阿奇霉素在抗冠状病毒感染中的应用的制作方法

本发明是关于阿奇霉素在制备抗冠状病毒感染药物中的应用，属于医药技术领域。本发明包含阿奇霉素在冠状病毒预防或治疗中的单独或联合应用。

背景技术：

冠状病毒(coronavirus，cov)病毒学分类属于网巢病毒目(nidovirales)冠状病毒科(coronaviridae)冠状病毒属(coronavirinae)。冠状病毒根据其进化，又可分为α-冠状病毒、β-冠状病毒和γ-冠状病毒[gorbalenyaae,enjuanesl,ziebuhrj,etal.nidovirales:evolvingthelargestrnavirusgenome.virusres.2006,117:17-37.](图1)。

冠状病毒是直径为50-200nm的球状包膜病毒，其基因组为单链正链rna，共编码4种结构蛋白：刺突蛋白(spike,s)、膜蛋白(membrane,m)、包膜蛋白(envelope,e)和核衣壳蛋白(nulcleocapsid,n)。其中s蛋白是唯一负责介导病毒进入宿主细胞的蛋白。s是跨膜蛋白，分子量128-160kda，s蛋白以三聚体形式嵌于病毒外壳。每一个s蛋白又由s1和s2亚基组成，其中s1高度可变，主要功能是与宿主细胞表面受体结合；s2为保守区，负责病毒的融合过程[masters,ps.；perlman,s.coronaviridae.in:knipe,dm.；howley,pm.,editors.fieldsvirology.philadelphia:lippincottwilliams&wilkins.2013,825-858.]。当冠状病毒以ph依赖方式进入宿主细胞后，遗传物质释放至胞浆，由于其基因组5'-甲基化和3'-polya序列的结构特征，使其rna可结合至核糖体并启动翻译过程，合成多聚蛋白[sethnapb,hungsl,brianda.coronavirussubgenomicminus-strandrnasandthepotentialformrnareplicons.procnatlacadsci.1989,86:5626-5630.]。冠状病毒的基因组还编码聚合酶，在该聚合酶的催化下，利用宿主元件可以以冠状病毒基因组rna为模板生成新rna。当多聚蛋白和rna基因组都被合成后，开始子代新病毒包装，多聚蛋白由冠状病毒的蛋白酶水解，变为具有功能的结构蛋白，此新生成的冠状病毒出芽，释放至细胞外并开始新一轮感染过程[hoguebg,machamerce.coronavirusstructuralproteinsandvirusassembly.in:perlmans,gallaghert,snijderej,eds.nidoviruses.washington,dc:asmpress.2008,179-200.]。

冠状病毒感染哺乳动物和人的上呼吸道或消化道。现已知可感染人类的冠状病毒共有六种：人冠状病毒oc43(humancoronavirusoc43，hcov-oc43)、人冠状病毒229e(humancoronavirus229e，hcov-229e)、人冠状病毒nl63(humancoronavirusnl63，hcov-nl63)、人冠状病毒hku1(humancoronavirushku1，hcov-hku1)、重症急性呼吸综合征冠状病毒(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus，sars-cov)和中东呼吸综合征冠状病毒(middleeastrespiratorysyndromecoronavirus，mers-cov)。人感染冠状病毒后一般引起呼吸系统疾病，前四株冠状病毒通常引起人的普通感冒，而人感染后两种冠状病毒的临床表现则为高致病性的呼吸窘迫症。

在2003年前，人们对人冠状病毒的通常认知是此类病毒感染会引起患者低致死率的上呼吸道感染。hcov-229e和hcov-oc43即为上世纪六十年代从患者上呼吸道分离获得的毒株[mcintoshk.coronaviruses:acomparativereview.currtopmicrobiolimmunol.1974,63:85-129.]。据报道，冠状病毒在全球范围内流行，10-15％的普通感冒是由冠状病毒感染引起[vanderhoek,l.humancoronaviruses:whatdotheycause？,antiviraltherapy.2007,12(4ptb):651–658.；jumpupwat,dennis).thecommoncold:areviewoftheliterature.europeanjournalofinternalmedicine.2004,15(2):79–88.]。人感染hcov-oc43、hcov-229e、hcov-nl63或hcov-hku1会引起普通感冒，目前无针对上述四种病毒的疫苗或特效药物。

2002年11月-2003年7月重症急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)在我国的传播造成较严重疫情，共8096人感染，其中774人死亡，死亡率9.6％["epidemicandpandemicalertandresponse(epr)".worldhealthorganization.]。患者感染sars-cov初期症状为发热、肌肉酸痛、喉咙痛。随着病情发展，呼吸短而气促，然后为病毒性肺炎症状或细菌性二次感染致肺炎。患者主要采用干扰素及对症或支持治疗，到目前为止尚无特效药或疫苗[robertsa,thomaswd,guarnerj,lamirandeew,babcockgj,greenoughtc,vogell,hayesn,sullivanjl,zakis,subbaraok,ambrosinodm."therapywithasevereacuterespiratorysyndrome-associatedcoronavirus-neutralizinghumanmonoclonalantibodyreducesdiseaseseverityandviralburdeningoldensyrianhamsters".jinfectdis.193(5):685–692.]。

中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)是另一种高致死率可传染人的冠状病毒。mers-cov最早于2012年在沙特阿拉伯被分离，起初称为“新冠状病毒2012”["ecdcrapidriskassessment-severerespiratorydiseaseassociatedwithanovelcoronavirus".19feb2013.retrieved22apr2014.]。该病毒已在26个国家出现，至2016年3月23日，共有1698人确诊感染，其中609人死亡，致死率36％[http://www.who.int/emergencies/mers-cov/en/，who]。流行病研究结果显示，蝙蝠为该病毒的原始宿主，大约在上世纪九十年代中期，该病毒由蝙蝠传播到骆驼，然后又由骆驼传到人。现尚无证据显示该病毒可在人际间传播。中东呼吸综合征的临床表现常见为发热、发热伴畏寒寒战、咳嗽、气短、肌肉酸痛、腹泻、恶心呕吐、腹痛等。目前尚无对mers-cov特效药。

由于用于治疗冠状病毒感染的临床用药缺乏，因此对此类病毒的药物研发具有重要意义。

阿奇霉素(结构式i)是15元环大环内酯类抗生素，该药物通过与细菌核糖核蛋白体的50s亚单位结合，妨碍肽链的延长，影响细菌蛋白合成而达到抑菌作用，对大多数革兰氏阳性菌、部分阴性菌及一些非典型致病菌均有效，是大环内酯类抗生素中对淋球菌和脑膜炎球菌等革兰氏阴性球菌抑菌活性最强的药物；对革兰氏阴性杆菌的作用比红霉素明显增强。阿奇霉素对流感嗜血杆菌的抑菌作用比红霉素强4-8倍；对肠杆菌、霍乱弧菌具有良好的抑菌作用。经检索，未见阿奇霉素抗冠状病毒活性报道。

本发明是基于应用冠状病毒感染细胞模型对1600个现有上市药物普筛，用以发现可以阻断冠状病毒感染宿主细胞的药物。本发明是关于已有药物新用途的应用专利。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是提供如结构式(i)所示的阿奇霉素在预防或治疗冠状病毒药物中的应用，以及含有如结构式(i)所示的阿奇霉素的药物组合物在预防或治疗冠状病毒药物中的应用，

为解决本发明的技术问题，本发明提供了如下技术方案：

本发明技术方案的第一方面是提供了如结构式(i)所示的阿奇霉素在预防或治疗冠状病毒药物中的应用，

本发明技术方案的第二方面是提供了含有如结构式(i)所示的阿奇霉素的药物组合物在预防或治疗冠状病毒药物中的应用，

上述的应用中，所述的药物组合物还可以含有其他的抗病毒药。

本发明第一方面和第二方面所述的冠状病毒优选感染人类的冠状病毒；进一步的，所述的冠状病毒优选重症急性呼吸综合征冠状病毒sars-cov(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus,sars-cov)、中东呼吸综合征冠状病毒mers-cov(middleeastrespiratorysyndromecoronavirus,mers-cov)或致普通感冒的冠状病毒；所述的致普通感冒的冠状病毒优选人冠状病毒oc43(humancoronavirusoc43)、人冠状病毒229e(humancoronavirus229e)、人冠状病毒nl63(humancoronavirusnl63)、人冠状病毒hku1(humancoronavirushku1)。

本发明第二方面涉及以本发明第一方面所述化合物作为活性成份的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-95重量％。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也可以制成缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；润湿剂可以是水、乙醇、异丙醇等；黏合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。

为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、ph调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；ph调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其他添加剂。

本发明的发明人发现阿奇霉素可特异性地阻断冠状病毒感染宿主细胞。

还可以和其他的抗病毒药物进行联合用药。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-150mg/kg体重，优选为0.1-100mg/kg体重，更优选为1-60mg/kg体重，最优选为2-30mg/kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其他治疗手段的给药方案。

本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其他治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

有益技术效果

阿奇霉素作为抗菌药已在临床长期应用，其安全性、药物代谢特性、毒副作用已经明确。而此次发现该药物抗冠状病毒的新用途将可快速使其应用于人冠状病毒致普通感冒和人冠状病毒致高危症状感染，缓解重大疫情。

附图说明

图1.冠状病毒分类

图2.阿奇霉素阻断sars-cov感染活性

图3.阿奇霉素阻断mers-cov感染活性

具体实施方式

实施例1.筛选模型的原理

冠状病毒进入宿主细胞是病毒感染的第一步，抑制病毒的进入就可有效阻断病毒感染。冠状病毒包膜表面刺突蛋白(spike，s)是冠状病毒进入过程的关键蛋白。

我们分别应用sars-cov包膜s基因(sars-covs，genebank:ay278741.1)和mers-cov包膜s基因(mers-covs,genebank:jx869059.2)。通过共转染表达s蛋白的质粒和hiv核心质粒(pnl4-3-luc-r^-e^-)，可获得s蛋白为外壳包裹hiv核心的sars-cov重组病毒sars-s/hiv[yingguo,jennifertisoncik,susannamcreynolds,michaelfarzan,bellurs.prabhabar,thomasgallagher,lijunrongandmichaelcaffrey.identificationofanewregionofsars-covsproteincriticalforviralentry.journalofmolecularbiology.2009,394:600-605.]和mers-cov重组病毒mers-s/hiv[grehank,ferraraf,tempertonn.anoptimisedmethodfortheproductionofmers-covspikeexpressingviralpseudotypes.methodsx.2015,2:379-384.]。该病毒颗粒具有以下特点：1)病毒对宿主细胞的选择性取决于刺突蛋白s的特性；2)由于hiv载体上env、nef和vpr基因缺失，因此该病毒只能一次性进入宿主细胞并且不能复制，所以该病毒是安全的；3)该hiv载体上带有一个荧光素酶报告基因，因此被感染的细胞会表达荧光素酶，通过检测荧光素酶活性就可标示细胞被病毒感染的程度。同时，我们还制备了以水疱性口膜炎病毒vsv的糖蛋白(vsv-g)为外膜蛋白的vsv-g/hiv重组病毒作为模型对照组。当化合物可抑制hcov-s/hiv病毒的进入，而对vsv-g/hiv病毒的进入无显著抑制时，视为特异性冠状病毒进入抑制剂。

实施例2.抗sars-cov感染药效学实验方法

在本发明中应用了sarscoronavirusurbani(genebank:ay278741.1)毒株。重组病毒制备[yingguo,jennifertisoncik,susannamcreynolds,michaelfarzan,bellurs.prabhabar,thomasgallagher,lijunrongandmichaelcaffrey.identificationofanewregionofsars-covsproteincriticalforviralentry.journalofmolecularbiology.2009,394:600-605.]：共转染pcdna3.1/sars-s质粒和pnl4-3-luc-r^-e^-质粒至293t细胞，转染后48h收集上清，上清液经0.45μm滤膜过滤，该上清中含有sars-s/hiv病毒颗粒，该重组病毒可用于感染。按照同样方法制备vsv-g/hiv重组病毒。

感染[yingguo,jennifertisoncik,susannamcreynolds,michaelfarzan,bellurs.prabhabar,thomasgallagher,lijunrongandmichaelcaffrey.identificationofanewregionofsars-covsproteincriticalforviralentry.journalofmolecularbiology.2009,394:600-605.]：应用改良磷酸钙方法将表达人血管紧张素转移酶ii(homosapiensace2，genebank:ab046569.1)的质粒转至293t细胞。感染前一天，按每孔6×10⁴个细胞的密度将293t-aceii细胞接种到24孔板上。用dmso溶解阳性对照化合物或待筛选化合物，感染前15分钟加入细胞培养液中，以dmso溶剂作空白对照。加入适宜稀释度的病毒液感染细胞。感染48小时后，弃去上清，然后向每孔被感染的细胞加入50μl细胞裂解液(promega)裂解细胞，将30μl荧光素酶底物(promega)与20μl细胞裂解液混合后用fb15荧光检测器(sirius)仪器测定细胞荧光素酶的相对活性，其活性的强弱反映了病毒的感染水平。结果显示，阿奇霉素可有效抑制sars-cov病毒对宿主细胞的感染，其半数抑制浓度为0.11μm(图2,表1)。在终浓度10μm时，阿奇霉素对vsvg/hiv感染无抑制作用。

表1

实施例3.抗mers-cov感染药效学实验方法

在本发明中应用了humanbetacoronavirus2cemc/2012(genebank:jx869059.2)毒株。重组病毒制备[grehank,ferraraf,tempertonn.anoptimisedmethodfortheproductionofmers-covspikeexpressingviralpseudotypes.methodsx.2015,2:379-384.]：共转染pcmv3/mers-s质粒和pnl4-3-luc-r^-e^-质粒至293t细胞，转染后48h收集上清，上清液经0.45μm滤膜过滤，该上清中含有mers-s/hiv病毒颗粒，该重组病毒可用于感染。

感染：应用改良磷酸钙方法将表达人cd26(genebank:nm_001935.3)的质粒转至293t细胞。感染前一天，按每孔6×10⁴个细胞的密度将293t-cd26细胞接种到24孔板上。用dmso溶解阳性对照化合物或待筛选化合物，感染前15分钟加入细胞培养液中，以dmso溶剂作空白对照。加入适宜稀释度的病毒液感染细胞。感染48小时后，弃去上清，然后向被感染的细胞每孔加入50μl细胞裂解液(promega)裂解细胞，将30μl荧光素酶底物(promega)与20μl细胞裂解液混合后用fb15荧光检测器(sirius)仪器测定细胞荧光素酶的相对活性，其活性的强弱反映了病毒的感染的水平。结果显示，阿奇霉素可有效抑制mers-cov病毒对宿主细胞的感染，其半数抑制浓度为0.10μm(图3,表2)。

表2

实施例4.细胞毒性试验

应用mts法测定了阿奇霉素对293t细胞的细胞毒性，结果显示阿奇霉素在10μm的终浓度下无细胞毒性。