抗丙型肝炎病毒的全人单克隆抗体8D6的制作方法

本发明属于生物技术和免疫学领域；更具体地,本发明涉及一个特异性和广谱抗丙型肝炎病毒的全人单克隆中和抗体。本专利提供了关于人源抗hcve2单克隆抗体的组成和方法。本专利发明的抗体结合hcve2蛋白的保守区，并且中和多种hcv基因型。本专利发明包括单独抗体和衍生物及片段，包括人源抗hcv单克隆抗体的制药配方，和生产该单克隆抗体的细胞株。
背景技术：
：丙型病毒性肝炎(丙肝)由丙型肝炎病毒(hcv)引起，一般通过血液和体液传播，是导致各种肝脏疾病的重要原因之一。据世界卫生组织who统计，目前全球约有1.5亿人患有慢性丙肝，并面临因肝功能丧失或者肝癌导致死亡的风险。每年有300-400万人新增感染丙肝病毒，并有35万余人死于与丙肝相关的肝脏疾病。2009国际肝病峰会数据表明，中国作为丙肝流行地区，目前约有4000万患者。急性hcv感染者转变为慢性丙肝患者的概率高达80％，呈现出明显的慢性化趋势。丙型肝炎病毒(hcv)引起的终末期肝脏疾病是肝移植的主要指标。然而，hcv的再感染普遍发生，且易导致同种异体移植的衰竭，这种衰竭是导致hcv病人肝脏再移植或死亡最常见的原因。超过三分之一的肝移植受者发展成肝硬化，并且在术后五年需要再移植。肝移植受者接受的(聚乙二醇)干扰素和利巴韦林联合治疗有较差的耐受性和疗效，治疗患者中只有大约30％发生了持续病病毒清除。中国十年间hcv的发病人数增长了9倍。全世界都迫切需要对于丙型病毒性肝炎的安全、有效、价格低廉的预防治疗方法。丙型肝炎病毒(hcv)属于黄病毒科(flaviviridae)肝炎病毒属。hcv病毒体呈球形，直径约60nm(在肝细胞中为36-40nm，在血液中为36-62nm)，内部为单链正义rna，在核衣壳外包裹有含脂质的囊膜，囊膜上有刺突。hcv基因组的单股正链rna全长约9.6kb，包含5’-端和3’-端非编码区(non-translatedregion，utr)及一个开放阅读框(openreadingframe，orf)，编码一个3000多个氨基酸的多聚蛋白前体，可翻译剪切为11种病毒蛋白。其中hcvrna的n-端编码core(f)、e1、e2和p7五个结构蛋白，c-端编码ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a和ns5b六个非结构蛋白。其中，核心蛋白是病毒核衣壳的最基本组成部分，e1/e2是病毒表面高度糖基化的包膜蛋白，p7是介导病毒颗粒组装和释放的离子通道蛋白，ns2、ns4b、ns5a、ns5b参与病毒的复制过程，ns3-4a参与病毒多聚蛋白前体的剪切工作。目前尚无疫苗可以有效防止hcv感染，针对慢性丙肝的标准疗法是聚乙二醇干扰素- α与利巴韦林的联合治疗，但基于所感染病毒基因型和其他因素，只有50-80％的患者可以产生持续病毒性应答，其他患者则无法用此疗法控制病情的发展。2011年5月，fda批准通过了两种丙型肝炎新药victrelis(伯赛匹韦,-1-boceprevir)和incivek(telaprevir,特拉匹韦)。这两种药物都属于一类所谓的蛋白酶抑制剂，该抑制剂能够阻止丙型肝炎病毒复制。这两种药物的治疗均可以有效降低患者hcvrna载量，但同时也面临着耐药性、副作用、价格昂贵等问题，制约了其在临床上的大规模使用。迫使人们寻求新的预防和治疗丙型病毒性肝炎的新方法—抗体药物。hcv的治疗需求可以与乙肝(hbv)患者进行肝移植时治疗需要相类比。核苷酸和核苷类似物对抑制hbv有良好的耐受性和较好的疗效，但必须同时使用乙肝免疫球蛋白(hbvigg)用于预防肝移植后hbv的感染，是公认的标准治疗方案。hbvigg的使用让乙肝患者从不适宜移植变成肝移植的理想候选人。因此，即使开发更有效和耐受性良好的口服抗丙型肝炎药物，一个有效的抗丙型肝炎抗体仍然是预防肝移植后hcv感染的重要基础。抗体药物用于病毒感染性疾病的治疗早有报道，抗血清用于治疗sars和重症h5n1丙型肝炎病毒感染者的案例已经证明了抗体在治疗病毒感染中发挥的重要作用。具有中和活性的抗丙型肝炎病毒的全人单克隆抗体具有以下潜在优势：一方面它可以阻断病毒与靶细胞的结合；另一方面通过补体和t细胞、nk细胞等效应细胞的作用，将被病毒感染的细胞杀死。1986年，第一株治疗器官移植出现的排斥反应的鼠单抗——莫罗单抗-cd3(murmonabcd3，hocloneokt3)获得美国fda批准上市，但由于其在人体内会产生人抗鼠抗体(hama)反应，限制了应用。随着免疫学和分子生物学的发展，基因工程抗体迅速发展，嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体生产技术不断发展，将hama反应降至最低乃至消除。2009年，美国fda批准的14个药物中有4个为全人抗体，这标志着全人单克隆抗体时代的来临，全人抗体成为抗体药物未来的发展方向。丙型肝炎病毒包膜蛋白中的e2蛋白，在病毒入侵细胞过程中扮演非常重要的角色，是主要的细胞表面受体结合区域，也是免疫反应的主要目标。e2蛋白的n-端包含两个高可变区(hvr)，分别是hvr1和hvr2，这两个区域处于蛋白表面，研究表明丙肝的慢性感染和病毒逃逸与这两个区域密切相关。目前，得到广泛认可的广谱中和性抗原表位是ar3表位，其包含三个不连续氨基酸区段(396-424，436-447和523-540位氨基酸)。综上，针对丙型肝炎病毒e2蛋白而开发的全人单克隆抗体，未来在hcv的预防及治疗中必将产生重要的作用。技术实现要素：本发明的目的在于提供抗丙型肝炎病毒的全人单克隆中和抗体。本专利提供了关于人类抗丙型肝炎病毒e2单克隆抗体的组成和方法。该专利发明的抗体结合在hcve2蛋白 的保守和必要区域，中和丙肝病毒，并且包含了多个丙型肝炎病毒基因型。该发明的具体体现包括了单独的抗体及其衍生品和片段，由一个或多个人类抗丙型肝炎病毒单克隆抗体组成的药物制剂；以及生产这些单克隆抗体的细胞株。并且提供的cdr氨基酸序列，这些序列赋予这些单克隆抗体的结合特异性。这些序列以及与本专利发明的单克隆抗体结合的同源抗原表位，可以用来识别其他特定的结合并中和hcv的抗体；预防与hcv病毒相关的疾病的免疫治疗方法，包括但不限于中和与肝移植相关的病毒。热门的疗法包括抗hcv疗法的联合疗法，例如特定结合一个不同抗原表位的单克隆抗体，而非本专利发明的抗体，小分子抗病毒药物，干扰素等。抗原的成分已经提供，包括全部或部分的hcve2蛋白，该蛋白中特定高度免疫原性的氨基酸分子片段，对抗体的抗病毒功能至关重要，因此不容易产生病毒逃逸突变体和选择性改变。这样的多肽通常是连续e2序列上至少约50个氨基酸，至少约100个氨基酸，至少约200个氨基酸，或者多达完整的e2蛋白。这些抗原在筛选实验中发现用途，可以作为丙肝疫苗成分刺激产生抗丙肝抗体。在本发明的第一方面，提供一种分离的结合分子，所述结合分子包含seqidno:8所示重链cdr1、seqidno:9所示重链cdr2和seqidno:10所示重链cdr3。在本发明的另一方面，提供一种分离的结合分子，所述结合分子包含seqidno:14所示轻链cdr1、seqidno:15所示轻链cdr2和seqidno:16所示轻链cdr3。在本发明的另一方面，提供一种分离的结合分子，所述结合分子包含以下的氨基酸序列：seqidno:8所示的重链cdr1，seqidno:9所示的重链cdr2和seqidno:10所示的重链cdr3，seqidno:14所示的轻链cdr1，seqidno:15所示的轻链cdr2和seqidno:16所示的轻链cdr3。在一个优选例中，所述的结合分子包含重链可变区，所述的重链可变区具有seqidno:2所示的氨基酸序列。在另一优选例中，所述的结合分子包含轻链可变区,所述的轻链可变区具有seqidno:4所示的氨基酸序列。在另一优选例中，所述的结合分子包含重链可变区和轻链可变区，其重链可变区和轻链可变区分别具有seqidno:2和seqidno:4所示的氨基酸序列。在另一优选例中，所述的结合分子是完整的免疫球蛋白，或者是单克隆抗体或嵌合抗体。在另一优选例中，所述的结合分子是fab、f(ab’)、f(ab’)2、fv、dab、fd、互补决定 区(cdr)片段、单链抗体(scfv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体；优选的，所述的结合分子是人单克隆抗体。更优选地，所述的结合分子还包含人源的恒定区igh序列和igkappa序列。更优选的，所述的人单克隆抗体其重链可变区和轻链可变区分别具有seqidno:2和seqidno:4所示的氨基酸序列，其重链恒定区选择下组中重链类型之一的恒定区：iggl、igg2a、igg2b、igg3和igg4，和其轻链恒定区选择下组轻链类型的恒定区之一：κ链和λ链；更优选的，所述的人单克隆抗体其重链可变区和轻链可变区分别具有seqidno:2和seqidno:4所示的氨基酸序列，其重链恒定区和轻链恒定区分别具有genebank号ack87036和ack87038所示的氨基酸序列。在另一优选例中，前面任一所述的结合分子能识别并结合丙型肝炎病毒的包膜蛋白(e2蛋白)中的表位。在发明的另一方面，提供编码所述的结合分子的核酸分子。在发明的另一方面，提供前面任一所述的结合分子在制备用于检测、治疗和/或预防丙型肝炎病毒感染的药物中的用途。在发明另一方面，提供一种表达载体,所述表达载体中含有编码前面任一所述的结合分子的dna。在本发明另一方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有所述的表达载体。在发明另一方面，提供一种组合物,它含有前面任一所述的结合分子，以及药学上可接受的载体。在发明另一方面，提供一种检测丙型肝炎病毒的试剂盒，其包括前面任一所述的结合分子。在一个优选例中，所述的试剂盒还包括：抗原或抗体包被用试剂，洗涤试剂，第二抗体，标记物(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β-d-半10乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶)，显色剂酶底物等。在发明一方面，提供一种抑制丙型肝炎病毒的方法(较佳地为非治疗方法)，利用前 面任一所述的结合分子来抑制丙型肝炎病毒。在发明另一方面，提供一种检测丙型肝炎病毒的方法(优选非诊断方法)，利用前面任一所述的结合分子与待测样品进行接触，通过检测所述的结合分子与受试样品的结合情况，获得丙型肝炎病毒的存在情况以及存在量。在一个优选例中，所述的丙型肝炎病毒是1a亚型、1b亚型、2a亚型病毒、2b亚型、3a亚型、4a亚型、5a亚型、6a亚型或7a亚型。在一个优选例中,所述的丙型肝炎病毒1a亚型包括：h77毒株；或所述的丙型肝炎病毒1b亚型包括：pr52b6m毒株、pr79毒株、pr26c3m20毒株、con1毒株、hcr6毒株、pr52毒株、pr26毒株、pr79毒株；或所述的丙型肝炎病毒2a亚型包括：d183毒株、jfh1毒株、pr63毒株；或所述的丙型肝炎病毒2b亚型包括：j8毒株；或所述的丙型肝炎病毒3a亚型包括：patient288毒株、s52毒株；或所述的丙型肝炎病毒4a亚型包括：ed43毒株；或所述的丙型肝炎病毒5a亚型包括：sa13毒株；或所述的丙型肝炎病毒6a亚型包括：hk6a毒株、74毒株；或所述的丙型肝炎病毒7a亚型包括：qc69毒株。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明通过参照对本发明的实施方案的图示说明可以更好地理解本发明，在附图中：图1、facs流式细胞仪分选特异性b细胞的分选图。图2、β-actin内参的pcr扩增产物的电泳结果。图3、重链基因的pcr扩增产物的电泳结果。图4、轻链基因的pcr扩增产物的电泳结果。图5、若干种全人单克隆抗体(包括8d6)抗原抗体特异性检测。图6、全人单克隆抗体(8d6)对于hcv真病毒(1b亚型pr26c3m、pr52b6m、pr79三个毒株；2a亚型pr79、jfh1毒株)的中和活性检测。图7、抗hcve2的中和性全人单抗1f2对于hcv真病毒的中和活性检测。图8、elisa验证8d6与不同基因型的hcv毒株的表面糖蛋白e2的结合活性。具体实施方式本发明人经过广泛而深入的研究，获得一种含有独特的互补决定区(cdr区)的抗丙型肝炎病毒广谱中和抗体，优选全人单克隆抗体(8d6)，该结合分子对于丙型肝炎病 毒具有显著的中和作用。在此基础上完成了本发明。结合分子本发明提供了能特异性结合丙型肝炎病毒的结合分子。优选地，所述结合分子是人结合分子。本发明的结合分子呈现对于丙型肝炎病毒的中和活性。本发明的结合分子可以是完整的免疫球蛋白分子，所述结合分子可以是单克隆抗体或嵌合抗体，所述结合分子也可以是抗原结合片段，包括但不限于fab、f(ab’)、f(ab’)2、fv、dab、fd、互补决定区(cdr)片段、单链抗体(scfv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体以及至少含有足以赋予与丙型肝炎病毒毒株的特异性抗原结合的(多)肽或其片段。本发明的结合分子也可以特异性结合丙型肝炎病毒的一或多个片段。对于治疗和/或预防丙型肝炎病毒的方法而言，所述结合分子优选能特异性结合丙型肝炎病毒的表面可及蛋白质。在特定的实施方案中，本发明的结合分子能特异性结合丙型肝炎病毒的e2分子。本发明还提供了所述的结合分子在制备诊断、预防和/或治疗丙型肝炎病毒感染的药物中的应用。本发明提供了可以中和导致丙型肝炎的丙型肝炎病毒感染的结合分子。cdr区是免疫学感兴趣的蛋白质的序列。在本发明的实施方案中，结合分子可包含本文揭示的二、三、四、五或者所有六个cdr区。优选地，本发明结合分子包含本文揭示的至少两个cdr。本发明的另一方面包括本文所述结合分子的功能变体。如果变体能与亲代结合分子竞争特异性结合丙型肝炎病毒或其蛋白片段，则认为该变体分子是本发明结合分子的功能变体。换句话说，所述功能变体仍能结合丙型肝炎病毒e2蛋白或其片段。功能变体包括但不限于一级结构序列基本相似、但是含有例如在亲代结合分子中发现的体外或体内化学和/或生物化学修饰的衍生物。这种修饰包括乙酰化、酰化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共价附着、脂质或者脂质衍生物的共价附着、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。换句话说，亲代结合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或者含有所述氨基酸序列的所述结合分子的结合特性，即所述结合分子仍能识别并结合其靶位。所述功能变体可以具有保守序列修饰，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域己知的标准技术导入，例如定向诱变和随机pcr介导的诱变，并且可包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有相似结构或者化学性质的另一氨基酸残 基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族己经在本领域中限定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人员明白也可以使用除了上述家族之外的其它氨基酸残基家族分类方式。另外，变体可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换。相似的小变异也可包括氨基酸缺失或者插入，或者这二者。使用本领域熟知的计算机程序可以发现确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫学活性的指导。此外，功能变体可包含氨基酸氨基或者羧基端或者这两端的截短体。本发明的功能变体与亲代结合分子相比可具有相同或不同的、更高或更低的结合亲和性，但是仍能结合丙型肝炎病毒或其片段。优选地，可变区包括但不限于构架区、高变区或cdr区的氨基酸序列被修饰。通常，轻链和重链可变区包含三个高变区，包括三个cdr，以及更保守的区域，即所谓的构架区(fr)。高变区包含来自cdr的氨基酸残基和来自高变环的氨基酸残基。在本发明范围内的功能变体与本文所述亲代结合分子具有至少大约50％至大约99％、优选至少大约60％至大约99％、更优选至少大约70％至大约99％、甚至更优选至少大约80％至大约99％、最优选至少大约90％至大约99％、特别是至少大约95％至大约99％，以及特别是至少大约97％至大约99％的氨基酸序列同源性。本领域技术人员已知的计算机算法如gap或者bestfit可用于最佳地排列氨基酸序列以进行对比以及明确相似或相同的氨基酸残基。功能变体可以通过使用本领域己知的普通分子生物学方法改变亲代结合分子或其一部分而获得，所述方法包括但不限于易错pcr、寡核苷酸指导的诱变、定点诱变以及重链和/或轻链改组法。在一个实施方案中，本发明的功能变体对于丙型肝炎病毒具有中和活性。所述中和活性与亲代结合分子相比可以相同或者更高或更低。此后，当使用术语(人)结合分子时，其也涵盖所述(人)结合分子的功能变体。作为本发明的优选方式，所述的结合分子是单克隆抗体，优选它包括人源的恒定区(如人源恒定区igh序列和igkappa序列)。所述的抗丙型肝炎病毒单克隆20抗体的重链可变区、轻链可变区以及位于重链可变区和轻链可变区的互补决定区(cdr)均具有独特的不同于现有技术的结构，且它们是全人源的。本发明包括：具有所述单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体，具有所述单克隆抗体可变区链的单克隆抗体。本发明还包括具有含所述的互补决定区(cdr)的轻链和重链的任何抗体，以及cdr区与本发明的单克隆抗体的cdr具有90％以上(较佳地95％以上)的同源性的任何抗体。抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为互补决定区(complementaritydeterminingregion，cdr)，所述的cdr区将可变区间隔成4 个框架区域(fr)，4个fr的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些cdr形成环状结构，通过其间的fr形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的cdr和相应轻链上的cdr构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了fr或cdr区域。对于本发明的单克隆抗体重链和轻链序列，可以用常规方法测定。经验证，本发发明的抗丙型肝炎病毒单克隆抗体的cdr区是全新的，其针对的是一个独特的丙型肝炎病毒e2蛋白上的抗原表位，技术构思不同于现有的抗丙型肝炎病毒抗体。本发明的单克隆抗体是全人源的，其重链、轻链可变区以及恒定区均来源于人抗体。因此，其在具有特别优异的识别和中和丙型肝炎病毒的作用的同时，还具有免疫原性低、安全性高的特点。在本发明的实施例中，从近年感染丙型肝炎病毒的志愿者体内获得外周血单个核细胞(pbmc)，使用cd19+/igg+/hcv-e2为特异性标志物，经流式细胞仪分选(facs)获得识别丙型肝炎病毒e2蛋白的特异性b细胞。使用文献已报道的单细胞rt-pcr技术(journalofimmunologicalmethods329(2008)112–124)，获得了抗体基因，并在293t细胞中进行表达获得全人单克隆抗体8d6。真病毒(hcvcc)中和试验表明，8d6抗体在较低浓度下(0.4μg/ml以下)对于一些hcv真病毒具有超过90％的抑制率。由此可见，8d6抗体具有较强的亲和力和中和活性，具有临床上预防和治疗丙型肝炎病毒感染的可能。另一方面，本发明包括免疫缀合物，即包含本文所述至少一个结合分子以及进一步包含至少一个标记如可检测的部分/物质的分子。本发明还涉及本发明免疫缀合物的混合物或者至少一种本发明免疫缀合物与另一分子的混合物，所述另一分子如治疗剂或者另一结合分子或免疫缀合物。本发明的免疫缀合物可包含一个以上的标记。这些标记可以彼此相同或不同，并且可以与结合分子非共价地结合/缀合。所述标记也可以通过共价键与人结合分子直接结合/缀合。或者，所述标记可以通过一或多种连接化合物与所述结合分子结合/缀合。标记与结合分子的缀合技术为本领域技术人员所熟知。本发明的免疫缀合物的标记可以是治疗剂，但是它们也可以是可检测的部分/物质。适于治疗和/或预防的标记可以是毒素或者其功能部分、抗生素、酶、增强吞噬作用或者免疫刺激作用的其它结合分子。包含可检测物质的免疫缀合物可诊断性地用于例如评定对象是否己经感染丙型肝炎病毒毒株或者作为临床实验程序的一部分监测丙型肝炎病毒感染的发生或进展以例如确定指定治疗方案的功效。然而，它们也可以用于其它检测和/或分析和/或诊断目的。可检测的部分/物质包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。为了检测和 /或分析和/或诊断目的用于标记结合分子的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术、激光扫描细胞计量术检测、荧光免疫测定、酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)、生物测定(例如吞噬作用测定)、蛋白质印迹应用等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。此外，本发明的人结合分子或者免疫缀合物也可以附着于固体支持物上，特别用于丙型肝炎病毒e2蛋白或其片段的体外免疫测定或者纯化。这种固体支持物可以是多孔或者无孔的、平面或非平面的。本发明的结合分子可以与标记序列融合以便于纯化。所述标记序列的例子包括但不限于六组氨酸标记、myc标记或者flag标记。或者，一种抗体可以与另一种抗体缀合形成抗体异源缀合物(hetero-conjugate)。另一方面，本发明的结合分子可以与一或多个抗原缀合/附着。优选地，这些抗原是由给予了结合分子-抗原缀合物的对象的免疫系统识别的抗原。所述抗原可以彼此相同，但也可以是不同的。使附着抗原和结合分子的缀合方法为本领域所熟知，包括但不限于使用交联剂。本发明的结合分子结合丙型肝炎病毒并且附着于结合分子的抗原将引发对于所述缀合物的有力t细胞攻击，最终导致丙型肝炎病毒的破坏。除了通过直接或间接(例如通过接头)缀合而化学产生免疫缀合物之外，所述免疫缀合物可以作为融合蛋白而产生，所述融合蛋白包含本发明的结合分子及合适的标记。融合蛋白可以通过本领域已知方法产生，例如通过构建核酸分子以及随后表达所述核酸分子而重组产生，所述核酸分子包含符合读框的编码结合分子的核苷酸序列以及编码合适标记的核苷酸序列。本发明另一方面提供了编码本发明的至少一种结合分子、其功能变体或者免疫缀合物的核酸分子。这种核酸分子可以用作中间物以进行克隆，例如用于如上述的亲和力成熟方法中。在一个优选的实施方案中，所述核酸分子是分离或纯化的。dna分子的序列可以用常规技术，或利用杂交瘤技术获得。本领域技术人员将意识到这些核酸分子的功能变体也是本发明的一部分。功能变体是这样的核酸序列，通过使用标准遗传密码可以将其直接翻译以提供与从亲代核酸分子中翻译的序列相同的氨基酸序列。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的结合分子(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的结合分子的序列中。本发明还涉及包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。优选的，本发明的载体是例如含病毒启动子的质粒表达载体，且在所述表达载体中分别插入了抗丙型肝炎病毒单克隆抗体重链可变区(vh)与恒定区的igh(来自人源igh的恒定区)融合序列和轻链可变区vl与人体igkappa(来自人源igkappa的恒定区)融合序列。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：细菌细胞如大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇s2或sf9；动物细胞如cho、cos7、nso或bowes黑素瘤细胞等。特别适用于本发明的宿主细胞是真核宿主细胞，尤其是哺乳动物细胞，如293细胞。用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，或常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的结合分子。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法诱导(如温度转换或化学诱导)选择的启动子，将细胞再培养一段时间。本发明的结合分子优选的是采用哺乳动物细胞来生产，哺乳动物细胞通常需要在含血清的培养基中进行培养。需要对细胞进行无血清的适应过程后，方可让细胞在无血清培养基中正常的生长。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。本发明的结合分子也可以在转基因非人哺乳动物如兔、山羊或者牛中产生，并且分泌进例如其乳中。药物组合物本发明的结合分子可用于制备抑制丙型肝炎病毒的组合物。基于本发明的新发现，还提供了一种可抑制丙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染疾病的组合物，其包含：有效量的本发明所述的结合分子；以及药学上可接受的载体。本文用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的结合分子相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。本发明的组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。本发明的结合分子可以以分离的或者分离的形式使用。此外，发明的结合分子可以单独应用或者于包含至少一种本发明的结合分子(或其变体或片段)的混合物中应用。换句话说，所述结合分子可以组合应用，例如作为包含两或更多种本发明的结合分子、其变体或片段的药物组合物。例如，具有不同但互补活性的结合分子可以组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用，但是或者也可以将具有相同活性的结合分子组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用。任选地，所述混合物进一步包含至少一种其它治疗剂。优选地，所述治疗剂如利巴韦林，可用于预防和/或治疗丙型肝炎病毒感染。所述药物组合物可包含两或多个对于丙型肝炎病毒具有中和活性的结合分子。在一个实施方案中，当组合应用时，所述结合分子呈现协同中和活性。换句话说，所述组合物包含至少两种具有中和活性的结合分子，特征在于所述结合分子在中和丙型肝炎病毒中起协同作用。如本文所用，术语“协同”是指当组合应用时，结合分子的组合作用高于单独应用时的加合作用。所述协同作用的结合分子可以结合丙型肝炎病毒的相同或不同片段上的不同结构。计算协同作用的方式是通过组合指数计算。组合指数(ci)的概念己经由chou andtalalay(1984)描述。本发明的结合分子或药物组合在用于人体之前可以在合适的动物模型系统中检测。这种动物模型系统包括但不限于小鼠、雪貂(ferret)和猴。抗丙型肝炎病毒的小分子化合物也可以协同作用。可以调整给药方案以提供最佳的所需应答(例如治疗应答)。合适的剂量范围可例如是0.01-100mg/kg体重，优选0.1-15mg/kg体重。此外，例如可以给予一次推注、随时间给予多次分开剂量或者根据治疗情况的紧急性而可以按比例降低或增加剂量。本发明的分子和组合物优选是无菌的。使得这些分子和组合物无菌的方法为本领域所熟知。用于诊断、预防和/或治疗的其它分子可以以本发明的结合分子相似的给药方案给予。如果单独给予其它分子，则可以在给予本发明的一或多种人结合分子或药物组合物之前、同时或者之后给予患者。对于人患者的精确给药方案通常在临床实验期间挑选出。检测试剂和试剂盒本发明的结合分子可用于制备检测丙型肝炎病毒的试剂或试剂盒。如本文所用，术语“待测样品”涵盖了多种样品类型，包括生物学来源的血液及其它体液样品，实体组织样品如活检组织样品或者组织培养物，或者衍生自其中的细胞或者其后代。该术语还包括在获得后已经通过任何方式处理的样品，例如用试剂处理、溶解、或者富集某些成分如蛋白质或者多核苷酸。该术语涵盖了得自任何物种的各种临床样品，也包括培养的细胞、细胞上清和细胞溶解产物。以所述的结合分子为基础，可制备方便、快速且准确地检测丙型肝炎病毒的试剂盒。因此，本发明提供了一种用于检测样品中是否存在丙型肝炎病毒的检测试剂盒，该试剂盒中含有本发明的抗丙型肝炎病毒的结合分子。在获得了本发明提供的结合分子后，可以方便地制备出用于特异性检测丙型肝炎病毒的检测试剂盒。作为本发明的一种检测方式，采用间接elisa法，将待测的抗原包被于固相载体上，利用本发明的结合分子进行检测。作为本发明的一种优选方式，所述的结合分子是抗体，可根据双抗夹心法的原理来检测。双抗夹心法常规的做法是将一抗(如本发明的单克隆抗体)固定于载体，然后使一抗与抗原反应，洗涤后再与二抗反应(所述的二抗携带可检测信号，或可与携带可检测信号的物质结合)，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。双抗夹心法特别适用于具有两个或两个以上表位的抗原的检测。为了在检测时更方便，所述试剂盒中除了含有本发明的结合分子以外，还可以包含其它检测试剂或辅助试剂，所述的辅助试剂例如是elisa试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的，如显色剂、标记物、 二抗、抗抗体、增敏剂等。本领域人员应理解，各种变化形式的检测试剂盒均是包含在本发明中的，只要在其中利用了本发明的结合分子作为识别丙型肝炎病毒的试剂。此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方法。在获得了本发明提供的结合分子和/或试剂盒后，可以利用多种免疫学相关方法来检测样品中e2蛋白或其含量，从而得知待测样品的供体是否感染丙型肝炎病毒，这些方法均被包含在本发明中。较佳地，所述的方法是以非疾病诊断为目的的。作为一种优选方式，本发明提供一种体外(非诊断或治疗性地)检测丙型肝炎病毒的方法，包括以下步骤：(a1)将待测样品包被于固相载体；(a2)将本发明的结合分子加样于(a1)的固相载体，从而使待测样品中的丙型肝炎病毒与结合分子结合，形成带有“丙型肝炎病毒－本发明的结合分子”二元复合物的固相载体；(a3)将特异性结合本发明的结合分子的检测物加样于(a2)的固相载体，形成带有“丙型肝炎病毒－本发明的结合分子-检测物”三元复合物的固相载体；所述的检测物上携带一标记物；(a4)检测三元复合物中的标记物，确定待检测样品中丙型肝炎病毒的存在与否以或存在的量。按照上述方法，只要设置已知浓度的抗原对照，制作浓度标准曲线，通过比照浓度标准曲线就可以得出待测样品中的丙型肝炎病毒含量。本发明的主要优点在于：1)提供了一种全新的结合分子，其是全人源的，与其它动物源性(如鼠源性)抗丙型肝炎病毒的分子相比，免疫原性大大减少，且亲和性良好。不仅治疗效果好，而且副作用低。2)本发明的结合分子能够结合具有天然构象的丙型肝炎病毒e2亚基，阻止丙型肝炎病毒侵染易感细胞。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。i.材料和方法以下说明本发明，即一株能够中和丙型肝炎病毒的全人单克隆抗体制备过程以及抗体 特性分析过程。分为两部分：(1)单细胞rt-pcr法获得抗体基因以及抗体表达制备；(2)抗体特性分析。具体过程如下:1.外周血单核细胞(pbmc)的获得从已感染丙型肝炎病毒的志愿者体内抽取外周血，采用常规ficoll-paque(厂家为-h(cedarlane)公司)密度梯度离心，得到107以上个外周血单核细胞(pbmc)。ficoll分离方法：(1)收集血液，于50ml离心管(预含4％柠檬酸钠1ml)，收集全血10ml，颠倒混匀8-10次。(即使柠檬酸钠终浓度为0.4％)；(2)加等体积rpmi1640(含柠檬酸钠)，混匀；(3)用15ml透明离心管，铺3ml淋巴细胞分离液，在其上小心加6ml血样。形成分离界面(或4ml分离液加8ml血样)；(4)室温离心800g，20min(2000rpm，20min)；(5)小心吸取界面层细胞，转移至新管；(6)加rpmi1640(含柠檬酸钠)，稀释减小液体密度。离心，800g/2000rpm，10min。去上清；(7)rpmi1640洗细胞2-3次，备用。2.e2蛋白特异性记忆b细胞分选使用fitc-cd19/apc-igg/cy3-hcv-e2为标志物，经流式细胞仪获得特异性b细胞至96孔rt-pcr板，每孔一个细胞，获得e2蛋白特异性记忆b细胞。1)丙型肝炎病毒包膜蛋白e2(hcv-e2)由哺乳动物细胞cho表达系统表tmmaxchoexpressionsystem手册；2)e2蛋白进行生物素(biotin)标记：no-weighsulfo-nhs-lc-biotin(购自pierce，参考pierce公司ez-linksulfo-nhs-lc-biotin生物素标记protocol)10mm试剂；另两个标志物fitc-cd19和apc-igg均购自bdbioscience公司；3)分选细胞的标记：pbmc细胞分组，实验组+对照组，按细胞数加入标志物，避光染色，进行标记，用pbs重悬后，使用40μmbdfalcon滤膜过滤；4)特异性b细胞的分选：使用bdfacsariaii筛选，根据前向角和侧向角从pbmc中筛选到淋巴细胞，然后通过不同对照组的调节补偿，获得丙肝e2蛋白的特异性记忆b细胞，将其分选到96孔板中进行rt-pcr(反转录pcr)，每孔一个细胞，板置于干冰上。3.抗体基因根据文献journalofimmunologicalmethods329(2008)112-124中报道的方法，获得抗体基因。获得的抗体基因连接pgemt载体(购自invitrogen公司)，进行测序(华大基因测序公司)，常规方法验证抗体基因。然后将重、轻链基因分别连接表达载体abvec-higg和abvec-higkappa(kennethsmithetal.rapidgenerationoffullyhumanmonoclonalantibodiesspecifictoavaccinatingantige.natprotoc.2009；4(3):372-384)。4.抗体表达将前述插入了重链和轻链基因的表达载体采用脂质体法瞬时转染293t细胞，进行全人抗体表达(参考lipofectamine2000转化手册)。(1)在转染前一天将1.0×106细胞接种到6细胞培养板中；(2)a管：500μlopti-mem+4μgigg+4μgigl；(3)b管：500μlopti-mem+20μllipofectaminereagent；(4)静置5分钟后，将a管与b管混合，在室温静置20min；(5)a、b管混合物加入细胞培养盘中，37℃孵育6h；(6)6h后，吸除含有lipofectaminereagentdna的培养液，每孔加入2mlfreestyletm293expressionmedium；(7)72h后，收集细胞上清，4℃，3000rpm，5min。5.抗原特异性检测检测表达的全人抗体是否识别hcv-e2(由哺乳动物细胞cho表达系统表达；参考freestylemaxchoexpressionsystem手册)，以及与抗原的结合能力。(1)包被hcv-e2于elisa板(购自nunc公司)，10μg/ml，每个样品两个复孔，每孔100μl，4℃过夜；(2)pbst洗板，3次；(3)封闭：1％bsa，每孔200μl，37℃，2h；(4)pbst洗板，3次；(5)根据测定浓度，调整全人抗体细胞上清至相同浓度，每孔100μl，hcv病人血浆为阳性对照，37℃，2h；(6)pbst洗板，3次；(7)goatanti-humanigg(fcspecific)-peroxidaseantibody，1:10000稀释，每孔100μl，加到样品和阳性对照的elisa板中，37℃，1h；(8)pbst洗板，3次；(9)底物a液:b液＝1:1，底物为tmb,3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(购自sigma，使用方法按产品说明)。每孔100μl，37℃，15min，避光反应；(10)加入2mh2so4，每孔50μl；(11)用分光光度计测定450nm波长下的吸光度(即od450)，并进行数据处理。6.抗体中和活性测定——真病毒中和试验1)消化huh7.5.1细胞，用含有10％血清的dmem重悬，以105个/ml的密度铺在96孔板上，培养12-24h，2)用含有10％血清的dmem培养液把病毒稀释到1-2×103个ffu/ml，加上适量的抗体，在37℃孵育1h，3)把培养huh7.5.1的96孔板中的培养液吸出，加入抗体孵育过的病毒100ul。24h后换成新鲜的含10％血清的dmem培养液，继续培养48h，4)加入100ul的pfa固定细胞，室温静置30min，5)加入含有0.3％tritonx-100，3％bsa，10％fbs的pbs，室温孵育1h，6)加入anti-ns3(或ns5a，或core)蛋白的一抗室温孵育1.5h，7)用pbs洗3次，每次5min，8)加入anti-mouse的荧光二抗，室温孵育1h，9)用pbs洗3次，每次5min，10)在荧光显微镜下观察记录每孔内病毒感染的细胞集落数目。ii.实施例实施例1、hcv-e2蛋白特异性记忆b细胞使用fitc-cd19/apc-igg/cy3-hcv-e2为特异性标志物，获得了若干个hcv-e2蛋白的特异性b细胞，见图1。实施例2、抗体基因rt-pcr和nested-pcr法获得抗体重轻链可变区基因，分子量为400bp左右，β-actin作为内参(343bp)，电泳图谱见图2，图3和图4。将来源于同一个b细胞抗体重轻链基因可变区连接t载体，测序并进行表达载体构建。8d6重链可变区基因序列如下(seqidno:1)：gaggtgcagctggtgcagtctgggtctgagttgaagaagcctggggcctcactgaagctctcctgcaaggcttctggatacacctacattacccctgccatgaac(cdr1)tgggtgcgacaggcccctggacatgggcttgagtggatgggaggaatcaacaccaacactgggaacccaacctatgcccagggcttcgcagga(cdr2)cggtttgtcttctcctgggacacctctgtcagcacggcatatctgcatatcagcagcctaaagactgaggacactgccgtctattactgtgcggacacccgaatcttttcttgtcggcgtggaacgtgctatggtggtttcgatgtc(cdr3)tggggccaagggacaatggtcaccgtctcttcag备注：其中使用下划线标注的为重链基因可变区中的高变区序列，依次为重链基因cdr1(seqidno:5)，cdr2(seqidno:6)，cdr3(seqidno:7)序列。8d6重链可变区氨基酸序列如下((seqidno:2)：evqlvqsgselkkpgaslklsckasgytyitpamn(cdr1)wvrqapghglewmggintntgnptyaqgfag(cdr2)rfvfswdtsvstaylhisslktedtavyycadtrifscrrgtcyggfdv(cdr3)wgqgtmvtvss备注：其中使用下划线标注的依次为重链氨基酸cdr1(seqidno:8)，cdr2(seqidno:9)，cdr3(seqidno:10)序列。8d6轻链可变区基因序列如下(seqidno:3)：gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagaatcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcaactttttaaat(cdr1)tggtttcagcatagaccggggaaagcccctaaactcctgatctatggtgcaaccattttgcaaagt(cdr2)ggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagagtgacagtagtacctacatc(cdr3)tttggccaggggaccaaggtggaaatcaaac备注：其中下划线标注的为轻链基因可变区中的高变区序列，依次为cdr1(seqidno:11)，cdr2(seqidno:12)，cdr3(seqidno:13)序列。8d6轻链可变区氨基酸序列如下(seqidno:4)：diqmtqspsslsasvgdrititcrasqsisnfln(cdr1)wfqhrpgkapklliygatilqs(cdr2)gvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsdsstyi(cdr3)fgqgtkveik备注：其中使用下划线标注的依次为轻链氨基酸cdr1(seqidno:14)，cdr2(seqidno:15)，cdr3(seqidno:16)序列。实施例3、抗体的抗原特异性elisa结果表明，8d6全人抗体对于cho表达的hcv-e2具有特异性结合能力。如图5所示，此实验，用感染过hcv的病人血浆作为阳性对照，用细胞培液和一株流感病毒抗体1f2(参见文献fullyhumanbroadlyneutralizingmonoclonalantibodiesagainstinfluenzaavirusesgeneratedfromthememorybcellsofa2009pandemich1n1influenzavaccinerecipient.huw，chena，miaoy，xias，lingz，xuk，etal.virology.2013jan20；435(2):320-8.doi:10.1016/j.virol.2012.09.034.)作为阴性对照。实施例4、抗体的中和活性全人单克隆抗体(8d6)使用293t细胞进行表达，表达纯化后将其浓度调整为50μg/ml、10μg/ml、2μg/ml、0.4μg/ml和0.08μg/ml进行真病毒中和试验测定其中和活性，即对hcv真病毒的抑制率。用于实验的真病毒包括：pr52b6m、pr79、jfh1(国际通用标准毒株)、pr26c3m、d183(2a)(国际通用标准毒株)，上述真病毒株均获自中国科学院上海巴斯德研究所。如图6-7所示，相比于阴性对照(一株流感病毒ha蛋白的中和性全人单抗1f2)，实验组(抗丙肝病毒e2蛋白的全人单抗8d6)对于1b亚型中pr52b6m、pr79两个毒株以及2a亚型中d183、jfh1两个毒株hcv真病毒，在浓度大于0.4μg/ml时，具有超过90％的抑制率，对于另一株1b亚型毒株pr26c3m在10μg/ml以上是有超过90％的抑制率。实施例5、elisa验证8d6与不同基因型的hcv毒株的表面糖蛋白e2的结合活性用293t细胞表达来自不同基因型的hcv的表面糖蛋白e2(表1，且c端带有6×histag)，收细胞上清，加入到预包被8d6抗体的96微孔板中，37℃孵育两个2小时，洗去杂蛋白后，用mouse-antihistag的单克隆抗体进行检测。用分光光度计测定450nm波长下的吸光度(即od450)，并进行数据处理。表1、不同基因型的hcv的表面糖蛋白e2的genbank登录号病毒株(基因型)表面糖蛋白e2genbank登录号h77(1a)jf343780.2con1(1b)aj238799.1hcr6(1b)ay045702.1pr52(1b)hq912958.1pr26(1b)hq912956.1pr79(1b)hq912959.1jfh1(2a)ab047639.1j8(2b)jf343783.1patient28(3a)gq356213.1ed43(4a)jf343785.1sa13(5a)jf343786.1hk6a(6a)jf343787.174(6a)dq480524.1qc69(7a)fj230884.1结果如图8，可见8d6抗体对于不同基因型的hcv具有广谱的结合活性。实施例6、真病毒水平上进行抗体微中和活性测定不同亚型的hcv病毒(表2)颗粒与梯度稀释的8d6抗体在室温孵育1个小时，然后加入到huh-7.5细胞中进行孵育，3个小时孵育后，吸走细胞上清，加入新鲜的细胞培养液，再额外孵育72小时。被hcv感染的细胞用4％的多聚甲醛固定后，通过确定带有荧光的细胞集落数量检测ns5a的表达水平，进而反应细胞被hcv感染的情况。抗体的ic50值即病毒的感染被抑制50％时抗体的浓度，通过统计学软件进行分析。表2、不同hcv毒株的相关信息亚型病毒genbank登陆号1ah77jf343780.21bcon1aj238799.11bpr26hq912956.11bpr52hq912958.11bpr79hq912959.12ajfh7ab047639.12apr63kf6763512bj8jf343783.13as52jf343784.24aed43jf343785.25asa13jf343786.26ahk6ajf343787.27aqc69fj230884.18d6抗体的ic50值结果如表3。表3、用细胞培养的hcv真病毒体系验证8d6的微中和活性由表3可见，8d6在较低浓度时就具有良好的微中和活性，且中和活性具有广谱性。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落本申请所附权利要求书所限定的范围。当前第1页12