本发明属于免疫学技术领域，涉及6种肽类抗原，可应用于制备酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)抗体检测试剂盒，用于检测血浆中天然肺癌相关抗体(lung cancer-associated antibody,LCAA)浓度。
背景技术：
恶性肿瘤是威胁整个人类健康的最主要杀手之一。基于灰霾雾霾等环境污染状况的持续存在，中国人群主要癌症的发病率呈逐年上升趋势。据统计，目前我国癌症平均每年发病率高达3/1000以上。肿瘤早期治疗手段，如手术切除或放射线治疗已发展的比较成熟，能够明显延长病人的存活时间。但是，如何预测肿瘤发病风险和早期诊断肿瘤是有效防治肿瘤的重要途径。
先前的研究表明，在恶性肿瘤体积发展到可用现代影像学技术检出之前3-5年，患者血中可出现高浓度的肿瘤相关抗原自身抗体。因此，检测血中肿瘤相关抗原自身抗体具有预测肿瘤发病风险和早期诊断肿瘤的重要价值。在国外,已有早期诊断肺癌和乳腺癌的诊断试剂盒市售。例如，由英国诺丁汉Oncimmune有限公司推出的Early CDTTM-Lung诊断试剂盒已在北美和欧洲用于临床早期诊断肺癌近6年。然而，目前所报道的抗体检测方法敏感度相对低，特异性差，假阴性比率可高达60％以上。其中主要原因，是由于每一种肿瘤相关抗原自身抗体在患者血中的阳性检测率平均在10％左右，即便是多种抗原混合，阳性检测率也难以突破50％。
近年来有关天然抗体研究报道显示，人血中50％以上的抗体属于天然抗体，主要由B1淋巴细胞产生,不需要特异性抗原刺激。天然抗体参与机体的各种生理调节和免疫功能稳定,并且充当固有免疫和特异免疫系统之间的桥梁。特别值得注意的是，某些天然抗体具有免疫监视功能，随时清除体内形成的恶性变细胞,以维持内环境稳定。因此，保持一定水平的天然抗体可以起到防癌作用。据此推测，天然抗体缺乏或阴性者发生肿瘤的风险可能明显高于正常人群。
技术实现要素：
本发明人研究发现，健康人体内会自然形成多种肿瘤相关抗体，例如与肺癌关相的抗白介素2受体A(Interleukin-2receptor subunit alpha，IL-2Rα或CD25)抗体，抗叉头蛋白3(Forkhead/winged helix，FOXP3)抗体，抗肿瘤坏死因子A(Tumor necrosis facto alpha,TNFα)抗体，抗转录因子c-MYC蛋白(transcription factor c-MYC,MYC)抗体，抗膜粘连蛋白I(Annexin A1，ANXA1)抗体和抗细胞凋亡抑制基因5(Baculoviral IAP repeat-containing 5,BIRC5)抗体等。因此，本发明的主要目的是提供一组用于检测人血浆中天然LCAA浓度的线性抗原多肽和由此制备的试剂盒，以及使用该组抗原多肽或该试剂盒检测人血浆中天然LCAA的方法。所述抗原多肽为衍生于CD25、FOXP3、TNFα、MYC、ANXA1和BIRC5六种蛋白的抗原表位。这些抗原表位能够与针对人血浆中抗CD25、抗FOXP3、抗TNFα、抗MYC、抗ANXA1和抗BIRC5的天然LCAA发生特异性结合。
本发明所定义的“肺癌相关抗体(LCAA)”是自然存在于健康人体内的抗体或抗体混合物，可能参与包括肺癌在内的多种恶性肿瘤的发生。检测天然LCAA具有预测肿瘤发病风险和早期诊断肿瘤的重要价值。在本发明的特定实施方案中，所述天然LCAA是指能识别SEQ ID NO:1-6中的一个或多个表位序列的天然抗体或天然抗体混合物。
本发明人利用免疫信息学方法和表位制图技术，分析CD25、FOXP3、TNFα、MYC、ANXA1和BIRC5六种蛋白序列上的人类白细胞二类抗原(Human leukocyte antigen II,HLA-II)表位，甄别具有高度亲和力的氨基酸序列，进而设计能被绝大多数人类抗原提呈细胞识别的HLA-II限制性表位及线性抗原多肽。
已经公认，抗原抗体的结合主要发生在抗原决定簇与抗体结合位点之间。因此，两者在空间结构和构型上越接近完全互补，抗原抗体的结合就越稳定，特异性就越强，结合效率就越高，因此，目标抗体(待检测样品中的抗体)及其结合位点结构是先决因素，抗原决定簇可代表整个蛋白抗原与抗体结合状态和亲和特性。
本发明根据CD25、FOXP3、TNFα、MYC、ANXA1和BIRC5六种蛋白的生物学特性，针对这六种蛋白的多个表位进行免疫信息学预测和模拟，经分析与抗原性相关的各种参数，分别设计了六种在空间结构和构型上与目标抗体完全互补的线性抗原多肽，其氨基酸序列见表1。
表1.检测人血浆中天然LCAA的线性抗原多肽序列
经固相化学法合成上述6种抗原多肽，并按比例混合后制备ELISA抗体检测试剂盒，按设定的流程规范检测健康个体血浆中天然LCAA浓度。上述6种抗原多肽在实际应用中可制备成简单易用的便捷试剂盒，以玻璃、医用塑料等非金属材料真空密封包装，4℃环境下可保存6个月以上。简言之，可将6种多肽抗原混合液包被的马来酰亚胺(Maleimide)活化96孔微量检测板在45度(45℃)烤箱中干燥后，用非金属包装材料真空密封包装，制成试剂盒。优选6种多肽抗原均为纯度>90％的制品。
因此，根据本发明之一，提供了一种用于检测天然LCAA的组合物，其包括如下6种抗原多肽：
H-DCKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKL-OH；
H-EPDDDPMQRKPTIRRKNLRKLRRKCAVPSSSWL-OH；
H-CQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLV-OH；
H-RIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESV-OH；
H-DWFTRMFAFFRNHPATWKNAIRHNLSLHKCD-OH；
H-DVFNTILTTRSYPQLRRVFQKYTKYSKCD-OH。
在一些实施方案中，所述6种抗原多肽为高纯度制品，优选为纯度>90％的化学合成制品。
在一些实施方案中，所述组合物中6种抗原多肽的比例为1:1:1:1:1:1(浓度比)。
根据本发明的另一个方面，提供一种用上述组合物制成的试剂盒。
在一些实施方案中，在所述试剂盒中，将6种抗原多肽混合液包被的马来酰亚胺(Maleimide)活化96孔微量检测板干燥后，用非金属医用包装材料真空密封包装。
在另一些优选的实施方案中，所述非金属医用包装材料为玻璃或医用塑料。
在另一些实施方案中，所述试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照。
根据本发明的另一个方面，提供一种使用上述组合物或上述试剂盒检测样品中天然LCAA的方法，优选该方法为体外的、非诊断目的的检测技术。
在一些实施方案中，所述方法包括将上述组合物中的6种抗原多肽等比混合，然后通过抗原抗体结合反应检测待测样品中天然LCAA浓度。
在优选的实施方案中，所述“通过抗原抗体结合反应检测个体血浆中天然LCAA浓度”是通过酶联免疫吸附测定(ELISA)方法实现的。
在更优选的实施方案中，所述酶联免疫吸附测定为夹心法ELISA。
在更优选的实施方案中，将上述组合物中的4种抗原多肽等比混合后，包被马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔微量检测板，放置4度过夜孵育，洗板，再对待测样品进行检测分析。
在更优选的实施方案中，所述对待测样品进行检测包括分步加样分析，所述分步加样分析包括将待测样品设双复孔，同时设2个阴性对照孔和2个阳性对照孔，用分析液将血浆稀释，并稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体，洗板，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)及过氧化物酶混合液，室温避光20～30分钟，每孔添加50μl终止液10％硫酸溶液(12％H2SO4)，然后用酶标仪检测光密度(OD)值，检测波长为450nm，参考波长为630nm。
在更优选的实施方案中，所述样品为人血浆，更优选为个体血浆。
在更优选的实施方案中，个体血浆为来自健康个体的血浆。
在更优选的实施方案中，所述方法的具体操作步骤为：
1.操作前，每种抗原用67％乙酸溶解为5毫克/毫升(mg/ml)储存液,然后等体积混合并放置-20℃(误差在±2℃范围内)冰箱中保存。
2.操作开始时，首先将表1中所列6种抗原多肽的混合液用包被液稀释为10～50微克/毫升(μg/ml)的工作液，该包被液为含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，pH为7.0～7.4之间。
3.用工作液包被马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔微量检测板(Thermo Scientific,美国)，4℃过夜孵育后，用洗液洗板3遍,所述洗液为含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，pH为7.0～7.4之间。
4.然后按一下步骤分步加样和分析：
a)待测血浆样品设双复孔，另设2个阴性对照孔(NC，参照物为不含抗CD25抗体、抗FOXP3抗体、抗TNFα抗体、抗MYC抗体、抗ANXA1抗体和抗BIRC5抗体的阴性对照液，如牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司提供)，藉此可反映表1所述的6种多肽抗原在天然LCAA阴性反应体系中的实验指标值)和2个阳性对照孔(PC，参照物为抗人CD25抗体、抗人FOXP3抗体、抗人TNFα抗体、抗人MYC抗体、抗人ANXA1抗体和抗人BIRC5抗体的等比混合物，藉此可反映表1所述的6种多肽抗原在天然LCAA阳性反应体系中的实验指标值。
b)用分析液将待测血浆样品1:200稀释，所述分析液与抗原包被液相同，即含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，pH为7.0～7.4之间，每孔加100μl,25℃孵育1-2小时，然后洗板3遍。
c)用分析液(即含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，酸碱度为7.0～7.4之间)稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体(用以验证血浆中被检测的物质是否是特异性抗体)，抗体稀释比例为1:10000～1:50000，每孔加100μl，25℃孵育1-2小时。
d)用洗液(即含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，pH值为7.0～7.4之间)洗板3遍后，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)及过氧化物酶混合液，室温避光20～30分钟。
e)每孔加50μl终止液10％硫酸溶液(10％H2SO4)，然后用酶标仪检测光密度(OD)值，检测波长为450nm，参考波长为630nm。检测过程在加入终止液后10分钟内完成，由此定量分析个体血浆中天然LCAA水平。
在一些实施方案中，在进行群体随机抽样分析时，可针对每一个体检测所得数据进行分析，采用阳性样品比值(Positive sample ratio，PSR)判定血浆中天然LCAA的相对水平。PSR计算方法如下：
PSR＝[待测样品OD值–ODNC值]/[阳性标准品OD值–ODNC值]，NC为各样本的阴性对照。
在本发明的另一个方面，提供上述组合物或试剂盒在体外的、非诊断目的检测样品中天然LCAA中的应用。
在本发明的另一个方面，还提供上述组合物在制备用于检测样品中天然LCAA的试剂中的应用。
在优选的实施方案中，所述样品为人血浆，更优选为个体血浆。
在更优选的实施方案中，个体血浆为来自健康个体的血浆。
基于以上方案，本发明提供了精度高、操作简易、成本适中的天然LCAA检测技术，并在此基础上，进一步提供了对天然LCAA的半定量(或相对定量)的分析和应用方案，进而为发展基于健康人血浆天然LCAA的全新早期诊断肿瘤和早期实施治疗策略奠定重要基础。
本发明提供了一种简便的人血浆天然LCAA检测手段，可用于辅助定性、定量检测天然LCAA水平，辅助量化测定不同群体(例如健康人群)和不同个体的血浆天然LCAA水平。天然LCAA水平较低或者阴性个体可能具有较高的肿瘤发病风险，具有预测肿瘤发病风险和早期诊断肿瘤的重要价值。用本发明产品检测出的血浆天然LCAA阴性个体，可能具有较高的肿瘤发病风险，可以对其进行临床随访和追踪，达到早期发现肿瘤和早期实施治疗的目的。本发明的天然LCAA检测方法可用于群体普查，检测获得该项指标的分布状态及平均值，由此可为探究肿瘤发生过程中的呈现机制((如肿瘤免疫“逃逸”机制及免疫监视机制等)提供关联指标。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的主要目的和其它优点可通过在说明书、权利要求书中所特别指出的方案来实现和获得。
附图说明
图1是肺癌患者血浆中天然LCAA IgG水平的ROC曲线图。
实施例
1、样本收集
收集61份早期非小细胞肺癌细胞癌(I期和II期鳞状上皮肺癌和腺上皮肺癌)患者手术治疗前的血浆样品及108例健康人血浆样品用于检测血浆天然LCAA。操作前所有血浆样品均在负80度(-80℃)条件下保存，经核实保存时间未超过两年，没有反复冻融(次数不超过3次)。
2、样本检测
在4℃环境下解冻血浆样品，本实验所采用的6条肽抗原(见表1)系由英国SEVERN BIOTECH有限公司合成，纯度为95％，具体进行如下操作步骤：
(1)操作前，每种抗原用67％乙酸溶解为5.7mg/ml储存液,然后等体积混合并放置-20℃冰箱中保存。
(2)操作开始时，首先将6种抗原混合液用包被液稀释为30微克/ml，该包被液为含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，测得酸碱度(pH值)为7.2。
(3)然后包被马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔检测板(Thermo Scientific,美国)，4℃过夜16.5小时孵育后，用洗液洗板3遍,所述洗液为含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，测得酸碱度pH值为7.2。
(4)然后分步加样分析如下：
a)待测血浆样本设双复孔，另设2个阴性对照孔(NC，参照物为牛血清白蛋白，由Sigma-Aldrich公司提供)和2个阳性对照孔(PC，参照物为抗人CD25抗体、抗人FOXP3抗体、抗人TNFα抗体、抗人MYC抗体、抗人ANXA1抗体和抗人BIRC5抗体的等比混合物，由Sigma-Aldrich公司提供)。
b)用分析液将血浆1:200稀释，所述分析液与抗原包被液相同，为含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，测得酸碱度(pH)为7.2，每孔加100μl，25℃孵育1.5小时。
c)以前述洗液(即含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，测得酸碱度为7.2)洗板3遍后，用分析液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG(由Sigma-Aldrich公司提供)，抗体工作浓度为1:30000，每孔加100μl，25℃孵育1.5小时。
d)以前述洗液(即含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，测酸碱度PH值为7.2)洗板3遍后，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)及过氧化物酶混合液(由Life Technologies公司提供)，室温避光25分钟。
e)每孔加50μl终止液12％硫酸溶液(12％H2SO4)，然后用酶标仪检测光密度(OD)值，检测波长为450nm，参考波长为630nm，加入终止液后10分钟内检测完毕，后续步骤将依据此结果针对每一个体进行天然LCAA IgG的定量对比分析。
3.数据分析
针对前述检测所得数据进行分析时，采用阳性样品比值(Positive sample ratio，PSR)判定血浆中天然LCAA IgG水平，PSR计算公式为：PSR＝[待测样品OD值–ODNC值]/[阳性标准品OD值–ODNC值]，NC为各样本的阴性对照。本方法的阈值是以健康对照组第5个百分位数的PSR值确定，低于该阈值的抗体水平被认为是天然LCAA IgG水平呈阴性。本实施例随机抽取的108份健康人血浆样品中，其LCAA IgG浓度平均值为PSR＝0.67，变异系数为49％，用第5个百分位数确定的LCAA IgG血浆水平阴性阈值为0.12。
应用接收者操作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线图分析数据。在该曲线图中，天然LCAA IgG水平呈阴性的血浆被定义为阳性样品。ROC曲线是根据一系列不同的二分类方式确定分界值或决定阈，即以病人血浆样品中真阳性率(灵敏度)为纵坐标，以健康人血浆样品中假阳性率(1-特异性)为横坐标绘制曲线。ROC曲线下的面积(AUC)值在1.0和0.5之间。在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断准确度越好。ROC曲线将灵敏度与特异性以图示方法结合在一起，可准确反映某分析方法特异性和敏感性的关系，是试验准确性的综合代表。采用Analyse-it for Microsoft Excel软件对前述检测实验数据拟制ROC曲线，计算AUC值，判定灵敏度和特异性。
如图1所示，肺癌患者血浆中天然LCAA IgG水平的ROC曲线下面积(AUC)为0.79(95％可信区间为0.67-0.90)，灵敏度为34.6％，特异性为97.1％。
以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内所想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。