新城疫病毒全长cDNA克隆的构建与鉴定的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新城疫病毒全长cDNA克隆的构建与鉴定。

背景技术：

反向遗传操作技术是指将RNA病毒基因组RNA 逆转录成cDNA，在体外通过基因突变、基因插入、基因敲除、基因置换等方法人为构建新的具有感染性的病毒，来研究病毒的基因组结构及功能和病毒宿主之间的相互作用等，也叫全长感染性cDNA克隆技术，又被称为“病毒拯救”。这一技术解决了RNA病毒基因组难以操作的难题，同时为新型疫苗的研发提供了新的思路。构建全长基因组克隆是进行反向遗传操作的关键技术步骤和核心的决定因素。

利用反向遗传方法开展病毒的功能基因组学和新型疫苗的研究，对有效防治病毒病意义重大。但是体外拯救系统还有许多问题需要进一步完善和改进，需要克服现有方法的一些缺点，如：体外RNA转录本的感染性常常比病毒RNA的要弱；全长克隆的构建费时费力；且制备的RNA容易降解，致使转染的RNA具有多态性和异质性，在细胞内难以恢复完整RNA的感染性；突变和嵌合体RNA病毒活性可能会很弱。

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是单股、不分节段的负链RNA病毒，属于副粘病毒科成员。按照标准的致病性指标可以将病毒分为速发型(强毒)、中发型(中等毒力)和缓发型(弱毒)。基因组长度大约15kb，其结构为3’-leader-NP-P-M-F-HN-L-trailer-5’，依次编码6 种结构蛋白：核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN）和大分子蛋白（L）。由于单独的NDV RNA在细胞内不能够进行转录和翻译蛋白，其需要核衣壳蛋白、磷蛋白和大分子蛋白组成RNP（核糖核蛋白复合物）才能行使转录和翻译的功能。

技术实现要素：

为进一步开展新城疫病毒GM0811功能基因组学的研究， 本发明的第一发明目的是提供了一种新城疫病毒全长cDNA序列。

本发明的另一发明目的是提供了一种上述新城疫病毒全长cDNA序列的构建方法。

一种新城疫病毒全长cDNA，所述的全长cDNA的核苷酸为SEQ ID NO.1 所示。

一种上述新城疫病毒全长cDNA的构建方法，具体操作方法采用以下步骤：

（1）提取分离新城疫病毒的总RNA，以所述总RNA为模板，反转录合成cDNA；

（2）以步骤（1）所述的cDNA为模板，用一对特异性引物进行PCR扩增，得扩增产物NDV-1PCR，对扩增产物进行电泳切胶回收目的基因片段NDV-In-PCR1，将目的基因片段构建入酶切后质粒pVAX中，并在大肠杆菌感受态细胞HST08中扩增，得到阳性质粒NDV-IN1-5；

（3）以步骤（1）所述的总cDNA为模板，用一对特异性引物进行PCR扩增，得扩增产物NDV-2PCR，对扩增产物进行电泳切胶回收目的基因片段NDV-In-PCR2，将目的基因片段构建入酶切后的阳性质粒NDV-IN1-5中，并在大肠杆菌dam-/dcm感受态细胞HST04中扩增，得到质粒NDV-IN2-2；

（4）以步骤（2）所述的扩增产物NDV-1PCR和步骤（3）所述的扩增产物NDV-2PCR为模板，用一对特异性引物进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳切胶回收目的基因片段，将已纯化的基因片段构建入酶切后的质粒NDV-IN2-2中，并在大肠杆菌感受态细胞HST08中扩增，得到新城疫病毒全长基因片段NDV-IN3-8。

以步骤（4）得到的新城疫病毒全长基因片段NDV-IN3-8为模板，用两对特异性引物分别对新城疫病毒全长基因片段NDV-IN3-8进行分段扩增，对扩增产物进行电泳切胶回收目的基因片段得NDV-IN3-8-PCR2和NDV-IN3-8-PCR3，对NDV-IN3-8-PCR2和NDV-IN3-8-PCR3分别进行测序，NDV-IN3-8-PCR2和NDV-IN3-8-PCR3全长拼接即可构成新城疫病毒的全长cDNA。

进一步的，步骤（2）所述的特异性引物的核苷酸为：SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；步骤（3）所述的特异性引物的核苷酸为：SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；步骤（4）所述的特异性引物的核苷酸为：SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7。

进一步的，所述的NDV-IN3-8-PCR2所用的特异性引物的核苷酸为: SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9；所述的NDV-IN3-8-PCR3所用的特异性引物的核苷酸为: SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11；分段扩增的反应条件为94℃ 1min，然后98℃ 10sec、55℃ 15sec、68℃ 3min共30个循环。

进一步的，步骤（2）、步骤（3）和步骤（4）所述的PCR扩增的反应条件均为：94℃ 1min，然后98℃ 10sec、55℃ 15sec、68℃ 3min共30个循环。

进一步的，步骤（2）所述的酶切后的质粒pVAX所用的内切酶为ClaI；步骤（2）所述的酶切反应体系的条件为30℃反应16h；步骤（2）所述的目的基因片段构建入酶切后质粒pVAX中的反应条件为50℃反应15min。

进一步的，步骤（3）所述的酶切后的阳性质粒NDV-IN1-5所用的内切酶为ClaI；步骤（3）所述的酶切反应体系的条件为30℃反应16h；步骤（3）所述的目的基因片段构建入酶切后阳性质粒NDV-IN1-5中的反应条件为50℃反应15min。

进一步的，步骤（4）所述的酶切后的质粒NDV-IN2-2所用的内切酶为ClaI；步骤（4）所述的酶切反应体系的条件为30℃反应16h；步骤（4）所述的目的基因片段构建入酶切后阳性质粒NDV-IN1-5中的反应条件为50℃反应15min。

有益效果

本发明在全基因组序列测定的基础上，根据相应酶切位点设计11条引物，利用RT-PCR方法扩增出覆盖基因组全长cDNA片段，以分段方法将全长cDNA克隆入PAVX载体，最终完成NDV 全长cDNA克隆NDV-IN3-8的构建，可实现体外获得感染性的克隆病毒。与现有技术相比，拯救出的重建病毒携带有设计的分子标记。构建的cDNA克隆转染可以引发完整的病毒感染，并产生成熟子代病毒粒子。由于引入真核启动子系统，从而省去了体外转录的步骤，使感染性克隆的操作显得十分方便。所构建的新城疫病毒全长cDNA克隆，经拯救后可通过对基因进行必要的修饰，进而研究基因结构与功能应用于新城疫病毒基因结构与功能的研究，亦可作为新城疫病毒疫苗或制备成预防或治疗新城疫病毒的疫苗或制剂。

附图说明

图1 扩增产物NDV-In-PCR1电泳图；

图2酶切质粒pVAX-ClaI电泳图；

图3扩增产物NDV-In-PCR电泳图；

图4 酶切质粒NDV-IN1-5-Cla I电泳图；

图5 扩增产物NDV-In3-PCR2电泳图；

图6酶切质粒 NDV-In2-PCR2电泳图；

图7扩增产物NDV-IN3-8-PCR2和NDV-IN3-8-PCR3电泳图。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

材料和仪器

1.实验材料 RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试剂盒、DNA Marker DL2000等均购于大连TaKaRa公司。

2.主要仪器设备 DYY-2型琼脂糖凝胶电泳槽（北京六一仪器厂）、PCR扩增仪（TaKaRa INC，Dice TP600）、凝胶成像系统（Alpha Innotech公司）、高速冷冻离心机（Beckman，AvantiTMJ-30I）、DNA测序仪（ABI，PRISMTM 3730XL DNA Sequencer）

实施例1

1．病毒RNA的提取

RNA提取：在1.5ml的无RNA酶的EP管中加入200ul新城疫病毒液和1ml的Trizol，充分混匀后在室温放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体。加入0.2 ml的氯仿，加盖好后剧烈震荡15秒，在室温放置2-3min，然后离心 ，离心的条件为4℃，12,000rpm离心15 min，离心后管内分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，上面是无色的水相。

RNA沉淀：小心将上层水相转移到另一无RNA酶的EP管中， 加入等量体积的预冷异丙醇，室温静置10 min，离心，离心的条件为4℃，12,000rpm离心15 min。离心后可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀。

RNA洗涤：去上清，向沉淀中加入1ml 75%预冷的乙醇洗涤RNA沉淀，轻轻混匀，离心，离心的条件为4℃，12,000rpm离心15 min。 RNA溶解：去上清，超净台内风干RNA沉淀，加入10ul DEPC水充分溶解RNA。

2.目的基因片段1的获取

（1）对步骤1提取的总RNA进行反转录，其基本要点是：反应液中加入模板、反应液、引物和酶反应后进行RT反应。反应物中含有缓冲液、酶和引物，反应总体积为20 ul。

反应体系为：

Total RNA 1ul

d NTP Mixture (10 mM each) 1ul

Ran dom 6 mers (20 uM) 1ul

Oligo dT Primer (2.5 uM ) 1ul

RNase Free dH₂O 1ul

上述反应体系的反应条件为65℃反应5min后，立即放置于冰上2min。

然后在上述反应体系中加入下列组分：

5× PrimeScript RT Buffe 4 ul

RNase Inhibitor (40 U/ul) 0.5 ul

PrimeScript RTase 0.5 ul

RNase Free dH₂O 10 ul

Total 20 ul

加入上述组分后的反应条件为：30℃反应10min,45℃反应30min,95℃反应5min，得到cDNA。

（2）对上述得到的产物cDNA进行PCR，反应总体积为50 ul，反应体系为：

cDNA 1ul

2×Gflex PCR Buffer（Mg²⁺, dNTP plus） 25ul

Tks Gflex DNA Polymerase (1.25 units/μl) 1ul

NDV INF1 (20 pmol/ul) 1ul

NDV INR1 (20 pmol/ul) 1ul

dH₂O 21ul

Total 50ul

反应条件为：94℃ 1min，然后98℃ 10sec、55℃ 15sec、68℃ 3min共30个循环。

反应引物的氨基酸为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，其序列见表1。

取上述反应得到的PCR反应产物NDV-1PCR 5ul进行1%琼脂糖电泳鉴定，在5.5kb附近有一条带为目的基因片段带，见附图1。

使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0切胶回收上述PCR产物目的片段，命名为NDV-In-PCR1。

（3）载体DNA的制备

酶切反应体系如下：

pVAX质粒 2.5 ul

10×M Buffer 5 ul

Cla I（10 U/ul） 1.5 ul

dH₂O Up to50 ul

酶切反应条件是30℃反应16小时。

取上述酶切反应产物5 ul进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，在2900bp附近有一条带为目的的基因片段带，见附图2。

使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0切胶回收DNA片段命名为pvax-Cla I载体DNA。

（4）构建入质粒pvax：将已鉴定的基因片段NDV-In-PCR1构建入pvax-Cla I载体DNA的多克隆位点中，该连接体系和连接条件为：

连接体系：

pBR322-Cla I Vector DNA (50 ng/ul ) 1.5 ul

NDV-In-PCR1 (50 ng/ul ) 2 ul

5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2 ul

dH₂O Up to10 ul

连接条件为50℃反应15min。

将连接产物取2ul热转化至大肠杆菌感受态细胞HST08中，涂布平板，37℃过夜培养，挑取阳性克隆植菌，提取质粒命名为NDV-IN1-5、NDV-IN1-6，使用引物NDV-VP1、NDV P7、NDV P8、NDV P9、NDV R6、NDV L-YF、NDV L-YR、NDV F7、NDV P16、NDV P19、NDV-VP2对上述质粒测序，确认使用NDV-IN1-5质粒继续进行后续实验。

3.目的基因片段2的获取

（1）对步骤2第（1）步得到的cDNA进行PCR扩增，扩增体系如下所示：

cDNA 1ul

2×Gflex PCR Buffer（Mg²⁺, dNTP plus） 25ul

Tks Gflex DNA Polymerase (1.25 units/μl) 1ul

NDV INF2 (20 pmol/ul) 1ul

NDV INR2 (20 pmol/ul) 1ul

dH₂O 21ul

Total 50ul

反应条件为：94℃ 1min，然后98℃ 10sec、55℃ 15sec、68℃ 3min共30个循环。

反应引物的氨基酸为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，其氨基酸序列见表1。

取上述反应得到的PCR反应产物NDV-2PCR 5ul进行1%琼脂糖电泳鉴定，在5.5kb附近有一条带为目的的基因片段带，见附图3。

使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0切胶回收上述PCR产物目的片段，命名为NDV-In-PCR2。

（2）载体DNA的制备

酶切反应体系如下：

NDV-IN1-5质粒 2.5ul

10×M Buffer 5ul

Cla I（10 U/ul） 1.5ul

dH₂O Up to50ul

上述酶切反应的反应条件是30℃反应16小时。 取上述酶切反应产物5ul进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，在5.7kb附近有一条带为目的的基因片段带，见附图4。

使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0切胶回收DNA片段命名为NDV-IN1-5-Cla I载体DNA。

（3）构建入阳性质粒NDV-IN1-5：将已鉴定的基因片段NDV-In-PCR2构建入NDV-IN1-5-Cla I载体DNA中，该连接体系和连接条件为:

连接体系为：

NDV-IN1-5-Cla I Vector DNA (50 ng/ul ) 1.5 ul

NDV-In-PCR2 (50ng/ul) 2 ul

5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2 ul

dH₂O Up to10 ul

连接条件为50℃反应15min。

将连接产物取2 ul热转化至E.coli HST04 dam-/dcm- Competent Cell中，涂布平板，37℃过夜培养，挑取阳性克隆植菌，提取质粒命名为NDV-IN2-2。使用NDV-IN2-2质粒继续进行后续实验。

4.目的基因片段3获取

（1）以步骤2制备的新城疫病毒基因片段NDV-1PCR和步骤3制备的新城疫病毒基因片段NDV-2PCR为模板，对新城疫基因片段进行扩增反应，反应后进行PCR反应，反应体系为：

NDV-1PCR产物 1ul

NDV-2PCR产物 1ul

2×Gflex PCR Buffer（Mg²⁺, dNTP plus） 25ul

Tks Gflex DNA Polymerase (1.25 units/μl) 1ul

NDV INF3 (20 pmol/ul) 1ul

NDV INR3 (20 pmol/ul) 1ul

dH₂O 20ul

Total 50ul

反应条件是94℃ 1min，然后98℃ 10sec、55℃ 15sec、68℃ 3min共30个循环。

反应引物的核苷酸为SEQ ID NO.6和 SEQ ID NO.7。

取上述酶切反应产物5ul进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，在4.0kb附近有一条带为目的的基因片段带，见附图5。

使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0切胶回收上述PCR产物目的片段，命名为NDV-IN3-PCR2。

（2）载体DNA的制备

酶切反应体系如下：

NDV-IN2-2质粒 2.5ul

10×M Buffer 5ul

Cla I（10 U/ul） 1.5ul

dH₂O Up to50ul

反应条件是30℃反应16小时。 取上述酶切反应产物5ul进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，在6.0kb附近有一条带为目的的基因片段带，见图6。

使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0切胶回收上述PCR产物目的片段，命名为NDV-IN2-2-Cla I 载体DNA。

（3）构建入阳性质粒NDV-IN2-2质粒：用已鉴定的基因片段NDV-IN3-PCR2构建入步骤3制备的阳性质粒NDV-IN2-2-Cla I质粒的多克隆位点中，该连接体系和连接条件为：

NDV-IN2-2-Cla I Vector DNA (50ng/ul) 1.5ul

NDV-IN3-PCR2 (50ng/ul) 2.5ul

5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2ul

dH₂O Up to10ul

连接条件为50℃反应15min。

将连接产物取2 ul热转化至E.coli HST08 Premium Competent Cell（Code No.9128）中，涂布平板，37℃过夜培养，挑取阳性克隆植菌，提取质粒命名为NDV-IN3-3、NDV-IN3-8，使用引物NDV-VP1、NDV F1、NDV P1、NDV P2、NDV P20、NDV F2、NDV R1、NDV P3、NDV P4、NDV F3、NDV R2、NDV-VP2对上述质粒测序。序列分析后选择 NDV-IN3-8 质粒进行后续全长基因测序。

5.分段PCR扩增目的基因

（1）以步骤4制备的新城疫病毒全长基因片段NDV-IN3-8为模板，对新城疫基因片段进行分段扩增，反应体系为：

NDV-IN3-8 1ul

2×Gflex PCR Buffer（Mg2+, dNTP plus） 25ul

Tks Gflex DNA Polymerase(1.25 units/μl) 1ul

Primer F (20 pmol/ul)^* 1ul

Primer R (20 pmol/ul)^* 1ul

dH₂O 21ul

Total 50ul

反应条件是94℃ 1min；然后98℃ 10sec、55℃ 15sec、68℃ 3min共30个循环。

上述反应用两对特异性引物，其中一对为SEQ ID NO.8和 SEQ ID NO.9；另一对为SEQ ID NO.10和 SEQ ID NO.11；其氨基酸序列见表1。

取上述两对特异性引物分别扩增得PCR产物各5 ul进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，两PCR产物大约在6Kb附近有一条带为目的的基因片段带。

使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0分别切胶回收上述NDV-IN3-8-PCR2、NDV-IN3-8-PCR3产物目的片段，命名为NDV-IN3-8-PCR2、NDV-IN3-8-PCR3。

分别对NDV-IN3-8-PCR2、NDV-IN3-8-PCR3进行基因测序，

测序结果发现，NDV-IN3-8质粒上NDV全基因组序列只有2处发生突变，表明成功构建全长cDNA克隆，测序所用的测序引物分别见表2。

全长cDNA克隆转染细胞，获得体外拯救病毒：待BNK细胞长至90％时，进行全长cDNA质粒转染。按照转染试剂（Lipoefenatline 2000，Invitrogen)说明书进行转染。质粒转染细胞的上清进行传代，经5次传代后，采用RT-PCR方法检测。同时，设未转染的细胞作为阴性对照。经检测证实成功构建新城疫病毒全长感染性cDNA克隆质粒，并成功转染DHK细胞，体外获得感染性的克隆病毒。

表1构建cDNA克隆所用的引物

表2测序引物

<110> 山东省农科院家禽研究所

<120> 新城疫病毒全长cDNA克隆的构建与鉴定

<160> 37

<210> 1

<211> 15192

<212> DNA

<213> 人工序列

accaaacaga gattctgtga gttacgataa aaagcgaagg agcaatcgaa gtcgcacggg 60

tagaaggtgt gaatctcgag tgcgagatcg aagctcaaac tcgagagagc cttctgccga 120

aatgtcttcc gtatttgatg agtacgagca gctccttgcg gcacagactc gccctaatgg 180

agctcatgga gggggagaga acgggagcac cttaaaagtt gaagtcccag tattcactct 240

caacagtgac gacccagaag atagatggaa ctttgcggta ttctgccttc ggattgctgt 300

tagcgaggat gccaacaagc cactcagaca aggtgctctc atatctctct tatgttccca 360

ctctcaagtg atgaggaacc atgttgctct tgcagggaaa caggatgaag ccacactggc 420

cgttcttgag atcgatggct ttaccaacag cgtgccccag ttcaacaaca ggagtggagt 480

gtctgaagag agagcacaga gattcatgat gatagcaggg tctctccctc gggcgtgcag 540

caatggtacc ccgttcatca cggctggggt tgaagatgat gcaccagaag atatcactga 600

tactctagag agaatcctct ctatccaggc tcaaatatgg gttacggtag caaaggccat 660

gactgcatat gagacagcag atgagtcgga aacaagaaga atcaataaat atatgcagca 720

aggcagagtc cagaagaggt acatccacca ccccgtgtgc aggagtgcaa ttcaactcac 780

aatcagacag tctctagcag tccgcatctt cttggttagc gagcttaaga gaggccgcaa 840

cacggcaggt gggagctcca catattacaa cctagtaggg gatgtagact catacatcag 900

gaacaccgcg cttactgcat tcttcctgac actcaagtat ggaatcaaca ccaagacttc 960

agccctcgca ctcagcagcc ttgcaggcga tatccaaaaa atgaaacagc tcatgcgttt 1020

atatcggatg aaaggagata atgcgccgta catgacattg ctaggtgaca gtgaccaaat 1080

gagctttgca ccagctgagt atgcacaact ttactctttt gccatgggta tggcatcagt 1140

cctggataaa gggactggca agtaccaatt cgccatagac tttatgagca catcattctg 1200

gagacttgga gtagagtatg ctcaggccca gggaagtagc attaatgagg atatggctgc 1260

cgagctaaag ctaaccccag cagcaaggag gggcctggca gccgctgccc aacgagtgtc 1320

tgaggagact ggcagcatgg atattcctac tcaacaagcc ggggtcctca ccgggctcag 1380

cgacaaaggc ccccaagccc cacaaggcgg atcgaacagg ccgcaaggac aaccggacgc 1440

cggggacggg gagacccaat ttttggacct tatgagagcg gtagcaaaca gtatgagaga 1500

agcgccgagc tctgcgcaga gcaccaccca gccagagccc ccctcaactc ctggaccatc 1560

tcaagataac gacaccgact gggggtattg accggcaaca ctcagcctgc ctctatagga 1620

ccatcccaac ccccttgcac gcaccccccc cccacccccc gatccacagc cccacatggc 1680

caaacccaca aacgagcccc cctctctctc ctctctcttc cagccccacg accccacccg 1740

cccaaagcaa cacaggcaca acttgaccca tcaacaatcc acacagaacc aaagacatta 1800

gaaaaaaata cgggtagaag agagatactc agagatcagg aagagtcacc agggtctctg 1860

ttctaccttc tacccagcag accagggcga atatggccac ctttacagac gcggagattg 1920

acgatctatt tgaaaccagt gggactgtca ttgacagcat aattacggcc cagggcaacc 1980

cagcggggac cgttggaagg agcgcaatcc cacaaggcaa aaccaaagca ttgagtgcag 2040

catgggagaa acatgagagc atccaaccat cggccagcca agacacccct gatagacaag 2100

acagaccaga caaacaaccg tccacaccta gacaggcgac tccacacaac aattcgccag 2160

ccacatctac tgaccagcct cctaccaagg ccgcagacga agccggcgac acacaactca 2220

agaccggagc aagcagctct cttctgtcga tgcttgacaa gcttaacaat aaatcgtcca 2280

atgctaaaaa gggcccatgg ttgagtcccc aggaagggca tcatcaactt ccaacccaac 2340

agcaggggag tcgaccgagc cgcagaaaca gtcaggagag accgcagaac caggtcaagg 2400

ccgcccctgg agaccggggc acagacgcga acacagcata tcatggacaa tgggaggagt 2460

cacaactatc agctggtgca atccctcatg ctctccggtc agggcagagc caagacaata 2520

ctcctgcacc tgtggatcat gcccagctac ctgtggactt tgtgcaggcg atgatgtcta 2580

tgatggaggc gatatcacag agggtaagta aagttgacca tcagctagac cttatcttaa 2640

aacaaacatc ctctatcccc atgatgcggt ctgaaatcca acagctgaaa acatccgttg 2700

cggtcatgga agccaattta ggcatgatga aaattctgga ccctggttgt gctaatgttt 2760

catctctaag tgatctacgg gcagtcgctc gatcccaccc agttttagtt tcaggccccg 2820

gagacccatc cccttatgtg acacaagggg gtgaaatggc actcaataaa ctttcacaac 2880

cagtgcaaca tctgtctgag ttgattaaac ctgccacggt aagcgggcct gatataggag 2940

tggagaggga cactgtccgt gcattgatca cctcacgtcc aatgcatccg agctcttcag 3000

ctaacctcct gagtaagctg gatgcagccg ggtcgatcga agaaatcaga aaaatcaagc 3060

gccttgcgct gaatggctga tcaccaccat cacctgcaac gggttcccgt tcattcagtg 3120

ccgcaagaga cccgccccga gccctcctcc ataaactcaa gctttaatac tccaagtgat 3180

aaccctctct tgcctcctct atctcattaa ataatcgcgc aaccgcaatt aatcctgcaa 3240

cattaatgat taagaaaaaa tacgggtaga atcggagtgc ccagactgtg ccaagatgga 3300

ctcatctagg acaatcgggc tatactttga ttctgccctt ccttctagca gcctgttagc 3360

attcccgatc atcctacaag acacaggtga cgggaagaag caaatcgccc cacaatatag 3420

gatccagcgt cttgacttgt ggacagatag taaagaagac tcggtattca tcaccaccta 3480

tggattcatc ttccaggtta gggatgaaga agtcgctgtc ggcatgatca atgataatcc 3540

caagcgcgag ttactttcct ctgcgatgct ctgcctagga agcgtcccga atatcggaga 3600

tcttgtcgag ctggcaaggg cctgcctcac tatggtggta acatgcaaga agagtgcaac 3660

caatactgag agaatggtct tctcggtagt gcaggcaccc caggtgctac agagctgtat 3720

ggtcgtggcg aacaaatatt cgtcagtgaa tgcagttaag catgtgaaag caccagagaa 3780

gatccctgga agcggaaccc tagagtacaa ggtgaatttt gtttctttga ctgtggtgcc 3840

gaagaaggac gtctacaaga tcccgaccgc agtgttgaag gtatctggct cgagcctgta 3900

caatctcgca ctcaatgtca ctattgatgt ggaggtagac ccaaagagcc cattagtcaa 3960

atttctttcc aggtccgaca gtggatacta tgctaatctc ttcttacata tcggacttat 4020

gtccactgta gataagaggg gaaggaaagt gacatttgac aagctggaga ggaagataag 4080

gagactcgat ctgtctgtcg ggcttagtga tgtgcttgta ccctctgtgc tcgtgaaggc 4140

gagaggtgca cgaactaggc tgctggcacc gttcttctct ggcagtggga cagcttgcta 4200

tcctatagca aatgcctctc ctcaggtagc caagatactc tggagtcaaa ccgcgtgcct 4260

gcggagtgta aaagtcatta tccaagcggg cacccaacgc gctgtcgcag tgactgctga 4320

ccatgaggtt acttctacta agatagagaa ggggcatacc atcgctaaat acaatccttt 4380

caagaaatag gctgcatctc tgaggctgca atccgcccgc ttccccgaat caccacggcg 4440

ccaaataatg atctgtctcg attacttata gttagctcac ctgtctatcg agttagaaaa 4500

aacacgggta gaagagtttg gatcccggtc ggcgcattca aagtgcaaga tgggccccaa 4560

atcttctacc aatgtcccag cacctctgat gctgaccgtc aggattgcgc tggcactgag 4620

ctgtgtccgt ctgacaaatt ctctcgatgg aaggcctctt gcagctgcag ggattgtagt 4680

aacgggagac aaagcagtca acatatacac ctcatctcag acagggtcaa taatagtcaa 4740

gttactccca aatatgccta aggataaaga ggcgtgtgca aaagccccgt tggaggcata 4800

caacaggaca ctgactactt tgctcacccc ccttggtgat tctatccgca ggatacaaga 4860

gtctgcgact acgtccggag gaaggaggca gagacgcttt ataggtgcca ttatcggcag 4920

tgtagctctt ggggttgcca cagctgcaca gataacagca gcctcagctc tgatacaagc 4980

caaccagaat gctgccaaca tcctccggct taaagagagc attgctgcaa ctaatgaagc 5040

tgtacatgaa gtcactgacg gattatcgca actagcagtg gcagttggga agatgcagca 5100

gtttgttaat gaccagttta ataacacagc tcaggaattg gactgtataa aaattacaca 5160

gcaggttggt gtagaactca acctgtacct aactgaattg actatagtat tcgggccaca 5220

aatcacttcc cctgccttaa ctcagctgac tatccaggcg ctttacaatc tagctggtgg 5280

taatatggat tatttgttga ctaagttagg tgttgggaac aaccaactca gctcattaat 5340

cggtagcggc ttgatcaccg gtaaccctat tctgtacgat tcacagactc aactcttggg 5400

tatacaggta actttaccct cagtcggtaa cctaaataat atgcgtgcta cctacttgga 5460

gaccttgtct gtaagcacaa ccaagggatt tgcctcagca cttgtcccaa aagtggtgac 5520

acaggtcggg tctgtgatag aggaacttga cacctcatac tgtgtagaga ccgatttgga 5580

tttatattgt acaagaatag tgacattccc tatgtctcct ggtatttatt cctgtctgag 5640

cggtaataca tcagcttgca tgtattcaaa gactgaaggt gcacttacta cgccatatat 5700

gactatcaag ggctcagtta ttgccaattg caagatgaca acatgcagat gtgcagaccc 5760

tccgggtatc atatcgcaaa attatggaga agctgtgtct ctaatagata ggcactcatg 5820

caatgtctta tccttagacg ggataacttt gaggctcagt ggagaatttg acgtaactta 5880

tcaaaagaat atctcaatat tagattctca ggtaatagtg acaggcaatc tcgatatctc 5940

aactgaactt gggaatgtca acaactcgat aagtaatgct ttggataagt tagaggaaag 6000

caatagcaaa cttgacaaag tcaatgtcaa gctgaccggc acgtctgctc tcattatcta 6060

tatagtttta actatcatat ctcttgtttg tggtatactt agcctggttc tagcatgcta 6120

tctgatgtat aaacaaaagg cgcaacaaaa gaccttatta tggcttggga ataataccct 6180

aaatcagatg agggccacta caagaatgtg aatgcagaca agaggcagag gtatctccaa 6240

gagcaatttg tgtgtgaatt caggcagcct gtcaattaga agaattaaga aaaaactacc 6300

ggatttgggt gatcaaaggg caacatacgg gtagaacggc cagagaggcc actccttagc 6360

caggaatcgg gcctcacacc atccgttcta ccgcatcacc aatagcggtt tttagtcatg 6420

gaccgtgtag ttagccaagt tgcgctagag aacgatgaaa gagaggcgaa aaatacatgg 6480

cgcttggtat ttcggaccgc agtcttactt ttaatagtag tgaccttttc catctctgct 6540

gccgccctga tgtacagtat ggaggctagc acacctggtg accttgtagg catactgact 6600

gcgatctcca gggcagaaga aaagattaca tctgcactcg gttccaatca agatgtagta 6660

gataggatat ataagcaggt ggccctcgaa tctccgttgg cattgctcaa caccgaatct 6720

ataattatga gtgcaataac gtccctctct taccagatca atggagctgc aaataacagt 6780

gggtgtgggg cacctgttca tgacccggat tatatcggag ggataggtaa agaactcatt 6840

gtggatgatg ctagtgatgt cacatcattc tatccctctg cgttccaaga acacctgaat 6900

tttatcccgg cgcccactac aggatcaggt tgcactcgga taccctcatt cgacatgagt 6960

gctacccact actgttacac tcataatgtg atattgtctg gctgcagaga tcactcacac 7020

tcacatcagt atttggcact tggtgtgctt cggacatctg caacagggag ggtattcttt 7080

tctactctgc gttccatcaa tttggatgac aaccaaaatc ggaagtcttg cagtgtgagt 7140

gcaactccct taggttgcga tatgttgtgc tctaaagtca cggaaactga ggaagaagat 7200

tataattcag ttatccccac accaatggta catgggaggc tggggtttga cggccaatac 7260

catgagaagg acctggatgt cgcaacatta tttggggact gggtggcaaa ttaccctggg 7320

gtgggaggag ggtcttttat tgacaaccgc gtatggttcc cagtctatgg agggctaaaa 7380

cccaattcgc ctagtgacac tgcacaagag gggagatatg taatatacaa gcggtacaat 7440

gacacatgcc cagatgagca agactaccag attcggatgg ctaagtcttc atataagcct 7500

gggcggtttg gtgggaaacg cgtacagcag gccatcctat ccatcaaggt atcaacatcc 7560

ttgggtgagg acccggtgct gactgtaccc cccaacacaa tcacacttat gggggccgaa 7620

ggcagagttc tcacagtagg gacatctcat ttcttttacc agcgagggtc atcatacttc 7680

tctcccgcct tattataccc tatgacagtc gacaataaaa cagccactct tcatagtcct 7740

tatgcattca atgctttcac tcggccaggt agtgtccctt gccaggcttc agccagatgc 7800

cctaactcgt gtgttactgg agtctacact gatccatacc ccttagtctt ccatagggac 7860

cacactttgc gaggggtatt cgggacaatg cttgatgata aacaagcaag actcaaccct 7920

gtatctgcag tatttgataa catatctcgc agtcgcataa cccgggtgag ttcaagcagt 7980

accaaggcag catacacgac atcaacatgt tttaaagttg tcaagaccaa taaaacctat 8040

tgcctcagca ttgcagaaat atccaatacc ctcttcgggg aattcaggat tgtcccttta 8100

ttagtcgaga ttctcaagga tgatgggatt taagaagcca ggtctggctg gttgagccag 8160

ctgtgaaagg gccgggaaga tgacactgcg ccacccatcc tttgtagcac caggaatcaa 8220

actgagaacc ggcacaggct caaatcatac gctgccggtc agccacaatc agctatcgcc 8280

aatgcgatta gtctggatct tgccaatagt cacttgatta agaaaaaata tagatggtag 8340

tgagatacga gacaaagcaa ctcacggtgg ataacacggg taggacatgg cgagctccgg 8400

tcccgagagg gcagagcacc agattatcct accagagtca catctgtctt caccattggt 8460

caagcacaaa ctgctctatt actggaaatt aacagggcta ccacttcctg acgaatgcga 8520

cttcgaccac cttattatca gtcgacaatg gaagaaagta cttgaatcgg ccactcctga 8580

cattgagaga atgataaaac tcgagcggtc agtacaccag actctcaacc acaattccag 8640

gataactgga gtactacatc ccagatgttt agaagaattg gctagtattg aggtccctga 8700

ttcaaccaac aaatttcgga agatcgaaaa gaagatccag attcacaaca caaggtatgg 8760

agaactattc actcggctgt gcacgcatgt agaaaagaaa ttattggggt cgtcttggtc 8820

tagcaatgtc ccacgatcag aggaattcag cagcatccgt acagatccgg cattctggtt 8880

tcattcaaaa tggtccacag ccaagtttgc atgtctccat ataaaacagg tccaaaggca 8940

tctaattgta gcagcaagaa caagatccgc agtcaacaaa ttagtaacgc tgacccataa 9000

ggtaggccaa gtatttgtta ctcctgagct tgttattgtg acacatacag atgagaacaa 9060

gttcacgtgt cttacccagg aacttgtgtt gatgtatgca gatatgatgg agggcagaga 9120

tatggtcaac ataatatcat ccacggcagc acatcttagg agcttatcag agaaaattga 9180

tgacattctg cggttgatag atgctttggc gaaagatttg ggcaatcagg tctacgatgt 9240

tgtagcacta atggagggat tcgcatacgg cgctgttcag ctgcttgagc cgtcaggtac 9300

atttgcaggg gatttctttg ccttcaacct gcaggagctc aaagatactc taatcggact 9360

cctccccaag gatatcacag aatctgtgac tcatgcaatc gccaccgtat tctctggctt 9420

agaacaaaat cacgcagccg agatgttgtg cttattgcgt ctgtggggcc atccactgct 9480

tgagtcccgc actgcagcaa aagcagttag gagccaaatg tgcgcaccaa aaatggtaga 9540

cttcgatatg atcctccagg tactgtcctt cttcaaagga acaatcatca atggatacag 9600

aaagaagaat gcaggtgtgt ggccacgtgt caaggtgaat acgatatatg ggaaggtcat 9660

tgggcaacta cacgctgatt cagcagagat ttcacatgat gtcatgttga gagagtgcaa 9720

aagtttatct gcacttgaat tcgagccatg tatagaatat gaccctgtca ccaatctgag 9780

catgtttcta aaagacaagg caattgcaca tccgaaagat aactggctcg cttcatttag 9840

gcgaaacctt ctctctgagg accagaagaa acatgtgaag gaggcaacct caactaatcg 9900

cctcttgata gagttcttag agtcaaatga ttttgatcca tataaggaga tggaatacct 9960

gacgaccctt gagtacctaa gagatgataa tgtggcagta tcatactcac tcaaagagaa 10020

ggaggtaaaa gttaatgggc ggattttcgc taaactaaca aagaaattaa gaaactgtca 10080

ggtaatggca gaagggatcc tagctgacca gattgcacct ttcttccagg gaaacggggt 10140

cattcaggat agcatatcct taactaagag tatgcttgcg atgagtcaac tgtctttcaa 10200

cagcaataag aaacgtatca ctgactgcaa ggaaagagta tcctcaagcc gcaatcatga 10260

tccgaagagc aagaatcgtc ggagagttgc cactttcata acaactgacc tgcaaaagta 10320

ttgtcttaat tggagatatc agacggtcaa gctgtttgct cacgccatca atcaactgat 10380

gggcctacct cacttcttcg agtggatcca tcttagacta atggacacta cgatgtttgt 10440

aggagaccct ttcaatcctc caagtgaccc aactgactgt gatctatcaa gagtcccaaa 10500

tgacgacata tacattgtca gtgctagggg gggcattgag ggattgtgtc agaagctgtg 10560

gacaatgatc tcaattgctg caatccaact tgctgcagca agatcacatt gtcgtgttgc 10620

ctgtatggta caaggtgaca atcaagtaat agctgtaacg agagaggtaa gatcagacga 10680

ctctccggag atggtattaa cgcaattgca tcaagccagt gataatttct tcaaggaatt 10740

gatccatgtc aatcatttaa ttggccataa tttgaaggat cgtgaaacca tcaggtcaga 10800

cacgttcttc atatacagca aacgaatatt caaggatgga gcaatactca gtcaggtcct 10860

caaaaactca tctaaattag tgctgatatc aggcgacctt agtgaaaaca ccgtaatgtc 10920

ttgtgccaac attgcatcta ctatagcgcg gctgtgcgag aacgggcttc ctaaggattt 10980

ctgttattac ttaaactacc taatgggttg cgtgcagaca tattttgatt ctgagttttc 11040

catcactaac aacccgcaac ccgattctaa ccagtcgtgg attgaggaca tctcttttgt 11100

gcattcatat gtcctgaccc ctgcccagct gggggggctg agcaaccttc aatactcaag 11160

gctctacaca aggaacatcg gtgatctagg aactactgct tttgcagaga tcaagcgatt 11220

agaggcagtg gggttactga gtcctagcat tatgactaac atcttaacta ggccacctgg 11280

taatggagat tgggccagtc tgtgcaatga tccgtactcc tttaattttg agactgtcgc 11340

aagcccgaat atcgtcctta agaagcatac acagagggtc ctatttgaaa cttgttcaaa 11400

tcccttatta tctggagtac atacagagga taatgaggca gaagaaaagg cattggctga 11460

attcttgctc aatcaagaag tgattcaccc acgcgtcgcg catgccatca tggaagcgag 11520

ctctgtaggc aggagaaaac aaattcaggg gcttgttgac acaacaaaca ccgtgattaa 11580

gatcgcactg actcggaggc ctctcggcat caagaggctg atgcggatag tcaattactc 11640

gaacatgcat gcaatgctat ttagagacga tgttttctca tccaacagat ccaaccaccc 11700

cttagtctct tctaatatgt gttctcttac gctggcagat tatgcacgga acagaagctg 11760

gtcacctttg acggggggca ggaagatact gggtgtatct aatcctgata ccatagaact 11820

tgtagagggt gagatcctta gtgtcagcgg agggtgcaca agatgtgata gcggagatga 11880

acagtttact tggttccatc ttccaagcaa tatagaactg accgctgaca ccagcaagaa 11940

tcctccaatg cgagtgccat atctcgggtc aaagacccaa gagaggagag ctgcctcgct 12000

tgcaaaaata gctcatatgt cgccacatgt gaaggcggct ctgagggcat catctgtgtt 12060

aatctgggct tatggggaca acgaagtaaa ttggactgct gctcttaaga ttgcaaggtc 12120

tcggtgcaac ataagctcag agtatcttcg actgttgtca cccttaccca cagctggtaa 12180

tctccaacat agactggatg atggcataac tcagacgaca ttcacccctg catctctata 12240

cagggtgtca ccttacattc acatatctaa tgattctcaa aggctattca ctgaagaagg 12300

agtcaaagaa gggaatgtga tttatcagca aatcatgctc ttgggtttat ctcttattga 12360

gtcactattc ccaatgacaa caaccaagac atatgatgaa atcacattac acctccacag 12420

taaatttagc tgctgtatca gggaagcatc tgttgcagtt ccattcgagc tactcggggt 12480

ggcaccagaa ctaagggcag taacctcaaa taagtttatg tatgatccta gccctgtatc 12540

agaaggagac tttgcgagac ttgacttagc tatctttaag ggttatgaac ttaatttaga 12600

gtcgtatccc acaatagagc taatgaacat tctttcaata tcctgtggga agttgattgg 12660

ccagtctgtg gtttcttatg acgaagatac ctctataaag aatgacgcta taatagtgta 12720

tgacaacaca cggaattgga tcagcgaagc tcagaattca gatgtggtcc gcctattcga 12780

gtatgcggca ctcgaagtgc tcctcgactg ttcttaccaa ctctactatc taagagtaag 12840

aggcctaaac aatattgtct tatatatgag tgatttatac aagaatatgc caggaattct 12900

actctccaat attgcagcta caatatctca ccccatcatc cattcgaggt tgaatgcagt 12960

aggtctggtc aaccatgacg gatcacacca acttgcagac acagatttca ttgaaatgtc 13020

tgcaaaactg ctagtatctt gcactcggcg cgtggcatca ggtttatatg cacgaaataa 13080

gtatgacctg ctgtttccat ctgtcttaga tgataacctg agtgagaaga tgcttcagtt 13140

gatatctcgg ttatgctgtc tgtacacggt gctctttgct acaacaagag aaatcccgaa 13200

aataagaggc ttatccgcgg aagaaaaatg ttcagtactc actgagtatc tactgtcaga 13260

tgctgtgaga ccattactta ggtccgagca agtgagctct atcatgtctc ccaacatagt 13320

tacgttccca gccaatctgt attacatgtc taggaagagc ctcaatttga tcagggaaag 13380

agaggacagg gatactatct tggcattgtt gttccctcaa gaaccactgc tcgagttacc 13440

ctcggtgcaa gatattggtg ctcgagtgaa ggatccattt acccgacaac ctgcggcgtt 13500

tttactagag ttggatttga gtgctccagc aaggtatgat gcatttacac ttaatcaggt 13560

tcattctgaa cacacattgc cgaacccaaa ggaagactac ttagtacgat acttgttcag 13620

aggaataggg accgcgtcat cctcttggta taaggcgtcc catcttcttt ctgtacccga 13680

ggtcagatgt gcaaggcatg gaaactcctt atacttagca gaaggaagtg gagccatcat 13740

gagtcttctc gaattgcatg tgccacatga gactatctat tacaatacgc ttttctcaaa 13800

tgagatgaac cccccacagc gacatttcgg accgaccccg acacagttcc tgaattcagt 13860

cgtttatagg aatttacagg cggaagtacc atgtaaggat ggatttgtcc aggaattccg 13920

tccattatgg agagagaata cagaggaaag cgacctgacc tcagataaag cagtggggta 13980

tatcacatct gcagtaccct acaggtccgt atcactgctg cattgtgaca ttgagattcc 14040

tccaggatcc agtcaaagct tactagatca attggctacc aatttgtccc tgattgccat 14100

gcattctgta agtgagggcg gggtcgtgat catcaaagta ctgtatgcaa tgggatacta 14160

cttccatcta ctcatgaact tgttcgctcc atgctctgcg aaaggatata ttctctctaa 14220

tggctacgca tgtagaggcg atatggagtg ttacctggta tttgtcatgg gctcccttgg 14280

cggacctaca tttgtgcatg aggtggtgag gatggcaaaa actctagtac agcggcacgg 14340

cacgcttttg tctaaatcgg atgaggttat actgactaag ttatttacct cacagcagca 14400

gcgtgtaata gaaatcctat ccagcccttt accgagacta atgaagttct tgagagagaa 14460

tattgatact gcgctgattg aagccggggg acagcctgtc cgtccattct gtgcagagag 14520

tttagtgagc acactaacag acatgactca gatgacccag atcattgcca gccacattga 14580

cacagtcatc cgatctgtga tctacatgga agctgagggt gatcttgctg acacagtatt 14640

cttatttacc ccttacaatc tctctgtaga cggaaaaaag aggacatcac ttaaacagtg 14700

cactagacag atcttagagg tcacaatact gggtctcaga gtcaaaaatc tcgataaggt 14760

aggtgatgta atcagcctag tgctcagagg tatgatttcc ctggaggacc tcatcccgct 14820

aagaacatac ttgaagcgta gtacctgccc taagtattta aagactgtcc taggtgttac 14880

taaactcaaa gaaatgttca cagacacttc tttattatac ttgacgcgtg ctcaacaaaa 14940

attgtacatg aaaactatag gcaatgcggt caagggatat tacagtagct gtgactctta 15000

aaggcgatca cacattaata ggctcctttt ttagccaatt gtatccttgt tgatttaatt 15060

ataccatatt agaaaaaagt tgaactccga ccctctagga ctcgtactcg gattcaaata 15120

attaccttag aaaaaaaatg cgcataattg ctcttgagtg tagttctgtc attcaccaaa 15180

tctttgtttg gt 15192

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

GACAGCTTAT CATCGATTGC AATCGCCACC GTATTCT 37

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

CATTAAAGCT TATCGACCAA ACAAAGATTT GGTGA 35

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

GACAGCTTAT CATCGATCTT ATGTCCACTG TAGATAA 37

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

ACGGTGGCGA TTGCATGAGT CACAGATTCT GTGAT 35

<210> 6

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

GACAGCTTAT CATCGATTAA TACGACTCAC TATAGGGACC AAACAGAGAT TCTGTGA 57

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

TACAGTGGAC ATAAGTCCGA TATGTAAGAA GAGAT 35

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

AGTGACTGCT GACCATGAGG 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

ATGCCATCAT CCAGTCTATG 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

CCTTCAACCT GCAGGAGCTC 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

ACCAGCTGAGTATGCACAAC 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

CATGATGATA GCAGGGTCTC 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

ACCAGCTGAG TATGCACAAC 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

ATCATGCCCA GCTACCTGTC 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

CCTAACCTGG AAGATGAATC 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

AGTGACTGCT GACCATGAGG 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

CTACCGATTA ATGAGCTGAG 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

CTAATCGCCT CTTGATAGAG 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

CGAGTGGATC CATCTTAGAC 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

CCGTAATGTC TTGTGCCAAC 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

GCAGAGGTATC TCCAAGAGC 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

AGACTGCGGT CCGAAATACC 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

ATGTTGCGAC ATCCAGGTCC 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

AGTCGAGATT CTCAAGGATG 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

CACTGCTCGA GTTACCCTCG 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

GAAATCATAC CTCTGAGCAC 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

GGCACAACTT GACCCATCAA 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

TTGTCTCATG AGCGGATACA 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

CATAGTGACT GGCGATGCTG 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

TGAGATATCG AGATTGCCTG 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

GGACACTACC TGGCCGAGTG 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

TGGAGGATCA TATCGAAGTC 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

ATGCCATCAT CCAGTCTATG 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

CCTTCAACCT GCAGGAGCTC 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

CCATTCGAGG TTGAATGCAG 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

AGAGTGCCAT ATCTCGGGTC 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

TGTGTACAGA CAGCATAACC 20