用效率，对于样品的浓集效果较差，加大了生产成本同时延长了生产周期。并且并未对Cohn组分四中的药用价值血浆蛋白进行选择性的分离，并不适合工业生产中“绿色生产”概念。

因此，本领域非常需要一种能够充分利用Cohn组分四中功能蛋白的方法，该方法工艺步骤简单，能实现“流水线”式生产，自动化程度高，生产成本较低，消耗工时少，提高企业利益。适合机械化大生产。工艺过程中采用的试剂为生理环境缓冲液，一方面对蛋白的结构影响小，活性不变，增加了临床应用以及科学研究的真实价值度，另一方面，产品中引入杂质少，样品纯度高。

技术实现要素：

本发明旨在以血浆蛋白生产过程中的副产物Cohn组分四为原料，提供一种操作简单，成本低廉，得率高，适合工业化大规模生产的高纯度蛋白的方法。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

本发明所述Cohn组分四是本领域公知的有关生物制品企业制备血浆制品所废弃的血浆副产物。作为优选，Cohn组分四固体与缓冲溶液质量比为1∶2～1∶10。作为优选，所述缓冲溶液可为马来酸缓冲液、丙二酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、乳酸缓冲液、甲酸缓冲液、丁二酸缓冲液、乙酸缓冲液、丙二酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、哌嗪缓冲液、L-组氨酸缓冲液、Tris缓冲液、三乙醇胺缓冲液、二乙醇胺缓冲液、乙醇胺缓冲液以及双胺丙烷缓冲液。

该方法包括下列步骤：

(1)Cohn组分四预处理：将Cohn组分四固体溶解于缓冲液中，充分溶解后低温高速离心得到上清液I。调节上清液I的pH值，低温高速离心除去杂蛋白，收集得到上清液II。

(2)分离：上清液II过层析柱，梯度洗脱分离，依次收集白蛋白、抗凝血酶III、铜蓝蛋白、α1-抗胰蛋白酶、载脂蛋白B、转铁蛋白、载脂蛋白E、载脂蛋白A-I。

(3)灭菌，冻干，得各蛋白干粉。

作为优选，所述步骤(1)中低温高速离心条件为：转速4000～10000rpm，温度-10～15℃，离心时间10～120min；所述步骤(2)上清液I的pH值范围为1.0～11.0；pH调节剂可为：氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、盐酸水溶液、醋酸水溶液等；所述步骤(2)中层析柱的填料包括下列一种：Sephadex系列凝胶过滤填料、Superdex系列凝胶过滤填料、Sephacryl系列凝胶过滤填料、Sepharose系列凝胶过滤填料、Superose系列凝胶过滤填料、Sepharose基架离子交换填料、Source基架离子交换填料、Capto基架离子交换填料、Sephadex基架离子交换填料、Source 15系列疏水层析填料、Sepharose系列疏水层析填料，层析柱体积优选20～50mL；洗脱流速小于10mL/min；洗脱方式为pH梯度洗脱以及离子强度梯度洗脱；所述步骤(3)中灭菌方法为下列一种或者多种：巴斯德消毒法、干热法、膜过滤法以及低pH孵放法；所述步骤(3)中冷冻干燥步骤中加入冻干保护剂，所述冻干保护剂为：甘露醇、乳糖、葡萄糖、海藻糖、山梨醇以及蔗糖，其含量为0％～25％。

本发明的特点在于：

本发明利用了层析技术，对Cohn组分四中的多种功能性血浆蛋白进行了同一流程梯度分离纯化。分离纯化出的多种蛋白具有较高的纯度和活性，纯度可达98％以上。该工艺制备过程中不涉及有机试剂，操作安全，成本较低。且该过程工艺过程操作方便，提纯周期短，便于工业化自动生产。

附图说明

图1：本发明的工艺生产流程图；

图2：实施例3层析谱图，其中横坐标为时间，纵坐标为280nm处的吸光度。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进一步详细的说明。应当理解，此处所述的具体实施例用以说明本发明，并不用于限定本发明的范围。

实施例1

将Cohn组分四固体50g溶解于100mL Tris缓冲液(pH 7.5～8.0)中，充分溶解。然后10000rpm，0℃条件下离心20min，去除助滤剂，得到上清液I。调节上清液I的pH值至2.0，分离杂蛋白得到上清液II，采用S-SOURCE 30装柱，层析柱体积40mL。先用pH 2.0的马来酸缓冲液平衡柱子，平衡10个柱体积，进样上清液II，以浓度为0至10M的pH 2.0马来酸缓冲液进行梯度洗脱，收集图谱上的各峰。

实施例2

将Cohn组分四固体50g溶解于150mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0～7.5)中，充分溶解。然后8000rpm，4℃条件下离心25min，去除助滤剂，得到上清液I。调节上清液I的pH值至4.0，分离杂蛋白得到上清液II，采用SP-Sepharose HP装柱，层析柱体积40mL。先用pH 4.0的甲酸缓冲液平衡柱子，平衡10个柱体积，进样上清液II，以浓度为0至4M的pH 4.0甲酸缓冲液进行梯度洗脱，收集图谱上的各峰。

实施例3

将Cohn组分四固体50g溶解于120mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，充分溶解。然后8000rpm，4℃条件下离心20min，去除助滤剂，得到上清液I。调节上清液I的pH值至7.8，分离杂蛋白得到上清液II，采用Q琼脂糖装柱，层析柱体积50mL。先用pH 7.8的磷酸缓冲液平衡柱子，平衡10个柱体积，进样上清液II，以浓度为0至2M的pH 7.8磷酸缓冲液进行梯度洗脱，收集图谱上的各峰。层析图谱见图2。

实施例4

将Cohn组分四固体50g溶解于120mLpH 7.4的磷酸盐缓冲液中，充分溶解。然后8000rpm，4℃条件下离心20min，去除助滤剂，得到上清液I。调节上清液I的pH值至8.0，分离杂蛋白得到上清液II，采用DEAE-Sepharose FF装柱，层析柱体积40mL。先用pH 8.0的磷酸缓冲液平衡柱子，平衡10个柱体积，进样上清液II，以浓度为0至3M的pH 8.0磷酸缓冲液进行梯度洗脱，收集图谱上的各峰。

实施例5

将Cohn组分四固体500g溶解于1.5LpH 7.4的磷酸盐缓冲液中，充分溶解。然后8000rpm，0℃条件下离心30min，去除助滤剂，得到上清液I。调节上清液I的pH值至10.0，分离杂蛋白得到上清液II，采用Q-Sepharose FF装柱。先用pH 10.0的磷酸缓冲液平衡柱子，平衡10个柱体积，进样上清液II，以浓度为0至2M的pH 10.0磷酸缓冲液进行线性梯度洗脱，根据图谱收集各峰。