用于产生针对细胞相关抗原如P2X7、CXCR7或CXCR4的免疫球蛋白的基因免疫的制作方法

本申请是申请日为2009年12月21日、发明名称为“用于产生针对细胞相关抗原如p2x7、cxcr7或cxcr4的免疫球蛋白的基因免疫”的中国专利申请no.200980151192.3的分案申请。

发明领域

本发明涉及用于产生针对细胞相关抗原、更具体地是膜锚定的抗原的免疫球蛋白序列的方法。本发明还提供可通过本发明的方法获得的免疫球蛋白序列。具体地，本发明涉及利用dna疫苗接种产生免疫球蛋白序列。更具体地，本发明涉及通过dna疫苗接种在骆驼科动物中产生免疫球蛋白序列，所述免疫球蛋白序列优选地针对细胞相关抗原，特别是具有多个跨膜结构域的抗原，包括gpcrs和离子通道。此外，本发明涉及针对细胞相关抗原的所述免疫球蛋白序列，更具体地，针对膜锚定的抗原的所述免疫球蛋白序列，所述抗原诸如例如，gpcrs和离子通道，更优选的是离子通道。

细胞相关抗原，更具体是具有单个或多个跨膜结构域的那些，难以以其天然构象纯化。为了鉴定能够在体内修饰靶标功能的针对天然表位的抗体(或抗体片段，诸如纳米抗体)，将靶抗原以其天然构象施用至骆驼科动物是非常重要的[dormitz等.(2008).trendsinbiotechnology(生物技术趋势)26:659-667]。在不存在纯化的这些细胞相关抗原的天然蛋白时，最适用的免疫策略由以规则的时间间隔重复注射功能性表达所选抗原的全细胞组成。wo05/044858和wo07/042289中记述了已经成功实施了所述免疫策略(即，导致对中和性、体内成熟的纳米抗体的鉴定)的靶标的实例。然而，重复加强注射表达靶标的细胞通常导致变弱的或不能检测的靶标特异性免疫反应，特别是当所述靶标的表达水平很低且宿主细胞背景是高度免疫原性时。通过使用骆驼来源的细胞系，其对美洲驼(llama)的免疫原性较弱，体液反应可以更集中针对所述靶标。然而，重复注射(准)自体-表面标记还导致针对骆驼细胞系表面标记的反应。

鉴定针对gpcrs、离子通道或任意其它类型的多跨膜细胞表面标记的(中和性)选择性抗体是具有挑战性的[michel等.(2009).naunyn-schmiedarchivespharmacology379:385-388],因为i)最常见的是，没有一种天然蛋白可以用于免疫或随后的抗体鉴定，ii)多跨膜通常表现出较低的免疫原性(由于与大多数单跨膜受体相比，有限数量的细胞外表面暴露的氨基酸残基所导致)，和iii)多跨膜表面分子通常以较低的密度表达。

技术背景

免疫球蛋白序列,诸如抗体和来源于其的抗原结合片段，在研究和治疗性应用中广泛用于特异性靶向其各自的抗原。典型地，抗体的产生包括对实验动物的免疫，生产抗体的细胞的融合以产生杂交瘤和对所需要的特异性的筛选。备选地，可以通过筛选天然或合成的文库，例如，通过噬菌体展示，产生抗体。

已在多种出版物中广泛记述了免疫球蛋白序列如纳米抗体的产生，在所述出版物中，可以示例的有wo94/04678,hamers-casterman等.1993和muyldermans等.2001。在这些方法中，将骆驼科动物用靶抗原免疫，以诱导针对所述靶抗原的免疫反应。进一步筛选由所述免疫获得的所有纳米抗体以获得结合所述靶抗原的纳米抗体。

在这些情形中，抗体的产生需要纯化的抗原以用于免疫和/或筛选。抗原可以从天然来源、或在重组生产过程中进行纯化。

一种重要种类的潜在的治疗靶标是细胞相关抗原，其包括跨膜抗原，特别是具有多个跨膜结构域的跨膜抗原。然而，细胞相关抗原，尤其是膜结合的抗原，难以以其天然构象获得，原因在于它们包埋在细胞膜中或者锚定在细胞膜中。然而，为了获得针对以天然构象存在的表位(即，构象表位，其存在于体内)的免疫球蛋白序列，用处于正确构象的靶抗原进行免疫是关键的。所述构象表位对于产生药用活性免疫球蛋白序列是极为重要的。例如，与离子通道的孔区特异性相互作用的免疫球蛋白序列将影响其传导性，且因此提供药学作用。

免疫和/或筛选免疫球蛋白序列可以使用所述抗原的肽片段进行。然而，所述方法不会提供针对构象依赖型表位的抗体，因为所述表位不能通过短的合成肽而复制。

因此，对于这些细胞相关抗原，用携带所述抗原的全细胞免疫和随后对以这种方式诱导的全体纳米抗体筛选结合所述细胞相关抗原的纳米抗体是一种选择(如例如在wo2005/044858；wo2007/042289；wo2008/074839；wo2009/068625；wo2009/138519中进行的)。然而，所述细胞表达多种抗原，导致主要针对非目的抗原的抗体反应。因此，通过这种方法可获得的抗体反应特征在于低特异性，并且特别地特征在于，在所有产生的抗体中目的抗体的频率极低。因此，这种方法排除了针对目的靶抗原的抗体的有效产生。

因此，本领域没有提供令人满意的产生针对构象表位、特别是膜相关抗原的适当宽度的特异性抗体反应的方法。

发明概述

本发明的目的是克服现有技术的这些缺点。具体地，本发明的目的是提供一种产生针对复杂的抗原如表现构象表位的细胞相关抗原的免疫球蛋白序列的方法。

通过本发明克服了上述问题。已经发现基因疫苗接种可以引起针对构象表位、即针对采用其天然构象的细胞相关抗原的良好特异性和可接受宽度的抗体反应。

本发明涉及下列各项。

用于产生可以结合细胞相关抗原和/或具有针对细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列的方法，所述方法包括下述步骤：

a)用编码所述细胞相关抗原或所述细胞相关抗原的结构域或特定部分的核酸基因疫苗接种非人动物；和

b)任选地用采用其天然构象的所述抗原加强所述动物，所述采用其天然构象的抗原选自包括表达所述细胞相关抗原的天然的或转染的细胞的细胞、细胞来源的膜提取物、携带富集抗原的小泡或任何其它膜衍生物、脂质体或表达所述细胞相关抗原的病毒颗粒；

c)筛选来源于所述非人动物的免疫球蛋白序列的组、集合或文库，以获得可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列。在本发明的具体的实施方案中，所述细胞相关抗原选自跨膜抗原、具有多个跨膜结构域的跨膜抗原，诸如gpcrs或离子通道。按照本发明，所述非人动物可以选自脊椎动物，鲨鱼，哺乳动物，蜥蜴，骆驼科动物，美洲驼，优选骆驼科动物和美洲驼。

在本发明的一个实施方案中,所述免疫球蛋白序列是轻链可变结构域序列(例如，vl-序列)，或重链可变结构域序列(例如，vh-序列)；更具体地，所述免疫球蛋白序列可以是来源于常规4-链抗体的重链可变结构域序列或来源于重链抗体的重链可变结构域序列。

按照本发明，所述免疫球蛋白序列可以是结构域抗体,或适于用作结构域抗体的免疫球蛋白序列，单结构域抗体，或适于用作单结构域抗体的免疫球蛋白序列，"dabs”，或适于用作dabs的免疫球蛋白序列，或纳米抗体，包括但不限于vhh序列，且优选是纳米抗体。

按照本发明，疫苗接种可以通过无针喷射注射(needle-freejetinjection)、通过冲击法、通过针头介导的注射如纹身(tattoo)、通过以贴片将dna局部施用到皮肤上、或通过任意这些施用方法而后通过体内电穿孔进行，并且另外包括通过皮内、肌内或皮下施用dna进行的疫苗接种。

所述免疫球蛋白序列的组、集合或文库可以由所述非人哺乳动物的血液获得。

在本发明中，所述细胞相关抗原可以在允许表达天然构象的抗原的任何细胞背景下表达。所述细胞背景的实例为cho,cos7,hek293,或骆驼科动物来源的细胞。优选地，所述细胞相关抗原是跨膜抗原，其包括但不限于，选自cxcr7,cxcr4和p2x7的抗原。

免疫球蛋白序列的组、集合或文库可以在细胞或病毒的组、集合或样品中表达，并且筛选所述细胞或病毒的组、集合或样品以获得表达可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列的细胞或病毒，更具体地，可以由所述细胞或病毒纯化和/或分离编码可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列的核酸序列，然后表达所述免疫球蛋白序列。

按照本发明，免疫球蛋白序列的组、集合或文库可以由核酸序列的组、集合或文库编码，并且筛选所述核酸序列的组、集合或文库以获得编码可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列的核酸序列；更具体地，可以纯化和/或分离编码可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列的核酸序列，然后表达所述免疫球蛋白序列。

按照本发明，可以纯化和/或分离可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的所述免疫球蛋白序列。

本发明还涉及可通过本发明所述的方法可获得的免疫球蛋白，和包括所述免疫球蛋白序列的组合物，更具体地涉及针对(如本文定义)离子通道和gpcrs的免疫球蛋白序列。

特别地,本发明涉及针对(如本文定义)离子通道的免疫球蛋白序列,以及包括一种或多种所述免疫球蛋白序列或基本上由一种或多种所述免疫球蛋白序列组成的化合物或构建体，且具体是蛋白和多肽(本发明还分别称为“本发明的免疫球蛋白序列”,“本发明的化合物”,和“本发明的多肽”)。本发明还涉及编码所述免疫球蛋白序列和多肽的核酸(本发明还称为“本发明的核酸”或“本发明的核苷酸序列”)；涉及制备所述免疫球蛋白序列和多肽的方法；涉及表达或能够表达所述免疫球蛋白序列或多肽的宿主细胞；涉及包括所述免疫球蛋白序列、多肽、核酸和/或宿主细胞的组合物、且特别是药物组合物；并且涉及所述免疫球蛋白序列或多肽、核酸、宿主细胞和/或组合物的应用，特别是用于预防、治疗或诊断目的，诸如本文提及的预防、治疗或诊断目的的应用。

附图简述

图1.在用pig-jet(图片a)或纹身法(图片b)基因疫苗接种后，在美洲驼中体液免疫反应的动力学。

图2.单次hbsag蛋白加强对dna疫苗接种的美洲驼的影响。图例同图1。

图3.相对于蛋白免疫(美洲驼32和33)，通过“dna”致敏–“蛋白”加强方案(美洲驼124,160,117,203)获得的体液免疫反应。

图4.重链抗体(igg2和3)介导的针对hbsag的抗体反应。

发明详述

本发明包括，但不限于，后附的权利要求书的主题。

a)定义

除非另外指明或定义，所用的所有术语具有本领域常用的意思，这是技术人员所清楚的。例如，参考标准手册，如sambrook等,"molecularcloning:alaboratorymanual(分子克隆：实验室手册)"(第2版),卷1-3,coldspringharborlaboratorypress(冷泉港实验室出版社)(1989)；f.ausubel等,编,"currentprotocolsinmolecularbiology(现代分子生物学方法)",greenpublishingandwileyinterscience,纽约(1987)；lewin,“genesii(基因ii)”,johnwiley&sons,纽约,n.y.,(1985)；old等.,“principlesofgenemanipulation:anintroductiontogeneticengineering(基因操作原理：基因工程入门)”,第2版,universityofcaliforniapress(加利福尼亚大学出版社),berkeley,ca(1981)；roitt等.,“immunology(免疫学)”(第6版),mosby/elsevier,edinburgh(2001)；roitt等.,roitt’sessentialimmunology(roitt’s基础免疫学),第10版.blackwellpublishing,英国(2001)；和janeway等.,“immunobiology(免疫学)”(第6版),garlandsciencepublishing/churchilllivingstone,纽约(2005),以及其中所引用的公知

背景技术：
；

除非另外指明，术语“免疫球蛋白序列”–在本文中不管是用来指重链抗体还是常规4-链抗体–该术语用作概括性术语，包括完整尺寸的抗体，其单条链、以及所有的其部分、结构域或片段(分别包括但不限于，抗原-结合结构域或片段如vhh结构域或vh/vl结构域)。术语抗原-结合分子或抗原-结合蛋白可与免疫球蛋白序列互换使用，并且包括纳米抗体。

在本发明的一个实施方案中,所述免疫球蛋白序列是轻链可变结构域序列(例如，vl-序列),或重链可变结构域序列(例如，vh-序列)；更具体地,所述免疫球蛋白序列可以是来源于常规4-链抗体的轻链可变结构域序列或来源于重链抗体的重链可变结构域序列。

按照本发明，所述免疫球蛋白序列可以是结构域抗体,或适于用作结构域抗体的免疫球蛋白序列，单结构域抗体，或适于用作单结构域抗体的免疫球蛋白序列，"dabs”，或适于用作dabs的免疫球蛋白序列，或纳米抗体，包括但不限于vhh序列，且优选是纳米抗体。

本发明提供的免疫球蛋白序列优选地以基本上分离的形式(如本文定义)存在，或形成本发明的蛋白或多肽的一部分(如本文定义)，其可以包括一种或多种本发明的免疫球蛋白序列或基本上由一种或多种本发明的免疫球蛋白序列组成，并且其可以任选地还包括一种或多种其它的免疫球蛋白序列(所有任选地通过一个或多个适当的接头连接)。例如，并且不限于，所述本发明的一种或多种免疫球蛋白序列可以用作所述蛋白或多肽中的结合单位，其可以任选地包含一种或多种可以作为结合单位的其它免疫球蛋白序列(即，针对除细胞相关抗原以外的一种或多种其它靶标)，从而分别提供本发明的单价、多价或多特异性多肽，所有均如本文所述。所述蛋白或多肽也可以以基本上分离的形式(如本文定义)存在。

本发明包括不同来源的免疫球蛋白序列，包括小鼠、大鼠、兔、驴、人和骆驼科动物免疫球蛋白序列。本发明还包括完全人的、人源化的或嵌合的免疫球蛋白序列。例如，本发明包括骆驼科动物免疫球蛋白序列和人源化的骆驼科动物免疫球蛋白序列,或骆驼源化的结构域抗体,例如，骆驼源化的dab，如由ward等(参见例如wo94/04678以及davies和riechmann(1994和1996))所述。而且，本发明包括融合的免疫球蛋白序列，例如，形成多价和/或多特异性构建体(对于包含一个或多个vhh结构域的多价和多特异性多肽及其制备，还参考conrath等.,j.biol.chem.(生物化学杂志),卷276,10.7346-7350,2001,以及例如wo96/34103和wo99/23221)，和包括标记或其它功能性结构部分(例如，毒素、标记、放射性化学品等)的免疫球蛋白序列，其可来源于本发明的免疫球蛋白序列。

可以认为所述免疫球蛋白序列和免疫球蛋白序列的结构，特别是纳米抗体-然而不限于此-由四个构架区或“fr’s”组成，其在本领域中和在本文中分别称为“构架区1”或“fr1”；“构架区2”或“fr2”；“构架区3”或“fr3”；和“构架区4”或“fr4”；所述构架区由三个互补决定区或“cdr’s”中断，其在本领域中分别称为“互补决定区1”或“cdr1”；“互补决定区2”或“cdr2”；和“互补决定区3”或“cdr3”。

纳米抗体中氨基酸残基总数可以在110-120区间，优选112-115，并且最优选113。然而，应该注意纳米抗体的部分、片段、类似物或衍生物(如本文进一步所述)不特别限制它们的长度和/或大小，只要这样的部分、片段、类似物或衍生物满足本发明列出的深层要求，并且还优选地适于本文所述的目的。

当用于本文时，术语“免疫球蛋白序列”是指编码免疫球蛋白分子的核酸序列和免疫球蛋白多肽本身这二者。任何更加限制性的意思将通过具体的上下文而清楚。

所有这些分子还称为“本发明的多肽”，其与本发明的“免疫球蛋白序列”同义。

另外，术语“序列”在用于本文时(例如，在术语如“免疫球蛋白序列”,“抗体序列”,“可变结构域序列”,“vhh序列”或“蛋白序列”中)通常应该理解为包括相关的免疫球蛋白序列以及编码其的核酸序列或核苷酸序列二者，除非上下文需要更局限性的解释。

在下文中，对本发明的“核酸分子”的引用可以涉及用于基因疫苗接种的核酸，或编码本发明的免疫球蛋白序列的核酸，或二者，这将通过具体的上下文变得清楚。

除非另外指明，所有没有具体详细描述的方法、步骤、技术和操作可以以本身已知的方式进行并且已经进行，这对于专业技术人员是清楚的。例如，仍旧参考标准手册，参考本发明所提及的公知背景技术，和参考其中所引用的其它参考文献；以及例如下列的综述：presta,adv.drugdeliv.rev.(高级药物递送评论)2006,58(5-6):640-56；levin和weiss,mol.biosyst.(分子生物系统)2006,2(1):49-57；irving等,j.immunol.methods(免疫学方法杂志),2001,248(1-2),31-45；schmitz等,placenta(胎盘),2000,21增刊a,s106-12,gonzales等,tumourbiol.(肿瘤生物学),2005,26(1),31-43,它们描述了蛋白工程的技术，诸如亲和力成熟和其他用于改善蛋白诸如免疫球蛋白的特异性和其他所需特性的技术。

本发明涉及可以结合本文定义的抗原和/或具有针对本文定义的抗原的亲和性的免疫球蛋白序列。在本发明的情形中，“结合某种抗原和/或具有针对某种抗原的亲和性”具有本领域中常用的意思，例如，如在抗体及其各自的抗原的情形中所理解的意思。

在本发明的具体实施方案中，术语“结合和/或具有针对……的亲和性”意指所述免疫球蛋白序列特异性与抗原相互作用，并且与“针对”所述抗原的免疫球蛋白序列互换使用。

术语“特异性”是指特定的免疫球蛋白序列、抗原-结合分子或抗原-结合蛋白(诸如本发明的纳米抗体或多肽)可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。一种抗原-结合蛋白的特异性可以依据亲和力和/或抗体亲抗原性(avidity)而确定。亲和力，表示为抗原与抗原-结合蛋白的解离平衡常数(kd)，是抗原决定簇和所述抗原-结合蛋白上抗原-结合位点之间的结合强度的量度：kd值越小，抗原决定簇和抗原-结合分子之间的结合强度越强(备选地，亲和力还可以表示为亲和常数(ka)，其为1/kd)。专业技术人员应该清楚(例如，基于本发明进一步的公开内容)，亲和力可以以本身已知的方式确定，其取决于目的特异性抗原。抗体亲抗原性是抗原-结合分子(诸如本发明的纳米抗体或多肽)和相关抗原之间的结合强度的量度。抗体亲抗原性与抗原决定簇与其在抗原-结合分子上的抗原结合位点之间的亲和力以及在所述抗原-结合分子上存在的相关结合位点的数目相关。

典型地，本发明的免疫球蛋白序列(诸如本发明的免疫球蛋白序列、纳米抗体和/或多肽)将以10^-5-10^-12摩尔/升或更小、并且优选地10^-7-10^-12摩尔/升或更小并且更优选地10^-8-10^-12摩尔/升的解离常数(kd)(即，以10⁵-10¹²升/摩尔或更大、并且优选地10⁷-10¹²升/摩尔或更大、且更优选地10⁸-10¹²升/摩尔的缔合常数(ka))而结合它们的抗原，和/或

以10²m^-1s^-1–约10⁷m^-1s^-1,优选10³m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1,更优选10⁴m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1,诸如10⁵m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1的kon-速率与本文定义的细胞相关抗原结合；和/或

以1s^-1(t1/2＝0.69s)-10^-6s^-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合体),优选10^-2s^-1-10^-6s^-1,更优选10^-3s^-1-10^-6s^-1,诸如10^-4s^-1-10^-6s^-1的koff速率与本文定义的细胞相关抗原结合。

任何大于10^-4摩尔/升的kd值(或任何小于10⁴m^-1的ka值)升/摩尔通常认为指示非特异性结合。

优选地，本发明的单价免疫球蛋白序列将以小于500nm、优选地小于200nm、更优选地小于10nm诸如小于500pm的亲和力与理想的抗原结合。

抗原-结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以本身已知的任何适当的方法确定，其包括，例如，斯卡查德分析和/或竞争性结合测定，诸如放射性免疫测定(ria)、酶免疫测定(eia)和夹心式(sandwich)竞争测定，和本领域本身已知的其不同的变化；以及本发明提及的其它技术。

解离常数可以是实际的或表观解离常数，这是专业技术人员应该清楚的。确定解离常数的方法对于专业技术人员应该是清楚的，并且例如，包括本发明提及的技术。在这一点上，还应该清楚，不可能测量大于10^-4摩尔/升或10^-3摩尔/升(例如，10^-2摩尔/升)的解离常数。任选地，专业技术人员还应该清楚，可以根据(实际或表观)缔合常数(ka)利用[kd＝1/ka]的关系计算所述(实际或表观)解离常数。

亲和力表示分子相互作用的强度或稳定性。亲和力通常作为kd或解离常数给出，其具有摩尔/升(或m)的单位。亲和力还可以表示为缔合常数ka，其等于1/kd，并且具有(摩尔/升)^-1(或m^-1)的单位。在本说明书中，两个分子(诸如本发明的免疫球蛋白序列、免疫球蛋白序列、纳米抗体或多肽及其目的靶标)之间的相互作用的稳定性将主要以它们相互作用的kd值表示；专业技术人员应该清楚，考虑到ka＝1/kd的关系，通过其kd值表示分子相互作用的强度也可以用于计算相对应的ka值。由于kd-值通过公知的关系式dg＝rt.ln(kd)(等价于dg＝-rt.ln(ka))与结合的自由能(dg)相关，kd-值还在热力学意义上表征分子相互作用的强度，在所述关系式中，r等于气体常数，t等于绝对温度，并且ln表示自然对数。

关于认为是有意义的(例如，特异性的)生物学相互作用(诸如本发明的免疫球蛋白序列与本文定义的细胞相关抗原的结合)的kd典型地在10^-10m(0.1nm)-10^-5m(10000nm)范围内。相互作用越强，其kd越低。

kd也可以表示为复合体的解离速率常数(表示为koff)与其缔合速率(表示为kon)的比例(以致kd＝koff/kon和ka＝kon/koff)。解离速率koff具有单位s^-1(其中s是秒的si单位符号)。缔合速率kon具有单位m^-1s^-1。

关于本发明的免疫球蛋白序列，缔合速率可以在10²m^-1s^-1–约10⁷m^-1s^-1之间变化，对于两分子相互作用达到扩散-极限缔合速率常数。解离速率以关系式t1/2＝ln(2)/koff与给定的分子相互作用的半衰期相关。本发明的免疫球蛋白序列的解离速率可以在10^-6s^-1(接近具有数天的t1/2的不可逆复合体)到1s^-1(t1/2＝0.69s)之间变化。

两个分子之间的分子相互作用的亲和力可以通过本身已知的不同技术测量，诸如公知的表面等离子体共振(spr)生物传感器技术(例如，参见ober等,国际免疫学(intern.immunology),13,1551-1559,2001)，其中将一个分子固定在生物传感器芯片上，另一个分子在流动条件下经过所固定的分子，产生kon,koff测量值以及因此产生kd(或ka)值。例如，这可以使用公知的biacore仪器进行。

专业技术人员还应该理解，如果测量过程以某种方式影响暗指的分子的固有结合亲和力，例如通过与一个分子的生物传感器上的涂层相关的人为产物影响，则测量的kd可以与表观kd相对应。此外，如果一个分子含有针对另一个分子的多于一个的识别位点，则可以测量表观kd。在这样的情形中，所测量的亲和力可以受到两个分子之间相互作用的抗体亲抗原性的影响。

可以用来评估亲和力的另一种方法是friguet等(免疫方法杂志(j.immunol.methods),77,305-19,1985)的2步elisa(酶联免疫吸附测定)方法。该方法建立溶液相结合平衡测量，并且避免与在支持物如塑料上的一个分子的吸附相关的可能的人为产物。

然而，kd的准确测量可能是非常费力的，并且作为结果，通常确定表观kd值来评估两个分子的结合强度。应该注意到，只要所有的测量以一致的方式(例如，保持测定条件不变)进行，表观kd测量可以用作真实kd的近似值，并且因此在现有文献中，应该以同等的重要性或相关性对待kd和表观kd。

最后，应该注意到，在许多情形中，有经验的科学家可以判断相对于一些参照分子确定结合亲和力是便利的。例如，为了评估分子a和b之间的结合强度，例如，人们可以使用已知与b结合且适合用荧光团或生色团或其它化学结构部分标记的参照分子c，诸如在elisa或facs(荧光活化的细胞分选)中容易检测的生物素、或其它形式(用于荧光检测的荧光团，用于光吸收检测的生色团，用于链霉抗生物素蛋白-介导的elisa检测的生物素)。典型地，参照分子c保持在固定的浓度，并且a的浓度关于b的给定的浓度或量变化。结果，获得ic50值，其对应于在不存在a的条件下关于c所测量的信号为一半时的a的浓度。假定已知参照分子的kd，即kdref，以及参照分子的总浓度cref，则可以通过下式获得关于a-b相互作用的表观kd：kd＝ic50/(1+cref/kdref)。注意，如果cref<<kdref,则kd≈ic50。假定以一致的方式(例如，保持cref不变)针对比较的结合剂进行ic50测量，则分子相互作用的强度或稳定性可以通过ic50进行评估，并且在本发明的整个内容中，认为该测量等价于kd或等价于表观kd。

在本发明的上下文中，“构象依赖型表位”，或“构象表位”表示包括不在抗原一级序列的单一连续区段中的氨基酸的表位。换言之，由于蛋白靶标的二级和/或三级结构，在一级结构中可能被间隔开的氨基酸彼此接近，由此参与形成表位。例如，如果抗原包括三个氨基酸环，则在这些环中每一个环上的残基可以参与形成单个的表位。这适用于包括多于一个结构域或亚单位的抗原。在这种情形中，表位可以由不同结构域或亚单位上的氨基酸形成。通过适当的条件完全或部分变性蛋白，即，部分或完全破坏二级和/或三级结构，也将部分或完全破坏构象表位。专业技术人员将理解通过使蛋白变性而破坏构象表位的精确条件取决于所述蛋白的性质和具体的情形。

在优选实施方案中，本发明涉及针对构象表位的免疫球蛋白序列。具体地，本发明涉及针对本文定义的细胞相关抗原上的构象表位的免疫球蛋白序列，其可以优选的是骆驼科动物免疫球蛋白序列，包括纳米抗体。

在本发明的上下文中，“细胞相关抗原”意指稳固地锚定在或者位于细胞膜(包括亚细胞区室和细胞器的膜)中的抗原，并且包括具有单个或多个跨膜区的抗原。换言之，该术语是指展现出膜-依赖性构象表位的抗原。具体地，该术语是指具有本文定义的构象表位的抗原。该术语包括跨膜抗原，具有多个跨膜结构域的跨膜抗原如gpcrs或离子通道。在所有这些抗原中，专业技术人员知晓多种可药用的靶抗原，其代表本发明的优选的细胞相关抗原。本发明特别涉及这样的细胞相关抗原，其中构象依赖型表位依赖于在膜中的正确锚定和/或位置。因此，本发明提供针对所述构象依赖型表位的免疫球蛋白序列。

在优选的实施方案中，本发明涉及作为具有一个或多个、优选多个跨膜结构域的完整的膜蛋白的抗原。这些抗原位于细胞质膜、和/或亚细胞区室和细胞器的膜中并且在其中运作。多种跨膜蛋白，如跨膜受体，包括两个或多个亚单位或结构域，其彼此在功能上相互作用。

完整的膜蛋白包括三个不同的部分或结构域，即，细胞外(区室外)结构域，跨膜结构域和细胞内(或区室内)结构域。具有多个跨膜结构域的蛋白典型地还将具有多个细胞外/区室外和细胞内/区室内结构域。例如，七跨膜受体包括7个跨膜结构域。

因此，术语细胞相关抗原在本文中理解为意欲排除仅是松散缔合的抗原，即，排除不是稳固地锚定或位于膜内的抗原。如果抗原包括至少一个延伸到膜内的结构域或部分，则抗原是稳固锚定的。

在一个实施方案中，本发明排除通过脂质尾部插入膜而不具有跨膜结构域的抗原。在这种情形中，蛋白的亲水部分或结构域的构象不取决于膜环境。例如，可以表达缺少脂质尾部、以正确的构象存在的重组蛋白，即，表达在抗原通过脂质尾部与膜缔合时也存在的构象表位。类似地，在具体实施方案中，本发明排除仅是松散地缔合的任何其它的蛋白。在这种情形中，“松散地缔合”意指甚至在不存在膜的条件下表现出其天然构象的蛋白，即，其天然构象不依赖于锚定或包埋在膜中。在更具体的实施方案中，本发明排除art2.2。

本发明所述的细胞相关抗原的典型实例包括七膜结构域受体，其包括g蛋白偶联的受体，如本发明进一步所述的那些，肾上腺素能受体，嗅觉受体,受体酪氨酸激酶,如表皮生长因子受体,胰岛素受体,成纤维细胞生长因子受体,高亲和性神经营养蛋白受体,和eph受体,整联蛋白,低亲和性神经生长因子受体,nmda受体,一些免疫受体，包括toll-样受体,t细胞受体和cd28。此外，本发明所述的细胞相关抗原还包括离子通道,如本发明进一步所述的那些，钙通道,钠通道,钾通道,2p离子通道,6-tm离子通道,电压-门控离子通道和/或钙-激活的钾通道。

当用于本文时，术语“细胞相关抗原”意欲包括，并且还指，所述细胞相关抗原的任意部分、片段、亚单位、或结构域。所述细胞相关抗原的任何亚部分都落入本发明的范围之内，条件是其表现出目的构象表位。例如，如果目的表位位于受体的结合位点中，或者位于离子通道的孔中，则所述细胞相关抗原的能够形成所述表位的任何片段都包括在本发明中。优选地，这些部分、结构域、片段或亚单位是所述细胞相关抗原负责膜依赖性构象的那些部分。例如，如果蛋白包括多个通过延长的细胞内环连接的跨膜结构域，则认为所述环被部分或完全省略，而不影响细胞外构象表位。

特别地，本发明涉及针对以其天然构象存在的细胞相关抗原的免疫球蛋白序列。在本发明的上下文中，“天然构象”意指蛋白表现出其二级和/或三级结构，特别是其膜依赖性二级和/或三级结构。换言之，天然构象描述以非变性形式存在的蛋白，并且描述其中存在构象表位，特别是存在膜依赖型构象表位的构象。具体地，蛋白具有当所述蛋白整合到膜内或稳固地附着到膜上时存在的构象。当存在于下列之中时，可以获得以其天然构象存在的抗原：在包括表达所述细胞相关抗原的天然的或转染的细胞的细胞中、细胞来源的膜提取物、携带抗原的小泡或任何其它膜衍生物、脂质体、或表达所述细胞相关抗原的病毒颗粒中。在任意这些实施方案中，抗原可以通过适当的方式富集。所述细胞相关抗原可以在允许表达以其天然或自然构象存在的抗原的任何适宜的细胞上表达，所述细胞包括但不限于，cho,cos7,hek293，或骆驼科动物来源的细胞。

本发明的细胞相关抗原优选是可药用的膜蛋白，特别是具有多个跨膜结构域的可药用的膜蛋白。在本发明的一个实施方案中,所述靶标是gpcr或离子通道。

具体地，下文提供了代表本发明所述的细胞相关抗原的离子通道的非限制性实例。还列出了特异性识别所述离子通道的免疫球蛋白序列的治疗作用。

离子通道和它们相关的疾病与病症在本领域中是公知的。例如，参考下述综述：goldstein等.,pharmacologicalreviews(药理学综述),57,4,527(2005)；yu等.,pharmacologicalreviews(药理学综述),57,4,387(2005)；clapham和garbers,pharmacologicalreviews(药理学综述),57,4,451(2005)；hoffmann等.,pharmacologicalreviews(药理学综述),57,4,455(2005)；kubo等.,pharmacologicalreviews(药理学综述),57,4,509(2005)；wei等.,pharmacologicalreviews(药理学综述),57,4,463(2005)；shieh等,pharmacologicalreviews(药理学综述),57,4,557(2005)；catterall等,pharmacologicalreviews(药理学综述),57,4,411(2005)；gutman等.,pharmacologicalreviews(药理学综述),57,4,473(2005)；clapham等.,pharmacologicalreviews(药理学综述),57,4,427(2005)；和catterall等.,pharmacologicalreviews(药理学综述),57,4,397(2005)；以及在这些综述中引用的其它参考文献和下述论文和综述:chandy等.,trendsinpharmacologicalsciences(药理学趋势),2004年5月,280-289；takana和shigenobu,j.pharmacol.sci.(药理学杂志),99,214-200(2005)；padinjat和andrews,journalofcellscience(细胞科学杂志),117,5707-5709(2004)；amir等.,thejournalofpain(疼痛杂志),卷7,no.5,s1-s29(2006)；devor,thejournalofpain(疼痛杂志),卷7,no.15,s3-s12(2006)；xie等.,currentdrugdiscovery(现代药物发现),2004年4月,31-33；vianna-jorge和suarez-kurtz,biodrugs(生物药物)2004,18(5),329-41；garcia和kaczorowski,scistke,2005,302；gopalakrishnan和shieh,expertopin.ther.targets(治疗靶标专家观点),2005,8(5),437-58；mannhold,med.res.rev.(医药研究综述),2004,24(2),213-66；sabido-david等.,expertopin.investig.drugs(药物研究专家观点),2004,13(1)1249-61；和christ,journalofandrology(男科学杂志),卷23,no.5,s10-s19(2002),以及其中引用的其它现有技术(所有这些通过引用结合在本文中),以及下表和在本申请中引用的其它现有技术。

从这些综述以及本现有技术中可以看出，离子通道通常基于可以从离子通道中流过的离子(即，作为钙通道，钠通道或钾通道)，基于离子通道的组成和结构(例如，亚单位、孔和跨膜结构域的数目和类型，例如，2p离子通道,6-tm离子通道等)，和/或基于离子通道被激活的方式(例如，电压-门控离子通道或钙激活的钾通道)进行分类。

离子通道通常包括多个跨膜结构域亚单位，其通过细胞内环和细胞外环的组合连接。同样参考上文引用的参考文献和现有技术，以及参考benham,naturebiotechnology(自然生物技术),2005年10月,1234-1235和本文引用的其它现有技术。

离子通道是膜蛋白以及已知它们与多种疾病状态相关的事实使得离子通道成为药用和兽医用化合物的有吸引力的分子靶标(即，用于预防、治疗或诊断)。此外，关于离子通道及其生物或生理活性筛选有活性(作为激动剂、拮抗剂、阻断剂和/或开放剂)和/或选择性的潜在的药用或兽医用化合物的方法在本领域中是公知的。取决于所涉及的离子通道，一些适当的技术的非限制性的实例包括诸如膜片钳、电压钳、测量离子流出、flipr、钙成像和电生理学技术的技术。

在下文中提供了代表本发明所述的细胞相关抗原的gpcrs的具体的、非限制性的实例。还列出了本发明针对这些gpcrs的免疫球蛋白序列的一些示例性的治疗作用。

a类gpcrs

-乙酰胆碱受体(激动剂),

-毒蕈碱性受体(muscarinicreceptor)(激动剂),

-毒蕈碱性m1受体(激动剂),

-毒蕈碱性m2受体(激动剂),

-毒蕈碱性m3受体(激动剂),

-毒蕈碱性m4受体(激动剂),

-毒蕈碱性m5受体(激动剂)

-毒蕈碱性受体(部分激动剂)

-肾上腺受体(激动剂),

-α肾上腺受体(激动剂),

-α1肾上腺受体(激动剂),

-α1a肾上腺受体(激动剂),

-α1b肾上腺受体(激动剂)

-α1d肾上腺受体(激动剂)

-α2肾上腺受体(激动剂),

-α2a肾上腺受体(激动剂),

-α2b肾上腺受体(激动剂),

-α2c肾上腺受体(激动剂),

-α2肾上腺受体(部分激动剂)

-α3肾上腺受体(激动剂),

-β肾上腺受体(激动剂),

-β1肾上腺受体(激动剂),

-β2肾上腺受体(激动剂),

-β3肾上腺受体(激动剂),

-多巴胺受体(激动剂),

-多巴胺d5受体(激动剂)

-多巴胺d1受体(激动剂),

-多巴胺d2受体(激动剂),

-多巴胺d3受体(激动剂),

-多巴胺d4受体(激动剂),

-组胺受体(激动剂),

-组胺h1受体(激动剂),

-组胺h2受体(激动剂),

-组胺h3受体(激动剂),

-组胺h4受体(激动剂),

-5-htgpcr(激动剂),

-5-ht1(激动剂),

-5-ht2(激动剂),

-5-ht4(激动剂),

-5-ht5a(激动剂),

-5-ht5b(激动剂)

-5-ht6(激动剂),

-5-ht7(激动剂),

-痕量胺-相关的受体(traceamine-associatedreceptor)(激动剂),

-痕量胺-相关的受体-1(激动剂),

-痕量胺-相关的受体-2(激动剂)

-痕量胺-相关的受体-3(激动剂)

-痕量胺-相关的受体-4(激动剂)

-痕量胺-相关的受体-5(激动剂)

-痕量胺-相关的受体-6(激动剂)

-痕量胺-相关的受体-7(激动剂)

-痕量胺-相关的受体-8(激动剂)

-痕量胺-相关的受体-9(激动剂)

-apelin受体(激动剂),

-大麻素受体(cannabinoidreceptor)(激动剂),

-大麻素cb1受体(激动剂),

-大麻素cb2受体(激动剂),

-溶血鞘脂受体(lysosphingolipidreceptor)(激动剂),

-鞘氨醇-1-磷酸酯受体-1(sphingosine-1-phosphatereceptor-1)(激动剂),

-溶血磷酸酯-1受体(激动剂)

-鞘氨醇-1-磷酸酯受体-3(激动剂),

-溶血磷酸酯-2受体(激动剂)

-鞘氨醇-1-磷酸酯受体-2(激动剂)

-鞘氨醇-1-磷酸酯受体-4(激动剂),

-溶血磷酸酯-3受体(激动剂)

-鞘氨醇-1-磷酸酯受体-5(激动剂)

-a类激素蛋白gpcr(激动剂),

-fsh(激动剂),

-促黄体激素受体(激动剂),

-tsh(激动剂),

-白三烯(激动剂),

-白三烯blt受体(激动剂),

-半胱氨酰白三烯受体(激动剂),

-褪黑激素(melatonin)(激动剂),

-褪黑激素mt1(激动剂),

-褪黑激素mt2(激动剂),

-褪黑激素mt3(激动剂)

-a类核苷酸样gpcr(激动剂),

-腺苷受体(激动剂),

-p2y受体(激动剂),

-a类孤独gpcr(激动剂),

-生长素释放肽(ghrelin)(激动剂),

-a类肽gpcr(激动剂),

-血管紧张肽受体(激动剂),

-血管紧张肽i受体(激动剂),

-血管紧张肽ii受体(激动剂),

-铃蟾肽受体(bombesinreceptor)(激动剂),

-铃蟾肽bb1受体(激动剂)

-铃蟾肽bb2受体(激动剂)

-铃蟾肽bb3受体(激动剂),

-胃泌素释放肽配体(gastrinreleasingpeptideligand),

-神经调节肽b配体(neuromedinbligand)

-神经调节肽c配体

-缓激肽受体(bradykininreceptor)(激动剂),

-缓激肽b1受体(激动剂),

-缓激肽b2受体(激动剂),

-c3a受体(激动剂),

-c5a(激动剂),

-cck受体(激动剂),

-cck1受体(激动剂),

-cck2受体(激动剂),

-促胃液素(gastrin)(激动剂),

-趋化因子(激动剂),

-cc趋化因子受体(激动剂),

-ccr1趋化因子(激动剂),

-ccr2趋化因子(激动剂),

-ccr3趋化因子(激动剂),

-ccr4趋化因子(激动剂),

-ccr5趋化因子(激动剂),

-ccr6趋化因子(激动剂),

-ccr7趋化因子(激动剂)

-ccr8趋化因子(激动剂),

-ccr9趋化因子(激动剂)

-ccr10趋化因子(激动剂),

-ccr11趋化因子(激动剂)

-cx3c趋化因子受体(激动剂),

-cx3cr1趋化因子(激动剂),

-xcr1趋化因子(激动剂)

-cxc趋化因子受体(激动剂),

-cxcr1趋化因子(激动剂)

-cxcr3趋化因子(激动剂),

-cxcr4趋化因子(激动剂),

-cxcr5趋化因子(激动剂)

-肾上腺髓质素受体(adrenomedullinreceptor)(激动剂),

-内皮缩血管肽(endothelin)(激动剂),

-内皮缩血管肽et-a(激动剂),

-内皮缩血管肽et-b(激动剂),

-甘丙肽(galanin)(激动剂),

-甘丙肽gal1(激动剂),

-甘丙肽gal2(激动剂),

-甘丙肽gal3(激动剂)

-il-9(激动剂),

-kiss-1受体(激动剂),

-黑色素浓缩激素(melaninconcentratinghormone)(激动剂),

-mch受体-1(激动剂)

-mch受体-2(激动剂)

-黑皮质素(melanocortin)(激动剂),

-黑皮质素mc1(激动剂),

-acth受体(激动剂),

-黑皮质素mc3(激动剂),

-黑皮质素mc4(激动剂),

-黑皮质素mc5(激动剂),

-nk(激动剂),

-nk1(激动剂),

-nk2(激动剂)

-nk3(激动剂),药物:1

-神经肽y受体(激动剂),

-神经肽y1受体(激动剂)

-神经肽y2受体(激动剂),

-神经肽y4受体(激动剂),

-神经肽y5受体(激动剂),

-神经肽y6受体(激动剂)

-神经降压肽受体(neurotensinreceptor)(激动剂),

-神经降压肽nts1(激动剂),

-神经降压肽nts2(激动剂)

-食欲肽(orexin)&神经肽ff受体(激动剂),

-食欲肽(激动剂),

-阿片样物质(opioid)(激动剂),

-δ阿片样物质(激动剂),

-κ阿片样物质(激动剂),

-μ阿片样物质(激动剂),

-orl1受体(激动剂),

-阿片样物质(部分激动剂)

-σ阿片样物质(激动剂),

-食欲肽&神经肽ff受体(激动剂),

-神经肽ff受体(激动剂),

-神经肽ff1受体(激动剂)

-神经肽ff2受体(激动剂),

-食欲肽(激动剂),

-食欲肽-1(激动剂)

-食欲肽-2(激动剂)

-蛋白酶-激活的受体(激动剂),

-蛋白酶-激活的受体-1(激动剂),

-蛋白酶-激活的受体-2(激动剂),

-蛋白酶-激活的受体-3(激动剂)

-蛋白酶-激活的受体-4(激动剂)

-前动力蛋白(prokineticin)受体(激动剂),

-前动力蛋白受体-1(激动剂),

-前动力蛋白受体-2(激动剂),

-促生长素抑制素(激动剂),

-促生长素抑制素1(激动剂),

-促生长素抑制素2(激动剂),

-促生长素抑制素3(激动剂),

-促生长素抑制素4(激动剂),

-促生长素抑制素5(激动剂),

-硬骨鱼紧张肽ii(urotensinii)(激动剂),

-血管升压素样受体(激动剂),

-催产素(激动剂),

-血管升压素(激动剂),

-血管升压素v1(激动剂),

-血管升压素v2(激动剂),

-前列腺素类受体(激动剂),

-dp前列腺素类(激动剂),

-pgd2(激动剂),

-ep1前列腺素类(激动剂),

-pge2(激动剂),

-ep2前列腺素类(激动剂),

-pge2(激动剂),

-ep3前列腺素类(激动剂),

-pge2(激动剂),

-ep4前列腺素类(激动剂),

-pge2(激动剂),

-fp前列腺素类(激动剂),

-pgf2α(激动剂),

-ip前列腺素类(激动剂),

-前列环素(激动剂),

-前列腺素类受体(部分激动剂)

-tp前列腺素类(激动剂),

-血栓烷a2(thromboxanea2)(激动剂)

-琥珀酸受体1(激动剂)

-trh(激动剂),

-trh1(激动剂)

-trh2(激动剂)

-犁鼻型-1受体(激动剂)

-犁鼻型-1受体-1(激动剂)

-犁鼻型-1受体-2(激动剂)

-犁鼻型-1受体-3(激动剂)

-犁鼻型-1受体-4(激动剂)

-犁鼻型-1受体-5(激动剂)

-apelin受体(调节剂),

-大麻素受体(调节剂),

-趋化因子受体-样1(调节剂),

-溶血鞘脂受体(调节剂),

-a类激素蛋白gpcr(调节剂),

-白三烯受体(调节剂),

-褪黑激素受体(调节剂),

-a类核苷酸样gpcr(调节剂),

-a类孤独gpcr(调节剂),

-paf受体(调节剂),

-a类肽gpcr(调节剂),

-前列腺素类受体(调节剂),

-琥珀酸受体1(调节剂)

-trh受体(调节剂),

-犁鼻型-1受体(调节剂),

b类gpcrs

-g-蛋白偶联受体-3(调节剂),

-g-蛋白偶联受体-3(激动剂)

-g-蛋白偶联受体-3(拮抗剂),

-g-蛋白偶联受体-6(调节剂),

-g-蛋白偶联受体-6(激动剂)

-g-蛋白偶联受体-6(拮抗剂),

-g-蛋白偶联受体-12(调节剂),

-g-蛋白偶联受体-12(激动剂)

-g-蛋白偶联受体-12(拮抗剂),

-g-蛋白偶联受体-14(调节剂)

-g-蛋白偶联受体-14(激动剂)

-g-蛋白偶联受体-14(拮抗剂)

-b类gpcr(激动剂),

-crf-1受体(激动剂)

-crf-2受体(激动剂),

-降钙素受体(调节剂),

-降钙素(激动剂),

-降钙素(拮抗剂),

-acth释放因子受体(调节剂),

-crf-1受体(调节剂),

-crf-1受体(激动剂)

-crf-1受体(拮抗剂),

-crf-2受体(调节剂),

-crf-2受体(激动剂),

-crf-2受体(拮抗剂),

-acth释放因子(激动剂),

-crf-1受体(激动剂)

-crf-2受体(激动剂),

-acth释放因子(拮抗剂),

-crf-1受体(拮抗剂),

-crf-2受体(拮抗剂),

-胰高血糖素样肽受体(调节剂),

-胰高血糖素样肽1受体(调节剂),

-胰高血糖素样肽2受体(调节剂),

-胰高血糖素样肽(激动剂),

-胰高血糖素样肽(拮抗剂),

-胰高血糖素受体(调节剂),

-胰高血糖素(激动剂),

-胰高血糖素(拮抗剂),

-ghrh受体(调节剂),

-ghrh(激动剂),

-生长素释放因子(拮抗剂),

-pacap型i受体(调节剂),

-pacap型i受体(激动剂),

-pacap型i受体(拮抗剂)

-pth受体(调节剂),

-pth-1受体(调节剂)

-pth-2受体(调节剂)

-pth(激动剂),

-pth(拮抗剂),

-分泌素受体(调节剂),

-分泌素(激动剂),

-分泌素(拮抗剂)

-vip受体(调节剂),

-vip-1受体(调节剂),

-vip-2受体(调节剂),

-vip(激动剂),

-vip(拮抗剂),

c类gpcrs

-c类gpcr(调节剂),

-c类gpcr(激动剂),

-gabab受体(激动剂),

-代谢型谷氨酸受体(激动剂),

-代谢型谷氨酸受体1(激动剂),

-代谢型谷氨酸受体2(激动剂),

-代谢型谷氨酸受体3(激动剂),

-代谢型谷氨酸受体4(激动剂),

-代谢型谷氨酸受体5(激动剂),

-代谢型谷氨酸受体6(激动剂)

-代谢型谷氨酸受体7(激动剂)

-代谢型谷氨酸受体8(激动剂)

优选地，所述细胞相关抗原是跨膜抗原，包括但不限于，选自离子通道的抗原，诸如例如p2x7。

专业技术人员应该理解，可能存在术语“天然构象”所包括的不同的特异性三维构象。例如，如果蛋白在膜环境中具有两种或多种不同的构象，则所有这些构象均被认为是“天然构象”。这由受体通过激活改变其构象所示例，例如，视紫红质由光诱导的不同激活状态，或表现出“关闭”或“开放”构象的离子通道。本发明包括针对这些不同天然构象中的任一种的免疫球蛋白序列，即，针对可能存在的不同种类的构象表位的免疫球蛋白序列。

本发明的“核酸”可以采取单链或双链dna或rna的形式，并且优选采取双链dna的形式。例如，本发明的核苷酸序列可以是基因组dna，cdna或合成的dna(诸如具有特别适于在要用的宿主细胞或宿主生物体中表达的密码子应用的dna)。

根据本发明的一个实施方案，本发明的核酸以本文定义的基本上分离的形式存在。

本发明的核酸还可以是这样的形式，存在于和/或是载体的一部分，诸如例如质粒、黏端质粒或yac，其也可以是基本上分离的形式。

本发明的核酸可以以本身已知的方法制备或获得，其基于关于本发明的细胞相关抗原或免疫球蛋白序列的信息，和/或可以从适当的天然来源分离。为了提供类似物，例如，编码天然存在的vhh结构域的核苷酸序列可以进行位点定向诱变，以提供编码所述类似物的本发明的核酸。并且，专业技术人员应该清楚，为了制备本发明的核酸，一些核苷酸序列，诸如至少一种编码纳米抗体的核苷酸序列，以及例如编码一种或多种接头的核酸，还可以以适当的方法连接在一起。

用于产生本发明的核酸的技术应该是专业技术人员所清楚的，并且例如可以包括但不限于，自动dna合成；位点定向诱变；将两个或多个天然存在的和/或合成的序列(或者其两个或更多个部分)组合，引入引起剪截表达产物表达的突变；引入一个或多个限制性位点(例如，以产生可以使用适宜的限制性酶容易地消化和/或连接的盒和/或区)，和/或通过使用一个或多个“错配”引物，使用例如天然存在的gpcr序列作为模板的pcr反应的方法引入突变。这些以及其它技术应该是专业技术人员所清楚的，并且参考也参见上文提及的标准手册，诸如sambrook等和ausubel等，以及下文的实施例。

本发明的核酸还可以是这样的形式，存在于和/或是遗传构建体的一部分，这对于本领域的技术人员应该是清楚的。这样的遗传构建体通常包括至少一种本发明的核酸，其任选地与本身已知的一个或多个遗传构建体元件连接，诸如例如一个或多个适宜的调节元件(诸如适当的启动子、增强子、终止子、等等)和本文提到的其它遗传构建体元件。包括至少一种本发明的核酸的所述遗传构建体在本文也叫作“本发明的遗传构建体”。

本发明的遗传构建体可以是dna或rna，并且优选地是双链dna。本发明的遗传构建体还可以是适于要用的宿主细胞或宿主生物体的转化的形式，适于结合到要用的宿主细胞的基因组dna中的形式，或者适于在要用的宿主生物体中独立复制、维持和/或遗传的形式，或适于基因免疫的形式。例如，本发明的遗传构建体可以是载体形式，诸如例如质粒、黏端质粒、yac、病毒载体或转座子。特别地，所述载体可以是表达载体，即，可以提供体外和/或体内表达的载体(例如，在适宜的宿主细胞、宿主生物体和/或表达系统中)。

在一个优选的但非限制性的方面中，本发明的遗传构建体包括：

a)至少一种本发明的核酸；其可操作性地连接于

b)一个或多个调节元件，诸如启动子和任选地适宜的终止子；

并且任选地还有

c)本身已知的一个或多个其它遗传构建体元件；

其中术语“调节元件”、“启动子”、“终止子”和“可操作性地连接”具有它们在本领域中的通用意思(如本文进一步所述)；并且其中存在于遗传构建体中的所述“其它元件”，例如，可以是3’-或5’-utr序列、前导序列、选择标记、表达标记/报道基因、和/或可以促进或增加转化或整合(效率)的元件。用于所述遗传构建体的这些和其它适宜的元件对于专业技术人员应该是清楚的，并且例如可能取决于所用的构建体、要用的宿主细胞、待免疫的宿主生物体或动物的类型；本发明的目的核苷酸序列在其中表达的方式(例如，通过组成型的、瞬时的或可诱导的表达)；和/或要用的转化/疫苗接种技术。例如，本身已知用于抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和scfv片段)表达和生产的调节序列、启动子和终止子可以以基本上相似的方式使用。

优选地，在本发明的遗传构建体中，所述至少一种本发明的核酸和所述调节元件，以及任选地所述一个或多个其它元件，彼此“可操作性地连接”，这通常意指它们彼此是功能性关系。例如，如果所述启动子能够起始或者另外控制/调节编码序列的转录和/或表达，那么启动子被视为与编码序列“可操作性地连接”(其中所述编码序列应该理解为“受控于”所述启动子)。一般地，当两个核苷酸序列可操作性地连接时，它们应该在相同的方向，并且通常还在同一阅读框中。它们通常还应该基本上邻接，尽管这也可以不是必需的。

优选地，本发明的遗传构建体的调节以及其它元件是这样的，即，它们能够在要用的宿主细胞或宿主生物体内提供它们需要的生物学功能。

例如，在要用的宿主细胞或宿主生物体中，启动子、增强子或终止子应该是“可操作的”，这意味着(例如)所述启动子应该能够起始或者另外控制/调节与其可操作性地连接(如本文所定义)的核苷酸序列――例如，编码序列――的转录和/或表达。

关于可以存在于/用于本发明的遗传构建体的启动子、选择标记、前导序列、表达标记和其它元件的一些(其它)非限制性的实例――诸如终止子、转录和/或翻译增强子和/或整合因子――参考上文提及的通用手册，诸如sambrook等和ausubel等，以及wo95/07463,wo96/23810,wo95/07463,wo95/21191,wo97/11094,wo97/42320,wo98/06737,wo98/21355,us-a-6,207,410,us-a-5,693,492和ep1085089中给出的实例。其它实例对于专业技术人员应该是清楚的。参考也参见上文引用的公知背景技术和本文引用的其它参考文献。

本发明的遗传构建体通常可以通过将本发明的核苷酸序列与上文所述的一个或多个其它元件适当地连接而提供，例如应用上文提及的通用手册诸如sambrook等和ausubel等中所述的技术。

通常，本发明的遗传构建体通过将本发明的核苷酸序列插入到本身已知的适当的(表达)载体中而获得。适当的表达载体的一些优选的但非限制性的实例是下述实施例中所用的那些，以及本文提及的那些。

本发明的核酸和/或本发明的遗传构建体可以用于转化宿主细胞或宿主生物体，即，用于表达和/或生产本发明的纳米抗体或多肽，或用于基因疫苗接种。适当的宿主或宿主细胞是专业技术人员所清楚的，并且例如可以是任何适当的真菌的、原核的或真核的细胞或细胞系，或者任何适当的真菌的、原核的或真核的生物体。

根据本发明的一个非限制性实施方案，本发明的免疫球蛋白序列、纳米抗体或多肽被糖基化。根据本发明的另一个非限制性实施方案，本发明的免疫球蛋白序列、纳米抗体或多肽未被糖基化。

在本发明的上下文中，“基因疫苗接种”包括将核酸序列，例如，dna序列转移到适于诱导针对由所述核酸序列编码的蛋白的免疫反应的靶标动物的任何已知的方法或方式。专业技术人员知晓标准基因疫苗接种方法。根据本发明，基因疫苗接种可以通过无针喷射注射、通过冲击法、通过针头介导的注射如纹身、通过以贴片将dna局部施用到皮肤上、或通过任意这些施用方法而后通过体内电穿孔进行，并且还包括通过皮内、肌内或皮下施用dna进行的疫苗接种。

在基因疫苗接种的情形中，术语“基因”是指任何适当类型或种类的核酸分子，例如，如本文定义，诸如dna,rna,cdna,双链dna,其包括含有修饰的核苷酸的核酸分子(诸如pna)，其中所述核酸分子编码本文定义的细胞相关抗原，并且适于在非人动物中引起表达，从而可以产生免疫反应。

核酸分子的实例包括dna,rna,pna,cdna,双链dna,以及包含例如增加体内或体外稳定性的化学修饰的其它形式的核酸分子。

核酸分子可以是适于在动物中表达所述抗原的表达载体、质粒或任何其它的核酸分子或遗传构建体形式。合适的核酸分子是专业技术人员已知的，并且包括商购表达载体和质粒。具体地，非限制性的实例包括可从aldevron获得的商购pvax1构建体、或编码乙型肝炎小表面抗原(hbsag)的真核表达载体prc/cmv-hbs(s)，其可以通过常规方法改造以表达目的抗原。

用于哺乳动物细胞的载体的一些非限制性的实例包括：pmamneo(clontech),pcdna3(invitrogen),pmc1neo(stratagene),psg5(stratagene),ebo-psv2-neo(atcc37593),pbpv-1(8-2)(atcc37110),pdbpv-mmtneo(342-12)(atcc37224),prsvgpt(atcc37199),prsvneo(atcc37198),psv2-dhfr(atcc37146),puctag(atcc37460)和1zd35(atcc37565),以及基于病毒的表达系统，诸如基于腺病毒的那些；

基因疫苗接种通过包括适于在非人动物中表达靶抗原的元件的适宜的核酸或遗传构建体进行。所述元件包括编码抗原或其部分的结构信息的元件，条件是该结构信息体现目的构象表位。遗传构建体还包括负责控制表达的元件，诸如适宜的启动子、增强子、终止子和专业技术人员已知的其它控制序列。具体地，本发明包括使用在体内转染后允许组成型表达的启动子。适宜的启动子的具体的、非限制性实例是组成型巨细胞病毒(cytomegalovirus)(cmv)启动子。专业技术人员已知多种其它适宜的启动子，包括但不限于，在哺乳动物细胞中表达的启动子：人巨细胞病毒(hcmv)即时早期增强子/启动子；人巨细胞病毒(hcmv)即时早期启动子变体，其包含两个四环素操纵子序列，以致所述启动子可以受tet阻抑物调节；单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus)胸苷激酶(tk)启动子；劳斯肉瘤病毒长末端重复(rsvltr)增强子/启动子；来自于人、黑猩猩、小鼠或大鼠的延伸因子1α(hef-1α)启动子；sv40早期启动子；hiv-1长末端重复启动子；β-肌动蛋白启动子。

本发明包括通过本领域已知的方法以适当的量生产基因疫苗接种所需要的核酸分子。例如，可以使用无内毒素gigaprep试剂盒(qiagen)按照供应商的使用说明生产低内毒素质粒dna。

对于基因疫苗接种，本文所述的核酸分子可以以适当的形式配制。例如，所述核酸分子，诸如载体或质粒，最终在无内毒素的h2o中，优选在lal(鲎变形细胞溶解物(limulusamaebocytelysate))h2o(即，已经用lal检测过内毒素的水)中或在lalh2o中的无内毒素的0.9％nacl中，或专业技术人员已知的的另一种适宜的缓冲液或溶液中重建。重建的核酸分子可以以整分试样在溶液中保存在-20℃,或者备选地可以以冻干形式保存，以便在使用之前重建。

所述核酸分子稀释成适当的稀释物，以用于基因疫苗接种，例如，浓度为0.1-10mg/ml,特别地1-5mg/ml,更特别地1mg/ml。

对于基因疫苗接种，将所述核酸分子以本文列出的适当形式施用至动物。用于皮内施用dna的适当的方法的具体实例包括无针喷射注射(pig-jet),纹身法(bins,等.,naturemedicine(自然医学)11:899-904),使用vacci-jet(robbinsinstruments(罗宾斯器械),美国)的无针喷射注射,通过以贴片将dna局部施用到皮肤上或使用helios基因枪(biorad)以冲击法施用dna。所有的dna施用法之后可以进行体内电穿孔，以提高细胞转染效率。

在任一种上述方法的情形中，所述核酸可以与适当的载体缔合。例如，所述核酸可以与颗粒缔合，所述颗粒包括但不限于金颗粒。专业技术人员已知用于将核酸与适当的载体缔合的常规技术。

在本发明的情形中，“非人动物”包括，但不限于，脊椎动物，鲨鱼，哺乳动物，蜥蜴，骆驼科动物，美洲驼，优选骆驼科动物，且最优选美洲驼或羊驼(alpaca)。

b)本发明的方法

本发明涉及用于产生可以结合细胞相关抗原和/或具有针对细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列(如本文定义)的方法。所述方法包括，但不限于，下述步骤：

a)用这样的核酸基因疫苗接种非人动物，所述核酸编码所述细胞相关抗原或所述细胞相关抗原的结构域或特定部分，或所述细胞相关抗原的结构域或特定部分与例如免疫调控遗传元件的遗传融合体，或所述细胞相关抗原嫁接在骆驼科动物直系同源序列上的结构域或特定部分；和

b)任选地用采用其天然构象的所述抗原加强所述动物，所述采用其天然构象的抗原选自：包括表达所述细胞相关抗原(或所述抗原的抗原结构域或特定部分)的天然的或转染的细胞的细胞、细胞来源的膜提取物、携带富集抗原的小泡或任何其它膜衍生物、脂质体或表达所述细胞相关抗原的病毒颗粒；

c)筛选来源于所述非人动物的免疫球蛋白序列的组、集合或文库，以获得可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列。

因此，在通用术语中，本发明的方法包括本文定义的非人动物的基因疫苗接种。在一个具体的实施方案中，所述非人动物是骆驼科动物。

本发明的一个特别的优点在于这样的事实：其提供了用于产生广泛适用于一定范围的抗原的免疫球蛋白序列的稳健方法。本发明的方法不受蛋白抗原的可及性的限制。具体地，没有要求纯化抗原。有利地，所述方法还排除对在细胞上表达的抗原、或在膜环境中存在的抗原的需要，因为其可以通过仅用基因疫苗接种进行。因此，本发明的方法广泛适用于上述示例的任何抗原，并且不限于这些。具体地，所述方法适用于相应的核酸序列已知或可以通过常规方法鉴定的抗原。

因此，与缺少这样稳健和广泛适用性的现有技术方法相比，本发明是优越的。特别地，在现有技术中没有关于在动物中如骆驼科动物、特别是美洲驼中产生免疫球蛋白序列的这样稳健的方法的教导。

具体地，本发明提供一种用于产生针对细胞相关抗原的免疫球蛋白序列的改善的方法，按照一个具体的实施方案，其无需用纯化的蛋白加强，其通过dna疫苗接种诱导免疫反应，然后筛选可以结合所述细胞相关抗原的免疫球蛋白序列。更具体地，本发明提供用于产生针对细胞相关抗原的免疫球蛋白序列(包括纳米抗体)的方法，所述方法包括下述步骤：

a)用编码所述细胞相关抗原(或所述抗原的抗原结构域或特定部分)的核酸疫苗接种骆驼科动物；和

b)筛选来源于所述骆驼科动物的免疫球蛋白序列的组、集合或文库，以获得可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列。

还已经令人吃惊地发现，甚至在与基于蛋白或细胞的免疫相比较，在dna疫苗接种后血清抗体滴度较低的情形中，筛选特异性免疫球蛋白序列提供了可比较的击中(hit)率，即，可以获得可比较的特异性免疫球蛋白序列的频率。此外，鉴定的结合剂的亲和力较高(如本文定义)。这强调了本发明导致更特异性的高亲和力免疫球蛋白反应和允许更有效的筛选和分离特异性的免疫球蛋白的特别的优点。由现有技术不能预见到通过dna疫苗接种可以获得这样的优点，特别是当被免疫的动物关于血清抗体滴度表现出较低的免疫反应时。

在备选的实施方案中，本发明提供一种用于产生针对细胞相关抗原的免疫球蛋白序列(包括纳米抗体)的方法，所述方法包括下述步骤：

a)用编码所述细胞相关抗原(或所述抗原的抗原结构域或特定部分)的核酸疫苗接种骆驼科动物；

b)例如，使用表达所述细胞相关抗原(或所述抗原的抗原结构域或特定部分)的转染的细胞，用细胞膜提取物或用表达所述细胞相关抗原的病毒颗粒，用以其天然构象存在的细胞相关抗原加强所述骆驼科动物，和

c)筛选来源于所述骆驼科动物的免疫球蛋白序列的组、集合或文库，以获得可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列。

疫苗接种

在本发明的方法中，进行适于在动物中诱导免疫反应的基因疫苗接种。更具体地，基因疫苗接种必须适于在动物中诱导反映为产生免疫球蛋白序列的免疫反应。在动物血清中检测抗体反应也称为“血清转化”。专业技术人员可以通过常规方法确定抗体反应而监测基因疫苗接种。因此，专业技术人员可以容易地确定诱导适当的抗体反应所需要的适当的剂量和频率。

优选地，基因疫苗接种诱导足够的抗体滴度。抗体滴度对应于产生特异性抗体的细胞数目，所述细胞允许通过分离和/或筛选产生免疫球蛋白序列。然而，如上文指出的，本发明的方法允许甚至在较常规方法仅存在低的血清抗体滴度时成功分离高亲和力的免疫球蛋白序列。例如，基因疫苗接种允许在较在蛋白加强后获得的血清滴度(其与通过常规蛋白免疫技术可获得的抗体滴度相当)低例如2倍的血清抗体滴度下成功分离高亲和力免疫球蛋白序列。在具体的实施方案中，所述血清抗体滴度可以低4倍，优选低9倍。血清滴度可以通过常规方法确定，例如，包括elisa或facs。

本发明其它方面的重要性是通过基因疫苗接种获得的抗体全体成员的宽度。具体地，本发明的一方面在于抗体反应针对线性表位和构象表位二者，并且重要地是针对膜依赖型构象表位。

因此，本发明涉及适于在非人动物中获得足够滴度和宽度的抗体反应的基因疫苗接种。

在一个实施方案中，本发明可以包括在动物的一个或多个部位的单次基因疫苗接种。例如，骆驼科动物可以在1,2,3,4,5或多个部位注射，所述部位可以彼此紧邻或者以适当位置分布在动物身体上。在具体的实例中，骆驼科动物，例如，美洲驼，在颈部多至5个相邻的部位接受基因疫苗接种。不证自明的是用于基因疫苗接种的区域必须是洁净且无毛的。因此，本发明包括适当的去毛方式，诸如剃毛和化学方式，诸如脱毛膏或通过胶带物理去除毛发。

在本发明的一个方面中，已经令人惊讶地发现，施用dna疫苗的位置影响可获得的免疫球蛋白序列，特别是影响多样性和表位优选性。

本发明包括重复的基因疫苗接种，例如，以适当的时间间隔进行的2,3,4或5次的基因疫苗接种。所述时间间隔优选是数天至数周，例如，3天-4周，更优选地5天-两周。合适的时间间隔包括，在第0,3,7,21,24,28,56,59和63天，备选地在第0,14,28和57天，备选地在第0,3,7,21,24,28,56,59和63天，备选地在第0,14,28和42天进行基因疫苗接种。

在一个具体的实施方案中，基因疫苗接种每周或每隔一周进行，直到在动物中引发了足够的抗体反应。

在更具体的实施方案中，在第0,14,28和57天进行皮内施用，例如，通过无针注射进行。在另一个具体的实施方案中，在第0,3,7,21,24,28,56,59和63天进行纹身，其为一种短时间间隔的纹身法。更具体的实例包括在第0,14,28和42天通过无针注射免疫。在冲击法基因疫苗接种中，剂量可以是在多至500-600psi的压力设置下12次发射1μgdna/mg金，其以0,14,28和42天间隔施用。

在一个具体的实施方案中，本发明涉及使用适当的dna施用技术然后体内电穿孔进行基因疫苗接种。已经令人惊讶地发现，这种施用模式较常规基因疫苗接种法有利。例如，体内电穿孔在疫苗接种功效方面是有利的，即，其导致更明显的、和/或更可靠的免疫反应。在这一情形中，更可靠意指在个体动物之间观察到较低的免疫反应变异性，并且特别是通过筛选可获得的“击中”的数目的较低的变异性。此外，使用电穿孔允许通过改变系统的设置而容易地将疫苗接种方案适应于所需要的透深，例如，在皮内、皮下或肌内疫苗接种之间选择。此外，考虑到某些动物的相对厚且硬的皮肤，诸如骆驼科动物，电穿孔还允许良好的疫苗接种功效，并且容易适应以不同的皮肤特性为特征的各种不同的免疫位置。

专业技术人员可以选择适于基因疫苗接种的适当的核酸分子剂量。例如，0.1-10mg核酸,特别是1-5mg,更特别是1-2mg,或1mg核酸可以用于一次基因疫苗接种施用(例如，在第0天)，导致累积剂量，其取决于重复基因疫苗接种的次数。

当在动物中证实适当的抗体反应时，在本发明的一个实施方案中，免疫球蛋白序列可以通过本文所述的方法直接从所述动物分离，即，无需蛋白加强。抗体反应的检测可以通过常规方法进行，诸如elisa,ria,facs,或任何其它检测抗体的方法。

蛋白加强

备选地，所述方法还包括用合适来源的蛋白加强动物。具体地，考虑用包括本文定义的以其天然构象存在的细胞相关抗原、特别是跨膜抗原的组合物加强动物。所述组合物可以包括表达所述抗原的细胞，或所述细胞的碎片或衍生物，诸如膜级分，分离的细胞器，或其它适当的制备物。病毒、脂质体、胶束或其它适于含有以其天然构象存在的细胞相关抗原的系统也在考虑之内。

在本发明的一个方面中，抗原可以在同源细胞上表达。例如，对于骆驼科动物的免疫，抗原可以在骆驼科动物细胞上表达。骆驼科动物免疫系统耐受所述骆驼科动物细胞，即，其不将产生针对该细胞中所包括的大部分抗原的免疫反应。然而，如果向所述细胞中人工引入异源抗原，其包括但不限于本文定义的细胞相关抗原，则动物的免疫系统将产生特别针对所述抗原的免疫反应。这具有这样的优点：免疫反应主要针对目的抗原，即，其特征在于提高的针对该抗原的特异性。专业技术人员应该理解，这种方法可以用于相关的物种。例如，考虑到它们相近的关系，骆驼来源的细胞可以用于免疫美洲驼，反之亦然。

可以使用与待免疫的动物同源的任何适宜的细胞。例如，骆驼科动物细胞可以用于免疫骆驼科动物，例如，美洲驼细胞用于免疫美洲驼。适宜的细胞包括，但不限于，自发无限增殖的细胞，例如，癌细胞或未分化的细胞，诸如胚胎来源的细胞。适宜的细胞还包括通过已知方法人工无限增殖化的细胞。

在施用至动物之前，可以有利地处理细胞，使其体内增殖减少或消除。适当的处理包括，但不限于，化学和物理处理。适当的物理处理的一个具体的实例是用x射线照射，以使细胞不再增殖。

任何上述细胞还可以凭自身用于免疫本文定义的非人动物，即，不依赖于dna疫苗接种。

优选地，蛋白富集在任何上述制备物中，以加强免疫反应。例如，使用高效启动子在细胞中重组表达可以用来增加每个细胞的抗原产量。在一个实施方案中，当使用骆驼科动物作为非人动物时，表达目的抗原的细胞可以是骆驼科动物来源的细胞，优选是无限增殖化的骆驼科动物来源的细胞。对所述细胞进行遗传修饰以表达所述抗原。

此外，专业技术人员应该理解，本发明还包括使用常用的佐剂，以在疫苗接种的情形中增强免疫反应。蛋白制剂还可以是增强免疫反应的物理形式，诸如例如，凝胶或乳剂。佐剂的具体而非限制性的实例包括stimune或specol(cedidiagnostics(cedi诊断),lelystad,荷兰),弗氏完全佐剂,弗氏不完全佐剂,titermax(金),单磷酰基脂质a(monophosphoryllipida)(mpl),alum,quila,cpgdna。

本发明包括使用以其天然构象存在的所述蛋白来源(任选地使用佐剂)的单次或多次加强。蛋白加强将以适当的时间间隔进行，这可以通过常规方法确定，例如，通过监测动物中的免疫球蛋白反应而确定。

加强可以通过不同的施用途径进行，包括，但不限于，皮内，皮下或肌内施用。

在一个具体的实施方案中，本发明涉及减少在动物中激发适当的免疫反应所需要的蛋白施用的次数。因此，基因疫苗接种-蛋白加强(也称为“致敏-加强”)策略将消除对动物重复蛋白加强的需要。举例来说，这减轻了动物的负担，促进且加速了流程，并且减少了产生所述免疫球蛋白序列所必需的抗原的量。因此，本发明的基因疫苗接种-蛋白加强策略可以令人惊讶地在动物血液中导致与包括多次蛋白加强的常规方法相同的抗体滴度，即使在基因疫苗接种后不给予蛋白加强或仅给予单次蛋白加强。

使用细胞作为用于加强的抗原来源的致敏-加强策略的另一个特别的优点在于这样的事实，抗体反应特征在于较已知方法特别高的特异性。换言之，由于dna致敏，通过细胞加强引发的记忆性免疫反应主要针对目的抗原，并且在所述细胞上的任何其它的抗原决定簇都不显著影响整体免疫反应。因此，本发明所述的dna致敏-细胞加强在特异性方面是特别有利的，因此导致有利的“击中率”，即，当筛选时产生大量特异性免疫球蛋白序列。

因此，在包括蛋白加强的实施方案中，具体的技术效果包括增强的免疫反应。并且，提高了属于同一b细胞谱系的不同功能性纳米抗体的序列多样性。与已鉴定的序列相比，本发明所述的加强仅在基因免疫后引起先前未鉴定的氨基酸置换的引入，这是加强介导的体内成熟的指示。

筛选/分离免疫球蛋白序列

本发明所述的基因疫苗接种在动物中诱导免疫反应。然后，从所述动物分离免疫球蛋白序列的组、集合或文库。“分离”包括：a)分离来自所述动物的序列，例如，通过取样适当的组织，和b)选出特异性的序列，例如，通过筛选进行，即，分离特异性结合剂的“击中”。

专业技术人员非常熟悉建立适宜的免疫球蛋白序列的组、集合或文库并从中筛选目的序列的技术。专业技术人员可以常规参考例如wo02/085945和wo04/049794中所述的技术。还可以参考wo99/37681,wo01/90190,wo03/025020和wo03/035694中所述的技术和方法。备选地，可以使用由按照本发明免疫的动物获得的例如来源于vhh文库的改善的合成的或半合成的文库，诸如通过诸如随机诱变和/或cdr改组的技术由vhh文库获得的vhh文库，例如，如在wo00/43507中所述。

本发明包括从动物分离包括免疫球蛋白序列的物质，诸如，但不限于，产生抗体的细胞。例如，可以通过常规方法分离外周血单核细胞(pbmcs)。其它物质包括外周血淋巴细胞(pbls)，外周淋巴结，特别是引流免疫部位的淋巴结，脾，骨髓，或其它免疫学相关的物质。

在一个具体而非限制的实例中，可以收集包含b细胞的血液样品，并且可以通过标准方法纯化外周血淋巴细胞(pbls)。例如，可以按照供应商的使用说明使用在ficoll-paque(amershambiosciences(安玛西亚生物科学),乌普萨拉,瑞典)上的密度梯度离心。

任意上述物质，包括，例如，由动物分离的pbls，包括多种免疫球蛋白序列，即，免疫球蛋白序列的组、集合或文库。

在例如，在pbmcs上表达的所述多种免疫球蛋白序列中，可以直接分离所需要的免疫球蛋白特异性，例如，通过细胞的免疫淘选(immunopanning)进行。

备选地，编码免疫球蛋白序列的组、集合或文库的核酸序列可以分离、转移和表达在细胞或病毒的组、集合或样品上。

可以通过适当的方法分离和进一步加工遗传物质，从而分离编码具有所需要特异性的免疫球蛋白序列的所述序列。为了这一目的，例如，可以通过适当的方法从所述物质提取编码所述多种多样免疫球蛋白序列的核酸序列，并且转移到接受体细胞或病毒中进行表达。专业技术人员熟悉提取免疫球蛋白序列并且操作这些序列例如在细胞或病毒中的表达文库中进行表达的适宜的技术。一些非限制性的实例包括产生在例如大肠杆菌(e.coli)或噬菌体中的表达文库。

在一个具体而非限制性的实例中，可以从所述物质提取总rna。所述总rna可以通过已知的方法转化成cdna。使用该cdna，可以通过常规方法，包括例如，本领域已知的pcr,或巢式pcr法(参见上述专利文献)，扩增免疫球蛋白序列，诸如例如，纳米抗体全体成员。

包括免疫球蛋白序列的核酸分子可以使用适当的限制性酶消化，任选地然后例如通过凝胶电泳纯化。消化的序列可以连接到适宜的遗传构建体(诸如载体或质粒)中的相对应的限制性位点中。适宜的载体的非限制性实例包括噬菌体展示载体，例如，pax50。pax50包含lacz启动子,大肠杆菌噬菌体piii蛋白编码序列,氨苄青霉素或羧苄青霉素抗性基因,多克隆位点(携带sfii和bsteii限制性位点)和嵌合的前导序列，所述前导序列由基因3和胡萝卜软腐欧文氏菌(erwiniacarotovora)pelb基序组成。该展示载体允许产生噬菌体颗粒，其表达作为与基因iii产物的融合蛋白的单个纳米抗体。

例如，通过转化适宜的宿主生物体，如大肠杆菌，连接的核酸分子可以用来获得文库。专业技术人员知晓适宜的转化技术，例如，化学方法，电穿孔，和其它的技术。因此，可以获得适宜大小(例如，1e7-1e8)的文库。

在一个实施方案中，可以通过培养细菌至对数期(例如，od600＝0.5)，然后用辅助噬菌体感染以获得在噬菌体顶端作为piii融合蛋白表达克隆的免疫球蛋白序列的全体成员的重组噬菌体而拯救文库，所获得的噬菌体可以例如，在过滤灭菌后，保存用于进一步的应用，例如，保存在4℃。

筛选细胞或病毒的组、集合或文库，以获得表达可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列的细胞或病毒，更特别地，可以从所述细胞或病毒纯化和/或分离编码可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列的核酸序列，然后表达所述免疫球蛋白序列。

因此，本发明还包括适当的筛选步骤，以从在非人动物中存在的多个序列中选择和分离针对目的抗原的免疫球蛋白序列(或编码其的核酸序列)。所述筛选方法包括适于选出与目的免疫球蛋白序列相关的细胞、病毒、表达构建体或序列的所有方法。专业技术人员非常清楚多种适当的技术，包括噬菌体展示，免疫淘选等。当然，本发明还涉及已知方法的组合。适当的组合是专业技术人员所清楚的。

在一个具体的实施方案中，可以通过适宜的细胞相关抗原的来源的单轮、或多轮淘选而选择表达免疫球蛋白序列的文库或噬菌体，所述来源包括但不限于，包括目的抗原的(固定的)细胞或脂质体。

在一轮选择后，例如，通过免疫淘选，输出结果可以作为库重新克隆到适当的表达载体中，用于进一步的选择和/或处理。

按照本发明，可以纯化和/或分离可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列。

专业技术人员可以使用标准技术生产免疫球蛋白。因此，在通过筛选方法鉴定了编码目的免疫球蛋白序列的细胞、病毒或核酸序列后，例如，通过重组表达可以生产所述免疫球蛋白序列。为了这一目的，可以直接使用所述细胞或病毒，或者可以将编码所述免疫球蛋白序列的核酸转移到适当的表达系统中，所述表达系统包括适宜的宿主细胞。宿主细胞包括哺乳动物系统，诸如cho细胞，真核系统，诸如昆虫细胞或真菌，包括例如巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)，和原核系统，诸如大肠杆菌。专业技术人员已知用于在这些宿主系统中表达免疫球蛋白序列的适宜的表达载体和工具。

本发明的免疫球蛋白序列,纳米抗体和核酸可以以本身已知的方法制备，专业技术人员将从本文的描述中而清楚。专业技术人员应该理解哪些具体实例适于基因疫苗接种，适于产生和/或筛选免疫球蛋白序列的组、集合或文库，或适于在选择抗原特异性序列后生产免疫球蛋白序列。

例如，本发明的多肽可以以本身已知的用于制备抗体且特别是用于制备抗体片段(包括但不限于，(单)结构域抗体和scfv片段)的任何方法制备。

如专业技术人员所清楚的，用于制备本发明的多肽的一种特别有用的方法包括下述步骤：

在适宜的宿主细胞或宿主生物体(本文也称为“本发明的宿主”)或在另一种适宜的表达系统中表达编码本发明的所述纳米抗体或多肽的核酸(本文也称为“本发明的核酸”，该术语还用于为了疫苗接种的遗传构建体，这从具体的上下文中清楚可见)，任选地然后：

分离和/或纯化这样获得的本发明的纳米抗体或多肽。

此外，可以通过标准技术纯化所产生的免疫球蛋白，包括沉淀，亲和层析，大小排阻层析，离子交换层析，hplc,过滤，和其它已知的纯化方法。

此外，所述免疫球蛋白序列可以通过已知方法进一步表征，例如，以确定其表位特异性，结合动力学等。

免疫球蛋白序列

本发明还涉及可通过本文所述的方法可获得的免疫球蛋白序列,即，多肽分子，和包括所述免疫球蛋白序列的组合物。所述组合物包括用于研究目的的组合物和用于治疗的药物组合物。专业技术人员熟悉标准技术和关于免疫球蛋白序列的治疗应用的制剂。因此，在一个方面中，本发明的方法包括纯化特异性免疫球蛋白序列和它们作为药物组合物的制剂。

本发明提供基本上是分离形式的免疫球蛋白序列，即，是至少90％纯,至少95％纯,至少98％,至少99％,或至少99.99％纯的形式。在一个非限制性实施方案中，纯度意指在制备物中不存在其它免疫球蛋白序列。在另一个非限制性实施方案中，纯度意指在组合物中不存在来自制备生物体的污染物。

本发明还包括作为可通过本文公开的方法获得的免疫球蛋白序列的衍生物的免疫球蛋白序列。例如，本发明包括可通过本领域已知的方法获得的人源化的免疫球蛋白序列。此外，本发明包括同样可通过本领域已知的方法获得的骆驼源化的免疫球蛋白序列。本发明还包括已知的的免疫球蛋白序列结构变体。

针对乙型肝炎小表面抗原的免疫球蛋白序列

本发明涉及针对(如本文定义)乙型肝炎小表面抗原的免疫球蛋白序列，以及涉及包括一种或多种所述免疫球蛋白序列或基本上由一种或多种所述免疫球蛋白序列组成的化合物或构建体，特别是蛋白和多肽(在本文中还分别称为“本发明的免疫球蛋白序列”,“本发明的化合物”,和“本发明的多肽”)。本发明还涉及编码所述免疫球蛋白序列和多肽的核酸(在本文中还称为“本发明的核酸”或“本发明的核苷酸序列”)；涉及制备所述免疫球蛋白序列和多肽的方法；涉及表达或能够表达所述免疫球蛋白序列或多肽的宿主细胞；包括所述免疫球蛋白序列、多肽、核酸和/或宿主细胞的组合物，特别是药物组合物；并且涉及所述免疫球蛋白序列或多肽、核酸、宿主细胞和/或组合物的应用，特别是用于预防、治疗或诊断目的，诸如本文提及的预防、治疗或诊断目的的应用。

针对离子通道的免疫球蛋白序列

本发明涉及针对(如本文定义)离子通道的免疫球蛋白序列，以及包括一种或多种所述免疫球蛋白序列或基本上由一种或多种所述免疫球蛋白序列组成的化合物或构建体，且特别是蛋白和多肽(在本文中还分别称为“本发明的免疫球蛋白序列”,“本发明的化合物”,和“本发明的多肽”)。本发明还涉及编码所述免疫球蛋白序列和多肽的核酸(在本文中还称为“本发明的核酸”或“本发明的核苷酸序列”)；涉及制备所述免疫球蛋白序列和多肽的方法；涉及表达或能够表达所述免疫球蛋白序列或多肽的宿主细胞；包括所述免疫球蛋白序列、多肽、核酸和/或宿主细胞的组合物，特别是药物组合物；并且涉及所述免疫球蛋白序列或多肽、核酸、宿主细胞和/或组合物的应用，特别是用于预防、治疗或诊断目的，诸如本文提及的预防、治疗或诊断目的的应用。

xu等.,naturebiotechnology(自然生物技术),2005年10月,1289-1293和benham,naturebiotechnology(自然生物技术),2005年10月,1234-1235,描述了阻断具有6-跨膜结构域结构的离子通道的方法，其中使用在兔中产生的针对特定细胞外环(即，第三细胞外区(e3))的多克隆抗体。然而，兔多克隆抗体不适用于在人类中的治疗应用。因此，本发明的目的是提供可以用于预防、治疗或诊断与离子通道相关和/或与离子通道的生物学和/或生理学活性相关的疾病和病症的治疗性化合物。当用于本文时，疾病或病症的“预防”和“治疗”通常包括有益于患有所述疾病或病症或处于所述疾病或病症的危险中的受试者的治疗效果，并且例如，还包括减轻或预防疾病的一种或多种症状，和预防或减缓疾病的发作和/或(进一步)进展。

具体地，本发明的目的是提供能够调控离子通道的所述治疗性化合物。“调控离子通道”在本文中通常意指，当接触或另外适当地与所述离子通道相互作用时(即，在适当体外条件下，细胞或体内测定中和/或在适当的动物模型中；且特别是在生理条件下，即，当适当施用给受试者时)，所述化合物提供关于所述离子通道和/或关于与所述离子通道相关的生物学和/或生理学功能的激动或拮抗作用。

本发明的另一个目的是提供可以用于预防、治疗和/或诊断这样的疾病和病症的治疗性化合物，所述疾病和病症可以分别以预防或治疗(即，通过向需要所述治疗的受试者施用一种或多种所述化合物，如本文进一步所述)或诊断目的(也如本文进一步所述)使用本文所述的治疗性化合物进行治疗、预防和/或诊断。具体地，本发明的目的是提供可以用于预防、治疗和/或诊断这样的疾病和病症的治疗性化合物，所述疾病和病症分别可以通过调控(如本文定义)至少一种离子通道而治疗、预防和/或诊断。另一个目的是提供这样的化合物，其不具有与使用多克隆抗体、与使用在兔中产生的抗体、和与使用常规4-链抗体相关的缺点。本发明的再一个目的是提供可以用于容易地产生所述化合物的方法。

本发明的一个具体而非限制性的目的是提供针对离子通道的蛋白和/或多肽，和提供用在所述蛋白或多肽中的免疫球蛋白序列，与由xu等所述的常规多克隆兔抗体或其片段相比，其具有改善的治疗和/或药理学特性和/或其它有利的特性(诸如例如，改善的制备容易性和/或减少的商品成本)。这些改善的和有利的特性将通过本文进一步的描述变得清楚。上述目的通常通过(使用)本文所述的免疫球蛋白序列和组合物而实现。

本发明的免疫球蛋白序列、多肽和组合物通常可以用于调控离子通道的开放和/或关闭(或增强其开放和/或关闭)和/或调控离子通过离子通道的流动(即，增加或减少所述流动，或部分或完全阻断所述流动；以不可逆的方式但是优选以可逆的方式)。同样地，本发明的多肽和组合物通常可以用于调控其中涉及离子通道和/或离子通过离子通道的流动的生物学功能、途径、反应、效果、机制和作用。特别地，本发明的多肽和组合物可以用于减少或抑制(即，完全或部分，且以不可逆的方式但是优选以可逆的方式)离子通过离子通道的流动。同样地，本发明的免疫球蛋白序列、多肽和组合物通常可以作用为离子通道的(完全或部分)阻断剂和/或(完全或部分)开放剂(同样以不可逆的方式但是优选以可逆的方式)和/或作用为离子通道和/或其中涉及离子通道和/或离子通过离子通道的流动的生物学功能、途径、反应、效果、机制和作用的激动剂或拮抗剂。因此，本发明的多肽和组合物可以用于预防和治疗(如本文定义)与离子通道相关的疾病和病症。通常，“与离子通道相关的疾病和病症”可以定义为这样的疾病和病症：所述疾病和病症可以分别通过向需要其的受试者(即，患有所述疾病或病症或具有至少一种其症状和/或处于易患或发展所述疾病或病症的危险中)适当施用本发明的多肽或组合物(且特别地，其药用活性量)和/或已知的针对离子通道有活性的活性成分而预防或治疗。基于本文的公开内容，专业技术人员将清楚与离子通道相关的所述疾病和病症的实例，并且例如，包括在本文引用的现有技术中提及的疾病和病症，其依赖于本发明的免疫球蛋白序列或化合物/多肽所针对的离子通道。因此，但不限于此，例如，本发明的免疫球蛋白序列和多肽可以用于预防和/或治疗目前用可以调控离子通道的活性成分来预防或治疗的所有疾病和病症，诸如在上述引用的现有技术中提及的那些。还考虑本发明的多肽可以用来预防和/或治疗所有这样的疾病和病症，所述疾病和病症目前正开发、已经提议、或将来将提议或开发用所述活性成分进行治疗。另外，由于本文进一步所述的其有利的特性，考虑本发明的多肽可以用于预防和治疗除对其正使用这些已知的活性成分或将提议或开发的那些疾病和病症之外的其它疾病和病症；和/或本发明的多肽可以提供用于治疗本文所述的疾病和病症的新方法和方案。

通过本文进一步的公开内容，专业技术人员将清楚本发明的免疫球蛋白序列和多肽的其它应用和用途。通常，本发明提供针对(如本文定义)和/或可以特异性结合(如本文定义)离子通道的免疫球蛋白序列；以及包括至少一种所述免疫球蛋白序列的化合物和构建体，且特别是蛋白和多肽。更具体地，本发明提供可以以本文定义的亲和力(适当测量和/或表示为kd-值(实际的或表观的),ka-值(实际的或表观的),kon-速率和/或koff-速率,或备选地为ic50值,如本文进一步所述)结合离子通道的免疫球蛋白序列；以及包括至少一种所述免疫球蛋白序列的化合物和构建体，且特别是蛋白和多肽。

具体地，本发明的免疫球蛋白序列和多肽优选是这样的，即，它们：

-以10^-5-10^-12摩尔/升或更小、并且优选地10^-7-10^-12摩尔/升或更小、并且更优选地10^-8-10^-12摩尔/升的解离常数(kd)(即，以10⁵-10¹²升/摩尔或更大、并且优选地10⁷-10¹²升/摩尔或更大、且更优选地10⁸-10¹²升/摩尔的缔合常数(ka))与离子通道结合；

和/或是这样的，即，它们：

-以10²m^-1s^-1–约10⁷m^-1s^-1,优选10³m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1,更优选10⁴m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1,诸如10⁵m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1的kon-速率与离子通道结合；

和/或是这样的，即，它们：

-以1s^-1(t1/2＝0.69s)-10^-6s^-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合体),优选10^-2s^-1-10^-6s^-1,更优选10^-3s^-1-10^-6s^-1,诸如10^-4s^-1-10^-6s^-1的koff速率与离子通道结合。

优选地，本发明的单价免疫球蛋白序列(或包含仅一个本发明的免疫球蛋白序列的多肽)优选是这样的，即，它将以小于500nm,优选小于200nm,更优选小于10nm,诸如小于500pm的亲和力与离子通道结合。对于本发明的免疫球蛋白序列或多肽与离子通道结合的一些优选的ic50值将从本发明的进一步描述和实施例中变得显而易见。对于与离子通道结合，本发明的免疫球蛋白序列通常将在其免疫球蛋白序列内包含一个或多个氨基酸残基、或氨基酸残基的一个或多个序列(即，每个“序列(stretch)”包括彼此相邻或彼此紧邻的两个(或多个)氨基酸残基，即，在该免疫球蛋白序列的一级或三级结构上)，通过其本发明的免疫球蛋白序列可以与离子通道结合，因此所述氨基酸残基或氨基酸残基的序列形成结合离子通道的“位点”(本文还称为“抗原结合位点”)。

本发明提供的免疫球蛋白序列优选地采用基本上分离形式(如本文所定义)、或形成本发明的蛋白或多肽的一部分(如本文所定义)，其可以包括一个或多个本发明的免疫球蛋白序列或基本上由一个或多个本发明的免疫球蛋白序列组成，并且其可以任选地还包括一个或多个其它的免疫球蛋白序列(全部任选地通过一个或多个适当的接头连接)。例如，并且不限于，本发明的一个或多个免疫球蛋白序列可以用作在这样的蛋白或多肽内的结合单位，所述蛋白或多肽可以任选地包含可以充当结合单位的一个或多个其它的免疫球蛋白序列(即，针对除离子通道外的一个或多个其它靶标)，以便分别提供单价、多价或多特异性的本发明的多肽，全如本发明所述。这样的蛋白或多肽也可以采用基本上分离的形式(如本文所定义)。

因此，本发明的免疫球蛋白序列和多肽优选地基本上由不通过二硫键与任一另一免疫球蛋白序列或链连接(但是其可以或可以不包含一个或多个分子内二硫键。例如，已知纳米抗体----如本文所述----有时可以含有在cdr3和cdr1或fr2之间的二硫键)的单个氨基酸链组成。然而，应该注意，一个或多个本发明的免疫球蛋白序列可以彼此连接和/或与其他免疫球蛋白序列连接(例如，通过二硫键)，以提供也可以用于本发明的肽构建体(例如，fab’片段,f(ab’)2片段,scfv构建体,“双抗体”和其他多特异性构建体。例如，参考holliger和hudson,natbiotechnol.(自然生物技术)2005年9月；23(9):1126-36的综述))。一般地，当本发明的免疫球蛋白序列(或包含其的化合物、构建体或多肽)意欲施用给受试者时(例如，为了如本文所述的治疗和/或诊断目的)，优选其是在所述受试者内天然不存在的免疫球蛋白序列；或当它的确在所述受试者内天然存在时，采用基本上分离的形式(如本文所定义)。

专业技术人员还应该清楚，对于药物应用，本发明的免疫球蛋白序列(以及包含其的化合物、构建体和多肽)优选地针对人离子通道；而对于兽医用目的，本发明的免疫球蛋白序列和多肽优选地针对来自待治疗的物种的离子通道，或至少与来自待治疗的物种的离子通道交叉反应。

此外，本发明的免疫球蛋白序列可以任选地，并且除了所述至少一个针对离子通道结合的结合位点之外，包含针对其它抗原、蛋白或靶标结合的一个或多个其它的结合位点。

本发明的免疫球蛋白序列和多肽的功效、以及包含其的组合物的功效可以使用任何适合的体外测定、基于细胞的测定、体内测定和/或本身已知的动物模型、或它们的任何组合进行检测，这取决于所涉及的具体的疾病或病症。适当的测定和动物模型对于专业技术人员来说将是清楚的，并且例如，包括本文引用的综述和现有技术中提及的测定和动物模型。

并且，根据本发明，针对来自第一温血动物物种的离子通道的免疫球蛋白序列和多肽可以或可以不表现出与来自一种或多种其它温血动物物种的离子通道的交叉反应性。例如，针对人离子通道的免疫球蛋白序列和多肽可以或可以不表现出与来自一种或多种其它灵长类物种(诸如，不限于，小鼠，来自猕猴属(macaca)的猴子(诸如，并且特别地，食蟹猴(食蟹猴(macacafascicularis))和/或恒河猴(恒河猴(macacamulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(papioursinus)))的离子通道的交叉反应性，和/或与来自通常用于疾病的动物模型中(例如小鼠、大鼠、兔、猪或狗)、且特别是用于与离子通道相关的疾病和紊乱的动物模型中的一种或多种动物物种(诸如本文提及的物种和动物模型)的离子通道的交叉反应性。在这一方面，对于专业技术人员应该清楚，从药物开发观点来看，所述交叉反应性，当存在时，可能具有优点，因为它允许所述针对人离子通道的免疫球蛋白序列和多肽在所述疾病模型中被检测到。

更一般地，与来自多个哺乳动物物种的离子通道交叉反应的本发明的免疫球蛋白序列和多肽将通常有利于用于兽医应用，原因在于它将允许在多种物种之间使用相同的免疫球蛋白序列或多肽。因此，在本发明的范围内还包括，针对来自一个动物物种的离子通道的免疫球蛋白序列和多肽(诸如针对人离子通道的免疫球蛋白序列和多肽)可以用于治疗另一个动物物种，只要所述免疫球蛋白序列和/或多肽的应用在待治疗的物种中提供所需要的作用。

本发明的免疫球蛋白序列(以及包括其的多肽)优选是这样的，即，它们能够调控(如本文定义)离子通道。特别地，本发明的免疫球蛋白序列(以及包括其的多肽)优选是这样的，即，它们能够调控(完全或部分)阻断离子通道。用化合物分别“完全或部分阻断”离子通道分别意指，通过所述免疫球蛋白序列或多肽调控离子通道导致减少的通过该通道的离子流动(即，与当没有所述免疫球蛋白序列/多肽与所述离子通道之间的相互作用时通过所述离子通道的离子流动相比较，这通过适当的测定法诸如本文所述的那些确定)或基本上没有通过该通道的离子流动，而不管所述离子通道被所述免疫球蛋白序列或多肽阻断的具体机制。例如，但不限于，所述免疫球蛋白序列或多肽可以直接通过与离子通道的表位(或其至少一个亚单位)结合而部分或完全阻断所述离子通道，从而使通过所述通道的离子流动被完全或部分阻断(例如，通过空间位阻或空间相互作用)；或者间接地，例如，通过与离子通道的一个或多个细胞外部分、区域、结构域或环相互作用，或通过影响离子通道的(可能的)构象，或通过限制所述离子通道可能进行构象改变的程度和/或速率而进行。

本发明作为离子通道的阻断剂的免疫球蛋白序列或多肽优选是这样的，即，如使用适当的测定(诸如本发明提及的那些)确定的，与在不存在所述免疫球蛋白序列/多肽与所述离子通道之间的相互作用时通过所述离子通道的离子流相比较，其减少通过所述通道的离子流至少1％，优选至少5％，诸如至少10％，例如25％或更多，或甚至50％或更多，多至75％，或甚至超过90％或更多。

本发明作为离子通道的开放剂的免疫球蛋白序列或多肽优选是这样的，即，如使用适当的测定(诸如本发明提及的那些)确定的，与在不存在所述免疫球蛋白序列/多肽与所述离子通道之间的相互作用时通过所述离子通道的离子流相比较，其增加通过所述通道的离子流至少1％，优选至少5％，诸如至少10％，例如25％或更多，或甚至50％或更多，多至75％，或甚至超过90％或更多。

本发明作为离子通道和/或与其相关的生物学功能或反应的激动剂的免疫球蛋白序列或多肽优选是这样的，即，如使用适当的测定(诸如本发明提及的那些)确定的，与在不存在所述免疫球蛋白序列/多肽与所述离子通道之间的相互作用时的生物学功能或反应相比较，其增加所需要的生物学功能或反应至少1％，优选至少5％，诸如至少10％，例如25％或更多，或甚至50％或更多，多至75％，或甚至超过90％或更多。

本发明作为离子通道和/或与其相关的生物学功能或反应的拮抗剂的免疫球蛋白序列或多肽优选是这样的，即，如使用适当的测定(诸如本发明提及的那些)确定的，与在不存在所述免疫球蛋白序列/多肽与所述离子通道之间的相互作用时的生物学功能或反应相比较，其减少所需要的生物学功能或反应至少1％，优选至少5％，诸如至少10％，例如25％或更多，或甚至50％或更多，多至75％，或甚至超过90％或更多。

本发明作为离子通道的阻断剂或开放剂(或增强阻断剂或开放剂)和/或作为离子通道或与其相关的生物学功能或反应的激动剂或拮抗剂的免疫球蛋白序列或多肽可以以不可逆方式提供其合乎需要的活性，但是优选以可逆方式提供其合乎需要的活性。

本发明在其最广泛意义上也不特别限于或限定于本发明的免疫球蛋白序列和多肽所针对的离子通道的特异性抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚单位或构象(confirmation)(在适用时)。

本发明的免疫球蛋白序列和多肽可以针对任何需要的离子通道，并且可以特别针对具有至少一个细胞外结构域的离子通道。更具体地，但不限于，本发明的免疫球蛋白序列和多肽可以针对任何需要的离子通道，所述离子通道具有至少一个跨膜结构域，更具体地至少两个跨膜结构域，诸如至少四个跨膜结构域(例如，4-tm离子通道)或六个以上的跨膜结构域(例如，6-tm离子通道)。基于本文引用的现有技术，专业技术人员将清楚所述离子通道的实例。例如，参考上文引用的goldstein等.,yu等.,clapham和garbers,hoffmann等.,kubo等.,wei等.,shieh等.(例如，参见第559页的图2),catterall等,gutman等.,clapham等.,catterall等的综述。如本文进一步所述，例如，本发明的免疫球蛋白序列和多肽可以针对所述跨膜结构域的细胞外部分，且特别针对连接所述跨膜结构域的细胞外环/重复(例如，同样参考shieh等第559页的图2和xu等，同前所述在第1290页的图1，其示意性显示2-tm,4-tm和6-tm离子通道的所述细胞外环)。

在一个优选的但非限制性的方面中，本发明的免疫球蛋白序列和多肽针对6-tm离子通道(诸如，但不限于，上文提及的kv–离子通道(例如，kv1.1-kv9.3,kvlqt离子通道,slo和ikca10)),并且特别针对连接所述6-tm离子通道的跨膜结构域的细胞外环/重复中的一个，诸如e1,e2,且特别是e3环，或是在重复2,3和4的s5和s6之间的区域。

然而，按照本发明的具体方面，本发明的免疫球蛋白序列或多肽可以针对(如本文定义)在细胞表面上表达的离子通道和/或针对离子通道的至少一个细胞外区域、结构域、环或其它细胞外表位。

具体地，按照这一方面，本发明的免疫球蛋白序列或多肽针对(如本文定义)离子通道的至少一个细胞外区域、结构域、环或其它细胞外表位；且优选地进一步是这样的，即，本发明的所述免疫球蛋白序列或多肽能够调控(如本文定义)所述离子通道。更具体地，按照这一方面，本发明的免疫球蛋白序列或多肽针对(如本文定义)离子通道的至少一个细胞外区域、结构域、环或其它细胞外表位；且优选地进一步是这样的，即，本发明的所述免疫球蛋白序列或多肽能够(完全或部分)阻断所述离子通道。

按照本发明的这一方面，本发明的免疫球蛋白序列或多肽可以针对任何适宜的细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位，但是优选针对跨膜结构域的一个细胞外部分，或更优选地针对连接跨膜结构域的一个细胞外环。更具体地，当所述离子通道是6-tm通道时,蛋白或多肽(且特别是本文描述的至少一种免疫球蛋白序列)可以针对连接跨膜结构域的细胞外e3环(和/或可以已经针对所述细胞外e3环和/或针对衍生于或基于所述细胞外e3环的序列的合成或半合成的肽而产生)。

通过kyte-doolittle分析相关离子通道的免疫球蛋白序列；通过比对属于同一(亚)家族的离子通道并且鉴定各个跨膜结构域和细胞外部分、区域、结构域或环(包括e3环)；通过tmap-分析；或通过它们的任何适当的组合；可以衍生其它适宜的细胞外部分、区域、结构域、环或表位。本发明还涉及针对所述细胞外部分、区域、结构域、环或表位的免疫球蛋白序列(如本文进一步定义)(和/或已经针对包括所述细胞外部分、区域、结构域、环或表位的免疫球蛋白序列的部分或片段和/或针对衍生于或基于所述细胞外部分、区域、结构域、环或表位的合成的或半合成的肽而生成)。

具体地，本发明的免疫球蛋白序列和多肽优选是这样的，即，它们：

-以10^-5-10^-12摩尔/升或更小、并且优选地10^-7-10^-12摩尔/升或更小并且更优选地10^-8-10^-12摩尔/升的解离常数(kd)(即，以10⁵-10¹²升/摩尔或更大、并且优选地10⁷-10¹²升/摩尔或更大、且更优选地10⁸-10¹²升/摩尔的缔合常数(ka))而结合离子通道的细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位(如本文定义)；

和/或是这样的，即，它们：

-以10²m^-1s^-1–约10⁷m^-1s^-1,优选10³m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1,更优选10⁴m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1,诸如10⁵m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1的kon-速率结合离子通道的细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位(如本文定义)；

和/或是这样的，即，它们：

-以1s^-1(t1/2＝0.69s)-10^-6s^-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合体),优选10^-2s^-1-10^-6s^-1,更优选10^-3s^-1-10^-6s^-1,诸如10^-4s^-1-10^-6s^-1的koff速率结合离子通道的细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位(如本文定义)。

优选地，本发明的单价免疫球蛋白序列(或仅包含一个本发明的免疫球蛋白序列的肽)优选是这样的，即，其将以小于500nm、优选地小于200nm、更优选地小于10nm诸如小于500pm的亲和力与离子通道的细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位(如本文定义)结合。

关于本发明的免疫球蛋白序列或多肽结合离子通道的细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位(如本文定义)的结合的一些优选的ic50值将通过本文的进一步描述和实施例而变得清楚。

此外，按照这一方面，本发明的任何多价或多特异性(如本文定义)多肽还可以适当地针对同一抗原上的两个或多个不同的细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位，例如，针对两个不同的细胞外环，针对跨膜结构域的两个不同的细胞外部分，或针对一个细胞外环和一个细胞外环。所述本发明的多价或多特异性多肽还可以具有(或被改造和/或选择)关于所需要的离子通道的增加的抗体亲抗原性和/或提高的选择性，和/或关于可以使用所述多价或多特异性多肽获得的任何其它理想的特性或理想的特性组合的增加的抗体亲抗原性和/或提高的选择性。

当本发明的免疫球蛋白序列或多肽针对肽抗原本身时，例如，在按原样使用本发明的肽抗原(例如，而不是作为较大的蛋白或多肽的部分，例如，作为细胞表面上存在的离子通道的部分的肽抗原)来确定本发明的免疫球蛋白序列或多肽针对所述肽抗原的结合(即，所述结合的特异性，亲和力，kd,ka,kon或koff；全部如本文所述)的标准测定中，也可以认为本发明的免疫球蛋白序列或多肽“针对”(如本文进一步定义)所述肽抗原。专业技术人员清楚用于确定免疫球蛋白序列或多肽与小肽结合的技术，并且例如包括本文所述的技术。

当本发明的免疫球蛋白序列或多肽已经针对肽抗原筛选，使用肽抗原选择和/或针对(即，通过适当免疫哺乳动物，如本文进一步所述)肽抗原生成时，也可以认为本发明的免疫球蛋白序列或多肽“针对”(如本文进一步定义)所述肽抗原。用于生成针对本发明的肽抗原的本发明的免疫球蛋白序列和多肽的技术和用于关于针对本发明的肽抗原的结合筛选或选择本发明的免疫球蛋白序列和多肽的技术是专业技术人员所清楚的，例如，基于本文进一步公开的内容。

通常，本发明的免疫球蛋白序列和多肽针对本发明的肽抗原本身，和/或已经针对本发明的肽抗原筛选、使用本发明的肽抗原选择和/或针对本发明的肽抗原生成，预测本发明的免疫球蛋白序列和多肽也能够结合(且特别地，特异性结合，如本文定义)形成存在于细胞表面上的离子通道(或至少其一个亚单位)的一部分的本发明的肽抗原。因此，本发明的肽抗原可以特别用于生成本发明的免疫球蛋白序列和多肽(如本文定义)的方法；并且所述方法和应用形成本发明的进一步的方面。

例如，这样的方法可以包括下述步骤之一或下述两个步骤的适当的组合：

a)用适当的抗原适当免疫骆驼科动物的步骤，所述抗原包括所需要的细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位，从而产生针对所需要的细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位的免疫反应。所述抗原可以是能够产生针对所需要的细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位的免疫反应的任何适当的抗原；诸如例如，且不限于，在其表面上具有所需要的细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位的全细胞，其细胞壁碎片或来源于所述细胞的任何其它适当的制备物，在其表面上具有所需要的细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位的小泡，包括所需要的细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位的离子通道的亚单位的亚单位或片段，或包括和/或基于所需要的细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位(的免疫球蛋白序列)的合成的或半合成的肽；

和/或

b)筛选关于所需要的细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位的亲和性和/或结合的步骤。例如，这可以通过下述进行：筛选在其表面上表达重链抗体的细胞(例如，从适当免疫的骆驼科动物获得的b细胞)的组、集合或文库；筛选vhh序列或纳米抗体序列的(首次用于实验的或免疫的)文库，或筛选编码vhh序列或纳米抗体序列的核酸序列的(首次用于实验的或免疫的)文库；这些可以全部以本身已知的方法进行，关于其参考进一步的公开内容和本文提及的现有技术；

且该方法可以任选地进一步包括一个或多个本身已知的其他合适步骤，诸如，例如且不限于，亲和力成熟的步骤，表达所需免疫球蛋白序列的步骤，筛选针对所需抗原(在该情形中，离子通道)结合和/或针对所需抗原(在该情形中，离子通道)的活性的步骤，确定所需免疫球蛋白序列或核苷酸序列的步骤，引入一个或多个人源化置换(例如如本文中进一步所述)的步骤，以合适的多价和/或多特异性形式格式化的步骤，筛选所需生物学和/或生理学性质(即利用合适的测定，诸如本文中所述的那些)的步骤；和/或一个或多个所述步骤以任何合适顺序的任何合适的组合。

所述方法和通过所述方法获得的免疫球蛋白序列，以及包含所述免疫球蛋白序列或基本由其组成的蛋白和多肽形成本发明的其他方面。

在优选的实施方案中，本发明的免疫球蛋白序列或多肽是“单克隆”免疫球蛋白序列或多肽,这意味着所述针对所述蛋白或多肽中存在的离子通道(且优选所述蛋白或多肽中存在的全部免疫球蛋白序列)的一个或多个免疫球蛋白序列至少每一个是“单克隆的”，如专业技术人员通常理解那样。然而，在该方面，应该注意到，如进一步在本文中所述，本发明明确地涵盖包含两个或更多个免疫球蛋白序列(且特别地，单克隆免疫球蛋白序列)的多价或多特异性蛋白，所述两个或更多个免疫球蛋白序列针对相同离子通道的不同部分、区域、结构域、环或表位，且特别地，针对相同离子通道的不同细胞外部分、区域、结构域、环或表位。

在另一个方面中，本发明涉及包括至少一种本发明的免疫球蛋白序列或本发明的免疫球蛋白序列的至少一个部分、片段、类似物、变体或衍生物或基本上由其组成的蛋白或多肽，其中所述蛋白或多肽能够调控(如本定义)离子通道。优选地，所述蛋白或多肽能够完全或部分阻断(如本定义)离子通道。

本文所述的蛋白或多肽优选地针对在细胞表面上表达的离子通道和/或针对离子通道的至少一个细胞外区域、结构域、环或其他细胞外表位，更优选地针对离子通道的至少一个细胞外环。在一个具体的方面中，当所述离子通道是具有六个跨膜结构域(6-tm)的离子通道时，所述蛋白或多肽优选地针对细胞外e3环。本文所述的蛋白或多肽还可以针对本发明的肽抗原。

在一个具体的方面中，本发明涉及包括至少一种本发明的免疫球蛋白序列或本发明的免疫球蛋白序列的至少一个部分、片段、类似物、变体或衍生物或基本上由其组成的蛋白或多肽，其中在蛋白或多肽中存在的至少一种本发明的免疫球蛋白序列(或本发明的免疫球蛋白序列的至少一个部分、片段、类似物、变体或衍生物)针对离子通道。优选地，在蛋白或多肽中存在的至少一种本发明的免疫球蛋白序列(或本发明的免疫球蛋白序列的至少一个部分、片段、类似物、变体或衍生物)能够调控离子通道，且更优选地完全或部分阻断离子通道。此外，优选地，在蛋白或多肽中存在的至少一种本发明的免疫球蛋白序列(或本发明的免疫球蛋白序列的至少一个部分、片段、类似物、变体或衍生物)针对离子通道的至少一个细胞外区域、结构域、环或其他细胞外表位，且特别针对离子通道的一个细胞外环。在一个具体的方面中，当所述离子通道是具有六个跨膜结构域(6-tm)的离子通道时，在所述蛋白或多肽中存在的至少一种本发明的免疫球蛋白序列优选地针对细胞外e3环。

本文所述的蛋白或肽可以包括单个本发明的免疫球蛋白序列(或本发明的免疫球蛋白序列的部分、片段、类似物、变体或衍生物)、或备选地至少两种(诸如两种、三种、四种或更多种)本发明的免疫球蛋白序列(或本发明的免疫球蛋白序列的部分、片段、类似物、变体或衍生物)(其任选地通过一个或多个适当接头(如本文定义)而适当连接)或基本上由其组成。所述接头的适当的实例是本领域的专业技术人员所清楚的，例如，基于本文进一步公开的内容。

在本发明的一个方面中，当蛋白或多肽包括至少两种本发明的免疫球蛋白序列时，在所述蛋白或多肽中存在的至少两种本发明的免疫球蛋白序列(或本发明的免疫球蛋白序列的部分、片段、类似物、变体或衍生物)针对相同的离子通道。例如，在所述蛋白或多肽中存在的至少两种本发明的免疫球蛋白序列(或本发明的免疫球蛋白序列的部分、片段、类似物、变体或衍生物)可以针对相同离子通道上的不同的细胞外区域、结构域、环或其他细胞外表位。然而，优选地在所述蛋白或多肽中存在的至少一种(或至少两种)本发明的免疫球蛋白序列(或本发明的免疫球蛋白序列的部分、片段、类似物、变体或衍生物)针对离子通道的至少一个细胞外环。

当本发明的蛋白或多肽包括至少两种本发明的免疫球蛋白序列(或本发明的免疫球蛋白序列的部分、片段、类似物、变体或衍生物)或基本上由其组成时，其可以包括至少两种不同的本发明的免疫球蛋白序列(或本发明的免疫球蛋白序列的部分、片段、类似物、变体或衍生物)，和/或包括至少两种相同的本发明的免疫球蛋白序列(或本发明的免疫球蛋白序列的部分、片段、类似物、变体或衍生物)。

在一个具体的方面中，当本发明的蛋白或多肽包括至少两种本发明的免疫球蛋白序列(或本发明的免疫球蛋白序列的部分、片段、类似物、变体或衍生物)或基本上由其组成时，其可以包括至少一种针对不同于离子通道的蛋白、多肽或其他抗原的本发明的免疫球蛋白序列(或本发明的免疫球蛋白序列的部分、片段、类似物、变体或衍生物)。

在另一个方面中，本发明涉及本发明的免疫球蛋白序列，或发明的免疫球蛋白序列的能够调控离子通道的部分、片段、类似物、变体或衍生物。优选地，所述本发明的免疫球蛋白序列能够完全或部分阻断(如本文定义)离子通道。

本文所述的本发明的免疫球蛋白序列优选地针对离子通道的至少一个细胞外区域、结构域、环或其他细胞外表位，更优选地针对离子通道的至少一个细胞外环。在一个具体的方面中，当所述离子通道是具有六个跨膜结构域(6-tm)的离子通道时，本发明的免疫球蛋白序列优选针对细胞外e3环。

在适用时，本发明的免疫球蛋白序列可以结合于离子通道的两个以上的抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚单位或构象，这也在本发明范围内。在此情况下，本发明的免疫球蛋白序列和/或多肽结合的离子通道的抗原决定簇、表位、部分、结构域或亚单位可以基本上是相同的(例如，如果离子通道包含重复的结构基序或以多聚体形式存在)，或可以是不同的(并且在后一种情况下，本发明的免疫球蛋白序列和多肽可以以可能相同或不同的亲和力和/或特异性结合于离子通道的所述不同的抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚单位)。此外，例如，当离子通道以活化构象存在和以无活性构象存在时，本发明的免疫球蛋白序列和多肽可以结合于这些构象中的任一种，或者可以结合于这两种构象(即，以可能是相同的或不同的亲和力和/或特异性)。此外，例如，本发明的免疫球蛋白序列和多肽可以这样地结合于离子通道的构象，即，在所述构象中其与相关配体结合，可以这样地结合于离子通道的构象，即，在所述构象中其不与相关配体结合，或者可以结合于所述两种构象(同样以可能是相同的或不同的亲和力和/或特异性)。

还期望本发明的免疫球蛋白序列和多肽通常将结合于离子通道的所有天然存在的或合成的类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段；或至少结合于离子通道的下面的那些类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段，即它们包含与在离子通道中(例如在野生型离子通道中)与本发明的免疫球蛋白序列和多肽结合的(一个或多个)抗原决定簇或(一个或多个)表位基本上相同的一个或多个抗原决定簇或表位。同样地，在此情况下，本发明的免疫球蛋白序列和多肽可以以本发明的免疫球蛋白序列与(野生型)离子通道结合的亲和力和特异性相同或不同(即，高于或低于其)的亲和力和/或特异性结合于所述类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段。本发明的免疫球蛋白序列和多肽结合于离子通道的一些类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段而不结合于另一些，这也包括在本发明的范围内。

当离子通道以单体形式存在和以一个或多个多聚体形式存在时，本发明的免疫球蛋白序列和多肽只结合单体形式的离子通道，只结合多聚体形式的离子通道，或结合单体和多聚体形式二者，这在本发明的范围内。同样地，在这样的情形中，本发明的免疫球蛋白序列和多肽可以以与本发明的免疫球蛋白序列和所述多聚体形式结合的亲和力和特异性相同或不同(即，高于或低于其)的亲和力和/或特异性与单体形式结合。

此外，当离子通道可以与其他蛋白或多肽缔合以形成蛋白复合体(例如，具有多个亚基)时，本发明的免疫球蛋白序列和多肽与处于其非缔合状态的离子通道结合，与处于其缔合状态的离子通道结合，或与二者均结合，这在本发明的范围内。在所有这些情形中，本发明的免疫球蛋白序列和多肽可以以与本发明的免疫球蛋白序列和多肽与处于其单体和非缔合状态的离子通道结合的亲和力和/或特异性可能是相同的或不同(即，高于或低于其)的亲和力和/或特异性与所述多聚体或缔合的蛋白复合体结合。

此外，对于专业技术人员应该是清楚的，包含两个或更多个针对离子通道的免疫球蛋白序列的蛋白或多肽可以以比相对应的一个或多个单体免疫球蛋白序列更高的抗体亲抗原性与离子通道结合。例如，但不限于，包含两个或更多个针对离子通道的不同表位的免疫球蛋白序列的蛋白或多肽可以(并且通常将)以比不同单体的每一个更高的抗体亲抗原性结合，并且包含两个或更多个针对离子通道的免疫球蛋白序列的蛋白或多肽还可以(并且通常将)以更高的抗体亲抗原性结合离子通道的多聚体。

一般地，本发明的免疫球蛋白序列和多肽将至少结合那些形式的离子通道(包括单体、多聚体和缔合形式)，从生物学和/或治疗观点看来，这些形式是最相关的，这对于专业技术人员将是清楚的。使用本发明的免疫球蛋白序列和多肽的部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物，和/或使用包括一个或多个所述部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物或基本上由其组成的蛋白或多肽，也在本发明的范围内，只要这些适用于本发明考虑的应用。所述部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物通常将包含(至少部分地)针对离子通道结合的功能性抗原-结合位点；并且更优选地将能够特异性结合离子通道，并且甚至更优选地能够以如本发明所定义的亲和力(适当地测量和/或表示为kd-值(实际的或表观的),ka-值(实际的或表观的),kon-速率和/或koff-速率,或备选地作为ic50值,如本发明进一步所述)结合离子通道。所述部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因、衍生物、蛋白和/或多肽的一些非限制性实例将通过本发明的进一步描述变得清楚。还可以通过适当组合(即，通过连接或基因融合)一个或多个(更小的)本发明所述的部分或片段而提供本发明的其他片段或多肽。

在本发明的一个具体而非限制性方面中，其将在本发明中进一步描述，与衍生它们的免疫球蛋白序列相比，所述类似物、突变体、变体、等位基因、衍生物具有增加的半衰期(如本发明进一步所述)。例如，可以将本发明的免疫球蛋白序列连接到(化学或其他方式)一个或多个延长半衰期的基团或结构部分(诸如peg)上，以提供具有增加的半衰期的本发明的免疫球蛋白序列的衍生物。

在一个具体而非限制性的方面中，本发明的免疫球蛋白序列可以是包括免疫球蛋白折叠的免疫球蛋白序列，或可以是在适当条件(诸如生理条件)下能够形成免疫球蛋白折叠(即，通过折叠)的免疫球蛋白序列。其中特别参考halaby等,j.(1999)蛋白质工程(proteineng.)12,563-71的综述。优选地，当正确折叠以形成免疫球蛋白折叠时，这样的免疫球蛋白序列能够特异性结合(如本发明所定义)离子通道；并且更优选地能够以如本发明所定义的亲和力(适当地测量和/或表示为kd-值(实际的或表观的),ka-值(实际的或表观的),kon-速率和/或koff-速率,或备选地作为ic50值,如本发明进一步所述)结合离子通道。此外，所述免疫球蛋白序列的部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物优选是这样的，即，它们包括免疫球蛋白折叠或者能够在适当的条件下形成免疫球蛋白折叠。

特别地，但不限于，本发明的免疫球蛋白序列可以是基本上由4个构架区(分别为fr1-fr4)和3个互补性决定区(分别为cdr1-cdr3)组成的免疫球蛋白序列；或所述免疫球蛋白序列的任何适当的片段(那么其通常将包含至少一些形成至少一个cdr的氨基酸残基，如本文进一步所述)。

在这样的本发明的免疫球蛋白序列中，所述构架序列可以是任何适当的构架序列，并且例如，基于标准手册和进一步公开的内容以及本发明引用的现有技术，适当的构架序列的实例对于专业技术人员将是清楚的。

所述构架序列优选是免疫球蛋白构架序列或已经来源于免疫球蛋白构架序列(例如，通过人源化或骆驼源化)的构架序列(的适当组合)。例如，所述构架序列可以是来源于轻链可变结构域(例如，vl-序列)和/或来源于重链可变结构域(例如，vh-序列)的构架序列。在一个特别优选的方面中，所述构架序列是已经来源于vhh-序列的构架序列(其中所述构架序列可以任选地已经被部分或完全人源化)或是已经骆驼源化(如本文所定义)的常规vh序列。

所述构架序列优选地是这样的，以致本发明的免疫球蛋白序列是结构域抗体(或适合用作结构域抗体的免疫球蛋白序列)；是单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的免疫球蛋白序列)；是"dab"(或适合用作dab的免疫球蛋白序列)；或是纳米抗体^tm(包括但不限于vhh序列)。同样地，例如，基于标准手册和进一步的公开内容以及本文所提及的现有技术，适当的构架序列对于专业技术人员将是清楚的。

特别地，在本发明的免疫球蛋白序列中存在的所述构架序列可以包含一个或多个标志残基(如本文所定义)，以致本发明的免疫球蛋白序列是纳米抗体^tm。所述构架序列(的适当的组合)的一些优选的、而非限制性的实例将通过本文进一步的公开内容变得清楚。

同样地，如本文关于本发明的免疫球蛋白序列概括所述，还可以使用前述任一种的适当的片段(或片段组合)，诸如包含适当与一个或多个构架序列侧连和/或通过一个或多个构架序列连接的一个或多个cdr序列的片段(例如，以如这些cdr相同的顺序，并且构架序列可以以衍生所述片段的完全大小的免疫球蛋白序列存在)。所述片段还可以也是这样的，以致它们包括或可以形成免疫球蛋白折叠，或者备选地是这样的，以致它们不包括或不能形成免疫球蛋白折叠。

在一个具体的方面中，这样的片段包括如本文所述的单cdr序列(并且特别是cdr3序列)，其在每一边侧连构架序列(的一部分)(并且特别地，在衍生所述片段的免疫球蛋白序列中与所述cdr序列相邻的构架序列的一部分。例如，cdr3序列可以在fr3序列(的一部分)之后并且在fr4序列(的一部分)之前)。这样的片段还可以包含二硫键，并且特别是连接分别在所述cdr序列之前和之后的两个构架区的二硫键(为了形成这样的二硫键的目的，可以使用在所述构架区中天然存在的半胱氨酸残基，或备选地，半胱氨酸残基可以合成添加或引入到所述构架区)。对于这些“加速片段(expeditefragments)”的进一步描述，同样参考wo03/050531，以及wo2009/127691。

本发明的免疫球蛋白序列可以特别是免疫球蛋白序列或其适当的片段，并且更特别地是免疫球蛋白可变结构域序列或其适当的片段，诸如轻链可变结构域序列(例如，vl-序列)或其适当的片段；或重链可变结构域序列(例如，vh-序列)或其适当的片段。当本发明的免疫球蛋白序列是重链可变结构域序列时，它可以是来源于常规四链抗体的重链可变结构域序列(诸如，不限于，来源于人抗体的vh序列)，或是来源于所谓的“重链抗体”(如本文所定义)的所谓的vhh-序列(如本文所定义)。

然而，应该注意到，本发明不限制本发明的免疫球蛋白序列的来源(或用于表达其的本发明的核苷酸序列的来源)，也不限制产生或获得(或已经产生或获得)本发明的免疫球蛋白序列或核苷酸序列的方法。因此，本发明的免疫球蛋白序列可以是天然存在的免疫球蛋白序列(来自任何适当的物种)或合成的或半合成的免疫球蛋白序列。在本发明的具体而非限制性方面，所述免疫球蛋白序列是天然存在的免疫球蛋白序列(来自任何适当的物种)或合成的或半合成的免疫球蛋白序列，包括但不限于“人源化的”(如本文所定义)免疫球蛋白序列(诸如部分或完全人源化的小鼠或兔免疫球蛋白序列,并且特别是部分或完全人源化的vhh序列或纳米抗体),“骆驼源化的(camelized)”(如本文所定义)免疫球蛋白序列,以及已经通过下列技术获得的免疫球蛋白序列：诸如亲和力成熟(例如，起始于合成的、随机的或天然存在的免疫球蛋白序列),cdr嫁接,镶盖术(veneering),组合来源于不同的免疫球蛋白序列的片段,利用重叠的引物进行的pcr装配,以及专业技术人员公知的加工免疫球蛋白序列的相似技术；或前述任一项的任何适当的组合。例如，参考标准手册，以及进一步描述和本文提及的现有技术。

类似地，本发明的核苷酸序列可以是天然存在的核苷酸序列或合成的或半合成的序列,并且例如，可以是通过pcr从适当的天然存在的模板(例如，从细胞分离的dna或rna)分离的序列，已经从文库(并且特别是表达文库)分离的核苷酸序列，已经通过向天然存在的核苷酸序列中引入突变(利用任何适当的本身已知的技术，诸如错配pcr)而制备的核苷酸序列，已经使用重叠的引物通过pcr制备的核苷酸序列，或已经利用本身已知的dna合成技术制备的核苷酸序列。

特别地，本发明的免疫球蛋白序列可以是纳米抗体^tm(如本文所定义)或其适当的片段。[注意：纳米抗体^tm(nanobody^tm),纳米抗体^tm(nanobodies^tm)和纳米克隆^tm(nanoclone^tm)为埃博灵克斯股份有限公司(ablynxn.v.)的商标。]所述针对离子通道的纳米抗体在本文也称为“本发明的纳米抗体”。对于纳米抗体的概括描述，参考下文的进一步描述，以及参考本文所引用的现有技术。在这一方面，然而，应该注意到，本文描述和现有技术主要描述所谓“vh3种类”的纳米抗体(即，与vh3种类的人种系序列如dp-47、dp-51或dp-29具有高度序列同源性的纳米抗体)，所述纳米抗体形成本发明的优选方面。然而，应该注意到，本发明在其最广泛意义上通常涵盖任何类型的针对离子通道的纳米抗体，并且例如，还涵盖属于所谓的“vh4种类”的纳米抗体(即，与vh4种类的人种系序列如dp-78具有高度序列同源性的纳米抗体)，例如，如在埃博灵克斯股份有限公司(ablynxn.v.)于2006年4月14日提交的题目为“dp-78样纳米抗体(dp-78-likenanobodies)”的美国临时申请60/792,279中描述。

一般地，纳米抗体(特别是vhh序列和部分人源化的纳米抗体)可以特别地特征在于，在一个或多个构架序列(同样如本文进一步所述)中存在一个或多个“标志残基(hallmarkresidues)”(如本文所述)。因此，通常，纳米抗体可以定义为具有下述(通用)结构的免疫球蛋白序列：

fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4

其中fr1-fr4分别是指构架区1-4,并且其中cdr1-cdr3分别是指互补性决定区1-3,并且其中一个或多个标志残基如本文进一步所定义。

特别地，纳米抗体可以是具有下述(通用)结构的免疫球蛋白序列：

fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4

其中fr1-fr4分别是指构架区1-4,并且其中cdr1-cdr3分别是指互补性决定区1-3,并且其中所述构架序列如本文进一步所定义。

特别地，纳米抗体可以是具有下述(通用)结构的免疫球蛋白序列：

fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4

其中fr1-fr4分别是指构架区1-4,并且其中cdr1-cdr3分别是指互补性决定区1-3,并且其中所述构架序列如本文进一步所定义。

更特别地，纳米抗体可以是具有下述(通用)结构的免疫球蛋白序列：

fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4

其中fr1-fr4分别是指构架区1-4,并且其中cdr1-cdr3分别是指互补性决定区1-3,并且其中：

i)优选地，在按照kabat编号的位置11,37,44,45,47,83,84,103,104和108的氨基酸残基的一个或多个选自下表b-2中提及的标志残基；

并且其中：

ii)所述免疫球蛋白序列与seqidno’s:1–22中的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成cdr序列的氨基酸残基(在序列seqidno’s:1–22中表示为x)。

在这些纳米抗体中，所述cdr序列通常如本文进一步所定义。

因此，本发明还涉及这样的纳米抗体，其可以结合(如本文定义)和/或针对离子通道，涉及其适当的片段，以及涉及包含一种或多种所述纳米抗体和/或适当的片段或基本上由其组成的多肽。

seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775或778-780(参见表a-1)给出了多种已经针对离子通道产生的vhh序列的免疫球蛋白序列。

表a-1:优选的vhh序列或纳米抗体序列(本文也称为具有特定名称的序列或seqidno:x,其中x是引用相关免疫球蛋白序列的编号):

特别地，本发明在一些具体的方面中提供下述：

-这样的免疫球蛋白序列，其针对(如本文定义)离子通道，且其与seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780(参见表a-1)中的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％，优选至少85％，诸如90％或95％以上的序列同一性。这些免疫球蛋白序列可以进一步是这样的，即，它们中和同源配体与离子通道的结合；和/或与同源配体竞争与离子通道的结合；和/或针对离子通道上的相互作用位点(如本文定义)(诸如配体结合位点)；

-这样的免疫球蛋白序列，其交叉阻断(如本文定义)seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780(参见表a-1)中的至少一种免疫球蛋白序列与离子通道的结合，和/或与seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780(参见表a-1)中的至少一种免疫球蛋白序列竞争与离子通道的结合。同样地，这些免疫球蛋白序列可以进一步是这样的，即，它们中和同源配体与离子通道的结合；和/或与同源配体竞争与离子通道的结合；和/或针对离子通道上的相互作用位点(如本文定义)(诸如配体结合位点)；

所述免疫球蛋白序列可以如本文进一步所述(并且例如可以是纳米抗体)；以及包括一种或多种所述免疫球蛋白序列的本发明的多肽(其可以如本文进一步所述，并且例如可以是本文所述的双特异性和/或双互补位多肽)，和编码所述免疫球蛋白序列和多肽的核酸序列。所述免疫球蛋白序列和多肽不包括任何天然存在的配体。

因此，一些特别优选的本发明的纳米抗体是可以结合(如本文进一步定义)和/或针对离子通道的纳米抗体，并且其：

i)与seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780(参见表a-1)中的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性的程度的目的，忽略形成cdr序列的氨基酸残基。在这一点上，也参考表b-1，该表列出了seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780(参见表a-1)的纳米抗体的构架1序列(seqidno’s:126-207),构架2序列(seqidno’s:290-371),构架3序列(seqidno’s:454-535)和构架4序列(seqidno’s:618-699)(关于构架1序列位置1-4和27-30的氨基酸残基，还参考下述评述。因此，为了确定氨基酸同一性程度，优选忽略这些残基)；

并且其中:

ii)优选地，在按照kabat编号的位置11,37,44,45,47,83,84,103,104和108的氨基酸残基的一个或多个选自下表b-2中提及的标志残基。

在这些纳米抗体中，cdr序列通常如本文进一步所述。

同样地，所述纳米抗体可以以任何适当的方式获得，并且来源于任何适当的来源，并且例如，可以是天然存在的vhh序列(即，来自于适当的骆驼科(camelid)物种)或合成的或半合成的免疫球蛋白序列,包括但不限于“人源化的”(如本文所定义)纳米抗体,“骆驼源化的”(如本文所定义)免疫球蛋白序列(并且特别是骆驼源化的重链可变结构域序列),以及已经通过下列技术获得的纳米抗体：诸如亲和力成熟(例如，起始于合成的、随机的或天然存在的免疫球蛋白序列),cdr嫁接,镶盖术,组合来源于不同的免疫球蛋白序列的片段,利用重叠的引物进行的pcr装配,以及专业技术人员公知的加工免疫球蛋白序列的相似技术；或前述任一项的任何适当的组合，这如本文进一步描述。此外，当纳米抗体包括vhh序列时，所述纳米抗体可以适当地被人源化，如本文进一步所述，以便提供一个或多个本发明的进一步(部分或完全)人源化的纳米抗体。类似地，当纳米抗体包括合成的或半合成的序列(诸如部分人源化的序列)时，所述纳米抗体可以任选地进一步适当地被人源化，同样如本文所述，同样以便提供一个或多个本发明的进一步(部分或完全)人源化的纳米抗体。

特别地，人源化的纳米抗体可以是如前述段落中关于纳米抗体概括定义的免疫球蛋白序列，但是其中存在至少一个这样的氨基酸残基(并且特别地，在至少一个构架残基中)，所述氨基酸残基是和/或对应人源化的置换(如本文所定义)。基于本发明公开的内容，对于专业技术人员，一些优选的、而非限制性的人源化置换(及其适当的组合)将变得清楚。另外，或者备选地，通过比较天然存在的vhh序列的构架区序列与一个或多个紧密相关的人vh序列的相对应的构架序列，可以确定其它潜在有用的人源化置换，此后，可以将由此确定的一个或多个潜在有用的人源化置换(或其组合)引入到所述vhh序列中(以本身已知的任何方式，如本文进一步所述)，并且可以检测所得到的人源化的vhh序列对靶标的亲和力、稳定性、表达的容易性和水平、和/或其它需要的特性。以这种方式，通过利用有限的试验和误差程度，专业技术人员基于本发明公开的内容可以确定其它适当的人源化置换(或其适当的组合)。此外，基于前述内容，纳米抗体(的构架区)可以是部分人源化的或完全人源化的。

在一个优选而非限制性的方面中，本发明涉及针对离子通道诸如例如p2x7的纳米抗体(如本文定义)，其由4个构架区(分别为fr1-fr4)和3个互补性决定区(分别为cdr1-cdr3)组成，其中：

-cdr1选自由下列各项组成的组：

j)seqidno’s:208-289的免疫球蛋白序列；

k)与seqidno’s:208-289的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

l)与seqidno’s:208-289的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列；

和/或

-cdr2选自由下列各项组成的组：

m)seqidno’s:372-453的免疫球蛋白序列；

n)与seqidno’s:372-453的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

o)与seqidno’s:372-453的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列；

和/或

-cdr3选自由下列各项组成的组：

p)seqidno’s:536-617的免疫球蛋白序列；

q)与seqidno’s:536-617的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

r)与seqidno’s:536-617的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列；

或所述免疫球蛋白序列的任何适当的片段。

具体地，按照该优选而非限制性的方面，本发明涉及针对离子通道诸如例如p2x7的纳米抗体(如本文定义)，其由4个构架区(分别为fr1-fr4)和3个互补性决定区(分别为cdr1-cdr3)组成，其中

-cdr1选自由下列各项组成的组：

a)seqidno’s:208-289的免疫球蛋白序列；

b)与seqidno’s:208-289的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

c)与seqidno’s:208-289的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列；

并且

-cdr2选自由下列各项组成的组：

d)seqidno’s:372-453的免疫球蛋白序列；

e)与seqidno’s:372-453的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

f)与seqidno’s:372-453的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列；

并且

-cdr3选自由下列各项组成的组:

g)seqidno’s:536-617的免疫球蛋白序列；

h)与seqidno’s:536-617的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

i)与seqidno’s:536-617的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列；

或所述免疫球蛋白序列的任何适当的片段。

如本文关于本发明的免疫球蛋白序列概括提及的，当本发明的纳米抗体包含一个或多个b)和/或c)所述的cdr1序列时：

i)与a)所述的相对应cdr相比，在b)和/或c)所述的cdr中的任何氨基酸置换优选是保守氨基酸置换(如本文所定义)；

和/或

ii)与a)所述的相对应cdr相比，b)和/或c)所述的cdr优选地仅包含氨基酸置换，并且没有氨基酸删除或插入；

和/或

iii)利用一种或多种本身已知的亲和力成熟技术通过亲和力成熟的方式，

b)和/或c)所述的cdr可以是来源于a)所述的cdr的cdr。

类似地，当本发明的纳米抗体包含一个或多个e)和/或f)所述的cdr2时：

i)与d)所述的相对应cdr相比，在e)和/或f)所述的cdr中的任何氨基酸置换优选是保守氨基酸置换(如本文所定义)；

和/或

ii)与d)所述的相对应cdr相比，e)和/或f)所述的cdr优选地仅包含氨基酸置换，并且没有氨基酸删除或插入；

和/或

iii)利用一种或多种本身已知的亲和力成熟技术通过亲和力成熟的方式，

e)和/或f)所述的cdr可以是来源于d)所述的cdr的cdr。

此外，类似地，当本发明的纳米抗体包含一个或多个h)和/或i)所述的cdr3时:

i)与g)所述的相对应cdr相比，在h)和/或i)所述的cdr中的任何氨基酸置换优选是保守氨基酸置换(如本文所定义)；

和/或

ii)与g)所述的相对应cdr相比，h)和/或i)所述的cdr优选地仅包含氨基酸置换，并且没有氨基酸删除或插入；

和/或

iii)利用一种或多种本身已知的亲和力成熟技术通过亲和力成熟的方式，

h)和/或i)所述的cdr可以是来源于g)所述的cdr的cdr。

应该理解，最后三个段落总体上适用于分别包括b),c),e),f),h)或i)所述的一个或多个cdr1序列、cdr2序列和/或cdr3序列的本发明的任何纳米抗体。

在本发明的纳米抗体中，包括上面明确地列举的一个或多个cdr的纳米抗体是特别优选的；包括上面明确地列举的两个或多个cdr的纳米抗体是更特别优选的；和包括上面明确地列举的三个cdr的纳米抗体是最特别优选的。

一些特别优选的，但非限制性的cdr序列的组合，以及优选的cdr序列和构架序列的组合在下面的表b-1中提及，该表列举了存在于大量优选的(但非限制的)本发明的纳米抗体中的cdr序列和构架序列。如专业技术人员所清楚的，在相同克隆中出现的cdr1、cdr2和cdr3序列的组合(即，在表b-1中同一行中提及的cdr1、cdr2和cdr3序列)通常将是优选的(尽管本发明在其最广泛的意义上不限于此，并且还包括表b-1中提及的cdr序列的其他适当的组合)。此外，在同一克隆中出现的cdr序列和构架序列的组合(即，在表b-1中同一行中提及的cdr序列和构架序列)通常将是优选的(尽管本发明在其最广泛的意义上不限于此，并且还包括表b-1中提及的cdr序列和构架序列的其他适当的组合，以及所述cdr序列和其他适当的构架序列的组合，例如，如本文进一步所述)。

此外，在包括表b-1中提及的cdr的组合的本发明的纳米抗体中，每个cdr可以被选自由与所提及的cdr具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同一性(如本文所定义)的免疫球蛋白序列组成的组的cdr替换；其中：

i)与表b-1中提及的相应cdr序列相比，所述cdr中的任何氨基酸置换优选地是保守氨基酸置换(如本文所定义)；

和/或

ii)与表b-1中提及的相应cdr序列相比，任何所述cdr序列优选地仅含有氨基酸置换，且不含有氨基酸缺失或插入；

和/或

iii)任何所述cdr序列是这样的cdr，其通过本身已知的亲和力成熟技术并且特别地从表b-1中提及的相应cdr序列开始衍生。

然而，如专业技术人员所清楚的，表b-1中提及的cdr序列(的组合)，以及cdr序列和构架序列(的组合)通常将是优选的。

因此，在本发明的纳米抗体中，存在的cdr1,cdr2和cdr3序列的至少一个适当地选自由表b-1中分别列举的cdr1,cdr2和cdr3序列组成的组；或选自分别与表b-1中分别列举的cdr1,cdr2和cdr3序列的至少一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％“序列同一性”(如本文所定义)的cdr1,cdr2和cdr3序列的组；和/或选自由分别与表b-1中分别列举的cdr1,cdr2和cdr3序列的至少一个具有3，2或仅1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的cdr1，cdr2和cdr3序列组成的组。

在该上下文中，通过“适当地选择”是指，根据适用的情况，分别地，cdr1序列选自适当的cdr1序列(即，如本文所定义)，cdr2序列选自适当的cdr2序列(即，如本文所定义)，和cdr3序列选自适当的cdr3序列(即，如本文所定义)。更具体地，cdr序列优选地这样选择，以致本发明的纳米抗体以如本发明所定义的亲和力结合离子通道诸如例如p2x7(适当测量和/或表示为kd-值(实际的或表观的),ka-值(实际的或表观的),kon-速率和/或koff-速率,或备选地作为ic50值,如本文进一步所述)。

具体地，在本发明的纳米抗体中，存在的至少cdr3序列适当地选自由表b-1中列举的cdr3序列组成的组或选自与表b-1中列举的cdr3序列的至少一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同一性的cdr3序列的组；和/或选自由与表b-1中列举的cdr3序列的至少一个具有3，2或仅1个氨基酸差异的cdr3序列组成的组。

优选地，在本发明的纳米抗体中，存在的cdr1,cdr2和cdr3序列的至少两个适当地选自由表b-1中分别列举的cdr1,cdr2和cdr3序列组成的组；或选自由分别与表b-1中分别列举的cdr1,cdr2和cdr3序列的至少一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同一性的cdr1,cdr2和cdr3序列组成的组；和/或选自由分别与表b-1中分别列举的cdr1,cdr2和cdr3序列的至少一个具有3，2或仅1个“氨基酸差异”的cdr1，cdr2和cdr3序列组成的组。

具体地，在本发明的纳米抗体中，存在的至少cdr3序列适当地选自由表b-1中列举的cdr3序列组成的组或选自与表b-1中列举的cdr3序列的至少一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同一性的cdr3序列的组；和存在的cdr1和cdr2序列的至少一个适当地选自由分别在表b-1中分别列举的cdr1和cdr2序列组成的组或选自分别与表b-1中分别列举的cdr1和cdr2序列的至少一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同一性的cdr1和cdr2序列的组；和/或选自由分别与表b-1中分别列举的cdr1和cdr2序列的至少一个具有3，2或仅1个氨基酸差异的cdr1和cdr2序列组成的组。

最优选地，在本发明的纳米抗体中，存在的所有三个cdr1,cdr2和cdr3序列适当地选自由表b-1中分别列举的cdr1,cdr2和cdr3序列组成的组或选自分别与表b-1中分别列举的cdr1,cdr2和cdr3序列的至少一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同一性的cdr1,cdr2和cdr3序列的组；和/或选自由分别与表b-1中分别列举的cdr1,cdr2和cdr3序列的至少一个具有3，2或仅1个“氨基酸差异”的cdr1，cdr2和cdr3序列组成的组。

甚至更优选地，在本发明的纳米抗体中，存在的cdr1,cdr2和cdr3序列的至少一个适当地选自由表b-1中分别列举的cdr1,cdr2和cdr3序列组成的组。优选地，在此方面，存在的其他两个cdr序列的至少一个或优选两个适当地选自与表b-1中分别列举的相应cdr序列的至少一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同一性的cdr序列；和/或选自由分别与表b-1中分别列举的相应序列的至少一个具有3，2或仅1个氨基酸差异的cdr序列组成的组。

具体地，在本发明的纳米抗体中，存在的至少cdr3序列适当地选自由表b-1中列举的cdr3组成的组。优选地，在此方面，存在的cdr1和cdr2序列的至少一个和优选两个适当地选自分别与表b-1中分别列举的cdr1和cdr2序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同一性的cdr1和cdr2序列的组；和/或选自由分别与表b-1中分别列举的cdr1和cdr2序列的至少一个具有3，2或仅1个氨基酸差异的cdr1和cdr2序列组成的组。

甚至更优选地，在本发明的纳米抗体中，存在的cdr1,cdr2和cdr3序列的至少两个适当地选自由表b-1中分别列举的cdr1,cdr2和cdr3序列组成的组。优选地，在此方面，存在的剩余cdr序列适当地选自与表b-1中列举的相应cdr序列的至少一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同一性的cdr序列的组；和/或选自由分别与表b-1中列举的相应序列的至少一个具有3，2或仅1个氨基酸差异的cdr序列组成的组。

具体地，在本发明的纳米抗体中，至少cdr3序列适当地选自由表b-1中列举的cdr3序列组成的组，并且cdr1序列或cdr2序列适当地选自由表b-1中分别列举的cdr1和cdr2序列组成的组。优选地，在此方面，剩余的存在的cdr序列适当地选自与表b-1中列举的相应cdr序列的至少一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同一性的cdr序列的组；和/或选自由与表b-1中列举的相应cdr序列具有3，2或仅1个氨基酸差异的cdr序列组成的组。

甚至更优选地，在本发明的纳米抗体中，存在的所有三个cdr1,cdr2和cdr3序列适当地选自由表b-1中分别列举的cdr1,cdr2和cdr3序列组成的组。此外，通常，表b-1中列举的cdr的组合(即，表b-1中同一行上提及的那些)是优选的。因此，通常优选，当本发明的纳米抗体中的cdr是表b-1中提及的cdr序列或适当地选自与表b-1中列举的cdr序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同一性的cdr序列的组；和/或选自由与表b-1中列举的cdr序列具有3，2或仅1个氨基酸差异的cdr序列组成的组，其他cdr中的至少一个和优选两个适当地选自属于表b-1中相同组合的cdr序列(即表b-1中同一行上提及的)或适当地选自与属于同一组合的cdr序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同一性的cdr序列的组和/或选自由与属于同一组合的cdr序列具有3，2或仅1个氨基酸差异的cdr序列组成的组。上述段落中指出的其他优选项也适用于表b-1中提及的cdr的组合。

因此，借助于非限制性实例，本发明的纳米抗体可以例如包括与表b-1中提及的cdr1序列之一具有超过80％序列同一性的cdr1序列，与表b-1中提及的cdr2序列之一(但属于不同的组合)具有3，2或1个氨基酸差异的cdr2序列，和cdr3序列。

本发明的一些优选的纳米抗体可以例如包括：(1)与表b-1中提及的cdr1序列之一具有超过80％序列同一性的cdr1序列；与表b-1中提及的cdr2序列之一(但属于不同的组合)具有3，2或1个氨基酸差异的cdr2序列；和与表b-1中提及的cdr3序列之一(但属于不同的组合)具有超过80％序列同一性的cdr3序列；或(2)与表b-1中提及的cdr1序列之一具有超过80％序列同一性的cdr1序列；cdr2序列，和表b-1中列举的cdr3序列之一；或(3)cdr1序列；与表b-1中列举的cdr2序列之一具有超过80％序列同一性的cdr2序列；和与表b-1中提及的cdr3序列(属于与cdr2序列相同的组合)具有3，2或1个氨基酸差异的cdr3序列。

本发明的一些特别优选的纳米抗体可以例如包括：(1)与表b-1中提及的cdr1序列之一具有超过80％序列同一性的cdr1序列；与表b-1中提及的cdr2序列(属于相同的组合)具有3，2或1个氨基酸差异的cdr2序列；和与表b-1中提及的cdr3序列(属于相同的组合)具有超过80％序列同一性的cdr3序列；(2)cdr1序列；表b-1中列举的cdr2和表b-1中列举的cdr3序列(其中cdr2序列和cdr3序列可以属于不同的组合)。

本发明的一些甚至更优选的纳米抗体可以例如包括：(1)与表b-1中提及的cdr1序列之一具有超过80％序列同一性的cdr1序列；属于同一组合的表b-1中列举的cdr2序列；和属于不同的组合的表b-1中提及的cdr3序列；或(2)表b-1中提及的cdr1序列；与表b-1中提及的cdr2序列(属于同一组合)具有3，2或1个氨基酸差异的cdr2序列；和与表b-1中列举的cdr3序列(属于相同或不同的组合)具有超过80％序列同一性的cdr3序列。

本发明的特别优选的纳米抗体可以例如包括表b-1中提及的cdr1序列，与表b-1中提及的cdr2序列(属于相同的组合)具有超过80％序列同一性的cdr2序列；和属于相同的组合的表b-1中提及的cdr3序列。在本发明的最优选的纳米抗体中，存在的cdr1,cdr2和cdr3序列适当地选自表b-1中分别列举的cdr1,cdr2和cdr3序列的组合之一。

根据本发明的另一优选的但非限制性的方面，(a)cdr1具有1和12个氨基酸残基之间，和通常2和9个氨基酸残基之间，诸如5，6或7个氨基酸残基的长度；和/或(b)cdr2具有13和24个氨基酸残基之间，和通常15和21个氨基酸残基之间，诸如16和17个氨基酸残基的长度；和/或(c)cdr3具有2和35个氨基酸残基之间，和通常3和30个氨基酸残基之间，诸如6和23个氨基酸残基之间的长度。

在另一个优选的但非限制性的方面，本发明涉及一种纳米抗体，其中cdr序列(如本文所定义)具有与seqseqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778(参见表a-1)的免疫球蛋白序列的至少一个的cdr序列具有超过80％，优选超过90％，更优选超过95％，诸如99％或更多的序列同一性(如本文所定义)。

通常，具有上述cdr序列的纳米抗体可以如本文进一步所述，并且优选地具有也如本文进一步所述的构架序列。因此，例如和如本文所提及，所述纳米抗体可以是天然存在的纳米抗体(来自任何适当的物种)，天然存在的vhh序列(即，来自适当的骆驼物种)或合成的或半合成的免疫球蛋白序列或纳米抗体，包括但不限于部分人源化的纳米抗体或vhh序列，完全人源化的纳米抗体或vhh序列，骆驼源化的重链可变结构域序列，以及已经通过本文提及的技术获得的纳米抗体。

因此，在一个具体而非限制性的方面中，本发明涉及人源化的纳米抗体，其由4个构架区(分别为fr1-fr4)和3个互补性决定区(分别为cdr1-cdr3)组成，其中cdr1-cdr3如本文所定义，且其中所述人源化的纳米抗体包括至少一个人源化置换(如本文定义)，且特别地是在其至少一个构架序列(如本文定义)中的至少一个人源化置换。

在另一个优选的但非限制性的方面，本发明涉及一种纳米抗体，其中cdr序列与seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778(参见表a-1)的免疫球蛋白序列的至少一个的cdr序列具有至少70％氨基酸同一性，优选至少80％氨基酸同一性，更优选至少90％氨基酸同一性，诸如95％氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％氨基酸同一性。此氨基酸同一性程度可以例如通过确定所述纳米抗体和seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778(参见表a-1)的序列的一个或多个之间的氨基酸同一性程度(以本文所述的方式)来确定，其中忽略形成构架区的氨基酸残基。所述纳米抗体可以如本文进一步所述。

在另一个优选的但非限制性的方面，本发明涉及具有这样的免疫球蛋白序列的纳米抗体，所述免疫球蛋白序列选自由seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778(参见表a-1)组成的组或选自由与seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778(参见表a-1)的免疫球蛋白序列的至少一个具有超过80％，优选超过90％，更优选超过95％，诸如99％或更多序列同一性(如本文所定义)的免疫球蛋白序列组成的组。

本发明的另一个优选的但非限制性的方面涉及seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778(参见表a-1)的纳米抗体的人源化变体，其与相应的天然vhh序列相比，包括至少一个人源化置换(如本文所定义)和特别地在其构架序列(如本文所定义)的至少一个中的至少一个人源化置换。

本发明的多肽包括本发明的至少一个纳米抗体或基本上由其组成。本发明的多肽的一些优选的而非限制性的实例在seqidno’s:789-791(参见表a-3)中给出。

表a-3(如果适用):优选的多肽或化合物序列(本文还称为具有特定名称的序列或seqidno:x,其中x是引用相关免疫球蛋白序列的编号):

专业技术人员应该清楚，本文提及为“优选的”(或“更优选的”、“甚至更优选的”、等等)纳米抗体也是优选的(或更优选的，或甚至更优选的，等等)用于本文所述的多肽中。因此，包括一个或多个“优选的”本发明的纳米抗体或基本上由其组成的多肽通常将是优选的，且包括一个或多个“更优选的”本发明的纳米抗体或基本上由其组成的多肽通常将是更优选的。

一般地，包括单一纳米抗体(如本发明的单一纳米抗体)或基本上由其组成的蛋白或多肽在本文称为“单价的”蛋白或多肽或称为“单价的构建体”。包括两个或多个纳米抗体(如至少两个本发明的纳米抗体或至少一个本发明的纳米抗体和至少一个其他纳米抗体)或基本上由其组成的蛋白和多肽在本文称为“多价的”蛋白或多肽或称为“多价的构建体”，且与相对应的本发明的单价纳米抗体相比较，这些可以提供某些优点。通过本文的进一步描述，所述多价构建体的一些非限制性的实例将变得清楚。

按照一个具体而非限制性的方面，本发明的多肽包括至少两个本发明的纳米抗体、如两个或三个本发明的纳米抗体或基本上由其组成。如本文进一步所述，与包括本发明的单一纳米抗体或基本上由其组成的蛋白或多肽相比较，所述多价构建体可以提供某些优点，如提高很多的对于离子通道诸如例如p2x7的抗体亲抗原性。基于本文的公开内容，对于专业技术人员来说所述多价构建体将是清楚的；所述多价纳米抗体构建体的一些优选而非限制性的实例是seqidno’s:789-791的构建体。

按照另一个具体而非限制性的方面，本发明的多肽包括至少一个本发明的纳米抗体和至少一个其他结合单位(即，针对另一个表位、抗原、靶标、蛋白或多肽)或基本上由其组成，所述其他结合单位优选地也是纳米抗体。所述蛋白或多肽在本文还称为“多特异性”蛋白或多肽，或称为“多特异性构建体”，且与相对应的本发明的单价纳米抗体相比较，这些可以提供某些优点(如从本文对一些优选的、但非限制性的多特异性构建体的进一步讨论中将变得清楚)。基于本文的公开内容，对于专业技术人员来说所述多特异性的构建体将是清楚的；所述多价纳米抗体构建体的一些优选而非限制性的实例是seqidno’s:789-791的构建体。

按照另一个具体的但非限制性的方面，本发明的多肽包括至少一个本发明的纳米抗体、任选地一个或多个其他纳米抗体、和至少一个赋予本发明的纳米抗体和/或赋予所得到的融合蛋白至少一种需要的特性的其他免疫球蛋白序列(如蛋白或多肽)，或基本上由其组成。同样地，与相对应的本发明的单价纳米抗体相比较，所述融合蛋白可以提供某些的优点。所述免疫球蛋白序列和所述融合构建体的一些非限制性的实例将通过本文的进一步描述变得清楚。

还可以组合两个或多个上述方面，例如，以提供三价双特异性构建体，其包括两个本发明的纳米抗体，和一个其他的纳米抗体，和任选地一个或多个其他的免疫球蛋白序列。所述构建体的其他非限制性的实例，以及在本发明的情形中特别优选的一些构建体，将通过本文的进一步描述变得清楚。

在上述构建体中，所述一个或多个纳米抗体和/或其他免疫球蛋白序列可以直接彼此连接和/或适当地通过一个或多个接头序列彼此连接。所述接头的一些适合的但非限制性的实例将通过本文的进一步所述变得清楚。

在本发明的一个具体的方面中，与本发明相对应的免疫球蛋白序列相比较，本发明的纳米抗体或包括至少一个本发明的纳米抗体的本发明的化合物、构建体或多肽可以具有增加的半衰期。基于本文进一步公开的内容，专业技术人员应该清楚所述纳米抗体、化合物和多肽的一些优选的但非限制性的实例，且例如，包括已经进行化学修饰(例如，通过聚乙二醇化)提高其半衰期的本发明的纳米抗体序列或多肽；包括至少一个用于结合血清蛋白(如血清白蛋白，参见例如ep0368684b1，第4页)的额外的结合位点的本发明的免疫球蛋白序列；或包括至少一个与至少一个增加本发明的纳米抗体的半衰期的结构部分(且特别是至少一个免疫球蛋白序列)连接的本发明的纳米抗体的本发明的多肽。基于本文进一步的公开内容，专业技术人员应该清楚包括所述半衰期延长结构部分或免疫球蛋白序列的本发明的多肽的实例；且例如包括，不限于，这样的多肽，其中所述一个或多个本发明的纳米抗体适当地与下列各项连接：一个或多个血清蛋白或其片段(如血清白蛋白或其适当的片段)，或一个或多个可以结合血清蛋白的结合单位(如例如，可以结合血清蛋白如血清白蛋白、血清免疫球蛋白如igg、或运铁蛋白的纳米抗体或(单)结构域抗体)；其中本发明的纳米抗体与fc部分(如人fc)或其适当的部分或片段连接的多肽；或其中所述一个或多个本发明的纳米抗体适当地与可以结合血清蛋白的一个或多个小蛋白或肽连接的多肽(诸如，不限于，记载在wo91/01743,wo01/45746,wo02/076489和埃博灵克斯股份有限公司(ablynxn.v.)于2006年12月5日提交的题目为“能够结合血清蛋白的肽(peptidescapableofbindingtoserumproteins)”的埃博灵克斯股份有限公司的美国临时申请(还参见pct/ep/2007/063348))。

同样地，如专业技术人员应该清楚的，所述纳米抗体、化合物、构建体或多肽可以包含一个或多个另外的基团、残基、结构部分或结合单位，如一个或多个另外的免疫球蛋白序列且特别是一个或多个另外的纳米抗体(即，不针对离子通道)，以提供多特异性纳米抗体构建体中的三特异性纳米抗体构建体。

一般地，具有增加的半衰期的本发明的纳米抗体(或包括其的化合物、构建体或多肽)优选地具有是相对应的本发明的免疫球蛋白序列本身的半衰期的至少1.5倍、优选地至少2倍，如至少5倍，例如至少10倍或超过20倍的半衰期。例如，与相对应的本发明的免疫球蛋白序列本身相比，具有增加的半衰期的本发明的纳米抗体、化合物、构建体或多肽可以具有增加超过1小时，优选超过2小时，更优选超过6小时，诸如超过12小时，或甚至超过24、48或72小时的半衰期。

在本发明的一个优选而非限制性方面中，所述本发明的纳米抗体、化合物、构建体或多肽在人中表现出至少约12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时、甚至更优选至少72小时或更多的血清半衰期。例如，本发明的化合物或多肽可以具有至少5天(诸如约5-10天)、优选至少9天(诸如约9-14天)、更优选至少约10天(诸如约10-15天)、或至少约11天(诸如约11-16天)、更优选至少约12天(诸如约12-18天或更多)、或超过14天(诸如约14-19天)的半衰期。

在本发明的另一个方面中，本发明的多肽包括与允许所得到的本发明的多肽穿过血脑屏障的一个或多个(诸如两个并且优选一个)免疫球蛋白序列连接(任选地通过一个或多个适当的接头序列连接)的一个或多个(诸如两个或优选一个)本发明的纳米抗体。特别地，允许所得到的本发明的多肽穿过血脑屏障的所述一个或多个免疫球蛋白序列可以是一个或多个(诸如两个并且优选一个)纳米抗体，诸如在wo02/057445中所述的纳米抗体，其中fc44(wo06/040153的seqidno:189)和fc5(wo06/040154的seqidno:190)是优选的实例。

特别地，包括一个或多个本发明的纳米抗体的多肽优选是这样的，以致它们：

-以10^-5-10^-12摩尔/升或更小、并且优选地10^-7-10^-12摩尔/升或更小、并且更优选地10^-8-10^-12摩尔/升的解离常数(kd)(即，以10⁵-10¹²升/摩尔或更大、并且优选地10⁷-10¹²升/摩尔或更大、且更优选地10⁸-10¹²升/摩尔的缔合常数(ka))与离子通道诸如例如p2x7结合；

和/或这样，以致它们:

-以10²m^-1s^-1–约10⁷m^-1s^-1,优选10³m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1,更优选10⁴m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1,诸如10⁵m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1的kon-速率与离子通道诸如例如p2x7结合；

和/或这样，以致它们:

-以1s^-1(t1/2＝0.69s)-10^-6s^-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合体),优选10^-2s^-1-10^-6s^-1,更优选10^-3s^-1-10^-6s^-1,诸如10^-4s^-1-10^-6s^-1的koff速率与离子通道诸如例如p2x7结合。

优选地，包含仅一个本发明的免疫球蛋白序列的多肽优选是这样，以致它将以小于500nm,优选小于200nm,更优选小于10nm,诸如小于500pm的亲和力与离子通道诸如例如p2x7结合。在这一方面中，专业技术人员应该清楚，与包含仅一个本发明的免疫球蛋白序列的多肽相比较，包含两个或多个本发明的纳米抗体的多肽可以以增加的抗体亲抗原性结合离子通道诸如例如p2x7。

对于关于本发明的免疫球蛋白序列或多肽与离子通道诸如例如p2x7结合的一些优选的ic50值将从本发明的进一步描述和实施例中变得清楚。

例如，按照本发明的这一优选方面的其他多肽可以选自由与seqidno’s:789-791(参见表a-3)的免疫球蛋白序列中的一个或多个具有超过80％，更优选超过90％，更优选超过95％，诸如99％或更多“序列同一性”(如本文定义)的免疫球蛋白序列组成的组，其中在所述免疫球蛋白序列中包括的纳米抗体优选如本文进一步所定义。

本发明的另一个方面涉及编码本发明的免疫球蛋白序列(诸如本发明的纳米抗体)或包括其的本发明的多肽的核酸。同样地，如本文关于本发明的核酸概括所述，这样的核酸可以以遗传构建体的形式存在，如本文定义。

在另一个方面中，本发明涉及表达或能够表达本发明的免疫球蛋白序列(诸如纳米抗体)和/或包括其的本发明的多肽的宿主或宿主细胞；和/或包含本发明的核酸的宿主或宿主细胞。通过本文进一步的描述，所述宿主或宿主细胞的一些优选的但非限制性的实例将变得清楚。

本发明的另一个方面涉及包含或包括至少一个本发明的免疫球蛋白序列、至少一个本发明的多肽和/或至少一个本发明的核酸的产品或组合物，和任选地本身已知的所述组合物的一种或多种其他成分，即，取决于所述组合物的目的用途。例如，所述产品或组合物可以是药物组合物(如本文所述)，兽医用组合物或用于诊断应用(也如本文所述)的产品或组合物。通过本文进一步的描述，所述产品或组合物的一些优选的但非限制性的实例将变得清楚。

本发明还涉及用于制备或产生本文所述的免疫球蛋白序列、化合物、构建体、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物的方法。通过本文进一步的描述，所述方法的一些优选的但非限制性的实例将变得清楚。

本发明还涉及本文所述的免疫球蛋白序列、化合物、构建体、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物的应用和用途，以及用于预防和/或治疗与离子通道诸如例如p2x7相关的疾病和病症的方法。通过本文进一步的描述，一些优选的但非限制性的应用和用途的实例将变得清楚。

通过下文的进一步描述，本发明的其他方面、实施方案、优点和应用也变得清楚。一般地，应该注意，术语纳米抗体在用于本文时在其最广泛意义上不限于具体的生物来源或具体的制备方法。例如，如在下文更详细讨论的，本发明的纳米抗体通常可以通过wo08/020079第61页和第62页提及的技术(1)-(8)、或任何其他本身已知的适当技术获得。一个优选的纳米抗体种类对应于针对离子通道诸如例如p2x7的天然存在的重链抗体的vhh结构域。如本文进一步所述，这样的vhh序列通常可以这样产生或获得：通过用离子通道诸如例如p2x7适当免疫骆驼科动物物种(即，以产生针对离子通道诸如例如p2x7的免疫反应和/或重链抗体)，通过获得来自所述骆驼科动物的适当的生物样品(诸如血液样品、血清样品或b-细胞样品)，并且通过利用本身已知的任何适当技术从所述样品开始产生针对离子通道诸如例如p2x7的vhh序列。所述技术对于专业技术人员应该是清楚的，和/或在本文中进一步所述。

备选地，所述针对离子通道诸如例如p2x7的天然存在的vhh结构域可以从首次用于实验的骆驼科动物vhh序列文库获得，例如，通过使用本身已知的一种或多种筛选技术用离子通道诸如例如p2x7、或其至少一部分、片段、抗原决定簇或表位筛选这样的文库。例如，这样的文库和技术记述在wo99/37681,wo01/90190,wo03/025020和wo03/035694中。备选地，可以使用来源自首次用于实验的vhh文库的改进的合成的或半合成的文库，诸如通过诸如随机诱变和/或cdr重排的技术从首次用于实验的vhh文库获得的vhh文库，如例如记述在wo00/43507中获得。

因此，在另一个方面中，本发明涉及用于产生针对离子通道诸如例如p2x7的纳米抗体的方法。在一个方面中，所述方法至少包括下列步骤：

a)提供纳米抗体序列的组、集合或文库；和

b)从所述纳米抗体序列的组、集合或文库中筛选可以结合离子通道诸如例如p2x7和/或具有针对离子通道诸如例如p2x7的亲和力的纳米抗体序列；

和

c)分离所述可以结合离子通道诸如例如p2x7和/或具有针对离子通道诸如例如p2x7的亲和力的一种或多种纳米抗体。

在这样的方法中，所述纳米抗体序列的组、集合或文库可以是纳米抗体序列的首次用于实验(naive)的组、集合或文库；纳米抗体序列的合成的或半合成的组、集合或文库；和/或已经进行了亲和力成熟的纳米抗体序列的组、集合或文库。

在本方法的优选方面中，所述纳米抗体序列的组、集合或文库可以是纳米抗体序列的免疫组、集合或文库，特别是，来自已经用离子通道诸如例如p2x7适当免疫的、或用基于其或来源于其的适当的抗原决定簇(诸如其抗原部分、片段、区域、结构域、环或其它表位)适当免疫的骆驼科物种的vhh序列的免疫组、集合或文库。在一个特别的方面中，所述抗原决定簇可以是细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位。

在上述方法中，所述纳米抗体或vhh序列的组、集合或文库可以被展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体、或适当的微生物(诸如酵母)上，如以促进筛选。用于展示和筛选纳米抗体序列(的组、集合或文库)的适当的方法、技术和宿主生物体对于本领域专业技术人员将是清楚的，例如，基于本发明进一步的公开内容。还参考wo03/054016和hoogenboom在naturebiotechnology(自然生物技术),23,9,1105-1116(2005)中的综述。

在另一个方面中，所述用于产生纳米抗体序列的方法包括至少下列步骤：

a)提供来源于骆驼科物种的表达免疫球蛋白序列的细胞的集合或样品；

b)从所述细胞集合或样品中筛选：(i)表达可以结合离子通道诸如例如p2x7和/或具有针对离子通道诸如例如p2x7的亲和力的免疫球蛋白序列的细胞；和(ii)表达重链抗体的细胞，其中子步骤(i)和(ii)可以基本上按照一个筛选步骤或作为两个独立的筛选步骤以任何适当的顺序进行，以提供至少一种表达可以结合离子通道诸如例如p2x7和/或具有针对离子通道诸如例如p2x7的亲和力的重链抗体的细胞；

和

c)(i)从所述细胞分离存在于所述重链抗体中的vhh序列；或(ii)从所述细胞分离编码存在于所述重链抗体中的vhh序列的核酸序列，然后表达所述vhh结构域。

在该方面所述的方法中，所述细胞的集合或样品可以是，例如，b细胞的集合或样品。此外，在该方法中，细胞样品可以来源于已经用离子通道诸如例如p2x7适当免疫的、或用基于其或来源于其的适当的抗原决定簇(诸如其抗原部分、片段、区域、结构域、环或其它表位)适当免疫的骆驼科动物。在一个特别的方面中，所述抗原决定簇可以是细胞外部分、区域、结构域、环或其他细胞外表位。

上述方法可以以任何适当的方式进行，这对于专业技术人员将是清楚的。例如，参考ep0542810,wo05/19824,wo04/051268和wo04/106377。步骤b)的筛选优选地使用流式细胞术技术诸如facs进行。对于此，例如，参考lieby等,血液(blood),卷97,no.12,3820。特别参考在埃博灵克斯股份有限公司(ablynxn.v.)的国际申请wo06/079372中记述的所谓的“纳米克隆^tm”技术。

在另一个方面中，所述用于产生针对离子通道诸如例如p2x7的免疫球蛋白序列的方法可以包括至少下列步骤：

a)提供编码重链抗体或纳米抗体序列的核酸序列的组、集合或文库；

b)从所述核酸序列的组、集合或文库中筛选编码可以结合离子通道诸如例如p2x7和/或具有针对离子通道诸如例如p2x7的亲和性的重链抗体或纳米抗体序列的核酸序列；

和

c)分离所述核酸序列，然后分别表达存在于所述重链抗体中的vhh序列、或表达所述纳米抗体序列。

在这样的方法中，所述编码重链抗体或纳米抗体序列的核酸序列的组、集合或文库可以是，例如，编码重链抗体或vhh序列的首次用于实验的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库；编码纳米抗体序列的合成的或半合成的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库；和/或编码已经进行了亲和力成熟的纳米抗体序列的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库。

在该方法的优选方面中，所述核酸序列的组、集合或文库可以是编码重链抗体或vhh序列的核酸序列的免疫的组、集合或文库，所述核酸序列来源于已经用离子通道诸如例如p2x7适当免疫的、或用基于其或来源于其的适当的抗原决定簇(诸如其抗原性部分、片段、区域、结构域、环或其它表位)适当免疫的骆驼科动物。在一个特别的方面中，所述抗原决定簇可以是细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位。

在上述方法中，所述核苷酸序列的组、集合或文库可以被展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体或适当的微生物(诸如酵母)上，如以促进筛选。用于展示和筛选编码免疫球蛋白序列的核苷酸序列(的组、集合或文库)的适当的方法、技术和宿主生物体对于本领域专业技术人员将是清楚的，例如，基于本文进一步的公开内容。还参考wo03/054016和hoogenboom在自然生物技术(naturebiotechnology),23,9,1105-1116(2005)中的综述。

专业技术人员应该清楚，本文所述的方法的筛选步骤也可以作为选择步骤进行。因此，术语“筛选”在用于本说明书时，可以包括选择、筛选或选择和/或筛选技术的任何适当的组合。此外，当使用序列的组、集合或文库时，它可以包含任何适当数量的序列，如1,2,3或约5,10,50,100,500,1000,5000,10⁴,10⁵,10⁶,10⁷,10⁸或更多序列。

此外，上述免疫球蛋白序列的组、集合或文库中的一个或多个或全部序列可以通过理性的、或半经验的方法如计算机建模技术或生物统计学或数据采掘(datamining)技术获得或定义。

此外，这样的组、集合或文库可以包括作为来自彼此的变体(例如，具有设计的点突变或具有随机的位置)的一个、两个或多个序列，包括来源于不同的天然多样性序列的组(例如，免疫文库)的多个序列，或不同序列的任何其他来源(例如，如在hoogenboom等,natbiotechnol(自然生物技术)23:1105,2005和binz等,natbiotechnol(自然生物技术)2005,23:1247中所述)。所述序列的组、集合或文库可以展示在噬菌体颗粒、核糖体、细菌、酵母细胞、哺乳动物细胞的表面上，且在这些载体内与编码所述免疫球蛋白序列的核苷酸序列连接。这使得所述组、集合或文库易于进行选择步骤，从而分离需要的本发明的免疫球蛋白序列。更一般地，当将序列展示在适当的宿主或宿主细胞上时，还可以(且习惯上)首先从所述宿主或宿主细胞分离编码所需要的序列的核苷酸序列，然后通过在适当的宿主生物体内适当表达所述核苷酸序列而获得所需要的序列。同样地，这可以以本身已知的任何适当的方式进行，其是专业技术人员应该清楚的。

用于获得针对离子通道诸如例如p2x7的vhh序列或纳米抗体序列的另一种技术包括适当地免疫能够表达重链抗体的转基因哺乳动物(即，以产生针对离子通道诸如例如p2x7的免疫应答和/或重链抗体)，从所述转基因哺乳动物获得包含所述vhh序列或纳米抗体序列(的编码核酸序列)的适当的生物样品(如血液样品、血清样品或b-细胞样品)，然后使用本身已知的任何适当的技术(如例如本文所述的任何方法或杂交瘤技术)由所述样品起始产生针对离子通道诸如例如p2x7的vhh序列。例如，为了该目的，可以使用记述在wo02/085945,wo04/049794和wo06/008548和janssens等,proc.natl.acad.sci.usa.(美国国家科学院学报)2006年10月10日；103(41):15130-5中的表达重链抗体的小鼠和其他方法和技术。例如，所述表达重链抗体的小鼠可以表达具有任何适当的(单)可变结构域、如来源于天然来源的(单)可变结构域(例如，人(单)可变结构域、骆驼科(单)可变结构域或鲨鱼(单)可变结构域)、以及例如合成的或半合成的(单)可变结构域的重链抗体。

本发明还涉及通过上述方法、或备选地通过包括上述方法之一和另外至少下列步骤的方法获得的vhh序列或纳米抗体序列，所述步骤为：确定所述vhh序列或纳米抗体序列的核苷酸序列或免疫球蛋白序列；和以本身已知的方式，如通过在适当的宿主细胞或宿主生物体内表达或通过化学合成，表达或合成所述vhh序列或纳米抗体序列。

如本文提及，本发明纳米抗体的一种特别优选的种类包括具有与天然存在的vhh结构域的免疫球蛋白序列相对应的但是已被“人源化”的免疫球蛋白序列的纳米抗体，“人源化”即，用在来自于人类的常规4-链抗体的vh结构域中对应位置存在的一个或多个氨基酸残基替换所述天然存在的vhh序列的免疫球蛋白序列中(并且特别是在构架序列中的)的一个或多个氨基酸残基(例如上文所示)，如在wo08/020079第63页进一步所述，并且使用在wo08/020079第63页提及的技术。本发明纳米抗体的另一种特别优选的种类包括具有与天然存在的vh结构域的免疫球蛋白序列相对应的但是已被“骆驼源化”的免疫球蛋白序列的纳米抗体，即，用在重链抗体vhh结构域中相对应位置存在的一个或多个氨基酸残基替换来自于常规4-链抗体的天然存在的vh结构域的免疫球蛋白序列中的一个或多个氨基酸残基，如在wo08/020079第63页进一步所述，并且使用在wo08/020079第63页提及的技术。

专业技术人员应该清楚从天然存在的vh序列或优选的vhh序列起始而获得本发明的纳米抗体和/或编码其的核酸的其它适宜方法和技术，并且例如，可以包括在wo08/00279第64页提及的技术。如本文提及，纳米抗体可以特别特征在于，在一个或多个构架序列中存在一个或多个“标志残基”(如本文定义)。

因此，根据本发明一个优选的但非限制性的方面，纳米抗体在其最广泛意义上通常可以定义为这样的多肽，所述多肽包括：

a)包含被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的免疫球蛋白序列，其中在按照kabat编号方式的位置108的氨基酸残基是q；

和/或:

b)包含被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的免疫球蛋白序列，其中按照kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是带电荷的氨基酸(如本文所定义)或半胱氨酸残基，并且在位置44的氨基酸残基优选是e；

和/或:

c)包含被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的免疫球蛋白序列，其中按照kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由p、r和s组成的组，并且特别选自由r和s组成的组。

因此，在第一优选的但非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以具有下述结构

fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4

其中fr1-fr4分别是指构架区1-4，并且其中cdr1-cdr3分别是指互补性决定区1-3，并且其中

a)按照kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是q；

和/或其中:

b)按照kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是带电荷的氨基酸或半胱氨酸，并且按照kabat编号方式在位置44的氨基酸残基优选是e；

和/或其中:

c)按照kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由p、r和s组成的组，并且特别选自由r和s组成的组；

并且其中:

d)cdr1,cdr2和cdr3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。

特别地，纳米抗体在其最广泛意义上可以通常定义为这样的多肽，所述多肽包括：

a)包括被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的免疫球蛋白序列，其中按照kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是q；

和/或:

b)包括被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的免疫球蛋白序列，其中按照kabat编号方式在位置44的氨基酸残基是e，并且其中按照kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是r；

和/或:

c)包括被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的免疫球蛋白序列，其中按照kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由p,r和s组成的组，并且特别是选自由r和s组成的组。

因此，根据一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以具有下述结构

fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4

其中fr1-fr4分别是指构架区1-4，并且其中cdr1-cdr3分别是指互补性决定区1-3，并且其中

a)按照kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是q；

和/或其中:

b)按照kabat编号方式在位置44的氨基酸残基是e，并且其中按照kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是r；

和/或其中:

c)按照kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由p、r和s组成的组，并且特别选自由r和s组成的组；

并且其中:

d)cdr1,cdr2和cdr3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。

特别地，根据本发明针对离子通道诸如例如p2x7的纳米抗体可以具有下述结构：

fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4

其中fr1-fr4分别是指构架区1-4，并且其中cdr1-cdr3分别是指互补性决定区1-3，并且其中

a)按照kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是q；

和/或其中:

b)按照kabat编号方式在位置44的氨基酸残基是e，并且其中按照kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是r；

和/或其中:

c)按照kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由p、r和s组成的组，并且特别选自由r和s组成的组；

并且其中:

d)cdr1,cdr2和cdr3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。

特别地，根据本发明方面的一个优选的但非限制性的方面，纳米抗体通常可以定义为包括包含被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的免疫球蛋白序列的多肽，其中：

a-1)按照kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由a,g,e,d,g,q,r,s,l组成的组；并且优选地选自由g,e或q组成的组；和

a-2)按照kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由l,r或c组成的组；并且优选地选自由l或r组成的组；和

a-3)按照kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由w,r或s组成的组；并且优选地是w或r，并且最优选地为w；

a-4)按照kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是q；

或者其中:

b-1)按照kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由e和q组成的组；和

b-2)按照kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是r；和

b-3)按照kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由w,r和s组成的组；并且优选地为w；

b-4)按照kabat编号方式在位置108的氨基酸残基选自由q和l组成的组；并且优选地为q；

或者其中:

c-1)按照kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由a,g,e,d,q,r,s,和l组成的组；并且优选地选自由g,e和q组成的组；和

c-2)按照kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由l,r和c组成的组；并且优选地选自由l和r组成的组；和

c-3)按照kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由p,r和s组成的组；并且特别选自由r和s组成的组；和

c-4)按照kabat编号方式在位置108的氨基酸残基选自由q和l组成的组；优选地为q；

并且其中

d)cdr1,cdr2和cdr3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。

因此，在另一个优选而非限制性的方面中，本发明的纳米抗体可以具有下述结构：

fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4

其中fr1-fr4分别是指构架区1-4，并且其中cdr1-cdr3分别是指互补性决定区1-3，并且其中：

a-1)按照kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由a,g,e,d,g,q,r,s,l组成的组；并且优选地选自由g,e或q组成的组；

并且其中：

a-2)按照kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由l,r或c组成的组；并且优选地选自由l或r组成的组；

并且其中：

a-3)按照kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由w,r或s组成的组；并且优选地选自由w或r组成的组，并且最优选地为w；

并且其中：

a-4)按照kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是q；

并且其中：

d)cdr1,cdr2和cdr3如本发明所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。

在另一个优选而非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以具有下述结构：

fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4

其中fr1-fr4分别是指构架区1-4，并且其中cdr1-cdr3分别是指互补性决定区1-3，并且其中：

b-1)按照kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由e和q组成的组；并且其中：

b-2)按照kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是r；

并且其中：

b-3)按照kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由w,r和s组成的组；并且优选地为w；

并且其中：

b-4)按照kabat编号方式在位置108的氨基酸残基选自由q和l组成的组；并且优选地为q；

并且其中：

d)cdr1,cdr2和cdr3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。

在另一个优选的但非限制性方面中，本发明的纳米抗体可以具有下述结构

fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4

其中fr1-fr4分别是指构架区1-4，并且其中cdr1-cdr3分别是指互补性决定区1-3，并且其中:

c-1)按照kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由a,g,e,d,q,r,s,和l组成的组；并且优选地选自由g,e和q组成的组；

并且其中：

c-2)按照kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由l,r和c组成的组；并且优选地选自由l和r组成的组；

并且其中：

c-3)按照kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由p,r和s组成的组；并且特别选自由r和s组成的组；

并且其中：

c-4)按照kabat编号方式在位置108的氨基酸残基选自由q和l组成的组；优选地为q；

并且其中：

d)cdr1,cdr2和cdr3如本发明所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。

本发明纳米抗体的两个特别优选的但非限制性的组是按照上述a)；按照上述(a-1)到(a-4)；按照上述b)；按照上述(b-1)到(b-4)；按照上述(c)；和/或按照上述(c-1)到(c-4)的那些，其中：

i)按照kabat编号方式在位置44-47的氨基酸残基形成序列glew(或如本文所述的glew-样序列)，并且在位置108的氨基酸残基是q；

或其中：

ii)按照kabat编号方式在位置43-46的氨基酸残基形成序列kere或kqre(或如本文所述的kere-样序列)，并且在位置108的氨基酸残基是q或l,并且优选地为q。

因此，在另一个优选的但非限制性方面，本发明的纳米抗体可以具有下述结构

fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4

其中fr1-fr4分别是指构架区1-4，并且其中cdr1-cdr3分别是指互补性决定区1-3，并且其中：

i)按照kabat编号方式在位置44-47的氨基酸残基形成序列glew(或如本发明定义的glew-样序列)，并且在位置108的氨基酸残基是q；

并且其中：

ii)cdr1,cdr2和cdr3如本发明所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。

在另一个优选而非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以具有下述结构：

fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4

其中fr1-fr4分别是指构架区1-4，并且其中cdr1-cdr3分别是指互补性决定区1-3，并且其中:

i)按照kabat编号方式在位置43-46的氨基酸残基形成序列kere或kqre(或kere-样序列)，并且在位置108的氨基酸残基是q或l，并且优选是q；

并且其中：

ii)cdr1,cdr2和cdr3如本发明所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。

在其中按照kabat编号方式在位置43-46的氨基酸残基形成序列kere或kqre的本发明的纳米抗体中，在位置37的氨基酸残基最优选是f。在其中按照kabat编号方式在位置44-47的氨基酸残基形成序列glew的本发明的纳米抗体中，在位置37的氨基酸残基选自由y,h,i,l,v或f组成的组，并且最优选是v。

因此，但不以任何方式局限于此，基于在上述位置存在的氨基酸残基，本发明的纳米抗体可以通常基于下述三组分类：

i)“glew-组”:按照kabat编号方式在位置44-47具有免疫球蛋白序列glew并且按照kabat编号方式在位置108具有q的纳米抗体。如本文进一步所述，在这一组内的纳米抗体通常在位置37具有v，并且可以在位置103具有w,p,r或s，并且优选地在位置103具有w。所述glew组还包括一些glew-样的序列，诸如下表b-2中提及的那些。更一般地，且不限于，属于该glew组的纳米抗体可以定义为在位置44具有g和/或在位置47具有w的纳米抗体，其中位置46通常为e，且其中优选地，位置45不是带电荷的氨基酸残基且不是半胱氨酸；

ii)“kere-组”:按照kabat编号方式在位置43-46具有免疫球蛋白序列kere或kqre(或另一个kere-样序列)并且按照kabat编号方式在位置108具有q或l的纳米抗体。如本文进一步所述，在这一组内的纳米抗体通常在位置37具有f，在位置47具有l或f；并且可以在位置103具有w,p,r或s，并且优选地在位置103具有w。更一般地，且不限于，属于该kere组的纳米抗体可以定义为在位置44具有k，q或r(通常为k)的纳米抗体，其中位置45是带电荷的氨基酸残基或半胱氨酸，且位置47如本文进一步定义；

iii)“103p,r,s-组”:在位置103具有p，r或s的纳米抗体。这些纳米抗体可以在按照kabat编号方式的位置44-47具有免疫球蛋白序列glew或者在按照kabat编号方式的位置43-46具有免疫球蛋白序列kere或kqre，后者最优选地与位置37的f和位置47的l或f结合(如关于kere-组所定义)；并且可以在按照kabat编号方式的位置108具有q或l，并且优选地具有q。

此外，在适当的情形中，纳米抗体可以属于这些种类的两种或更多种(即，具有其特征)。例如，一个特别优选的纳米抗体组在位置44-47具有glew或glew-样序列；在位置103具有p,r或s(并且特别是r)；并且在位置108具有q(其可以人源化为l)。

更一般地，应该注意，上述定义描述和应用于以天然(即，非人源化的)vhh序列的形式存在的纳米抗体，且这些纳米抗体的人源化的变体可以包含除了上述显示的那些(即，如本文定义的一个或多个人源化的置换)之外的其他氨基酸残基。例如，且不限于，在glew-组或103p,r,s-组的一些人源化的纳米抗体中，在位置108的q可以被人源化为108l。如本文已经提及的，基于本文的公开内容，其他人源化的置换(及其适当的组合)将为专业技术人员所清楚。另外，或备选地，其他潜在有用的人源化置换可以通过将天然存在的vhh序列的构架区序列与一个或多个紧密相关的人vh序列的相对应的构架序列进行比较而确定，之后，可以将由此确定的一个或多个潜在有用的人源化置换(或其组合)引入到所述vhh序列中(以本身已知的任何方式，如本文进一步所述)，且由此人源化的vhh序列可以检测针对靶标的亲和力、稳定性、表达的容易性和水平、和/或其他需要的特性。以这种方式，通过有限程度的试验和误差，其他适当的人源化置换(或其适当的组合)可以由专业技术人员基于本文的公开内容确定。此外，基于前述，纳米抗体(的构架区)可以被部分人源化或完全人源化。

因此，在另一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以是属于glew-组(如本文所定义)的纳米抗体，并且其中cdr1,cdr2和cdr3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如按照本文的一个更优选的方面而定义。

在另一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以是属于kere-组(如本文所定义)的纳米抗体，并且cdr1,cdr2和cdr3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。

因此，在另一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以是属于103p,r,s-组(如本文所定义)的纳米抗体，并且其中cdr1,cdr2和cdr3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。

此外，更一般地，并且除了上文提及的108q,43e/44r和103p,r,s残基之外，本发明的纳米抗体可以在常规vh结构域中形成(部分)vh/vl界面的一个或多个位置包含一个或多个氨基酸残基，所述氨基酸残基比在相对应的天然存在的vh序列同一位置天然存在的氨基酸残基更加高度带电荷，并且特别是一个或多个带电荷的氨基酸残基(如在国际申请wo08/020079第48页的表a-2中提及)。这样的置换包括，但不限于下表b-2中提及的glew-样序列；以及国际申请wo00/29004中所述关于所谓的“微体(microbodies)”的置换，例如以获得在位置108具有q和在位置44-47具有klew组合的纳米抗体。基于本发明的公开内容，在这些位置的其它可能的置换对于专业技术人员应该是清楚的。在本发明的纳米抗体的一个方面中，在位置83的氨基酸残基选自由l,m,s,v和w组成的组；并且优选地为l。此外，在本发明的纳米抗体的一个方面中，位置83的氨基酸残基选自由r,k,n,e,g,i,t和q组成的组；并且最优选地为k或e(对于与天然存在的vhh结构域相对应的纳米抗体)或r(对于“人源化”纳米抗体，如本发明所述)。在一个方面中，位置84的氨基酸残基选自由p,a,r,s,dt,和v组成的组，并且最优选地是p(对于与天然存在的vhh结构域相对应的纳米抗体)或r(对于“人源化”纳米抗体，如本发明所述)。此外，在本发明的纳米抗体的一个方面中，位置104的氨基酸残基选自由g和d组成的组；并且最优选地是g。

总而言之，在所述纳米抗体中如上文提及的在位置11,37,44,45,47,83,84,103,104和108的氨基酸残基在本文中还叫作“标志残基”。所述标志残基以及在最接近的相关的人vh结构域，即vh3的相对应的位置的氨基酸残基总结在表b-2中。

在天然存在的vhh结构域中存在的这些标志残基的一些特别优选但非限制性的组合在表b-3中提及。为了比较，将叫作dp-47的人vh3的相对应氨基酸残基以斜体显示。

表b-2:纳米抗体中的标志残基

在所述纳米抗体中，在除所述标志残基外的任何其它位置的每一氨基酸残基可以是在天然存在的vhh结构域的相应位置(按照kabat编号方式)天然存在的任何氨基酸残基。

专业技术人员对于这样的氨基酸残基应该是清楚的。表b-4至b-7提及一些非限制性的残基，其可以存在于天然存在的vhh结构域的fr1、fr2、fr3和fr4的每一位置(按照kabat编号方式)。对于每一位置，在天然存在的vhh结构域的每一位置最经常存在的氨基酸残基(并且其在纳米抗体中对于所述位置是最优选的氨基酸残基)以粗体显示；并且对于每一位置的其它优选的氨基酸残基已加下划线(注意：在天然存在的vhh结构域的位置26-30发现的氨基酸残基的数目支持chothia(同前所述)的构成编号方式的基础的假说，即，在这些位置的残基已经形成cdr1的部分)。

在表b-4至b-7中，还已经提及可以在人vh3结构域的每一位置存在的一些非限制性的残基。此外，对于每一位置，在天然存在的人vh3结构域的每一位置最经常存在的氨基酸残基以粗体显示；并且其它优选的氨基酸残基加下划线。

仅是为了参考，表b-4至b-7还包含对于代表性样品7732个vhh序列关于在每个氨基酸位置的vhh熵(“vhhent.”)和vhh可变性(“vhhvar.”)的数据(数据由乌得勒支大学(utrechtuniversity)的davidlutjehulsing和theoverrips教授馈赠)。关于vhh熵和vhh可变性的数值提供对于被分析的7732个vhh序列之间的氨基酸残基的可变性和保守度的测量：低数值(即<1,诸如<0.5)表示在所述vhh序列之间氨基酸残基是高度保守的(即，几乎没有可变性)。例如，在位置9的g和在位置36的w分别具有0.01和0的vhh熵数值，这表示这些残基是高度保守的，并且具有很小的可变性(并且假设在所分析的所有7732个序列中位置36是w)，而对于形成cdr部分的残基通常发现1.5或更大的数值(数据未显示)。注意：下述数据支持这样的假说：在位置27-30的氨基酸残基以及还可能甚至在位置93和94的氨基酸残基已经形成cdr的一部分(尽管本发明不限于任何具体的假说或解释，并且如上文所提及，本发明使用按照kabat的编号方式)。对于序列熵的一般解释，序列可变性以及用于确定其的方法，参见oliveira等,蛋白质：结构，功能和遗传(proteins:structure,functionandgenetics),52:544-552(2003)。

表b-4:fr1中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表b-2的脚注)

表b-4:fr1中的氨基酸残基的非限制性实例(续表)

表b-5:fr2中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表b-2的脚注)

表b-6:fr3中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表b-2的脚注)

表b-6:fr3中的氨基酸残基的非限制性实例(续表)

表b-7:fr4中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表b-2的脚注)

因此，在另一个优选的但非限制性的方面中，本发明的纳米抗体可以定义为具有下述(通用)结构的免疫球蛋白序列

fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4

其中fr1-fr4分别是指构架区1-4，并且其中cdr1-cdr3分别是指互补性决定区1-3，并且其中：

i)在按照kabat编号的位置11,37,44,45,47,83,84,103,104和108的一个或多个氨基酸残基选自表b-2中提及的标志残基；

并且其中:

ii)cdr1,cdr2和cdr3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如本发明的一个更优选的方面而定义。

例如，上述纳米抗体可以是vhh序列或可以是人源化的纳米抗体。当上述纳米抗体序列为vhh序列时，它们可以被适当地人源化，如本文进一步所述。当所述纳米抗体是部分人源化的纳米抗体时，它们可以任选地被进一步适当地人源化，同样如本文所述。

特别地，本发明的纳米抗体可以是具有下述(通用)结构的免疫球蛋白序列：

fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4

其中fr1-fr4分别是指构架区1-4，并且其中cdr1-cdr3分别是指互补性决定区1-3，并且其中：

i)(优选地)在按照kabat编号的位置11,37,44,45,47,83,84,103,104和108的氨基酸残基的一个或多个选自下表b-2中提及的标志残基(应该理解，vhh序列应该包含一个或多个标志残基；并且部分人源化的纳米抗体应该通常，且优选地，[仍然]包含一个或多个标志残基[尽管依据本发明在适当的情形中提供部分人源化的纳米抗体也在本发明的范围内，在所述部分人源化的纳米抗体中，所有的标志残基，而不是一个或多个其余氨基酸残基，已经被人源化]；并且在完全人源化的纳米抗体中，依据本发明在适当的情形中，所有在标志残基位置上的氨基酸残基应该是在人vh3序列中存在的氨基酸残基。基于本发明公开的内容，专业技术人员应该清楚，所述vhh序列、所述具有至少一个标志残基的部分人源化的纳米抗体、所述不具有标志残基的部分人源化的纳米抗体、和所述完全人源化的纳米抗体均形成本发明的方面)；

并且其中：

ii)所述氨基酸序列与seqidno’s:1-22中的至少一个免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性的程度的目的，忽略形成cdr序列的氨基酸残基(在序列seqidno’s:1–22中用x表示)；

并且其中

iii)cdr1,cdr2和cdr3如本文所定义，并且优选地如按照本文的一个优选方面而定义，并且更优选地如按照本文的一个更优选的方面而定义。

例如，上述纳米抗体可以是vhh序列或可以是人源化的纳米抗体。当上述纳米抗体序列为vhh序列时，它们可以被适当地人源化，如本文进一步所述。当所述纳米抗体是部分人源化的纳米抗体时，它们可以任选地被进一步适当地人源化，同样如本文所述。

特别地，本发明kere-组的纳米抗体可以是具有下述(通用)结构的免疫球蛋白序列：

fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4

其中:

i)按照kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是带电荷的氨基酸(如本文定义)或半胱氨酸残基，且位置44优选地是e；

且其中:

ii)fr1是与下述免疫球蛋白序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列：

表b-9:kere-组纳米抗体的代表性fw1序列。

且其中:

iii)fr2是与下述免疫球蛋白序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列：

表b-10:kere-组纳米抗体的代表性fw2序列。

且其中:

iv)fr3是与下述免疫球蛋白序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列：

表b-11:kere-组纳米抗体的代表性fw3序列。

且其中：

v)fr4是与下述免疫球蛋白序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列：

表b-12:kere-组纳米抗体的代表性fw4序列。

且其中：

vi)cdr1,cdr2和cdr3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。

在上述纳米抗体中，一个或多个其他标志残基优选地如本文所述(例如，当它们为vhh序列或部分人源化的纳米抗体时。)

此外，上述纳米抗体可以，例如，是vhh序列或可以是人源化的纳米抗体。当上述纳米抗体序列为vhh序列时，它们可以被适当地人源化，如本文进一步所述。当所述纳米抗体是部分人源化的纳米抗体时，它们可以任选地被进一步适当地人源化，同样如本文所述。

关于构架1，专业技术人员应该清楚，当上述免疫球蛋白序列通过表达核苷酸序列而产生时，前4个免疫球蛋白序列(即，按照kabat编号方式的氨基酸残基1-4)可以通常通过已经用来生成所述核酸的引物来确定。因此，为了确定氨基酸同一性的程度，优选忽略前4个氨基酸残基。

此外，关于构架1，且尽管按照kabat编号方式的氨基酸位置27-30被认为是构架区的一部分(且不是cdr’s)，通过分析多于1000个vhh序列的数据库已经发现，位置27-30具有比在位置1-26的可变性高得多的可变性(以vhh熵和vhh可变性表示----参见表b-4至b-7)。因为此，为了确定氨基酸同一性的程度，优选地也忽略在位置27-30的氨基酸残基。

考虑到此，kere种类的纳米抗体可以是包括由3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的免疫球蛋白序列，其中：

i)按照kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是带电荷的氨基酸(如本文定义)或半胱氨酸残基，且位置44优选地是e；

且其中：

ii)fr1是这样的免疫球蛋白序列，其在按照kabat编号方式的位置5-26与下述免疫球蛋白序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性：

表b-13:kere-组纳米抗体的代表性fw1序列(氨基酸残基5-26)。

且其中：

iii)fr2,fr3和fr4如本文关于kere-种类的纳米抗体的fr2,fr3和fr4所提及的；

且其中：

iv)cdr1,cdr2和cdr3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。

上述纳米抗体可以，例如，是vhh序列或可以是人源化的纳米抗体。当上述纳米抗体序列为vhh序列时，它们可以被适当地人源化，如本文进一步所述。当所述纳米抗体是部分人源化的纳米抗体时，它们可以任选地被进一步适当地人源化，同样如本文所述。

glew种类的纳米抗体可以是包括由3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的免疫球蛋白序列，其中

i)优选地，当所述glew-种类的纳米抗体是非人源化的纳米抗体时，在位置108的氨基酸残基是q；

ii)fr1是与下述免疫球蛋白序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列：

表b-14:glew-组的纳米抗体的代表性fw1序列。

且其中：

iii)fr2是与下述免疫球蛋白序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列：

表b-15:glew-组的纳米抗体的代表性fw2序列。

且其中：

iv)fr3是与下述免疫球蛋白序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列：

表b-16:glew-组的纳米抗体的代表性fw3序列。

且其中：

v)fr4是与下述免疫球蛋白序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列：

表b-17:glew-组的纳米抗体的代表性fw4序列。

且其中：

vi)cdr1,cdr2和cdr3如本文所定义，并且优选地如按照本文的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。

在上述纳米抗体中，其他标志残基中的一个或多个优选地如本文所述(例如，当它们为vhh序列或部分人源化的纳米抗体时。)

关于构架1，同样专业技术人员应该清楚，为了确定氨基酸同一性的程度，优选地忽略在位置1-4和27-30的氨基酸残基。

考虑到此，glew种类的纳米抗体可以是包括由3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的免疫球蛋白序列，其中：

i)优选地，当glew-种类的纳米抗体是非人源化的纳米抗体时，在位置108的氨基酸残基为q；

且其中:

ii)fr1是这样的免疫球蛋白序列，其在按照kabat编号方式的位置5-26与下述免疫球蛋白序列至少之一具有至少80％的氨基酸同一性：

表b-18:kere-组的纳米抗体的代表性fw1序列(氨基酸残基5-26)。

且其中：

iii)fr2,fr3和fr4如本文关于glew-种类的纳米抗体的fr2,fr3和fr4所提及的；

且其中：

iv)cdr1,cdr2和cdr3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。

例如，上述纳米抗体可以是vhh序列或可以是人源化的纳米抗体。当上述纳米抗体序列为vhh序列时，它们可以被适当地人源化，如本文进一步所述。当所述纳米抗体是部分人源化的纳米抗体时，它们可以任选地被进一步适当地人源化，同样如本文所述。在上述纳米抗体中，其他标志残基中的一个或多个优选地如本文所述(例如，当它们是vhh序列或部分人源化的纳米抗体时)。

p,r,s103种类的纳米抗体可以是包括由3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的免疫球蛋白序列，其中：

i)在按照kabat编号方式的位置103的氨基酸残基不同于w；

且其中：

ii)优选地，在按照kabat编号方式的位置103的氨基酸残基是p,r或s,且更优选是r；

且其中：

iii)fr1是与下述免疫球蛋白序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列：

表b-19:p,r,s103-组的纳米抗体的代表性fw1序列。

且其中：

iv)fr2是与下述免疫球蛋白序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列：

表b-20:p,r,s103-组的纳米抗体的代表性fw2序列。

且其中：

v)fr3是与下述免疫球蛋白序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列：

表b-21:p,r,s103-组的纳米抗体的代表性fw3序列。

且其中：

vi)fr4是与下述免疫球蛋白序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列：

表b-22:p,r,s103-组的纳米抗体的代表性fw4序列。

且其中：

vii)cdr1,cdr2和cdr3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。

在上述纳米抗体中，其他标志残基中的一个或多个优选地如本文所述(例如，当它们为vhh序列或部分人源化的纳米抗体时)。

关于构架1，同样专业技术人员应该清楚，为了确定氨基酸同一性的程度，优选地忽略在位置1-4和27-30的氨基酸残基。

考虑到此，p,r,s103种类的纳米抗体可以是包括由3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的免疫球蛋白序列，其中：

i)在按照kabat编号方式的位置103的氨基酸残基不同于w；

且其中：

ii)优选地，在按照kabat编号方式的位置103的氨基酸残基是p,r或s,且更优选是r；

且其中：

iii)fr1是这样的免疫球蛋白序列，其在按照kabat编号方式的位置5-26与下述免疫球蛋白序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性：

表b-23:p,r,s103-组纳米抗体的代表性fw1序列(氨基酸残基5-26)。

且其中：

iv)fr2,fr3和fr4如本文关于p,r,s103-种类的纳米抗体的fr2,fr3和fr4所提及的；

且其中：

v)cdr1,cdr2和cdr3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。

例如，上述纳米抗体可以是vhh序列或可以是人源化的纳米抗体。当上述纳米抗体序列为vhh序列时，它们可以被适当地人源化，如本文进一步所述。当所述纳米抗体是部分人源化的纳米抗体时，它们可以任选地被进一步适当地人源化，同样如本文所述。

在上述纳米抗体中，其他标志残基中的一个或多个优选地如本文所述(例如，当它们是vhh序列或部分人源化的纳米抗体时)。

在另一个优选的但非限制性的方面，本发明涉及如上所述的纳米抗体，其中所述cdr序列与seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778(参见表a-1)的至少一个免疫球蛋白序列的cdr序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多，或甚至基本上100％的氨基酸同一性。此氨基酸同一性的程度可以例如通过确定(以本文中所述的方式)所述纳米抗体和seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778(参见表a-1)的一个或多个序列之间的氨基酸同一性的程度来确定，其中忽略形成构架区的氨基酸残基。所述纳米抗体可以如本文进一步所述。

如本文已经提及的，本发明的另一个优选的但非限制性的方面涉及具有这样的免疫球蛋白序列的纳米抗体，所述免疫球蛋白序列选自由seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778(参见表a-1)组成的组或选自由与seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778(参见表a-1)的免疫球蛋白序列中的至少一个具有超过80％，优选超过90％，更优选超过95％，诸如99％或更多序列同一性(如本文所定义)的免疫球蛋白序列组成的组。

此外，在上述纳米抗体中：

i)任何氨基酸置换(当其不是如本文所定义的人源化置换时)优选地，并且与seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778(参见表a-1)的相应免疫球蛋白序列相比，是保守氨基酸置换,(如本文所定义)；

和/或

ii)与seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778(参见表a-1)的相应免疫球蛋白序列相比，其免疫球蛋白序列优选地仅含有氨基酸置换，或另外优选地不超过5个，优选不超过3个，和更优选仅1或2个氨基酸缺失或插入；

和/或

iii)cdr可以是这样的cdr，其通过亲和力成熟衍生，例如，从seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778(参见表a-1)的相应免疫球蛋白序列的cdr开始。

优选地，本发明的纳米抗体中的cdr序列和fr序列是这样的，即，本发明的纳米抗体(和包括其的本发明的多肽):

-以10^-5-10^-12摩尔/升或更小、并且优选地10^-7-10^-12摩尔/升或更小、并且更优选地10^-8-10^-12摩尔/升的解离常数(kd)(即，以10⁵-10¹²升/摩尔或更大、并且优选地10⁷-10¹²升/摩尔或更大、且更优选地10⁸-10¹²升/摩尔的缔合常数(ka))与离子通道诸如例如p2x7结合；

和/或这样，以致它们:

-以10²m^-1s^-1–约10⁷m^-1s^-1,优选10³m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1,更优选10⁴m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1,诸如10⁵m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1的kon-速率与离子通道诸如例如p2x7结合；

和/或这样，以致它们:

-以1s^-1(t1/2＝0.69s)-10^-6s^-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合体),优选10^-2s^-1-10^-6s^-1,更优选10^-3s^-1-10^-6s^-1,诸如10^-4s^-1-10^-6s^-1的koff速率与离子通道诸如例如p2x7结合。

优选地，在本发明的纳米抗体中存在的cdr序列和fr序列是这样的，以致本发明的纳米抗体将以小于500nm,优选小于200nm,更优选小于10nm,诸如小于500pm的亲和力与离子通道诸如例如p2x7结合。

根据本发明的一个非限制性方面，纳米抗体可以是如本文所定义的，但是具有这样的限制条件：与天然存在的人vh结构域的相对应的构架区相比，并且特别是与dp-47的相对应的构架区相比，其在至少一个构架区具有至少“一个氨基酸差异”(如本文所定义)。更特别地，根据本发明的一个非限制性方面，纳米抗体可以是如本文所定义的，但是具有这样的限制条件：与天然存在的人vh结构域的相对应的构架区相比，并且特别是与dp-47的相对应的构架区相比，其在至少一个标志残基(包括在位置108,103和/或45的那些)具有至少“一个氨基酸差异”(如本文所定义)。通常，纳米抗体应该在fr2和/或fr4中的至少一个中，并且特别是在fr2和/或fr4中的至少一个标志残基(同样，(包括在位置108,103和/或45的那些))与天然存在的vh结构域具有至少一个这样的氨基酸差异。

此外，人源化的本发明的纳米抗体可以如本发明所定义，但是具有这样的限制条件：与天然存在的vhh结构域的相对应的构架区相比，其在至少一个构架区具有至少“一个氨基酸差异”(如本文所定义)。更特别地，根据本发明的一个非限制性方面，人源化的纳米抗体可以如本文所定义，但是具有下述限制条件：与天然存在的vhh结构域的相对应的构架区相比，其在至少一个标志残基(包括在位置108,103和/或45的那些)具有至少“一个氨基酸差异”(如本文所定义)。通常，人源化的纳米抗体应该在fr2和/或fr4中的至少一个、并且特别是在fr2和/或fr4中的至少一个标志残基(同样，包括在位置108,103和/或45的那些)与天然存在的vhh结构域具有至少一个所述氨基酸差异。

从本发明的公开内容应该清楚，使用如本发明所定义的本发明的纳米抗体的天然或合成的类似物、突变体、变体、等位基因、同系物和直向同源物(本发明笼统称为“类似物”)，和特别地seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778(参见表a-1)的纳米抗体的类似物也在本发明的范围之内。因此，根据本发明的一个方面，术语“本发明的纳米抗体”在其最广泛意义上还涵盖所述类似物。

通常，在所述类似物中，与如本发明所定义的本发明纳米抗体相比，一个或多个氨基酸残基可以被置换、缺失和/或添加。这样的置换、插入或缺失可以在一个或多个构架区和/或在一个或多个cdr内进行。当所述置换、插入或缺失在一个或多个构架区内进行时，它们可以在一个或多个标志残基处和/或在构架残基中的一个或多个其它位置进行，尽管通常较不优选在标志残基处的置换、插入或缺失(除非这些是如本文所述的适当的人源化置换)。

通过非限制性实例的方式，例如，置换可以是保守置换(如本文所述)和/或氨基酸残基可以被天然存在于另一个vhh结构域中相同位置处的另一个氨基酸残基置换(关于这样的置换的一些非限制性实例参见表b-4至b-7)，尽管本发明通常不限于此。因此，在本发明的范围内包括任何一个或多个置换、缺失或插入，或它们的任何组合，所述置换、缺失或插入或其组合改善本发明的纳米抗体的特性，或至少没有将本发明的纳米抗体的理想特性或理想特性的平衡或组合减损太多(即，到所述纳米抗体不再适合其目的应用的程度)。基于本发明的公开内容，以及任选地在有限程度的常规实验之后，例如，常规实验可以包括引入有限数目的可能的置换并且确定它们对这样获得的纳米抗体特性的影响，专业技术人员通常应该能够确定并且选择适当的置换、缺失或插入、或它们的适当的组合。

例如，并且取决于用于表达本发明的纳米抗体或多肽的宿主生物体，所述缺失和/或置换可以以这样的方式设计，所述方式去除一个或多个翻译后修饰的位点(诸如一个或多个糖基化位点)，这应该在本领域技术人员的能力范围内。备选地，可以设计置换或插入，以引入一个或多个附着官能团(如本文所述)的位点，例如，以允许位点-特异性的聚乙二醇化(pegylation)(同样如本文所述)。

从在上述表b-4–b-7中提供的关于vhh熵和vhh可变性的数据可以看出，在构架区中的一些氨基酸残基比其它的更保守。通常，尽管本发明在其最广泛意义上不限于此，优选在较不保守的位置进行任何置换、缺失或插入。此外，通常，氨基酸置换优于氨基酸缺失或插入。

所述类似物优选是这样的，以致它们可以以如本文关于本发明的纳米抗体所定义的亲和力(适当测量的和/或表示为kd-值(实际的或表观的),ka-值(实际的或表观的),kon-速率和/或koff-速率，或备选地表示为ic50值，如本发明进一步所述)结合离子通道，诸如例如p2x7。

所述类似物优选还是这样的，以致它们保留所述纳米抗体的有利特性，如本文所述。

此外，根据一个优选的方面，所述类似物与seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778(参见表a-1)的纳米抗体之一具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、如至少95％或99％或更多的序列同一性程度；和/或优选地具有至多20个、优选地至多10个、甚至更优选地至多5个、如4,3,2或仅有1个氨基酸差异(如本文定义)。

此外，所述类似物的构架序列和cdr’s优选是这样的，以致它们与本文定义的优选方面一致。更一般地，如本文所述，所述类似物具有：(a)在位置108的q；和/或(b)在位置45的带电荷氨基酸或半胱氨酸残基，和优选地在位置44为e,更优选地在位置44为e和在位置45为r；和/或(c)在位置103的p,r或s。

本发明纳米抗体的类似物的一个优选的种类包括已经被人源化的纳米抗体(即，与天然存在的本发明的纳米抗体的序列相比较)。如在本发明引用的背景技术中提及的，这样的人源化通常包括用在人vh结构域如人vh3结构域中相同位置存在的氨基酸残基置换在天然存在的vhh序列中的一个或多个氨基酸残基。专业技术人员应该清楚可能的人源化置换或人源化置换的组合的实例，例如，从本发明的表格，从在本发明引用的背景技术中提及的可能的人源化置换，和/或从纳米抗体序列与天然存在的人vh结构域序列之间的比较获知。

所述人源化置换应该这样选择，以致所得到的人源化的纳米抗体仍然保留如本发明所定义的纳米抗体的有利特性，并且更优选这样选择，以致它们如在前段中关于类似物的描述。基于本文的公开内容，并且任选地在有限程度的常规实验之后，所述常规实验包括，例如，引入有限数量的可能的人源化置换，并且确定它们对这样获得的纳米抗体的特性的影响，专业技术人员通常能够确定并选择适当的人源化置换或适当的人源化置换的组合。

一般地，作为人源化的结果，本发明的纳米抗体可以变得更加“人-样”，同时仍然保留如本文所述的本发明的纳米抗体的有利特性。结果，与相对应的天然存在的vhh结构域相比，这样人源化的纳米抗体可以具有一些优点，诸如减小的免疫原性。同样，基于本发明的公开内容，并且任选在有限程度的常规实验之后，专业技术人员应该能够选择人源化置换或适当的人源化置换组合，其最优化或获得一方面在通过人源化置换提供的有利特性和另一方面在天然存在的vhh结构域的有利特性之间的理想的或适当的平衡。

本发明的纳米抗体可以在任何构架残基处被适当人源化，诸如在一个或多个标志残基处(如本文所定义)或在一个或多个其它构架残基处(即，非标志残基)或它们的任何适当的组合。关于“p,r,s-103组”或“kere组”的纳米抗体的一个优选的人源化置换是将q108置换成l108。“glew种类”的纳米抗体也可以通过将q108置换成l108被人源化，条件是其它标志残基中的至少一个含有骆驼科动物(骆驼源化)置换(如本文所定义)。例如，如上文所提及，人源化的纳米抗体的一个特别优选的种类在位置44-47具有glew或glew-样序列；在位置103具有p,r或s(并且特别是r)，并且在位置108具有l。

人源化的和其它类似物，以及编码其的核酸序列，可以以本身已知的任何方式提供，例如，使用在wo08/020079第103和104页提及的一种或多种技术而提供。

如其中提及的，专业技术人员还应该清楚，本发明的纳米抗体(包括它们的类似物)还可以从人vh序列(即，免疫球蛋白序列或相对应的核苷酸序列)起始设计和/或制备，所述人vh序列诸如例如人vh3序列，诸如dp-47、dp-51、或dp-29，即，通过引入一个或多个骆驼源化的置换(即，将在所述人vh结构域的免疫球蛋白序列中的一个或多个氨基酸残基改变成在vhh结构域相对应位置存在的氨基酸残基)，以提供本发明的纳米抗体序列，和/或将纳米抗体的有利特性赋予这样获得的序列。同样地，这通常可以应用前段中提到的各种方法和技术进行，其应用人vh结构域的免疫球蛋白序列和/或核苷酸序列作为起点。

一些优选的而非限制性的骆驼源化置换可以来自表b-4至b-7。同样应该清楚，在一个或多个标志残基处的骆驼源化置换通常将比在一个或多个其它氨基酸位置的置换对所需要的特性有更大的影响，尽管这两种置换以及它们的任何适当的组合均包括在本发明范围之内。例如，可以引入一个或多个已经赋予至少一些所需要的特性的骆驼源化置换，并且然后引入进一步的骆驼源化置换，其进一步改善所述特性和/或赋予额外的有利特性。同样地，基于本发明的公开内容，并且任选地在有限程度的常规实验之后，所述常规实验可以包括，例如，引入有限数量的可能的骆驼源化置换，并且确定是否获得或改善纳米抗体的有利特性(即，与原始vh结构域相比)，专业技术人员将通常能够确定并选择适当的骆驼源化置换或适当的骆驼源化置换的组合。

然而，一般地，所述骆驼源化置换优选是这样的以致得到的免疫球蛋白序列至少包含(a)在位置108的q；和/或(b)在位置45的带电荷的氨基酸或半胱氨酸残基以及优选地也在位置44的e，以及更优选地在位置44的e和在位置45的r；和/或(c)在位置103的p，r或s；和任选地一种或多种其它的骆驼源化置换。更优选地，所述骆驼源化置换是这样的以致它们产生本发明的纳米抗体和/或其类似物(如本文定义)，如得到人源化的类似物和/或优选地如在前述段落中定义的类似物。

纳米抗体还可以通过结合自然中稀有但是结构上与vh结构域折叠相容的置换而衍生于vh结构域。例如，但不限于，这些置换可以包括下述中的一种或多种：在位置35的gly,在位置37的ser,val或thr,在位置39的ser,thr,arg,lys,his,asp或glu,在位置45的glu或his,在位置47的trp,leu,val,ala,thr,或glu,在位置50的s或r。(barthelemy等.jbiolchem.(生物化学杂志)2008年2月8日；283(6):3639-54.电子公开于2007年11月28日)

如从本文的公开内容中还要清楚的是，使用如本文所定义的本发明的纳米抗体的部分或片段，或两个或多个部分或片段的组合，并且特别是seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778(参见表a-1)的纳米抗体的部分或片段，也包括在本发明的范围内。因此，根据本发明的一个方面，术语“本发明的纳米抗体”在其最广泛的意义上也涵盖所述部分或片段。

一般地，本发明的纳米抗体(包括其类似物)的所述部分或片段具有这样的免疫球蛋白序列，其中，与相对应的本发明的全长纳米抗体(或其类似物)的免疫球蛋白序列相比较，已经缺失和/或去除在n末端的一个或多个氨基酸残基，在c末端的一个或多个氨基酸残基，一个或多个连续的内部氨基酸残基，或它们的任何组合。

所述部分或片段优选是这样的，以致它们可以以如本文关于本发明的纳米抗体所定义的亲和力(适当测量和/或表示为kd-值(实际的或表观的),ka-值(实际的或表观的),kon-速率和/或koff-速率,或备选地为ic50值,如本发明进一步所述))结合离子通道，诸如例如p2x7。

任何部分或片段优选地是这样，以致其包括相对应的本发明的全长纳米抗体的免疫球蛋白序列的至少10个连续的氨基酸残基，优选地至少20个连续的氨基酸残基，更优选地至少30个连续的氨基酸残基，诸如至少40个连续的氨基酸残基。

此外，任何部分或片段优选是这样的，以致其包括cdr1、cdr2和/或cdr3中的至少一个或至少其部分(并且特别是至少cdr3或至少其部分)。更优选地，任何部分或片段是这样的，以致其包括至少一个cdr(并且优选至少cdr3或其部分)，和至少一个其它cdr(即，cdr1或cdr2)或至少其部分，优选通过适当的构架序列或至少其部分连接。更优选地，任何部分或片段是这样的，以致其包括至少一个cdr(且优选至少cdr3或其部分)，和至少两个剩余cdr的部分，同样优选通过适当的构架序列或至少其部分连接。

按照另一个特别优选的但非限制性的方面，这样的部分或片段包括至少cdr3，诸如相对应的本发明全长纳米抗体的fr3、cdr3和fr4，即，例如，如在国际申请wo03/050531(lasters等)中所述。

如上文已经提及，还可以组合两个或更多个这样的部分或片段(即，来自相同的或不同的本发明的纳米抗体)，即，以提供本发明纳米抗体的类似物(如本文所定义)和/或以提供其它部分或片段(如本文所定义)。例如，还可以将本发明纳米抗体的一个或多个部分或片段与人vh结构域的一个或多个部分或片段组合。

根据一个优选方面，所述部分或片段与seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778(参见表a-1)的纳米抗体之一具有至少50％、优选地至少60％、更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、诸如至少90％、95％或99％或更多的序列同一性程度。

所述部分和片段，以及编码其的核酸序列可以以本身已知的任何方式提供并且任选地组合。例如，所述部分或片段可以通过在编码本发明的全长纳米抗体的核酸中插入终止密码子，并且然后以本身已知的方式(例如，如本文所述)表达这样获得的核酸而获得。

备选地，编码所述部分或片段的核酸可以这样获得，即，通过适当限制性酶切(restrict)编码本发明的全长纳米抗体的核酸或通过以本身已知的方式合成这样的核酸。部分或片段还可以使用本身已知的肽合成技术提供。

本发明在其最广泛意义上还包括本发明的纳米抗体的衍生物。这样的衍生物通常可以通过本发明的纳米抗体和/或形成本发明的纳米抗体的一个或多个氨基酸残基的修饰而获得，并且特别是通过化学和/或生物(例如，酶促)修饰获得。

专业技术人员应该清楚这样的修饰的实例，以及纳米抗体序列中可以以这样的方式修饰的氨基酸残基的实例(即，在蛋白主链上但是优选地在侧链上)，可以用来引入所述修饰的方法和技术以及所述修饰的潜在用途和优点。

例如，这样的修饰可以包括向本发明的纳米抗体内或向本发明的纳米抗体上引入(例如，通过共价连接或以其它适当的方式)一个或多个官能团、残基或结构部分，并且特别是赋予本发明的纳米抗体一种或多种理想的特性或官能性的一个或多个官能团、残基或部分。专业技术人员应该清楚所述官能团的实例。

例如，所述修饰可以包括引入(例如，通过共价结合或以任何其它适当的方式)一个或多个这样的官能团，即，所述官能团增加本发明的纳米抗体的半衰期、溶解性和/或吸收，减少本发明的纳米抗体的免疫原性和/或毒性，消除或减弱本发明的纳米抗体的任何不理想的副作用，和/或赋予本发明的纳米抗体和/或多肽以其它的有利特性和/或减少本发明的纳米抗体和/或多肽的不理想特性；或者两种或多种上述的任何组合。所述官能团的实例以及引入所述官能团的技术的实例应该为专业技术人员清楚，并且通常可以包括上文引用的公知背景技术中提及的所有官能团和技术，以及本身已知的用于修饰药物蛋白并且特别用于修饰抗体或抗体片段(包括scfv’s和单结构域抗体)的官能团和技术，关于其的参考文献例如参考雷明顿药物科学(remington'spharmaceuticalsciences),第16版,mack出版公司,伊斯顿,pa(1980)。例如，所述官能团可以直接连接(例如共价地)到本发明的纳米抗体上，或者任选地通过适当的接头或间隔臂连接，这也为专业技术人员所清楚。

关于增加药物蛋白的半衰期和/或减少免疫原性最广泛应用的一种技术包括附着适当的药用聚合物诸如聚(乙二醇)(peg)或其衍生物(诸如甲氧基聚(乙二醇)或mpeg)。一般地，可以应用聚乙二醇化作用的任何适当的形式，诸如本领域中用于抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和scfv’s)的聚乙二醇化作用；例如，参考chapman,自然生物技术(nat.biotechnol.),54,531-545(2002)；veronese和harris,高级药物递送综述(adv.drugdeliv.rev.)54,453-456(2003),harris和chess,自然药物发现评论(nat.rev.drug.discov.),2,(2003)以及在wo04/060965中。用于蛋白聚乙二醇化的各种试剂还可以商购，例如从美国nektar治疗公司(nektartherapeutics)购得。

优选地，应用定向聚乙二醇化，特别是通过半胱氨酸-残基(参见例如yang等,蛋白质工程(proteinengineering),16,10,761-770(2003))。例如，为了这一目的，peg可以附着到在本发明的纳米抗体中天然存在的半胱氨酸残基上，本发明的纳米抗体可以这样进行修饰，以适当地引入一个或多个用于peg附着的半胱氨酸残基，或者可以将包括一个或多个用于peg附着的半胱氨酸残基的免疫球蛋白序列融合到本发明的纳米抗体的n-和/或c-端，其全部使用本身为专业技术人员所了解的蛋白质工程技术。

优选地，对于本发明的纳米抗体和蛋白，使用具有分子量大于5000，诸如大于10,000并且小于200,000，诸如小于100,000；例如在20,000-80,000范围内的peg。

另一种通常较不优选的修饰包括n-连接的或o-连接的糖基化，通常作为共翻译和/或翻译后修饰的一部分，其取决于为了表达本发明的纳米抗体或多肽所用的宿主细胞。

另一种修饰可以包括引入一种或多种可检测的标记或其它信号-产生基团或结构部分，其取决于所标记纳米抗体的目的用途。适宜的标记以及附着、使用和检测它们的技术是专业技术人员所清楚的，并且例如包括但不限于，荧光标记、磷光性标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性-同位素、金属、金属螯合物、金属阳离子、发色团和酶，诸如在wo08/020079第109页提及的那些。其它适宜的标记为专业技术人员所清楚，并且例如包括可以应用nmr或esr光谱检测的结构部分。

例如，这样标记的本发明的纳米抗体和多肽可以用于体外、体内或原位检测(包括本身已知的免疫检测，诸如elisa,ria,eia和其它“夹心式检测”等)，以及体内诊断和成像目的，这取决于特定的标记的选择。

专业技术人员应该清楚，另一种修饰可以包括引入螯合基团，例如以螯合上文提到的金属或金属阳离子中的一种。例如，适当的螯合基团包括但不限于二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)或乙二胺四乙酸(edta)。

另一种修饰可以包括引入作为特异性结合对诸如生物素-(链霉)抗生物素蛋白结合对的一部分的官能团。这样的官能团可以用来将本发明的纳米抗体与另一种蛋白、多肽或化学化合物结合，所述另一种蛋白、多肽或化学化合物与所述结合对的另一半结合，即，通过形成所述结合对。例如，本发明的纳米抗体可以缀合到生物素上，并且连接到与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白缀合的另一种蛋白、多肽、化合物或载体上。例如，这样缀合的纳米抗体可以用作报道子，例如在产生可检测的信号的试剂与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白缀合的诊断系统中用作报道子。例如，这种结合对还可以用来将本发明的纳米抗体与载体结合，所述载体包括适用于药物目的的载体。一个非限制性的实例是cao和suresh,药物靶向杂志(journalofdrugtargetting),8,4,257(2000)所述的脂质体制剂。这种结合对还可以用来将治疗活性剂与本发明的纳米抗体结合。

对于一些应用，特别是对于意欲杀死表达本发明的纳米抗体所针对的靶标的细胞(例如，在治疗癌症时)，或者意欲减少或减缓所述细胞的生长和/或增殖的那些应用中，本发明的纳米抗体还可以与毒素或者毒性残基或结构部分连接。例如，可以与本发明的纳米抗体连接以提供细胞毒性化合物的毒性结构部分、化合物或残基的实例对于专业技术人员是清楚的，并且例如，可以在上文引用的现有技术和/或本文的进一步描述中找到。一个实例是记述在wo03/055527中的所谓的adept^tm技术。

专业技术人员应该清楚其它潜在的化学和酶促修饰。这种修饰还可以为研究目的引入(例如，为了研究功能-活性关系)。例如，参考lundblad和bradshaw,生物技术和应用生物化学(biotechnol.appl.biochem.),26,143-151(1997)。

优选地，所述衍生物是这样的，以致它们以如本文关于本发明的纳米抗体所定义的亲和力(适当测量和/或表示为kd-值(实际的或表观的),ka-值(实际的或表观的),kon-速率和/或koff-速率,或备选地为ic50值,如本发明进一步所述)结合离子通道，诸如例如p2x7。

如上文提及，本发明还涉及基本上由至少一个本发明的纳米抗体组成或包括至少一个本发明的纳米抗体的蛋白或多肽。“基本上由……组成”意指本发明的多肽的免疫球蛋白序列与本发明纳米抗体的免疫球蛋白序列完全相同，或者与本发明纳米抗体的免疫球蛋白序列相对应，其将有限数目的氨基酸残基，诸如1-20个氨基酸残基，例如1-10个氨基酸残基并且优选地1-6个氨基酸残基，诸如1,2,3,4,5或6个氨基酸残基添加到所述纳米抗体的免疫球蛋白序列的氨基末端、羧基末端或者氨基末端和羧基末端两端。

所述氨基酸残基可以或者可以不变化、改变或者另外影响所述纳米抗体的(生物学)特性，并且可以或者可以不为所述纳米抗体添加其它的官能性。例如，所述氨基酸残基：

-可以包括n-端met残基，例如，作为在异源宿主细胞或宿主生物体内表达的结果；

-可以形成信号序列或前导序列，当合成时其引导所述纳米抗体从宿主细胞中分泌。适宜的分泌性前导肽应该是专业技术人员所清楚的，并且可以如本文进一步所述。通常，这样的前导序列与所述纳米抗体的n端连接，尽管本发明在其最广泛意义上不限于此；

-可以形成这样的序列或信号，即，所述序列或信号允许所述纳米抗体导向和/或透过或进入特异性的器官、组织、细胞、或者细胞的部分或区室，和/或所述序列或信号允许所述纳米抗体透过或穿过生物屏障诸如细胞膜、细胞层诸如上皮细胞层、肿瘤包括实体瘤、或血脑屏障。所述免疫球蛋白序列的实例对于专业技术人员是清楚的，并且包括在wo08/020079第112页c)段中提及的那些；

-可以形成“标记”，例如允许或促进所述纳米抗体的纯化的免疫球蛋白序列或残基，例如使用针对所述序列或残基的亲和技术进行纯化。然后，所述序列或残基可以被去除(例如，通过化学或酶促裂解)，以提供纳米抗体序列(为了这一目的，所述标记可以任选地通过可裂解的接头序列与所述纳米抗体序列连接或包含可裂解的基序)。这种残基的一些优选的但非限制性的实例是多组氨酸残基、谷胱甘肽残基以及myc-标记(例如参见wo06/12282的seqidno:31)；

-可以是已经被官能化和/或可以作为用于官能团附着的位点的一个或多个氨基酸残基。适宜的氨基酸残基和官能团应该是专业技术人员所清楚的，并且包括但不限于，本文为本发明的纳米抗体的衍生物提及的氨基酸残基和官能团。

在骆驼科动物中的dna疫苗接种

dna疫苗接种已经广泛地用于在实验动物中诱导免疫应答，所述实验动物诸如大鼠、小鼠和兔(参见，例如，tang等,nature(自然),1992；nagata等,j.immunol.methods(免疫学方法杂志),2003；bins等,naturemed.(自然医学)2005；bins等,j.immunol.(免疫学杂志),2007；kilpatrick等,hybridoma(杂交瘤),1998)。然而，认为对较大动物的dna疫苗接种如果不是不可能的话便是困难的。特别地，少有关于对骆驼科动物的dna疫苗接种的报道。kochnolte等,2007,的报道描述了一种冗长且繁琐的方法，其需要以6-12周的时间间隔不少于8轮的dna疫苗接种，结合另外两轮蛋白加强。本发明的目的是提供一种对大动物特别是骆驼科动物进行dna疫苗接种的改进方法。

a)不用蛋白加强产生免疫球蛋白序列

在具体的实施方案中，本发明涉及通过基因疫苗接种无需蛋白加强在非人动物、具体是骆驼科动物、更具体是美洲驼中产生免疫球蛋白序列的方法。

先前已经在非骆驼科动物如小鼠中证明，在dna疫苗接种后，无需用蛋白抗原加强，可以获得多克隆血清抗体反应(例如，bins等,naturemedicine(自然医学),2005；bins等,j.immunol.(免疫学杂志)2007)。然而，已知所述多克隆抗体反应不足以有效地产生抗原特异性单克隆抗体(nagata等,2003)。作者报道在不存在蛋白加强时在小鼠中“几乎可以忽略的”特异性杂交瘤产量(0.0-1.3/10e8个脾细胞)。

通常已知较大动物特别是骆驼科动物的基因疫苗接种与小鼠相比激发免疫应答的效率要低得多。因此，在骆驼科动物中利用基因疫苗接种产生免疫球蛋白序列被认为是不可能的。

koch-nolte等2007记述了用dna-致敏蛋白加强策略免疫美洲驼，以获得针对胞外-adp-核糖基转移酶(ecto-adp-ribosyltransferase)art2.2的单结构域抗体。然而，该方法特征在于效率低并且需要多次加强。更具体地，美洲驼接受4次用编码art2.2的表达载体以6-12周时间间隔进行的皮内基因枪免疫(在300psi的压力设置下，12次发射1μgdna/mg金)。为了获得满意的免疫应答，需要使用重组art2.2进行4次后续的加强dna免疫和另外两次蛋白加强。总之，该方法在动物中获得适当的免疫应答之前持续数月，并且有必要进行多次蛋白加强。

考虑到该现有技术的教导，本发明的令人惊讶的发现是，通过使用本文所述的方法，可以在无需蛋白加强的条件下在骆驼科动物中特别是在美洲驼中获得适当的免疫应答。换言之，仅用基因疫苗接种就可以足以诱导通过后续的筛选足以产生免疫球蛋白序列的免疫应答。特别地，已经令人惊讶地发现，即使血清抗体反应低于常规免疫策略，仅用dna疫苗接种仍然足以获得良好的“击中率”，即，以可接受的频率获得抗原特异性免疫球蛋白序列。

b)产生针对细胞相关抗原的抗体反应

如导言部分所述，现有技术没有提供产生针对本文定义的细胞相关抗原(特别是针对跨膜抗原)的抗体反应的适当的技术。

本发明基于这样的令人惊讶的发现，即，通过对适当的非人动物、特别是骆驼科动物、优选美洲驼进行基因疫苗接种，可以产生抗体反应，其特征在于，与现有技术尝试相比，提高的全体成员宽度以及提高的特异性。

细胞相关抗原，更具体地是具有单个或多个跨膜结构域的那些，难以以其天然构象纯化。为了获得针对天然表位的免疫球蛋白序列(包括纳米抗体)，重要地是向美洲驼施用以其天然构象存在的靶抗原。对于这些细胞相关抗原，用功能性表达所述抗原的全细胞免疫是优选的策略(例如，如在wo05/044858；wo07/042289；us61/004,332中进行的)。全细胞免疫的主要缺点是这样的事实，即，许多其它抗原(细胞表面标记)也被呈递到动物的免疫系统中，这导致高度减弱的靶标特异性免疫应答。为了提高特异性，必须设计精细的和技术上复杂的致敏-加强策略。到该程度，这些步骤中的任一个包括使用变性的蛋白或肽，所产生的抗体反应偏爱构象表位的缺点。因此，将限制可获得的免疫球蛋白序列谱的宽度。此外，仅基于细胞的方法，即，使用表达靶抗原的细胞进行免疫的方法，特征在于免疫球蛋白序列的极低的特异性，这使得不可能有效分离目的免疫球蛋白序列。

koch-nolte等2007描述了用dna致敏蛋白加强策略免疫一头美洲驼，以获得针对胞外-adp-核糖基转移酶art2.2的单结构域抗体。

胞外-adp-核糖基转移酶art2.2是gpi锚定蛋白，其特征在于通过脂质尾插入膜但是不具有跨膜结构域。对于该蛋白，可以制备正确折叠的纯化的蛋白用于加强。因此，加强可以使用纯化的蛋白进行。如上文所示，锚定在膜内或位于膜内的细胞相关抗原的纯化蛋白不能以其天然构象的纯化形式获得。任何纯化的制备物将失去膜依赖型构象表位。因此，使用来自这些细胞相关抗原的纯化蛋白进行加强是不可能的。

在跨膜蛋白的情形中，并且特别是具有多个跨膜结构域的蛋白的情形中，构象表位，且特别是膜依赖型构象表位作为免疫球蛋白序列的靶标是特别令人感兴趣的。例如，离子通道的孔代表具有首要治疗重要性的靶标。然而，使用常规的方法，几乎不可能产生识别所述靶标的免疫球蛋白序列。与该实例并列的是，离子通道的孔区域由多个跨膜结构域形成，并且可能甚至是该通道的多个亚单位形成。几乎不可能提供用于产生结合该孔区域的免疫球蛋白序列的肽。此外，由于蛋白仅在膜环境中表现出其天然构象，纯化的离子通道蛋白不能用于免疫。

本发明提供产生针对所述种类的构象表位的免疫球蛋白序列，并且排除对用纯化的蛋白加强的需求。

在本发明中，考虑在基因疫苗接种后(其提供免疫应答的必需的特异性)，动物可以用例如表达以其天然构象存在的蛋白(即，包埋/锚定在膜中)的细胞加强。即使这些细胞表达多种抗原，仅发生针对已经通过基因疫苗接种递送的抗原的免疫记忆反应。因此，用基因疫苗接种致敏动物允许用以其天然构象存在的蛋白加强，即使该蛋白是未纯化的，例如，在表达该蛋白的细胞的情形中，但是获得高度特异性的免疫球蛋白序列的全体成员。

在优选的实施方案中，本发明涉及在骆驼科动物中特别是在美洲驼中产生免疫球蛋白序列。这些动物的抗体反应特征在于存在可以延伸至、并且特异性结合靶抗原上的槽或缝隙的免疫球蛋白序列。在细胞相关抗原的构象表位的情形中，这是特别重要的和有益的。

因此，在一个具体的实施方案中，本发明涉及使用对骆驼科动物的基因疫苗接种来产生针对细胞相关抗原的构象表位的免疫球蛋白序列，特别是针对表现出一个或多个跨膜结构域的抗原的构象表位的免疫球蛋白序列。

现在，将通过参考特别优选的方面、实验和权利要求来示例本发明上述的概括原理。然而，不应该理解本发明局限于此。

在本申请中引用的所有参考文献(包括论文文献、授权的专利、公布的专利申请、和同时待审的专利申请)的全部内容通过引用清楚地结合在本文中。

优选的方面:

方面a-1:针对和/或可以特异性结合离子通道诸如例如p2x7的免疫球蛋白序列。

方面a-2:按照方面a-1的免疫球蛋白序列，其基本上以分离的形式存在。

方面a-3:按照方面a-1或a-2的免疫球蛋白序列，其用于施用于受试者，其中所述免疫球蛋白序列在所述受试者中不是天然存在的。

方面a-4:免疫球蛋白序列，其可以以10^-5-10^-12摩尔/升或更小、并且优选地10^-7-10^-12摩尔/升或更小、并且更优选地10^-8-10^-12摩尔/升的解离常数(kd)特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。所述免疫球蛋白序列可以特别是按照前述方面中任一项所述的免疫球蛋白序列。

方面a-5:免疫球蛋白序列，其可以以10²m^-1s^-1–约10⁷m^-1s^-1,优选10³m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1,更优选10⁴m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1,诸如10⁵m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1的缔合速率(kon-速率)特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。所述免疫球蛋白序列可以特别是按照前述方面中任一项所述的免疫球蛋白序列。

方面a-6:免疫球蛋白序列，其可以以1s^-1-10^-6s^-1,优选10^-2s^-1-10^-6s^-1,更优选10^-3s^-1-10^-6s^-1,诸如10^-4s^-1-10^-6s^-1的解离速率(koff速率)特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。所述免疫球蛋白序列可以特别是按照前述方面中任一项所述的免疫球蛋白序列。

方面a-7:免疫球蛋白序列，其可以以小于500nm,优选小于200nm,更优选小于10nm,诸如小于500pm的亲和力特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。所述免疫球蛋白序列可以特别是按照前述方面中任一项所述的免疫球蛋白序列。

方面a-8:按照前述方面中任一项的免疫球蛋白序列，其是天然存在的免疫球蛋白序列(来源于任何适当的物种)或是合成的或半合成的免疫球蛋白序列。

方面a-9:按照前述方面中任一项的免疫球蛋白序列,其包括免疫球蛋白折叠或在适当的条件下能够形成免疫球蛋白折叠。

方面a-10:按照前述方面中任一项的免疫球蛋白序列，其基本上由4个构架区(分别为fr1-fr4)和3个互补性决定区(分别为cdr1-cdr3)组成。

方面a-11:按照前述方面中任一项的免疫球蛋白序列，其为免疫球蛋白序列。

方面a-12:按照前述方面中任一项的免疫球蛋白序列，其是天然存在的免疫球蛋白序列(来源于任何适当的物种)或是合成的或半合成的免疫球蛋白序列。

方面a-13:按照前述方面中任一项的免疫球蛋白序列，其为人源化的免疫球蛋白序列,骆驼源化的免疫球蛋白序列或已经通过诸如亲和力成熟的技术获得的免疫球蛋白序列。

方面a-14:按照前述方面中任一项的免疫球蛋白序列，其基本上由轻链可变结构域序列(例如vl-序列)组成；或由重链可变结构域序列(例如vh-序列)组成。

方面a-15:按照前述方面中任一项的免疫球蛋白序列，其基本上由来源于常规4-链抗体的重链可变结构域序列组成或基本上由来源于重链抗体的重链可变结构域序列组成。

方面a-16:按照前述方面中任一项的免疫球蛋白序列，其基本上由结构域抗体(或适于用作结构域抗体的免疫球蛋白序列)组成,由单结构域抗体(或适于用作单结构域抗体的免疫球蛋白序列)组成,由"dab"(或适于用作dab的免疫球蛋白序列)组成或由纳米抗体(包括但不限于vhh序列)组成。

方面a-17:按照前述方面中任一项的免疫球蛋白序列，其基本上由纳米抗体组成。

方面a-18:按照前述方面中任一项的免疫球蛋白序列，其基本上由这样的纳米抗体组成，所述纳米抗体

i)与seqidno’s:1–22中的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成cdr序列的氨基酸残基；

并且其中:

ii)优选地，在按照kabat编号的位置11,37,44,45,47,83,84,103,104和108的氨基酸残基的一个或多个选自表b-2中提及的标志残基。

方面a-19:按照前述方面中任一项的免疫球蛋白序列，其基本上由这样的多肽组成，所述多肽

i)与seqidno’s:789-791中的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成cdr序列的氨基酸残基；

并且其中:

ii)优选地，在按照kabat编号的位置11,37,44,45,47,83,84,103,104和108的氨基酸残基的一个或多个选自表b-2中提及的标志残基。

方面a-20:按照前述方面中任一项的免疫球蛋白序列，其基本上由这样的

纳米抗体组成，所述纳米抗体

i)与seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成cdr序列的氨基酸残基；

并且其中:

ii)优选地，在按照kabat编号的位置11,37,44,45,47,83,84,103,104和108的氨基酸残基的一个或多个选自表b-2中提及的标志残基。

方面a-21:按照前述方面中任一项的免疫球蛋白序列，其基本上由人源化的纳米抗体组成。

方面a-22:按照前述方面中任一项的免疫球蛋白序列，其除了关于结合离子通道诸如例如p2x7的至少一个结合位点外，还包含一个或多个结合其它抗原、蛋白或靶标的其它结合位点。

基于cdr的方面

方面b-1:免疫球蛋白序列，其针对和/或其可以特异性结合离子通道，诸如例如p2x7,并且其包括选自由下列各项组成的组的一个或多个氨基酸残基序列(stretches):

a)seqidno’s:208-289的免疫球蛋白序列；

b)与seqidno’s:208-289的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

c)与seqidno’s:208-289的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列；

d)seqidno’s:372-453的免疫球蛋白序列；

e)与seqidno’s:372-453的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

f)与seqidno’s:372-453的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列；

g)seqidno’s:536-617的免疫球蛋白序列；

h)与seqidno’s:536-617的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

i)与seqidno’s:536-617的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列；

或它们的任何适当组合。

所述免疫球蛋白序列可以特别是按照方面a-1至a-22中任一项所述的免疫球蛋白序列。

方面b-2:按照方面b-1的免疫球蛋白序列，其中至少一个所述氨基酸残基序列形成结合离子通道诸如例如p2x7的抗原结合位点的一部分。

方面b-3:免疫球蛋白序列，其针对和/或其可以特异性结合离子通道，诸如例如p2x7,并且其包括选自由下列各项组成的组的两个或多个氨基酸残基序列:

a)seqidno’s:208-289的免疫球蛋白序列；

b)与seqidno’s:208-289的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

c)与seqidno’s:208-289的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列；

d)seqidno’s:372-453的免疫球蛋白序列；

e)与seqidno’s:372-453的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

f)与seqidno’s:372-453的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列；

g)seqidno’s:536-617的免疫球蛋白序列；

h)与seqidno’s:536-617的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

i)与seqidno’s:536-617的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列；

以致(i)当第一氨基酸残基序列对应于a),b)或c)所述的一种免疫球蛋白序列时,第二氨基酸残基序列对应于d),e),f),g),h)或i)所述的一种免疫球蛋白序列；(ii)当第一氨基酸残基序列对应于d),e)或f)所述的第一种免疫球蛋白序列时,第二氨基酸残基序列对应于a),b),c),g),h)或i)所述的一种免疫球蛋白序列；或(iii)当第一氨基酸残基序列对应于g),h)或i)所述的第一种免疫球蛋白序列时,第二氨基酸残基序列对应于a),b),c),d),e)或f)所述的一种免疫球蛋白序列。

所述免疫球蛋白序列可以特别是按照方面a-1至a-22,b-1或b-2中任一项所述的免疫球蛋白序列。

方面b-4:按照方面b-3的免疫球蛋白序列,其中所述至少两个氨基酸残基序列形成结合离子通道诸如例如p2x7的抗原结合位点的一部分。

方面b-5:免疫球蛋白序列，其针对和/或其可以特异性结合离子通道，诸如例如p2x7,并且其包括三个或多个氨基酸残基序列,其中第一氨基酸残基序列选自由下列各项组成的组:

a)seqidno’s:208-289的免疫球蛋白序列；

b)与seqidno’s:208-289的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

c)与seqidno’s:208-289的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列；

第二氨基酸残基序列选自由下列各项组成的组:

d)seqidno’s:372-453的免疫球蛋白序列；

e)与seqidno’s:372-453的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

f)与seqidno’s:372-453的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列；

并且第三氨基酸残基序列选自由下列各项组成的组:

g)seqidno’s:536-617的免疫球蛋白序列；

h)与seqidno’s:536-617的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

i)与seqidno’s:536-617的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列。

所述免疫球蛋白序列可以特别是按照方面a-1至a-22和/或b-1至b-4中任一项所述的免疫球蛋白序列。

方面b-6:按照方面b-5的免疫球蛋白序列,其中所述至少三个氨基酸残基序列形成结合离子通道诸如例如p2x7的抗原结合位点的一部分。

方面b-7:免疫球蛋白序列，其针对和/或其可以特异性结合离子通道，诸如例如p2x7，其中所述免疫球蛋白序列的cdr序列与seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778的至少一种免疫球蛋白序列的cdr序列具有至少70％的氨基酸同一性,优选至少80％的氨基酸同一性,更优选至少90％的氨基酸同一性,诸如95％的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％的氨基酸同一性。所述免疫球蛋白序列可以特别是按照方面a-1至a-22和/或b-1至b-6中任一项所述的免疫球蛋白序列。

方面c-1:免疫球蛋白序列，其针对离子通道，诸如例如p2x7，并且其交叉阻断seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778的至少一种免疫球蛋白序列与离子通道诸如例如p2x7的结合。所述免疫球蛋白序列可以特别是按照方面a-1至a-22和/或按照方面b-1至b-7中任一项所述的免疫球蛋白序列。此外，优选地，所述免疫球蛋白序列能够特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

方面c-2:免疫球蛋白序列，其针对离子通道，诸如例如p2x7，并且其与离子通道诸如例如p2x7的结合被seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778的至少一种免疫球蛋白序列交叉阻断。所述免疫球蛋白序列可以特别是按照方面a-1至a-22和/或按照方面b-1至b-7中任一项所述的免疫球蛋白序列。此外，优选地，所述免疫球蛋白序列能够特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

方面c-3:按照方面c-1或c-2任一项的免疫球蛋白序列,其中所述免疫球蛋白序列交叉阻断或被交叉阻断的能力在biacore测定中检测。

方面c-4:按照方面c-1至c-3中任一项的免疫球蛋白序列，其中所述免疫球蛋白序列交叉阻断或被交叉阻断的能力在elisa测定中检测。

方面d-1:按照方面b-1至b-7或c-1至c-7中任一项的免疫球蛋白序列，其以基本上分离的形式存在。

方面d-2:按照方面b-1至b-7,c-1至c-7,和/或d1中任一项的免疫球蛋白序列，其用于施用给受试者，其中所述免疫球蛋白序列在所述受试者中不是天然存在的。

方面d-3:按照方面b-1至b-7,c-1至c-7,和/或d1至d-2中任一项的免疫球蛋白序列，其可以以10^-5-10^-12摩尔/升或更小、并且优选地10^-7-10^-12摩尔/升或更小、并且更优选地10^-8-10^-12摩尔/升的解离常数(kd)特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

方面d-4:按照方面b-1至b-7,c-1至c-7,和/或d-1至d-3中任一项的免疫球蛋白序列，其可以以10²m^-1s^-1–约10⁷m^-1s^-1,优选10³m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1,更优选10⁴m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1,诸如10⁵m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1的缔合速率(kon-速率)特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

方面d-5:按照方面b-1至b-7,c-1至c-7,和/或d-1至d-4中任一项的免疫球蛋白序列，其可以以1s^-1-10^-6s^-1,优选10^-2s^-1-10^-6s^-1,更优选10^-3s^-1-10^-6s^-1,诸如10^-4s^-1-10^-6s^-1的解离速率(koff速率)特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

方面d-6:按照方面b-1至b-7,c-1至c-7,和/或d-1至d-5中任一项的免疫球蛋白序列，其可以以小于500nm,优选小于200nm,更优选小于10nm,诸如小于500pm的亲和力特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

按照方面d-1至d-6的免疫球蛋白序列可以特别是按照方面a-1至a-22中任一项所述的免疫球蛋白序列。

方面e-1:按照方面b-1至b-7,c-1至c-7和/或d1至d-6中任一项的免疫球蛋白序列,其是天然存在免疫球蛋白序列(来源于任何适当的物种)或是合成的或半合成的免疫球蛋白序列。

方面e-2:按照方面b-1至b-7,c-1至c-7,d1至d-6,和/或e-1中任一项的免疫球蛋白序列,其包括免疫球蛋白折叠或在适当的条件下能够形成免疫球蛋白折叠。

方面e-3:按照方面b-1至b-7,c-1至c-7,d1至d-6,和/或d-1或d-2中任一项的免疫球蛋白序列,其是免疫球蛋白序列。

方面e-4:按照方面b-1至b-7,c-1至c-7,d1至d-6,和/或e-1至e-3中任一项的免疫球蛋白序列,其是天然存在的免疫球蛋白序列(来源于任何适当的物种)或是合成的或半合成的免疫球蛋白序列。

方面e-5:按照方面b-1至b-7,c-1至c-7,d1至d-6,和/或e-1至e-4中任一项的免疫球蛋白序列,其为人源化的免疫球蛋白序列,骆驼源化的免疫球蛋白序列或已经通过诸如亲和力成熟的技术获得的免疫球蛋白序列。

方面e-6:按照方面b-1至b-7,c-1至c-7,d1至d-6,和/或e-1至e-5中任一项的免疫球蛋白序列,其基本上由轻链可变结构域序列(例如vl-序列)组成；或由重链可变结构域序列(例如vh-序列)组成。

方面e-7:按照方面b-1至b-7,c-1至c-7,d1至d-6,和/或e-1至e-6中任一项的免疫球蛋白序列,其基本上由来源于常规4-链抗体的重链可变结构域序列组成或基本上由来源于重链抗体的重链可变结构域序列组成。

方面e-8:按照方面b-1至b-7,c-1至c-7,d1至d-6,和/或e-1至e-7中任一项的免疫球蛋白序列,其基本上由结构域抗体(或适于用作结构域抗体的免疫球蛋白序列)组成,由单结构域抗体(或适于用作单结构域抗体的免疫球蛋白序列)组成,由"dab"(或适于用作dab的免疫球蛋白序列)组成或由纳米抗体(包括但不限于vhh序列)组成。

方面e-9:按照方面b-1至b-7,c-1至c-7,d1至d-6,和/或e-1至e-8中任一项的免疫球蛋白序列,其基本上由纳米抗体组成。

方面e-10:按照方面b-1至b-7,c-1至c-7,d1至d-6,和/或e-1至e-9中任一项的免疫球蛋白序列，其基本上由这样的纳米抗体组成，所述纳米抗体

i)与seqidno’s:1–22中的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成cdr序列的氨基酸残基；

并且其中:

ii)优选地，在按照kabat编号的位置11,37,44,45,47,83,84,103,104和108的氨基酸残基的一个或多个选自表b-2中提及的标志残基。

方面e-11:按照方面b-1至b-7,c-1至c-7,d1至d-6,和/或e-1至e-10中任一项的免疫球蛋白序列，其基本上由这样的纳米抗体组成，所述纳米抗体

i)与seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成cdr序列的氨基酸残基；

并且其中:

ii)优选地，在按照kabat编号的位置11,37,44,45,47,83,84,103,104和108的氨基酸残基的一个或多个选自表b-2中提及的标志残基。

方面e-12:按照方面b-1至b-7,c-1至c-7,d1至d-6,和/或e-1至e-11中任一项的免疫球蛋白序列，其基本上由人源化的纳米抗体组成。

方面e-13:按照方面b-1至b-7,c-1至c-7,d1至d-6,和/或e-1至e-11中任一项的免疫球蛋白序列，其除了由cdr序列形成的关于结合的至少一个结合位点外，还包含一个或多个结合其它抗原、蛋白或靶标的其它结合位点。

按照方面e-1至e-13的免疫球蛋白序列可以特别是按照方面a-1至a-22中任一项所述的免疫球蛋白序列。

构架+cdr’s方面

方面f-1:免疫球蛋白序列，其基本上由4个构架区(分别为fr1-fr4)和3个互补性决定区(分别为cdr1-cdr3)组成,其中:

-cdr1选自由下列各项组成的组：

a)seqidno’s:208-289的免疫球蛋白序列；

b)与seqidno’s:208-289的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

c)与seqidno’s:208-289的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列；

和/或

-cdr2选自由下列各项组成的组：

d)seqidno’s:372-453的免疫球蛋白序列；

e)与seqidno’s:372-453的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

f)与seqidno’s:372-453的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列；

和/或

-cdr3选自由下列各项组成的组：

g)seqidno’s:536-617的免疫球蛋白序列；

h)与seqidno’s:536-617的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

i)与seqidno’s:536-617的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列。

所述免疫球蛋白序列优选地针对离子通道，诸如例如p2x7和/或是可以特异性结合离子通道诸如例如p2x7的免疫球蛋白序列。此外，所述免疫球蛋白序列优选地是按照方面a-1至a-22,c-1至c-7,d1至d-6和/或e-1至e-13中任一项所述的免疫球蛋白序列。

方面f-2:免疫球蛋白序列，其基本上由4个构架区(分别为fr1-fr4)和3个互补性决定区(分别为cdr1-cdr3)组成,其中:

-cdr1选自由下列各项组成的组：

a)seqidno’s:208-289的免疫球蛋白序列；

b)与seqidno’s:208-289的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

c)与seqidno’s:208-289的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列；

和

-cdr2选自由下列各项组成的组：

d)seqidno’s:372-453的免疫球蛋白序列；

e)与seqidno’s:372-453的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

f)与seqidno’s:372-453的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列；

和

-cdr3选自由下列各项组成的组：

g)seqidno’s:536-617的免疫球蛋白序列；

h)与seqidno’s:536-617的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

i)与seqidno’s:536-617的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列。

所述免疫球蛋白序列优选地针对离子通道，诸如例如p2x7和/或是可以特异性结合离子通道诸如例如p2x7的免疫球蛋白序列。此外，所述免疫球蛋白序列优选地是按照方面a-1至a-22,c-1至c-7,d1至d-6和/或e-1至e-13中任一项所述的免疫球蛋白序列。

方面f-3:按照方面f-1和f-2中任一项的免疫球蛋白序列,其中所述免疫球蛋白序列的cdr序列与seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778的至少一种免疫球蛋白序列的cdr序列具有至少70％的氨基酸同一性,优选至少80％的氨基酸同一性,更优选至少90％的氨基酸同一性,诸如95％的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％的氨基酸同一性。

所述免疫球蛋白序列优选地针对离子通道，诸如例如p2x7和/或是可以特异性结合离子通道诸如例如p2x7的免疫球蛋白序列。此外，所述免疫球蛋白序列优选地是按照方面a-1至a-22,c-1至c-7,d1至d-6和/或e-1至e-13中任一项所述的免疫球蛋白序列。

方面f-4:按照方面f-1和f-3中任一项的免疫球蛋白序列,其针对离子通道，诸如例如p2x7，并且其交叉阻断按照任一方面所述的至少一种免疫球蛋白序列与seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778的免疫球蛋白序列的结合。

方面f-5:按照方面f-1和f-3中任一项的免疫球蛋白序列,其针对离子通道，诸如例如p2x7，并且其与离子通道诸如例如p2x7的结合被seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778的至少一种免疫球蛋白序列交叉阻断。

方面f-6:按照方面f-4和f-5中任一项的免疫球蛋白序列,其中所述免疫球蛋白序列交叉阻断或被交叉阻断的能力在biacore测定中检测。

方面f-7:按照方面f-4和f-5中任一项的免疫球蛋白序列,其中所述免疫球蛋白序列交叉阻断或被交叉阻断的能力在elisa测定中检测。

方面f-8:按照方面f-1和f-7中任一项的免疫球蛋白序列,其以基本上分离的形式存在。

方面f-9:按照方面f-1和f-8中任一项的免疫球蛋白序列,其用于施用给受试者，其中所述免疫球蛋白序列在所述受试者中不是天然存在的。

方面f-10:按照方面f-1和f-9中任一项的免疫球蛋白序列,其可以以10^-5-10^-12摩尔/升或更小、并且优选地10^-7-10^-12摩尔/升或更小、并且更优选地10^-8-10^-12摩尔/升的解离常数(kd)特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

方面f-11:按照方面f-1和f-10中任一项的免疫球蛋白序列,其可以以10²m^-1s^-1–约10⁷m^-1s^-1,优选10³m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1,更优选10⁴m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1,诸如10⁵m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1的缔合速率(kon-速率)特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

方面f-12:按照方面f-1和f-11中任一项的免疫球蛋白序列,其可以以1s^-1-10^-6s^-1,优选10^-2s^-1-10^-6s^-1,更优选10^-3s^-1-10^-6s^-1,诸如10^-4s^-1-10^-6s^-1的解离速率(koff速率)特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

方面f-13:按照方面f-1和f-12中任一项的免疫球蛋白序列,其可以以小于500nm,优选小于200nm,更优选小于10nm,诸如小于500pm的亲和力特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

方面f-14:按照方面f-1和f-13中任一项的免疫球蛋白序列,其是天然存在免疫球蛋白序列(来源于任何适当的物种)或是合成的或半合成的免疫球蛋白序列。

方面f-15:按照方面f-1和f-14中任一项的免疫球蛋白序列,其包括免疫球蛋白折叠或在适当的条件下能够形成免疫球蛋白折叠。

方面f-16:按照方面f-1和f-15中任一项的免疫球蛋白序列,其是免疫球蛋白序列。

方面f-17:按照方面f-1和f-16中任一项的免疫球蛋白序列,其是天然存在的免疫球蛋白序列(来源于任何适当的物种)或是合成的或半合成的免疫球蛋白序列。

方面f-18:按照方面f-1和f-17中任一项的免疫球蛋白序列,其为人源化的免疫球蛋白序列,骆驼源化的免疫球蛋白序列或已经通过诸如亲和力成熟的技术获得的免疫球蛋白序列。

方面f-19:按照方面f-1和f-19中任一项的免疫球蛋白序列,其基本上由轻链可变结构域序列(例如vl-序列)组成；或由重链可变结构域序列(例如vh-序列)组成。

方面f-20:按照方面f-1和f-19中任一项的免疫球蛋白序列,其基本上由来源于常规4-链抗体的重链可变结构域序列组成或基本上由来源于重链抗体的重链可变结构域序列组成。

方面f-21:按照方面f-1和f-20中任一项的免疫球蛋白序列,其基本上由结构域抗体(或适于用作结构域抗体的免疫球蛋白序列)组成,由单结构域抗体(或适于用作单结构域抗体的免疫球蛋白序列)组成,由"dab"(或适于用作dab的免疫球蛋白序列)组成或由纳米抗体(包括但不限于vhh序列)组成。

方面f-22:按照方面f-1和f-21中任一项的免疫球蛋白序列,其基本上由纳米抗体组成。

方面f-23:按照方面f-1和f-22中任一项的免疫球蛋白序列,其基本上由这样的纳米抗体组成，所述纳米抗体

i)与seqidno’s:1–22中的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成cdr序列的氨基酸残基；

并且其中:

ii)优选地，在按照kabat编号的位置11,37,44,45,47,83,84,103,104和108的氨基酸残基的一个或多个选自表b-2中提及的标志残基。

方面f-24:按照方面f-1至f-23中任一项的免疫球蛋白序列，其基本上由这样的纳米抗体组成，所述纳米抗体

i)与seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成cdr序列的氨基酸残基；

并且其中:

ii)优选地，在按照kabat编号的位置11,37,44,45,47,83,84,103,104和108的氨基酸残基的一个或多个选自表b-2中提及的标志残基。

方面f-25:按照方面f-1至f-24中任一项的免疫球蛋白序列，其基本上由人源化的纳米抗体组成。

方面g-1:按照前述方面中任一项的免疫球蛋白序列,其除了由cdr序列形成的关于结合的至少一个结合位点外，还包含一个或多个结合其它抗原、蛋白或靶标的其它结合位点。

方面h-1:纳米抗体，其针对和/或其可以特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

方面h-2:按照方面h-1的纳米抗体,其以基本上分离的形式存在。

方面h-3:按照方面h-1至h-2中任一项的纳米抗体,其可以以10^-5-10^-12摩尔/升或更小、并且优选地10^-7-10^-12摩尔/升或更小、并且更优选地10^-8-10^-12摩尔/升的解离常数(kd)特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

方面h-4:按照方面h-1至h-3中任一项的纳米抗体,其可以以10²m^-1s^-1–约10⁷m^-1s^-1,优选10³m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1,更优选10⁴m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1,诸如10⁵m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1的缔合速率(kon-速率)特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

方面h-5:按照方面h-1至h-4中任一项的纳米抗体,其可以以1s^-1-10^-6s^-1,优选10^-2s^-1-10^-6s^-1,更优选10^-3s^-1-10^-6s^-1,诸如10^-4s^-1-10^-6s^-1的解离速率(koff速率)特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

方面h-6:按照方面h-1至h-5中任一项的纳米抗体,其可以以小于500nm,优选小于200nm,更优选小于10nm,诸如小于500pm的亲和力特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

方面h-7:按照方面h-1至h-6中任一项的纳米抗体,其是天然存在纳米抗体(来源于任何适当的物种)或是合成的或半合成的纳米抗体。

方面h-8:按照方面h-1至h-7中任一项的纳米抗体,其为vhh序列,部分人源化的vhh序列,完全人源化的vhh序列,骆驼源化的重链可变结构域或已经通过诸如亲和力成熟的技术获得的免疫球蛋白序列。

方面h-9:按照方面h-1至h-8中任一项的纳米抗体,其

i)与seqidno’s:1–22中的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成cdr序列的氨基酸残基；

并且其中:

ii)优选地，在按照kabat编号的位置11,37,44,45,47,83,84,103,104和108的氨基酸残基的一个或多个选自表b-2中提及的标志残基。

方面h-10:按照方面h-1至h-9中任一项的纳米抗体,其

i)与seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成cdr序列的氨基酸残基；

并且其中:

ii)优选地，在按照kabat编号的位置11,37,44,45,47,83,84,103,104和108的氨基酸残基的一个或多个选自表b-2中提及的标志残基。

方面h-11:按照方面h-1至h-10中任一项的纳米抗体,其中:

-cdr1选自由下列各项组成的组：

a)seqidno’s:208-289的免疫球蛋白序列；

b)与seqidno’s:208-289的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

c)与seqidno’s:208-289的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列；

和/或

-cdr2选自由下列各项组成的组：

d)seqidno’s:372-453的免疫球蛋白序列；

e)与seqidno’s:372-453的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

f)与seqidno’s:372-453的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列；

和/或

-cdr3选自由下列各项组成的组：

g)seqidno’s:536-617的免疫球蛋白序列；

h)与seqidno’s:536-617的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

i)与seqidno’s:536-617的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列。

方面h-12:按照方面h-1至h-11中任一项的纳米抗体,其中:

-cdr1选自由下列各项组成的组：

a)seqidno’s:208-289的免疫球蛋白序列；

b)与seqidno’s:208-289的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

c)与seqidno’s:208-289的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列；

和

-cdr2选自由下列各项组成的组：

d)seqidno’s:372-453的免疫球蛋白序列；

e)与seqidno’s:372-453的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

f)与seqidno’s:372-453的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列；

和

-cdr3选自由下列各项组成的组：

g)seqidno’s:536-617的免疫球蛋白序列；

h)与seqidno’s:536-617的至少一种免疫球蛋白序列具有至少80％的氨基酸同一性的免疫球蛋白序列；

i)与seqidno’s:536-617的至少一种免疫球蛋白序列具有3,2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白序列。

方面h-13:按照方面h-1至h-12中任一项的纳米抗体,其中所述cdr序列与seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778的至少一种免疫球蛋白序列的cdr序列具有至少70％的氨基酸同一性,优选至少80％的氨基酸同一性,更优选至少90％的氨基酸同一性,诸如95％的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％的氨基酸同一性。

方面h-14:按照方面h-1至h-13中任一项的纳米抗体,其是部分人源化的纳米抗体。

方面h-15:按照方面h-1至h-14中任一项的纳米抗体,其是完全人源化的纳米抗体。

方面h-16:按照方面h-1至h-15中任一项的纳米抗体,其选自由seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778组成的组，或选自由与seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778的至少一种免疫球蛋白序列具有多于80％,优选多于90％,更优选多于95％，诸如99％或更多序列同一性(如本文定义)的免疫球蛋白序列组成。

方面h-17:按照方面h-1至h-16中任一项的纳米抗体,其是人源化的纳米抗体。

方面h-18:按照方面h-1至h-17中任一项的纳米抗体,其选自由seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773组成的组。

方面h-19:针对离子通道诸如例如p2x7的纳米抗体，其交叉阻断seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780，更优选seqidno’s732,773或778的至少一种免疫球蛋白序列与离子通道诸如例如p2x7的结合。

方面h-20:针对离子通道诸如例如p2x7的纳米抗体，其与离子通道诸如例如p2x7的结合被seqidno’s:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780，更优选seqidno’s732,773或778的至少一种免疫球蛋白序列交叉阻断。

方面h-21:按照方面h-19或h-20任一项的纳米抗体，其中所述纳米抗体交叉阻断或被交叉阻断的能力在biacore测定中检测。

方面h-22:按照方面h-19至h-21中任一项的纳米抗体，其中所述纳米抗体交叉阻断或被交叉阻断的能力在elisa测定中检测。

多肽.

方面k-1:多肽，其包括一个或多个按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的免疫球蛋白序列和/或一个或多个按照方面h-1至h-22中任一项所述的纳米抗体或基本上由其组成，并且任选地还包括一个或多个肽接头。

方面k-2:按照方面k-1的多肽,其中所述一个或多个结合单位是免疫球蛋白序列。

方面k-3:按照方面k-1或k-2任一项的多肽,其中所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单位选自由下列各项组成的组：结构域抗体,适于用作结构域抗体的免疫球蛋白序列,单结构域抗体,适于用作单结构域抗体的免疫球蛋白序列,"dab"’s,适于用作dab的免疫球蛋白序列,或纳米抗体。

方面k-4:按照方面k-1至k-3中任一项的多肽,其中所述一个或多个本发明的免疫球蛋白序列是免疫球蛋白序列。

方面k-5:按照方面k-1至k-4中任一项的多肽,其中所述一个或多个本发明的免疫球蛋白序列选自由下列各项组成的组：结构域抗体,适于用作结构域抗体的免疫球蛋白序列,单结构域抗体,适于用作单结构域抗体的免疫球蛋白序列,"dab"’s,适于用作dab的免疫球蛋白序列,或纳米抗体。

方面k-6:按照方面k-1至k-5中任一项的多肽,其包括一个或多个按照方面h-1至h-22中任一项所述的纳米抗体或基本上由其组成，并且其中所述一个或多个其它结合单位是纳米抗体。

方面k-7:按照方面k-1至k-6中任一项的多肽,其中所述至少一个结合单位是多价构建体。

方面k-8:按照方面k-1至k-8中任一项的多肽,其中所述至少一个结合单位是多互补位构建体。

方面k-9:按照方面k-1至k-8中任一项的多肽,其中所述至少一个结合单位是多特异性构建体。

方面k-10:按照方面k-1至k-9中任一项的多肽,分别与按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的相对应的免疫球蛋白序列本身或按照方面h-1至h-22中任一项的纳米抗体本身相比，其具有增加的半衰期。

方面k-11:按照方面k-10的多肽,其中分别与按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的相对应的免疫球蛋白序列本身或按照方面h-1至h-22中任一项的纳米抗体本身相比，所述一个或多个其它结合单位为所述多肽提供增加的半衰期。

方面k-12:按照方面k-10或k-11的多肽,其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其它结合单位选自由下列各项组成的组：血清蛋白或其片段，可以结合血清蛋白的结合单位，fc部分，和可以结合血清蛋白的小蛋白或肽。

方面k-13:按照方面k-10至k-12中任一项的多肽,其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其它结合单位选自由人血清白蛋白或其片段组成的组。

方面k-14:按照方面k-10至k-13中任一项的多肽,其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其它结合单位选自由可以结合血清白蛋白(诸如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(诸如igg)的结合单位组成的组。

方面k-15:按照方面k-10至k-14中任一项的多肽,其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其它结合单位选自由下列各项组成的组：结构域抗体,适于用作结构域抗体的免疫球蛋白序列,单结构域抗体,适于用作单结构域抗体的免疫球蛋白序列,"dab"’s,适于用作dab的免疫球蛋白序列,或可以结合血清白蛋白(诸如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(诸如igg)的纳米抗体。

方面k-16:按照方面k-10至k-15的多肽,其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其它结合单位是可以结合血清白蛋白(诸如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(诸如igg)的纳米抗体。

方面k-17:按照方面k-10至k-16中任一项的多肽,其具有分别是按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的相对应的免疫球蛋白序列本身或按照方面h-1至h-22中任一项的纳米抗体本身的半衰期至少1.5倍、优选地至少2倍，如至少5倍，例如至少10倍或超过20倍的血清半衰期。

方面k-18:按照方面k-10至k-17中任一项的多肽,分别与按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的相对应的免疫球蛋白序列本身或按照方面h-1至h-22中任一项的纳米抗体本身相比较，其具有增加超过1小时，优选超过2小时，更优选超过6小时，诸如超过12小时，或甚至超过24、48或72小时的血清半衰期。

方面k-19:按照方面k-1至k-18中任一项的多肽,其在人中具有至少约12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时、甚至更优选至少72小时或更多的血清半衰期；例如，具有至少5天(诸如约5-10天)、优选至少9天(诸如约9-14天)、更优选至少约10天(诸如约10-15天)、或至少约11天(诸如约11-16天)、更优选至少约12天(诸如约12-18天或更多)、或超过14天(诸如约14-19天)的血清半衰期。

化合物或构建体.

方面l-1:化合物或构建体,其包括一个或多个按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的免疫球蛋白序列和/或一个或多个按照方面h-1至h-22中任一项所述的纳米抗体或基本上由其组成，并且任选地还包括一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单位，其任选地通过一个或多个接头连接。

方面l-2:按照方面l-1的化合物或构建体,其中所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单位是免疫球蛋白序列。

方面l-3:按照方面l-1或l-2的化合物或构建体,其中所述一个或多个接头，如果存在的话，是一个或多个免疫球蛋白序列。

方面l-4:按照方面l-1至l-3中任一项的化合物或构建体,其中所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单位是免疫球蛋白序列。

方面l-5:按照方面l-1至l-4中任一项的化合物或构建体,其中所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单位选自由下列各项组成的组：结构域抗体,适于用作结构域抗体的免疫球蛋白序列,单结构域抗体,适于用作单结构域抗体的免疫球蛋白序列,"dab"’s,适于用作dab的免疫球蛋白序列,或纳米抗体。

方面l-6:按照方面l-1至l-5中任一项的化合物或构建体,其中所述一个或多个本发明的免疫球蛋白序列是免疫球蛋白序列。

方面l-7:按照方面l-1至l-6中任一项的化合物或构建体,其中所述一个或多个本发明的免疫球蛋白序列选自由下列各项组成的组：结构域抗体,适于用作结构域抗体的免疫球蛋白序列,单结构域抗体,适于用作单结构域抗体的免疫球蛋白序列,"dab"’s,适于用作dab的免疫球蛋白序列,或纳米抗体。

方面l-8:化合物或构建体,其包括一个或多个按照方面h-1至h-22中任一项所述的纳米抗体或基本上由其组成，并且其中所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单位是纳米抗体。

方面l-9:按照方面l-1至l-9中任一项的化合物或构建体,其是多价构建体。

方面l-10:按照方面l-1至l-10中任一项的化合物或构建体，其是多特异性构建体。

方面l-11:按照方面l-1至l-10中任一项的化合物或构建体，分别与按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的相对应的免疫球蛋白序列本身或按照方面h-1至h-22中任一项的纳米抗体本身相比，其具有增加的半衰期。

方面l-12:按照方面l-1至l-11的化合物或构建体,其中分别与按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的相对应的免疫球蛋白序列本身或按照方面h-1至h-22中任一项的纳米抗体本身相比，所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单位为所述化合物或构建体提供增加的半衰期。

方面l-13:按照方面l-12的化合物或构建体,其中为所述化合物或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单位选自由下列各项组成的组：血清蛋白或其片段，可以结合血清蛋白的结合单位，fc部分，和可以结合血清蛋白的小蛋白或肽。

方面l-14:按照方面l-12或l-13的化合物或构建体,其中为所述化合物或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单位选自由人血清白蛋白或其片段组成的组。

方面l-15:按照方面l-12至l-14中任一项的化合物或构建体,其中为所述化合物或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单位选自由可以结合血清白蛋白(诸如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(诸如igg)的结合单位组成的组。

方面l-16:按照方面l-12至l-14中任一项的化合物或构建体,其中为所述化合物或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单位选自由下列各项组成的组：结构域抗体,适于用作结构域抗体的免疫球蛋白序列,单结构域抗体,适于用作单结构域抗体的免疫球蛋白序列,"dab"’s,适于用作dab的免疫球蛋白序列,或可以结合血清白蛋白(诸如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(诸如igg)的纳米抗体。

方面l-17:按照方面l-12至l-14中任一项的化合物或构建体,其中为所述化合物或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单位是可以结合血清白蛋白(诸如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(诸如igg)的纳米抗体。

方面l-18:按照方面l-12至l-17中任一项的化合物或构建体,其具有分别是按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的相对应的免疫球蛋白序列本身或按照方面h-1至h-22中任一项的纳米抗体本身的半衰期至少1.5倍、优选地至少2倍，如至少5倍，例如至少10倍或超过20倍的血清半衰期。

方面l-19:按照方面l-12至l-18中任一项的化合物或构建体,分别与按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的相对应的免疫球蛋白序列本身或按照方面h-1至h-22中任一项的纳米抗体本身相比较，其具有增加超过1小时，优选超过2小时，更优选超过6小时，诸如超过12小时，或甚至超过24、48或72小时的血清半衰期。

方面l-20:按照方面l-12至l-19中任一项的化合物或构建体,其在人中具有至少约12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时、甚至更优选至少72小时或更多的血清半衰期；例如，具有至少5天(诸如约5-10天)、优选至少9天(诸如约9-14天)、更优选至少约10天(诸如约10-15天)、或至少约11天(诸如约11-16天)、更优选至少约12天(诸如约12-18天或更多)、或超过14天(诸如约14-19天)的血清半衰期。

方面l-21:单价构建体,其包括一种按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的免疫球蛋白序列和/或一种按照方面h-1至h-22中任一项所述的纳米抗体或基本上由其组成。

方面l-22:按照方面l-21的单价构建体,其中所述本发明的免疫球蛋白序列选自由下列各项组成的组：结构域抗体,适于用作结构域抗体的免疫球蛋白序列,单结构域抗体,适于用作单结构域抗体的免疫球蛋白序列,"dab"’s,适于用作dab的免疫球蛋白序列,或纳米抗体。

方面l-23:单价构建体,其包括一个按照方面h-1至h-22中任一项所述的纳米抗体或基本上由其组成。

核酸

方面m-1:核酸或核苷酸序列，其编码按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的免疫球蛋白序列,或按照方面h-1至h-22中任一项所述的纳米抗体。

方面m-2:核酸或核苷酸序列,其编码按照上述方面中任一项所述的化合物或构建体。

宿主细胞

方面n-1:宿主或宿主细胞，其表达或其在适当的环境中能够表达按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的免疫球蛋白序列,按照方面h-1至h-22中任一项所述的纳米抗体,按照方面k-1至k-19中任一项所述的多肽,按照方面l-1至l-21中任一项所述的化合物或构建体(其是这样的，即，其可以通过表达编码其的核酸或核苷酸序列而获得)，或按照方面l-22或l-23中任一项的单价构建体；和/或其包括按照方面m-1所述的核酸或核苷酸序列或按照方面m-2所述的遗传构建体。

组合物

方面o-1:组合物，其包括至少一种按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的免疫球蛋白序列,按照方面h-1至h-22中任一项所述的纳米抗体,按照方面k-1至k-19中任一项所述的多肽,按照方面l-1至l-21中任一项所述的化合物或构建体,按照方面l-22或l-23中任一项的单价构建体,或按照方面m-1或m-2所述的核酸或核苷酸序列。

方面o-2:按照方面o-1的组合物,其是药物组合物。

方面o-3:按照方面o-2的组合物,其是这样的药物组合物,其还包括至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂和/或辅药，并且其任选地包括一种或多种其它药物活性肽和/或化合物。

制备本发明的药剂和组合物

方面p-1:生产按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的免疫球蛋白序列,按照方面h-1至h-22中任一项所述的纳米抗体,按照方面k-1至k-19中任一项所述的多肽,按照方面l-1至l-21中任一项所述的化合物或构建体(其是这样的，即，其可以通过表达编码其的核酸或核苷酸序列而获得),或按照方面l-22或l-23中任一项的单价构建体的方法，所述方法至少包括下列步骤：

a)在适当的宿主细胞或宿主生物体中或在另一种适当的表达系统中，表达按照方面m-1所述的核酸或核苷酸序列，或按照方面m-2的遗传构建体；

任选地然后:

b)分离和/或纯化这样的获得的按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的免疫球蛋白序列,按照方面h-1至h-22中任一项所述的纳米抗体,按照方面k-1至k-19中任一项所述的多肽,按照方面l-1至l-21中任一项所述的化合物或构建体,或按照方面l-22或l-23中任一项的单价构建体。

方面p-2:生产按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的免疫球蛋白序列,按照方面h-1至h-22中任一项所述的纳米抗体,按照方面k-1至k-19中任一项所述的多肽,按照方面l-1至l-21中任一项所述的化合物或构建体(其是这样的，即，其可以通过表达编码其的核酸或核苷酸序列而获得),或按照方面l-22或l-23中任一项的单价构建体的方法，所述方法至少包括下列步骤：

a)在使所述宿主或宿主细胞表达和/或生产按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的至少一种免疫球蛋白序列,按照方面h-1至h-22中任一项所述的纳米抗体,按照方面k-1至k-19中任一项所述的多肽,按照方面l-1至l-21中任一项所述的化合物或构建体,或按照方面l-22或l-23中任一项的单价构建体的条件下，培养和/或维持按照方面……所述的宿主或宿主细胞；

任选地然后:

b)分离和/或纯化这样的获得的按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的免疫球蛋白序列,按照方面h-1至h-22中任一项所述的纳米抗体,按照方面k-1至k-19中任一项所述的多肽,按照方面l-1至l-21中任一项所述的化合物或构建体,或按照方面l-22或l-23中任一项的单价构建体。

筛选方法

方面q-1:筛选针对离子通道诸如例如p2x7的免疫球蛋白序列的方法，其包括至少下述步骤：

a)提供编码免疫球蛋白序列的核酸序列的组、集合或文库；

b)筛选所述核酸序列的组、集合或文库，以获得编码这样的免疫球蛋白序列的核酸序列，所述免疫球蛋白序列可以结合和/或具有针对离子通道诸如例如p2x7的亲和性，并且其被交叉阻断或交叉阻断本发明的纳米抗体,例如，seqidno:705-788,更优选seqidno’s726-750,753-758,762-764,772-773,775,或778-780,更优选seqidno’s732,773或778(表a-1)或其被交叉阻断或交叉阻断本发明的多肽或构建体,例如，seqidno:789至791(参见表a-3)；和

c)分离所述核酸序列，然后表达所述免疫球蛋白序列。

本发明的结合剂的用途

方面r-1:预防和/治疗至少一种[插入疾病和病症]的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用药学活性量的至少一种按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的免疫球蛋白序列,按照方面h-1至h-22中任一项所述的纳米抗体,按照方面k-1至k-19中任一项所述的多肽,按照方面l-1至l-21中任一项所述的化合物或构建体,按照方面l-22或l-23任一项所述的单价构建体；或按照方面o-2或o-3的组合物。

方面r-2:预防和/或治疗与离子通道诸如例如p2x7相关、与其生物学或药学活性相关、和/或与其中涉及离子通道诸如例如p2x7的生物学途径或信号传导相关的至少一种疾病或病症的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用药物活性量的至少一种按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的免疫球蛋白序列,按照方面h-1至h-22中任一项所述的纳米抗体,按照方面k-1至k-19中任一项所述的多肽,按照方面l-1至l-21中任一项所述的化合物或构建体,按照方面l-22或l-23任一项所述的单价构建体；或按照方面o-2或o-3的组合物。

方面r-3:预防和/或治疗至少一种下述疾病或病症的方法，所述疾病或病症可以通过向需要其的受试者施用至少一种按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的免疫球蛋白序列,按照方面h-1至h-22中任一项所述的纳米抗体,按照方面k-1至k-19中任一项所述的多肽,按照方面l-1至l-21中任一项所述的化合物或构建体,按照方面l-22或l-23任一项所述的单价构建体；或按照方面o-2或o-3的组合物而进行预防和/或治疗，所述方法包括向需要其的受试者施用药物活性量的至少一种按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的免疫球蛋白序列,按照方面h-1至h-22中任一项所述的纳米抗体,按照方面k-1至k-19中任一项所述的多肽,按照方面l-1至l-21中任一项所述的化合物或构建体,按照方面l-22或l-23任一项所述的单价构建体；或按照方面o-2或o-3的组合物。

方面r-4:免疫治疗的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用药物活性量的至少一种按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的免疫球蛋白序列,按照方面h-1至h-22中任一项所述的纳米抗体,按照方面k-1至k-19中任一项所述的多肽,按照方面l-1至l-21中任一项所述的化合物或构建体,按照方面l-22或l-23任一项所述的单价构建体；或按照方面o-2或o-3的组合物。

方面r-5:按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的免疫球蛋白序列,按照方面h-1至h-22中任一项所述的纳米抗体,按照方面k-1至k-19中任一项所述的多肽,按照方面l-1至l-21中任一项所述的化合物或构建体,按照方面l-22或l-23任一项所述的单价构建体在制备用于预防和/或治疗至少一种[插入疾病和病症]的药物组合物中的应用；和/或在一种或多种按照方面r-1至r-3所述的方法中的应用。

方面r-6:按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的免疫球蛋白序列,按照方面h-1至h-22中任一项所述的纳米抗体,按照方面k-1至k-19中任一项所述的多肽,按照方面l-1至l-21中任一项所述的化合物或构建体,按照方面l-22或l-23任一项所述的单价构建体；或按照方面o-2或o-3的组合物,其用于预防和/或治疗其中离子通道起作用或参与的至少一种疾病或病症。

片段方面

方面s-1:按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的免疫球蛋白序列，或按照方面h-1至h-22中任一项所述的纳米抗体的部分或片段。

方面s-2:按照方面s-1的部分或片段,其可以特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

方面s-3:按照方面s-1或s-2中任一项的部分或片段,其可以以10^-5-10^-12摩尔/升或更小、并且优选地10^-7-10^-12摩尔/升或更小、并且更优选地10^-8-10^-12摩尔/升的解离常数(kd)特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

方面s-4:按照方面s-1至s-3中任一项的部分或片段,其可以以10²m^-1s^-1–约10⁷m^-1s^-1,优选10³m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1,更优选10⁴m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1,诸如10⁵m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1的缔合速率(kon-速率)特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

方面s-5:按照方面s-1至s-4中任一项的部分或片段,其可以以1s^-1-10^-6s^-1,优选10^-2s^-1-10^-6s^-1,更优选10^-3s^-1-10^-6s^-1,诸如10^-4s^-1-10^-6s^-1的解离速率(koff速率)特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

方面s-6:化合物或构建体，其包括一个或多个按照方面s-1至s-4中任一项所述的部分或片段或基本上由其组成，并且任选地还包括一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单位，其任选地通过一个或多个接头连接。

方面s-7:按照方面s-6的化合物或构建体,其中所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单位是免疫球蛋白序列。

方面s-8:按照方面s-6或s-7的化合物或构建体,其中所述一个或多个接头，如果存在的话，是一个或多个免疫球蛋白序列。

方面s-9:核酸或和核苷酸序列，其编码按照方面s-1至s-7中任一项所述的部分或片段或按照方面s-8所述的化合物或构建体。

方面s-10:组合物，其包括至少一个按照方面s-1至s-7中任一项所述的部分或片段,按照方面s-6至s-8中任一项所述的化合物或构建体，或按照方面s-9所述的核酸或核苷酸序列。

衍生物方面

方面t-1:按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的免疫球蛋白序列，或按照方面h-1至h-22中任一项所述的纳米抗体的衍生物。

方面t-2:按照方面t-1的衍生物,其可以特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

方面t-3:按照方面t-1或t-2任一项的衍生物,其可以以10^-5-10^-12摩尔/升或更小、并且优选地10^-7-10^-12摩尔/升或更小、并且更优选地10^-8-10^-12摩尔/升的解离常数(kd)特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

方面t-4:按照方面t-1至t-3中任一项的衍生物,其可以以10²m^-1s^-1–约10⁷m^-1s^-1,优选10³m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1,更优选10⁴m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1,诸如10⁵m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1的缔合速率(kon-速率)特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

方面t-5:按照方面t-1至t-4中任一项的衍生物,其可以以1s^-1-10^-6s^-1,优选10^-2s^-1-10^-6s^-1,更优选10^-3s^-1-10^-6s^-1,诸如10^-4s^-1-10^-6s^-1的解离速率(koff速率)特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

方面t-6:按照方面k-1至k-19中任一项的多肽或按照方面l-1至l-23中任一项的化合物或构建体的衍生物。

方面t-7:按照方面t-6的衍生物,其可以特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

方面t-8:按照方面t-6或t-7任一项的衍生物,其可以以10^-5-10^-12摩尔/升或更小、并且优选地10^-7-10^-12摩尔/升或更小、并且更优选地10^-8-10^-12摩尔/升的解离常数(kd)特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

方面t-9:按照方面t-6至t-8中任一项的衍生物,其可以以10²m^-1s^-1–约10⁷m^-1s^-1,优选10³m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1,更优选10⁴m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1,诸如10⁵m^-1s^-1-10⁷m^-1s^-1的缔合速率(kon-速率)特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

方面t-10:按照方面t-6至t-9中任一项的衍生物,其可以以1s^-1-10^-6s^-1,优选10^-2s^-1-10^-6s^-1,更优选10^-3s^-1-10^-6s^-1,诸如10^-4s^-1-10^-6s^-1的解离速率(koff速率)特异性结合离子通道，诸如例如p2x7。

方面t-11:按照方面t-1至t-10中任一项的衍生物,其具有分别是按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的相对应的免疫球蛋白序列本身或按照方面h-1至h-22中任一项的纳米抗体本身，按照方面k-1至k-19中任一项的多肽或按照方面l-1至l-23中任一项的化合物或构建体本身的半衰期至少1.5倍、优选地至少2倍，如至少5倍，例如至少10倍或超过20倍的血清半衰期。

方面t-12:按照方面t-1至t-11中任一项的衍生物,分别与按照方面a-1至a-22,b-1至b-7,c-1至c-4,d-1至d-6,e-1至e-13,f-1至f-25或g-1中任一项所述的相对应的免疫球蛋白序列本身或按照方面h-1至h-23中任一项的纳米抗体本身，按照方面k-1至k-19中任一项的多肽或按照方面l-1至l-23中任一项的化合物或构建体本身相比较，其具有增加超过1小时，优选超过2小时，更优选超过6小时，诸如超过12小时，或甚至超过24、48或72小时的血清半衰期。

方面t-13:按照方面t-1至t-12中任一项的衍生物,其在人中具有至少约12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时、甚至更优选至少72小时或更多的血清半衰期；例如，具有至少5天(诸如约5-10天)、优选至少9天(诸如约9-14天)、更优选至少约10天(诸如约10-15天)、或至少约11天(诸如约11-16天)、更优选至少约12天(诸如约12-18天或更多)、或超过14天(诸如约14-19天)的血清半衰期。

方面t-14:按照方面t-1至t-13中任一项的衍生物,其是聚乙二醇化的衍生物。

方面t-15:化合物或构建体，其包括一个或多个按照方面t-1至t-14中任一项所述的衍生物或基本上由其组成，并且任选地还包括一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单位，其任选地通过一个或多个接头连接。

方面t-16:按照方面t-15的化合物或构建体,其中所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单位是免疫球蛋白序列。

方面t-17:按照方面t-16的化合物或构建体,其中所述一个或多个接头，如果存在的话，是一个或多个免疫球蛋白序列。

方面t-18:编码按照方面t-16或t-17所述的化合物或构建体的核酸。

方面t-19:组合物,其包括至少一种按照方面t-1至t-14中任一项所述的衍生物,按照方面t-15至t-17中任一项所述的化合物或构建体,或按照方面t-18的核酸或核苷酸序列。

特别优选的方面

1.用于产生可以结合细胞相关抗原和/或具有针对细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列的方法，所述方法包括下述步骤：

a)用编码所述细胞相关抗原或所述细胞相关抗原的结构域或特定部分的核酸基因疫苗接种非人动物；和

b)任选地用采用其天然构象的所述抗原加强所述动物，所述采用其天然构象的抗原选自包括表达所述细胞相关抗原的天然的或转染的细胞的细胞、细胞来源的膜提取物、携带富集抗原的小泡或任何其它膜衍生物、脂质体或表达所述细胞相关抗原的病毒颗粒；

c)筛选来源于所述非人动物的免疫球蛋白序列的组、集合或文库，以获得可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列。

2.根据方面1所述的方法，其中所述细胞相关抗原选自跨膜抗原，包括具有多个跨膜结构域的跨膜抗原，其包括但不限于gpcrs或离子通道。

3.根据方面1或2所述的方法，其中所述非人动物选自脊椎动物，诸如鲨鱼，蜥蜴，和哺乳动物，更特别地是骆驼科动物，诸如美洲驼(llama)和羊驼(alpaca)。

4.根据方面1-3中任一项所述的方法，其中所述非人动物是骆驼科动物或美洲驼。

5.根据方面1-4中任一项所述的方法，其中所述免疫球蛋白序列是轻链可变结构域序列，或重链可变结构域序列。

6.根据方面5所述的方法，其中所述免疫球蛋白序列是来源于常规4-链抗体的重链可变结构域序列或来源于重链抗体的重链可变结构域序列。

7.根据方面1-6中任一项所述的方法，其中所述免疫球蛋白序列是结构域抗体,或适于用作结构域抗体的免疫球蛋白序列，单结构域抗体，或适于用作单结构域抗体的免疫球蛋白序列，"dabs”，或适于用作dabs的免疫球蛋白序列，或纳米抗体，包括但不限于vhh序列或适于用作纳米抗体的免疫球蛋白序列。

8.根据方面7所述的方法，其中所述免疫球蛋白序列是纳米抗体。

9.根据方面1-8中任一项所述的方法，其中疫苗接种通过无针喷射注射、通过冲击法、通过针头介导的注射如纹身、通过局部施用或通过任意dna施用方法而后通过体内电穿孔进行。

10.根据方面1-9中任一项所述的方法，其中疫苗接种通过皮内、肌内或皮下施用dna进行。

11.根据方面1-10中任一项所述的方法，其中免疫球蛋白序列的组、集合或文库获自血液、淋巴结、脾、骨髓或携带编码所述非人哺乳动物的这些免疫球蛋白序列的细胞的任何组织。

12.根据方面1-11中任一项所述的方法，其中所述细胞相关抗原在允许表达天然构象的靶标的任何细胞上表达，所述细胞诸如但不限于选自下列的细胞：cho,cos7,hek293,或骆驼科动物来源的细胞，诸如美洲驼来源的细胞或羊驼来源的细胞。

13.根据方面1-12中任一项所述的方法，其中所述细胞相关抗原是跨膜抗原，诸如例如gpcr和/或离子通道。

14.根据方面1-13中任一项所述的方法，其中所述抗原选自cxcr7,cxcr4或/和p2x7。

15.根据方面1-14中任一项所述的方法，其中所述免疫球蛋白序列的组、集合或文库在细胞或病毒的组、集合或样品上表达，并且筛选所述细胞的组、集合或样品，以获得表达可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列的细胞。

16.根据方面15所述的方法，其中从所述细胞或病毒纯化和/或分离编码可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列的核酸序列，然后表达所述免疫球蛋白序列。

17.根据方面1-16中任一项所述的方法，其中免疫球蛋白序列的组、集合或文库由核酸序列的组、集合或文库编码，并且筛选所述核酸序列的组、集合或文库，以获得编码可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列的核酸序列。

18.根据方面17所述的方法，其中纯化和/或分离编码可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列的核酸序列，然后表达所述免疫球蛋白序列。

19.根据方面1-18中任一项所述的方法，其中纯化和/或分离可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列。

20.通过方面1-19中任一项的方法可获得的免疫球蛋白。

21.通过方面1-19中任一项的方法可获得的针对离子通道的免疫球蛋白。

22.根据方面21所述的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白是离子通道的拮抗剂(部分或完全的拮抗剂)。

23.根据方面21所述的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白是离子通道的激动剂(部分或完全的激动剂)。

24.通过方面1-19中任一项的方法获得的针对p2x7的免疫球蛋白。

25.包括根据方面20-24所述的免疫球蛋白序列的组合物。

附图:

图1.1:在用pigjet(图片b)或纹身法(图片c)基因疫苗接种后在美洲驼中的体液免疫应答的动力学。血清以1/400稀释检测。箭头表示jet免疫的时刻，纹身短时间间隔方案以星号表示。

图1.2:在单次hbsag蛋白加强后，在dna疫苗接种的美洲驼中观察到的强二级血清反应。

图1.3.通过“dna”致敏-“蛋白”加强方案(美洲驼124,160,117,203)获得的体液免疫应答相对于通过蛋白免疫(美洲驼32和33)获得的体液免疫应答。

图1.4.重链抗体(igg2和3)-介导的针对hbsag的抗体反应(美洲驼124)。

图2.1.pvax-hcxcr4转染后的hek293细胞和pcdna3.1-hcxcr4转染后的骆驼科动物的cxcr4特异性染色。

图2.2.在通过基因疫苗接种的美洲驼中的cxcr4特异性血清转换。图片a:“dna”致敏–“细胞”加强方案；图片b:仅“细胞”加强方案。

图2.3.由‘dna’,‘pb’或‘细胞’全体成员(文库数目)的hcxcr4特异性纳米抗体发现效率。

图2.4.在基因免疫(dna)和单次细胞加强(pb)后获得的互补性靶标特异性纳米抗体全体成员。显示了全体成员特异性纳米抗体的数目。

图2.5.在基因免疫(‘dna’),随后的单次细胞加强(‘pb’)后或在完全细胞免疫(‘细胞’)(个体纳米抗体的数目)后鉴定的cxcr4-特异性纳米抗体全体成员在初级筛选后的平均结合功效，这是通过facs(图片a)或elisa(图片b)确定的。

图3.1.在通过基因免疫的美洲驼中的mp2x7-特异性血清转换。

图3.2.人和小鼠mp2x7的序列比对。

图3.3.在通过遗传混合免疫的美洲驼中的mp2x7-特异性血清转换。

图3.4.在基因免疫后，吸附前的免疫血清包含mp2x7-特异性重链抗体。图片a:抗-美洲驼igg-1；图片b:抗-美洲驼igg-2/3

图3.5.来自‘dna’,‘pb’或‘细胞’全体成员(文库数目)的mp2x7特异性纳米抗体发现效率。

图3.6.在初级筛选后鉴定的关于mp2x7的纳米抗体的序列多样性。dna:dna免疫；pb:dna免疫然后进行后续加强(postboost)

图3.7.在用或不用抗-myc-抗体预先温育的条件下，结合表达mp2x7的hek293的克隆2c4和5a1和对照wthek293细胞的周质提取物的代表性实例。

图3.8.来自24个不同家族的纳米抗体结合mp2x7-cho细胞的滴定曲线。

图3.9.在表达mp2x7的yac-1细胞上释放的配体-诱导的cd62l的纳米抗体的剂量-依赖性抑制。

图3.10.在用固定浓度的纳米抗体(2μm)释放的mp2x7-介导的cd62l-胞外结构域中的核苷酸的滴定。图片a/b–纳米抗体14d5,13g9,7h6,13b5,无nb,art2.2nb；图片c/d:4b4,7d6,13a7,8g11,8f5,8g12,无nb,不相关的nb,art2.2nb

图3.11.二价纳米抗体13a7(细胞),8g11(pb)和14d5(dna)表现出增强的阻断或增强mp2x7功能的功效。图片a/b:纳米抗体或纳米抗体构建体:8g11,13a7-35gs-13a7,13a7,8g11-35gs-8g11,不相关的nb；图片c/d:纳米抗体或纳米抗体构建体:14d5,14d5-35gs-14d5,不相关的nb；图3.12.在基因免疫(‘dna’),随后的单次细胞加强(‘pb’)后或在完全细胞免疫(‘细胞’)(特有纳米抗体的数目)后鉴定的mp2x7特异性纳米抗体全体成员的平均结合功效，这是通过elisa确定的。

图3.13.84种非-冗余mp2x7-选择的纳米抗体与人种系序列vh3-23/jh5的序列比对。

图4.1.在通过基因枪基因免疫的美洲驼中的cxcr7特异性血清转换。白色或黑色条柱表示在cxcr7转染的或未转染的hek293wt细胞上产生的mcf值。

图4.2.由‘dna’,‘pb’或‘细胞’全体成员(文库数目)的cxcr7特异性纳米抗体发现效率。

图4.3.在基因免疫(dna)和单次细胞加强(pb)后获得的互补性靶标特异性纳米抗体全体成员。显示了全体成员特异性纳米抗体家族的数目。

实施例

实施例1.用乙型肝炎小表面抗原作为模式抗原基因免疫美洲驼并且鉴定免疫球蛋白序列

在dna疫苗接种之后鉴定靶标特异性骆驼科动物免疫球蛋白序列。选择乙型肝炎小表面抗原作为模式抗原，因为该蛋白在动物中已被广泛用于在基因免疫之后诱导体液免疫应答。

实施例1.1.产生并制备用于基因免疫的质粒

由aldevron获得编码乙型肝炎小表面抗原(hbsag)的真核表达载体prc/cmv-hbs(s)。表达受控于组成型巨细胞病毒(cmv)启动子。得到的构建体的序列通过序列分析进行验证。

使用不含内毒素的gigaprep试剂盒(qiagen)，按照供应商的使用说明，产生质粒dna。载体dna最终以1mg/ml的浓度在不含内毒素的lalh2o中或在lalh2o中的不含内毒素的0.9％nacl中重构。质粒以整分试样保存在-20℃。在使用之前，将质粒dna溶液离心以去除可能的聚集物。

实施例1.2.通过按照不同dna施用法进行的基因免疫在骆驼科动物中诱导体液免疫应答。

在得到兽医医药学院伦理委员会(ethicalcommitteeofthefacultyofveterinarymedicine)(根特大学(universityghent),比利时)的核准后，使用两种基因免疫法免疫4头美洲驼(124,160,117和203)，以诱导抗原特异性体液反应。对于两种方法，dna以皮内(id)施用。第一种dna施用法由无针喷射注射组成，第二种按照纹身法(bins等.2005.naturemedicine(自然医学)11:899-904)进行。

在施用dna之前，在肩胛上刮剃约200-240cm²的美洲驼皮肤区域，皮肤用商购的脱毛膏(veet)处理2分钟，从而化学去除所有剩余的毛发和部分角质层，并且剃毛的区域通过用水漂洗彻底清洁。对于第一种方面，将dna使用pig-jet装置(内窥镜的(endoscopic))施用到皮肤中(美洲驼124和160)。多管口的头允许将dna溶液同时分配在5个相邻的点，每个点0.04ml，注射泡或丘疹留在皮肤上几个小时。每次剂量(1mgdna)，美洲驼(在第0,14,28和57天)接受，这样产生25个注射泡。对于短时间间隔的纹身法，使用短时间间隔方案。将美洲驼117和203麻醉，并且将施用dna的区域分成三个部分，以在第0,3,7(时间间隔1),21,24,28(时间间隔2),56,59和63(时间间隔3)天进行纹身。施用1mg/ml的dna小滴，并且使用商购纹身装置(大9形针(magnum9formationneedle))以0.5mm深度在每期至少10分钟的期间内在约80cm²的表面上纹身到皮肤中。施用的dna剂量是1.33mg(时间间隔1和2)和4mg(时间间隔3)。在免疫过程中以规律的时间间隔从所有的美洲驼收集小份血样，以通过elisa监测血清转换。

为了验证在dna疫苗接种后美洲驼是否诱导了hbsag特异性体液免疫应答，使用400倍稀释的免疫前和免疫血清进行elisa。简言之，将1μg/ml重组hbsag(aldevron)在96孔maxisorp板(nunc)上在4℃固定过夜。孔用酪蛋白溶液(在pbs中1％)封闭。在加入血清稀释液后，使用山羊抗-美洲驼-igg辣根过氧化物酶缀合物(bethyl实验室公司(bethyllab.inc.),montgomery,tx)检测特异性结合的免疫球蛋白。结果显示在图1.1中，证明对两头美洲驼(124和160)的喷射注射法，检测到明显的靶标特异性血清转换(第0天相对于第80天)，尽管具有可变的量级(图1.1图片a,b)。在第三轮纹身后，对于美洲驼117和203表现出相似的趋势，尽管反应的量级低于喷射注射(图1.1图片a,c)。

实施例1.3.用hbsag蛋白加强dna致敏的骆驼科动物提高抗原特异性血清转换，包括重链抗体介导的反应。

在第85天，使用stimune(cedi诊断(cedidiagnostics),lelystad,荷兰)作为佐剂用50μg纯化的hbsag的单次加强肌内(im)施用至所有4头美洲驼的颈部，并且收集少量血清样品。如前述实施例中所述，通过elisa评估所有4只动物的免疫应答，并且表明单次hbsag加强对所有4只动物诱导了强的二级反应(图1.2)。按照该“dna”致敏–“蛋白”加强方法，与免疫法相比，产生了相似的抗原特异性血清滴度，在所述免疫法中仅注射hbsag蛋白(美洲驼32和33；6次每周一次的im颈部注射；剂量为100-50μg蛋白/注射，使用stimune作为佐剂)。结果显示在图1.3中。抗体反应通过常规的和表达重链抗体的b细胞全体二者提高(mount)，因为用特异性识别美洲驼igg1常规抗体的或仅重链美洲驼igg2和igg3抗体的单克隆抗体检测到结合的美洲驼免疫球蛋白(图1.4)(daley等,clindiagnlabimmunol.(临床诊断实验室免疫学)2005年3月；12(3):380-6)。

实施例1.4.在骆驼科动物中用dna引发针对hbsag的免疫应答足以在体内鉴定成熟的抗原特异性纳米抗体。

在最后一次dna施用和hbsag蛋白加强之间，从美洲驼124和117(所述美洲驼在pig-jet和纹身dna施用后分别表现出最高的血清转换)收集含有b细胞的150ml血样。随后，在ficoll-paque(安玛西亚生物科学(amershambiosciences),uppsala,瑞典)上，按照供应商的使用说明，通过密度梯度离心纯化外周血淋巴细胞(pbls)。提取总rna，并且制备cdna，以通过巢式pcr扩增纳米抗体全体成员，如前所述(例如，wo02/085945和wo04/049794)。pcr产物用sfii(在fr1引物区通过巢式pcr引入)和bsteii(在fr4中天然存在的限制性位点)消化，并且在凝胶电泳后，从凝胶纯化约350bps的dna片段。将330ng扩增的纳米抗体全体成员连接到1μgsfii-bsteii消化的噬菌体展示载体(pax50)的相对应的限制性位点中，以在电穿孔大肠杆菌(escherichiacoli)tg1后获得文库。pax50包含lacz启动子，大肠杆菌噬菌体piii蛋白编码序列，氨苄青霉素或羧苄青霉素抗性基因，多克隆位点(携带sfii和bsteii限制性位点)和由基因3和胡萝卜软腐欧文氏菌pelb基序组成的嵌合的前导序列。该展示载体允许产生噬菌体颗粒，其表达作为与c-myc,his6-标签和基因iii产物的融合蛋白的单个纳米抗体。来源于美洲驼124和117免疫组织的文库的大小分别为1×10⁸和3×10⁷cfus。作为文库质量控制，通过使用m13反向和基因iii引物对每个文库的24个随机挑取的菌落进行菌落pcr，确定正确大小的插入物的百分数分别为91和100％。

通过将细菌生长至对数期(od600＝0.5)，然后通过用辅助噬菌体感染而获得在噬菌体的末端表达作为piii融合蛋白的克隆的纳米抗体全体成员的重组噬菌体，而拯救文库。在过滤除菌后，将噬菌体保存在4℃备用。

在下述单轮淘选后选择hbsag特异性纳米抗体。将重组hbsag(aldevron)直接固定在maxisorp96-孔平板(nunc,威斯巴登,德国)上，每孔500和50ng。在用噬菌体文库温育2小时并且彻底洗涤后，在室温下，在15分钟内用胰蛋白酶(1mg/ml)洗脱结合的噬菌体。通过向100μl噬菌体洗脱液中加入5μl16mmabsf蛋白酶抑制剂而抑制蛋白酶活性。在所有选择条件下，当与从非hbsag包被的孔洗脱的洗脱噬菌体的数目相比时，观察到从hbsag固定的孔洗脱的噬菌体的数目较高，这表明hbsag特异性纳米抗体的富集。将每次选择的产物在37℃重新感染对数生长的大肠杆菌tg130分钟，并且将适当的稀释液在固体培养基(含有2％葡萄糖和氨苄青霉素的lb)上生长过夜，以获得单个菌落。从hbsag富集的选择结果中挑取单个菌落，并且培养在96深孔平板(1ml体积)中，通过加入iptg诱导纳米抗体表达。按照标准方法，在80μl的体积中制备周质提取物(pes)。

在188种pes(94种美洲驼124来源的pe和94种美洲驼117来源的pe)的总共10倍稀释液中，使用小鼠抗-myc单克隆抗体和随后步骤中的抗-小鼠-hrp缀合的检测抗体，通过elisa针对与固相包被的hbsag的特异性结合进行筛选。将表现出高于背景(未包被的孔)最少2倍的信号的周质提取物评分为阳性的，并且将相对应的纳米抗体克隆测序。对于文库124和117,分别有68％和4％的克隆评分为阳性的。在序列分析之后，鉴定了5个hbsag特异性纳米抗体家族(3个来自美洲驼124，2个来自美洲驼117；seqids表1.1)，代表性的家族实例为来自美洲驼124的hbsagpmp2e7(家族1),hbsagpmp2e12(家族2)和hbsagpmp2a4(家族3)和来自美洲驼117的hbsagpmp1c6(家族4)和hbsagpmp1e11(家族5)。

实施例1.5.由dna疫苗接种的美洲驼分离的纳米抗体表现出与由蛋白免疫的美洲驼鉴定的那些相似的解离速率(off-rate)。

将血浆来源的hbsag颗粒(biodesign)以11000rus的密度固定在表面等离子共振cm5传感芯片(biacore)上。使用0.1mhcl以45μl/分钟的流速的5秒流进行芯片表面的再生。注入周质纳米抗体提取物，以评估解离速率(biacore)。通过减去关于参照通道的曲线和空白运行缓冲注射的曲线而对数据进行双重参照。在biacoret100评估软件v1.1.1和biaevaluation软件v4.1中，通过将1：1的解离模型拟合到结合曲线上而评估处理过的曲线。hbsagpmp2e7,hbsagpmp2e12的解离速率分别计算为8.8e-4s-1和1.3e-3s^-1。这些解离速率与在对来自美洲驼32和33的文库选择后鉴定的hbsag特异性纳米抗体所获得的那些解离速率(解离速率为6.0e-2-1.7e-3s^-1)相似(serruys等.2009hepatology(肝脏学)49(1):39-49),这表明通过基因免疫获得的纳米抗体的亲和性没有不同于通过蛋白免疫鉴定的纳米抗体。

表1.1:序列：

实施例2.通过基因免疫鉴定针对g-蛋白偶联的受体的纳米抗体。

为了证明对于携带多个跨膜结构域的膜结合的靶标的基因免疫的可能性，选择人趋化因子受体cxcr4作为第一个实例。

实施例2.1.产生适于基因免疫的cxcr4-编码载体。

编码人趋化因子受体cxcr4的cdna(nm_003467)购自openbiosystems(开放生物系统)。在pcr介导引入限制性位点nhei(5’端)和xhoi(3’端)后，将扩增子克隆到pvax-1(invitrogen)和pcdna3.1(invitrogen)的相对应位点。通过序列分析验证得到的pvax1-cxcr4和pcdna3.1-cxcr4的序列完整性。设计载体pvax1用于基因免疫，并且携带人巨细胞病毒(cmv)启动子。pvax1允许在大肠杆菌中高拷贝数复制，目的蛋白在大部分哺乳动物细胞中在体外和体内的瞬时高水平表达。生产毫克量的不含内毒素的pvax1-cxcr4质粒，在lalh2o中的0.9％盐水中溶解至浓度为2mg/ml，并且保存在-20℃。

实施例2.2.pvax1-cxcr4转染的细胞表达功能性cxcr4受体。

为了验证人cxcr4的功能性表达，将不含内毒素的pvax1-cxcr4质粒用fugene(roche)瞬时转染到hek293细胞中，以在体外通过流式细胞术监测细胞外表达。人cxcr4特异性单克隆抗体12g5(r&d系统mab170)，然后是pe-标记的山羊抗-小鼠igg检测抗体(jacksonimmunoresearchinc.(jackson免疫研究公司)货号115-115-164)用作检测抗体。按照该方法，显示转染的pvax1-hcxcr4/hek293相对于未转染的hek293细胞的38倍高的荧光强度变化(图2.1，图片a)。按照供应商的步骤，通过结合其生物素化的配体cxcl12/sdf-1a(r&d系统,人cxcl12/sdf-1α生物素化fluorokine试剂盒nns00)与cxcr4-转染的hek293而不是亲本hek293细胞，而证实功能性cxcr4在细胞表面的存在(未显示)。

实施例2.3.产生稳定转染的cxcr4骆驼科动物细胞。

为了产生稳定的cxcr4细胞系，将pcdna3.1-hcxcr4质粒转染到无限增殖的骆驼科动物肾(caki)细胞中(nguyen等，2001.adv.immunol.(免疫学进展)79:261-296)。通过将单细胞沉淀在微量滴定平板孔(具有acdu的facsariai,bectondickinson)中，而克隆单个转染的细胞，其表现出通过用12g5抗体荧光染色所示的高表达密度(如实施例2.2所述)。在含有选择抗生素的培养基中培养克隆的细胞系并且通过流式细胞术验证cxcr4表达(如实施例2.2所述)后，获得多个均质稳定的cxcr4caki转染体。选择荧光变化是未转染的骆驼科动物细胞114倍高(表示高水平的cxcr4膜表达)的一个克隆用于进一步的实验(图2.1,图片b)。

实施例2.4.皮内递送pvax1-cxcr4足以在美洲驼中诱导可检查的靶标特异性免疫应答。

在得到兽医医药学院伦理委员会(根特大学(universityghent),比利时)的核准后，指定4头美洲驼(美洲驼389,401,402和403)进行基因免疫。在施用编码cxcr4的dna之前，立即刮剃覆盖美洲驼肩胛的250cm²的皮肤区域，并且所有剩余的毛发组织通过施用商购脱毛膏去除，如实施例1.2所述。使用3管口头的名称为vacci-jet的自动无针喷射注射器(dermojet)(akradermojet法国)通过无针喷射注射将溶解在0.9％盐水中的dna施用到光秃的皮肤中。对于所有4次dna施用(第0,14,28和42天)，每头美洲驼施用2mgdna，分布在多个相邻点。通过在皮肤上形成表面含液体的泡或丘疹几个小时而表示含有dna的液体的皮内(id)施用的成功。对每头美洲驼，收集免疫前的10-ml血清样品和在基因疫苗接种步骤过程中的不同血清样品，以监测抗原特异性体液反应。通过流式细胞术，关于cxcr4转染的骆驼科动物相对于未转染的骆驼科动物细胞的不同染色，对在250-至5000-倍稀释的免疫前样品(第0天)和免疫血清样品(第53天；在第4次dna施用后11天收集)中存在美洲驼免疫球蛋白的结合进行评分。细胞结合的美洲驼总igg(常规的+重链抗体)的检测通过山羊抗-美洲驼igg(货号a160-100；bethyl)然后用pe-缀合的驴抗-山羊igg(jacksonimmunoresearchlaboratories(杰克逊免疫研究实验室)货号115-115-164)二次染色进行检测。除了美洲驼403，与免疫前水平(对于所检测的最低程度的三份稀释液)相比，对于cxcr4-转染的caki细胞的所有第53天免疫血清观察到平均细胞荧光(mcf)的明显增加，而类似染色的未转染的caki细胞的mcf值保持较低(图2.2)。这表明，按照id基因免疫，4头美洲驼中有3头表现出针对天然靶标构象的特异性体液免疫反应。

实施例2.5.基因免疫然后进行单次细胞加强显著提高cxcr4特异性血清转换。

选择骆驼科动物细胞作为针对cxcr4的免疫反应的免疫原细胞背景，预测与人或啮齿动物宿主细胞背景相比，由于高的整体序列相似性，在美洲驼中骆驼科动物细胞表面抗原的免疫原性减小。新鲜收获培养的表达cxcr4的骆驼科动物细胞(实施例2.3)，并且用d-pbs洗涤两次，以去除所有培养基污染物。将细胞重悬在2mld-pbs中，并且在转送到动物设施过程中保持在冰上。将美洲驼389,401,402和403皮下(sc)注射2e7hcxcr4转染的骆驼科细胞，最少在最后一次dna施用后三周进行。在细胞加强后11天，从每头美洲驼收集免疫血样，并且如实施例2.4所述确定cxcr4血清滴度。对于所有4头美洲驼(以250–2250倍血清稀释物)，与在单独的dna施用(第53天)后获得的血清样品相比较，在cxcr4转染的骆驼科动物细胞上检测到提高的mcf值，而在三只动物中，与未转染的骆驼科动物细胞的血清结合仅略微提高。这些结果表明，对于所有4头美洲驼，单次细胞加强导致增加的cxcr4反应量级(图2.2和表2.1)。与4头基因免疫的美洲驼平行的，对从美洲驼217和218收集的第62天样品确定血清滴度(图2.2和表2.1)。这些美洲驼用6次cxcr4-hek293细胞注射(1-4e7个细胞/剂量)以每周的时间间隔免疫(记述在专利wo/2009/138519a1中)。与未转染的对照细胞相比，这两头美洲驼中只有一头(218)表现出强烈的针对cxcr4-表达细胞的血清反应(n＝2；一个所示的代表性实例)。检测的mcf值表明，与完全细胞免疫相比，进行的基因免疫方法(dna+细胞加强)产生相似的或更好的靶标特异性滴度量级。

实施例2.6.基因免疫足以鉴定cxcr4特异性纳米抗体。

对于美洲驼389,401,402,403,在最后一次dna施用(分别编码pbl1和pbl2)后3天和9天和在细胞加强(分别为pbl3和pbl4)后4天和8天，收集4份150ml血样。另外，在细胞加强后3-4天，通过局部手术从每头美洲驼收集可触摸到的弓形淋巴结(ln)活组织样品。通过在ficoll-paque上的密度梯度离心从pbl1-4样品纯化外周血淋巴细胞，如实施例1.4所述。从所有携带淋巴细胞的免疫组织提取总rna，并且用作模板制备cdna(如实施例1.4所述)。对于每头基因免疫的美洲驼，产生2个独立的文库(表2.2)：一个文库来源于汇集的pbl1+2cdna(‘dna’文库)，第二文库来源于汇集的pbl3+4和ln(后续加强或‘pb’文库)。

尽管通过流式细胞术检测的多克隆血清反应表明存在针对天然cxcr4的靶标特异性美洲驼抗体，但是滴度的量级不一定预测：i)抗-cxcr4重链抗体介导的克隆多样性，ii)单克隆纳米抗体针对靶标的亲和力和iii)反应的宽度，例如，个体纳米抗体覆盖的cxcr4表位。通过噬菌体展示鉴定cxcr4-特异性纳米抗体，以在单克隆水平上表征这些。对8个dna和pb文库的每一个，和对由细胞免疫的美洲驼产生的另外两个文库进行平行选择。文库以相似的方式从在最后一次细胞注射后4天和8天收集的、汇集的来源于pbl1+2的cdna类似地产生。

为了选择cxcr4特异性纳米抗体,如在实施例1.4中所述，从所有10个文库拯救重组噬菌体。在第一轮选择中，将来源于cxcr4转染的hek293细胞的10个单位的96-孔maxisorp平板(nunc)固定的膜小泡用低脂奶粉(在pbs中4％marvell)封闭。在与拯救的噬菌体温育2小时后，在进行15次pbs洗涤后，在室温下允许胰蛋白酶(1mg/ml)洗脱15分钟。通过施用0.8mm蛋白酶抑制剂absf而立即中和蛋白酶活性。将所有的噬菌体输出感染到对数生长的大肠杆菌tg1细胞中，并且涂布在琼脂平板(lb+amp+2％葡萄糖)上，以分析个体纳米抗体克隆。拯救第1轮噬菌体输出，并且在10或1个单位的平板-固定的cxcr4膜小泡上进行第2轮选择。富集计算为从cxcr4膜小泡洗脱的噬菌体数目和从未转染的hek293对照膜小泡洗脱的那些噬菌体数目之间的比率。对于10个文库中的8个，第2轮输出显示富集>5(数据未显示)。将在10或1个单位平板固定的hcxcr4膜小泡上选择的第2轮噬菌体输出感染到tg1细胞中，并且涂布在琼脂平板(lb+amp+2％葡萄糖)上。将在cxcr4膜小泡上选择的每次输出的45个单个克隆(第1轮和第2轮)培养在1-ml96-深孔平板中，并且制备周质提取物(pes)，如实施例1.4所述。

使用两种不同的受体形式，通过两种筛选测定，确定cxcr4特异性。在第一种方法中，将2个单位的cxcr4膜小泡通过在4℃包被过夜固定在96-孔maxisorp平板的每个孔中。在用在pbs中的4％marvell封闭后，加入10倍稀释的pe，并且通过顺序的小鼠抗-myc和兔抗-小鼠-hrp检测检查结合的纳米抗体(携带c-myc标签)。501种纳米抗体被认为是cxcr4特异性的，与对照膜小泡相比，其在hcxcr4膜小泡上表现出最低增加到5倍的elisa信号。两种类型的阴性对照pes(一种由表达不相关纳米抗体的tg-1产生，另一种来自包含空表达载体的tg-1)的相对应的平均比率分别为1.1±0.8和1.2±0.7。由该筛选方法导致，计算每次选择输出的击中率，并且总结在表2.1中。基于按照不同免疫策略的第2轮选择输出(10u膜小泡)的平均击中率，关于‘dna’,‘pb’和‘细胞’全体成员计算发现效率分别为14,71和91％(图2.3)。甚至在不存在可检测的针对cxcr4的重链抗体(hcab)滴度时(表2.1)，也鉴定靶标特异性纳米抗体，分别如在对美洲驼403dna文库一轮和两轮选择后4-31％的击中率所示。该击中率表明，在单次细胞加强后，单轮选择足以从全部hcab美洲驼全体成员鉴定cxcr4特异性纳米抗体(表2.1中的击中率为4-36％)。

对所有501种cxcr4特异性纳米抗体测序，并且去除冗余纳米抗体(相同的aa序列)。这导致鉴定了171种独特的序列，其属于70个不同的纳米抗体b细胞谱系(表2.1)。当它们的cdr3区表现出高氨基酸序列相似性且长度相同时，纳米抗体属于同一b细胞谱系。预测cdr3主要有助于抗原相互作用，并且因此，假定属于同一家族的纳米抗体结合相同的表位。每头美洲驼鉴定的cxcr4特异性纳米抗体家族的平均数目分别在细胞免疫(217,218)后为12.5，通过dna免疫(dna+细胞加强；389,401,402和403)为11.2。属于一个纳米抗体家族的纳米抗体氨基酸序列变体(最少1个aa残基突变)的数目在1-最多17个家族变体的范围内。

在通过流式细胞术测量纳米抗体与表达人cxcr4的细胞的结合的二级筛选测定中证实cxcr4特异性结合。关于此，将5倍稀释的pes用亲本或cxcr4转染的骆驼科动物细胞(2×10⁵个细胞)温育，并且通过小鼠抗-myc(serotecmca2200)和随后的抗-小鼠igg-pe(jacksonimmunoresearchlaboratories(杰克逊免疫研究实验室)115-115-164)检测抗体测量纳米抗体结合。对于所有样品，计算关于cxcr-4表达细胞的mcf值和关于未转染对照细胞的mcf的比率。尽管不相关的纳米抗体一致性地表现<2.4的比率，但是对于61个纳米抗体家族(至少一个家族成员)检测到>10的比率，由此证实这些家族针对天然cxcr4的特异性。在其余9个纳米抗体家族中，由单个成员组成的7个家族(7个家族)表现出<3的比率，尽管在elisa中关于膜小泡测量的吸附比率为5-10倍。对于其余两个纳米抗体家族(2个家族；所有单个成员家族)，吸附比率(elisa)分别为144和70，而mcf比率(facs)分别为2.2和2.3。

实施例2.7.皮内dna施用作为免疫方法足以鉴定纳米抗体介导的sdf-1-cxcr4受体相互作用。

在筛选cxcr4特异性(通过elisa或facs确定)之后，检测所有171种cxcr4特异性纳米抗体变体它们阻断配体sdf-1与其受体相互作用的能力，以鉴定调节受体功能的纳米抗体(如在专利wo/2009/138519a1中所述)。简言之，在存在或不存在纳米抗体竞争剂，即pe(如实施例1.4所述生产)的10倍稀释液的条件下，允许40pm[¹²⁵i]sdf-1配体(内部标记的)结合2μg的hcxcr4/hek293膜提取物。在4℃温育1小时后，洗涤膜提取物，并且确定每分钟结合的配体放射性计数(cpm)的总量。通过加入过量的未标记的sdf-1(100nm)，以竞争所有来自cxcr4受体的放射性-配体，确定放射性-标记的配体与膜提取物(非-cxcr4相关的)的非特异性结合。从总结合(在不存在nb条件下的cpm)和关于每种纳米抗体的cpm值减去每个平板的非特异性结合值，并且计算在存在纳米抗体条件下的％残留[¹²⁵i]sdf-1结合(sdfres)。鉴定了评分作为配体置换剂的纳米抗体家族的数目(表2.1)，这表明由每种免疫策略(表示dna、pb和细胞的全体成员)鉴定了配体竞争性纳米抗体。

实施例2.8.在不同免疫策略后鉴定的纳米抗体的表位绘图。

将由每种免疫策略选择的靶标特异性纳米抗体(竞争剂和结合剂)重新克隆到表达载体中，所述表达载体允许表达和纯化与his6和myc标签融合的可溶纳米抗体，用于进一步表征。在37℃iptg诱导后在大肠杆菌中发生表达。在离心细胞培养物后，通过冻融沉淀物并且重悬在dpbs中而制备周质提取物。这些提取物用作固定化金属亲和层析(imac)的起始物质。使用250mm咪唑从柱上洗脱纳米抗体，并且随后用dpbs脱盐。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)验证所有纳米抗体的纯度和完整性，而标签的存在通过蛋白质印迹法验证。

为了确定dna疫苗接种策略(仅dna或随后进行细胞加强)是否导致鉴定与在细胞免疫策略后鉴定的纳米抗体相比针对不同表位的纳米抗体，将进行多种表位结合测定(epitopebinningassay)。这些为：结合与aa残基1-14相对应的cxcr4n-端肽(elisa)，结合cxcr4突变受体，其中已经在n端和细胞外环区引入点突变，或者结合突变的cxcr4如n端截短的hcxcr4受体，或cxcr4嵌合体，其中n端或细胞外环已分别被相关的gpcr序列而替换。备选地，使用不同cxcr4-特异性化合物对我们纯化的纳米抗体的组进行竞争性实验，而进行表位绘图，所述cxcr4-特异性化合物包括：i)单克隆抗体或fab片段，其表位已被描述(carnec等2005,j.vir.(病毒学杂志)1930-33)，诸如4g10(santacruz,sc53534)，其结合直链n-端,ii)小分子抑制剂,如拮抗剂amd3100(sigmaa5602),和iii)用荧光标记或生物素标记的其他纳米抗体。

实施例2.9.在基因免疫后进行细胞加强产生不同的纳米抗体全体成员。

从美洲驼389,401,402和403,鉴定了45个cxcr4特异性纳米抗体家族，其由(已测序的225种中)123种纳米抗体序列变体组成。将这123种变体中的每一种指定为‘dna’文库或‘pb’文库(从这两种文库没有获得具有相同aa序列的变体)。这45个家族中仅有5个(11.1％的总家族多样性)，从来源于同一动物的‘dna’文库和‘pb’文库鉴定了属于相同家族的纳米抗体变体(表2.2)。这5个家族包括42种不同的纳米抗体变体，其对应于34％的非冗余克隆。其余纳米抗体全体成员(76％)被鉴定为来自‘dna’文库或来自‘pb’文库，这表明在基因免疫后的细胞加强在体内引起纳米抗体全体成员的成熟(图2.4)，所述成熟是通过对仅进行基因免疫后产生的文库的淘选不容易鉴定的。仅进行基因免疫产生不同的纳米抗体全体成员，这表明所述全体成员在细胞加强后可能丢失。

实施例2.10.‘dna’全体成员的平均功效低于‘pb’和‘细胞’全体成员的平均功效。

前述实施例表明，仅有有限数目的家族已从‘dna’和‘pb’文库两者鉴定。为了验证细胞加强对该全体成员亚组起什么作用，我们通过下述对体内成熟进行评分：i)为在特定纳米抗体家族内的每种变体计算相对于亲本v-基因种系序列的遗传距离(氨基酸或核苷酸突变的数目；排除编码cdr3和fr4区的d-和j-基因片段)，和ii)比较纳米抗体变体功效。为了计算遗传距离，我们假定对所有文库成比例引入扩增错误(已经使用校正聚合酶来限制由纳米抗体全体成员克隆法(包括通过pcr扩增)引起的突变数目)。对于这5个家族中有3个，相对于亲本v-基因种系序列，‘pb’来源的纳米抗体表现出平均12,13和9个aa突变(或26,19和13个nt突变)，而对于来源于‘dna’文库的纳米抗体，分别为10,12和5个(或在nt水平上，19,17和5.5个)，这表明，平均来说，‘pb’来源的纳米抗体比‘dna’来源的纳米抗体距离亲本v-基因种系更远(因此，更加成熟)。对于这3个家族，‘pb’纳米抗体的较高的成熟度也反映在‘pb’相对于‘dna’来源的纳米抗体的平均结合功效(如实施例2.6所述的mcf比率)上，对于3个家族分别为553vs46,261vs105,556vs505(facs结果，但是趋势在elisa中证实，参见表2.2)。

当对于来自于美洲驼389,401,402和403的所有122种独特的纳米抗体(分别来自于‘dna’和‘pb’文库的20种和102种纳米抗体变体)分析浓度依赖性靶标结合时，关于来源于‘pb’和‘dna’文库的纳米抗体，平均mcf比率(facs)分别为427和196(图2.5)。由来源于‘细胞’文库(美洲驼217或218)的49种纳米抗体变体计算的相对应的数为538。这一趋势通过由elisa测定产生的数证实：关于来源于‘pb’和‘dna’文库的纳米抗体，平均吸附比率(如实施例2.6所述计算)分别为36.2和23。由来源于‘细胞’文库(美洲驼217或218)的49种纳米抗体变体计算的相对应的数为28。这表明，来源于‘dna’文库的纳米抗体变体的平均遗传距离较由‘pb’文库鉴定的那些纳米抗体与亲本种系序列更加紧密相关，因此被认为是较不成熟的。此外，当分析3种全体成员的平均结合功效时，‘dna’全体成员的功效似乎低于‘pb’全体成员的功效，后者的功效与‘细胞’全体成员的功效相似(图2.5)。

然而，对于第4个家族，令人惊讶地，表明由‘dna’文库获得的变体的体内成熟程度等于或高于由‘pb’文库鉴定的纳米抗体的体内成熟程度(表2.2)。与v-种系相比，来自于该家族的‘dna’来源的克隆表现出15个aa(或21个nt)突变，并且对于‘pb’来源的纳米抗体，相对应的平均值为14.6(aa)或21.7(nt)。这也反映在‘dna’和‘pb’纳米抗体的facs测定中的平均功效中，分别为755和671。对于第5个家族，‘dna’和‘pb’文库的成熟评分高度相似，因为按照4种分析方法(aa或nt突变,facs和elisa)，在‘dna’和‘pb’来源的纳米抗体之间没有检测到一致的评分等级。

尽管在这3种不同的全体成员的平均结合功效之间不存在统计学显著性差异，但是‘pb’全体成员的平均功效与由‘细胞’文库获得的全体成员的平均功效相似，由‘细胞’文库获得的全体成员的平均功效高于‘dna’全体成员的平均功效。然而，在单克隆水平上，与在细胞加强或细胞免疫后鉴定的那些相比，在仅进行基因免疫后已经鉴定了具有相似结合功效的纳米抗体。

实施例3.鉴定针对配体-操纵的离子通道的纳米抗体。

选择小鼠嘌呤受体p2x7作为第二实例来证明对于携带多个跨膜结构域的膜结合的靶标的基因免疫的可能性。

p2x7是一种配体-门控离子通道，其由高浓度的外源atp或由nad-依赖性adp-核糖基化激活。该功能通道由3个p2x7蛋白亚单位形成，每个蛋白亚单位由2个跨膜区和285个aa残基的单个细胞外环组成。激活该嘌呤受体诱导构象改变，导致形成大的非选择性孔，最后引起膜释放和细胞程序性死亡。

先前已经证明用p2x7进行基因免疫在兔和大鼠中成功产生多克隆和单克隆的抗-p2x7抗体(adriouch等.2005,cellimmun(细胞免疫)236,72-77)。这里，我们证明鉴定了在基因免疫后调控配体-诱导的p2x7激活的p2x7-特异性纳米抗体。

实施例3.1.在美洲驼中通过用冲击法进行的基因免疫诱导针对mp2x7的体液反应。

已经表明基因枪免疫是一种在各种范围内的动物(包括小鼠、牛和美洲驼)中诱导体液反应的有效的皮内dna递送方法(koch-nolte2007,faseb.j.21,3490-3499)。该冲击施用法将dna包被的金微粒在高压下递送至高免疫能力的皮肤组织，立即靶向并且转染真皮中存在的免疫效应器细胞，诸如朗格汉斯抗原呈递细胞。这导致提高的体内转染效率，因此导致持续的抗原呈递，其被认为是刺激对体液免疫应答的诱导。

将3头美洲驼(407,414和417)用小鼠p2x7(mp2x7)编码dna免疫。用于dna递送的装置是helios基因枪(biorad)。按照供应商的使用说明，将不含内毒素的mp2x7-表达质粒pcdna6.1-mp2x7(adriouch等.2005,cellimmun(细胞免疫)236,72-77)包被到1μm金颗粒(biorad,货号1652263)上。按实施例1.2准备好美洲驼颈部区域的皮肤。每头美洲驼接受4次抗原剂量，施用的时间间隔是2周。每个剂量由12次质粒-缀合的金颗粒发射(每次发射缀合到0.5mg金颗粒上的1μgdna)组成，其以600psi的压力设置施用到皮肤中。在最后一次基因免疫后3周，所有的美洲驼接受使用2x10⁷个mp2x7-转染的hek293细胞的单次加强。以规律的时间间隔，收集血样，从而随时间监测体液免疫应答的诱导。为了分离b细胞组织，在第4次dna免疫后3天和9天(pbl1和pbl2)，和在细胞加强后4天和8天(pbl3和pbl4)，从这些动物收集血液。在细胞加强后4天，采集弓形区中可触摸到的淋巴结(ln)的活组织样品。

另外3头美洲驼(413,415和416)在弓形区用2x10⁷个稳定转染的mp2x7hek293细胞(adriouch等2005,cellimmun(细胞免疫)236,72-77)皮下免疫4次，时间间隔为两周。在第4次免疫后4天和8天从这些动物收集血液，并且在第4次免疫后4天采集ln活组织样品。

与实施例2.4所述类似，使用未转染的和mp2x7-转染的cho细胞通过流式细胞术监测关于mp2x7反应性的血清反应。对于dna免疫的美洲驼，比较在免疫前血清样品(第0天),在最后一次dna免疫后(第51天,pbl2)收集的血清样品和在细胞加强后(第71天,pbl4)收集的血清样品之间的mp2x7血清转换。对于通过4次细胞注射免疫的美洲驼，比较在免疫前和在第52天收集的免疫样品之间的mp2x7特异性滴度。图3.1显示所有6头mp2x7免疫的美洲驼的总igg(常规的和重链抗体)免疫应答。除了美洲驼407，与免疫前水平(对于所检测的最少3份稀释液)相比，使用在细胞加强后收集的第71天免疫血清样品观察到mp2x7-转染的cho细胞的平均细胞荧光(mcf)的明显增加。针对未转染的cho细胞的mcf值保持较低。按照基因免疫方法(dna致敏，然后单次细胞加强)，3头美洲驼中有2头表现出针对天然靶标构象的特异性体液反应。接受了多次细胞注射的所有3头动物表现出可检测的mp2x7特异性血清滴度(第52天)。与通过基因免疫(dna+细胞加强)而免疫的那些动物相比，在这些动物中针对不相关的cho细胞表面抗原的背景反应较高。

实施例3.2:使用基因枪进行人和小鼠p2x7的基因混合物免疫。

基因免疫的一个益处是通过向同一动物施用不同的靶标编码基因产生针对多种靶标的免疫反应的多功能性。混合物免疫(cocktailimmunization)也可以用来使免疫应答偏向于特定构象。作为混合物免疫的实例，我们选择人(h)和mp2x7(其为享有80.5％整体序列同一性的直向同源物，如图3.2所示)用于美洲驼的基因枪dna免疫。另外，为了允许诱导针对开放构象的p2x7通道的免疫应答，进行了对实施例3.1所述的免疫策略的两种改进。首先，使用编码mp2x7和mart2.2的质粒的混合物进行混合物免疫，其中mart2.2是一种介导adp-核糖基化的已知p2x7激活剂。第二，在细胞加强之前，将p2x7-转染的hek293细胞用atp处理，以激活该通道，之后使用低聚甲醛固定细胞以保持开放的构象。

将2头美洲驼(405和418)使用基因枪进行基因免疫而用h和mp2x7皮下免疫。将不含内毒素的pcdna6.1-mp2x7和pcdna6.1-mart2.2(1:10比例)混合物缀合到1μm金颗粒上。类似地，将编码hp2x7的pcdna6.1-hp2x7质粒缀合到1μm金颗粒上。如实施例3.1所述进行基因免疫(1μg/0.5mg/发射)。颈部左侧用于使用mp2x7/mart2.2-缀合物进行免疫，而右侧用于使用hp2x7缀合物进行免疫。在第4次dna免疫后3周，2头美洲驼同时用2x10⁷atp-处理的,固定的mp2x7-hek293细胞(左边)和hp2x7-hek293细胞(右边)加强。3天后在左边用2x10⁷atp-处理的,固定的hp2x7-hek293细胞进行第二次加强。为了分离b细胞组织，在第4次dna免疫后3天和9天(pbl1和pbl2)，和在第1次细胞加强后4天和8天(pbl3和pbl4)，从这些动物收集血液。在第1次细胞加强后3天，在左边从弓形区采集ln活组织样品。

如在实施例3.1所述，使用未转染的和mp2x7-转染的细胞以流式细胞术监测2头美洲驼的针对mp2x7的总igg血清滴度反应。于此将免疫前血清样品(第0天)与在dna免疫(第51天，pbl2)和各自细胞加强(第71天，pbl4)后采集的样品进行比较。美洲驼418在dna免疫后表现出明显的针对mp2x7的总igg免疫反应，其在细胞加强后进一步提高，而美洲驼405在细胞加强后仅表现出mp2x7反应性(图3.3)。对于2头美洲驼，关于未转染的cho细胞的mcf值保持较低。没有确定针对人p2x7的血清反应性。总之，在基因免疫和随后的细胞加强后，5头美洲驼中有4头表现出明显的mp2x7血清反应。

实施例3.3:在基因免疫后诱导重链抗体反应。

另外，在稳定的hek293-mp2x7转化体上使用美洲驼igg同种型-特异性单克隆抗体通过facs监测重链抗体(hcab)介导的mp2x7-特异性反应的诱导。为了检测该设置，将美洲驼血清的稀释液(对于dna-免疫的美洲驼1/200和对于细胞-免疫的美洲驼1/1000)在室温下在1×10⁷wthek293细胞上预先吸附1小时，以耗尽细胞背景抗体。接着，将5×10⁵个hek293-mp2x7或未转染的hek293细胞用0.1ml预先吸附的血清在4℃温育0.5小时(以防止内在化)，之后通过小鼠-抗-美洲驼igg2和igg3抗体的混合物(daley等2005.clindiagnlabimmunol(临床诊断实验室免疫学)12:380-386)然后进行抗-小鼠igg-pe(jacksonimmunoresearch)染色检测结合的hcabs。使用抗-美洲驼igg1检测常规美洲驼抗体的结合。作为mp2x7染色的对照，包括大鼠mabhano43(adriouch等.2005,cellimmun(细胞免疫)236,72-77)。由于高水平的hek293细胞背景结合，不能确定hek293-mp2x7免疫的美洲驼的mp2x7特异性igg血清滴度，而对于dna-免疫的美洲驼407，没有观察到这样高的背景。图3.4表明在用mp2x7(美洲驼414和417)或m和hp2x7的混合物(美洲驼405和418)基因免疫后的常规抗体(图片a)和hcab介导的(图片b)血清反应。在仅用dna疫苗接种后，关于mp2x7转染的hek293细胞相对于未转染的wthek293细胞针对常规ab-介导的反应，美洲驼414和418的血清表现出明显的mcf迁移，这证实了通过总igg检测的血清转换(在实施例3.1和3.2中)。关于mp2x7转染的hek293细胞相对于未转染的wthek293细胞，细胞加强诱导了中等(美洲驼417)至明显(美洲驼405,414和418)的常规ab介导的mcf迁移。对于美洲驼414和418，在细胞加强前检测到中等hcab反应，对于美洲驼414，该反应通过细胞加强提高(比较第71天和第67天血清)。相反，如果对于美洲驼405和417存在任何可检测的重链血清反应，仅存在很少(图3.4-b)。总之，在5头美洲驼中有2头，基因免疫在细胞加强后导致针对mp2x7的可检测的hcab反应。

实施例3.4.文库构建。

按照供应商(amershambioscience(安马西亚生物科学))使用说明，用ficoll-hypaque从血样制备外周血单核细胞。接着，从这些细胞和从ln活组织样品提取总rna，并且用作rt-pcr的起始材料，以扩增纳米抗体编码基因片段(实施例1.4)。对于5头dna免疫的美洲驼405,407,414,417和418,将从在仅dna免疫后的pbl1和pbl2获得的cdna用来产生‘dna’文库，而来自pbl3,pbl4和ln的cdna用来构建加强后(pb)文库。对于用hek293-mp2x7细胞免疫的美洲驼，将由pbl1,pbl2和ln获得的cdna用来产生文库。将与hcab全体成员的可变结构域相对应的片段克隆到来源于puc119的噬菌粒载体中，其包含lacz启动子,大肠杆菌噬菌粒piii蛋白编码序列,氨苄青霉素或羧苄青霉素的抗性基因,多克隆位点和基因3前导序列。与纳米抗体编码序列符合阅读框的，该载体编码c端c-myc标签和(his)6标签。总共产生13个噬菌体文库，指定为405-dna,405-pb,407-dna,407-pb,414-dna,414-pb,417-dna,417-pb,418-dna418-pb,413-细胞,415-细胞,和416-细胞。得到的噬菌体文库的大小估计在0.12-2.5×10⁸个克隆之间，插入百分数为83-100％。按照标准方法制备噬菌体，并且保存在4℃备用。

实施例3.5.使用噬菌体展示在mp2x7-表达细胞上选择纳米抗体。

为了鉴定以其天然构象存在的识别mp2x7嘌呤受体的纳米抗体，使用由dna疫苗接种后的动物产生的所有10个文库和由细胞免疫的美洲驼产生的3个文库，在表达mp2x7的全体细胞上进行选择。为了比较通过不同的免疫法鉴定的单克隆纳米抗体的特征，平行进行对所有文库的选择。在第一轮选择中，将转染了mp2x7的cho细胞或未转染的cho细胞(5x10⁶/文库)用封闭缓冲液(在pbs中的10％的胎牛血清(fbs)和2％marvel)在4℃封闭30分钟。作为预先封闭步骤，将所有噬菌体输入在封闭缓冲液中在4℃温育30分钟。将细胞在缓慢旋转下在4℃用所述噬菌体温育，然后离心并且用封闭缓冲液洗涤3次和用pbs洗涤两次。如实施例1.4所述，用胰蛋白酶洗脱细胞-结合的噬菌体。将所有的噬菌体输出感染到对数生长的大肠杆菌tg1细胞中，并且涂布在琼脂平板(lb+amp+2％葡萄糖)上，以分析个体纳米抗体克隆。富集计算为在平行选择中从mp2x7-cho细胞洗脱的噬菌体数目和从未转染的cho细胞洗脱的那些数目之间的比例。仅对413和414文库，可以观察到3倍高的第一轮选择富集，后者的pb文库甚至表现出>200-倍的富集。拯救第1轮mp2x7/cho选择的噬菌体输出，并且用于在小鼠yac-1细胞上进行的第二轮选择，所述小鼠yac-1细胞内源性表达mp2x7。进行细胞背景的改变，以减少对与不相关细胞背景标记结合的噬菌体的选择。按照第一轮，进行基本上相同的步骤。由于对于第二轮没有可用的对照细胞，通过采用第2轮/第1轮的比率计算相对富集。从dna文库，仅对407和417检测到富集(比率分别为6和97)。对于pb全体成员，5个文库中有3个表现出高于10的富集，而对于407，观察到中等的3倍的富集。对于pb文库414，没有观察到进一步的富集，这可能是由于在第一轮选择过程中已经很高的抗原特异性噬菌体富集。从细胞免疫的文库，仅413表现出中等3倍的富集。将每次选择输出(第1轮和第2轮)的45-48个个体克隆培养在96孔形式中，并且制备噬菌体用于后续的筛选，如实施例1所述。

实施例3.6.筛选mp2x7-特异性纳米抗体。

首先通过噬菌体elisa在未转染的和mp2x7-转染的cho细胞上确定p2x7特异性。将细胞以4×10⁴个细胞/孔的密度接种在96-孔培养板的0.2mldmem培养基中，所述培养基含有10％fbs，其中补充了青霉素和链霉素(分别为100u/ml和100μg/ml)，并且在5％co2气氛中在37℃温育24小时。用pbs漂洗分汇合的细胞，并且在rt下用在pbs中的4％低聚甲醛固定。固定的细胞用pbs洗涤三次，并且用在pbs中的2％bsa封闭2小时。封闭后，加入含有噬菌体的10-倍稀释的培养物上清，并且温育1小时。通过小鼠抗-m13-hrp-缀合物(gehealthcare(ge卫生保健),货号e2886)检测结合细胞的噬菌体。将大鼠mabhano43用作阳性对照。相对于对照cho细胞，所筛选的1506个来源于所有选择轮次的个体克隆中有523个在mp2x7-cho细胞上表现出最低2倍增加的elisa信号。在dna,pb,和细胞文库的初级筛选后的击中率显示在表3.1中。

基于在关于在不同免疫策略(dna,pb,细胞)后产生的全体成员的第1轮和第2轮选择输出的平均击中率，对于‘dna’,‘pb’和‘细胞’全体成员，发现效率分别计算为4,40和11(第1轮输出)或31,78,和60％(第2轮输出)(图3.5)。这表明，对于‘pb’和‘细胞’，在不同全体成员中的mp2x7结合纳米抗体的比例高于对于‘dna’的比例。对于cdna免疫的动物，对于来自美洲驼405,418和414的pb文库，在两轮选择后观察到血清滴度和击中率之间的良好相关性，在第1轮后击中率在>48％的范围内，且在第2轮后>90％。为了比较，在两轮选择后，用来自细胞免疫的文库观察到的击中率在40-73％的范围内。在美洲驼407和417中在dna免疫后，尽管不存在可检测的血清滴度(图3.1)，但是在两轮选择后，相对应的dna文库的击中率分别为25％和87％。如先前关于cxcr4所示，这表明dna疫苗接种足以通过噬菌体展示技术鉴定mp2x7-特异性纳米抗体，即使在不存在可检测的靶标-特异性血清转换的情形中。

实施例3.7.mp2x7-结合克隆的序列多样性。

分析初级筛选中的所有mp2x7结合剂的序列。523个纳米抗体克隆中，鉴定84个独特的克隆，其可以分类为29个不同的序列家族(图3.13)。在图3.6中总结了属于同一家族的纳米抗体氨基酸序列变体的数目。在dna疫苗接种(dna+pb)和细胞免疫后已经分别鉴定了15个和14个家族，这在dna+细胞加强免疫法后导致平均3个家族的多样性，在细胞免疫策略后导致平均4.7个家族的多样性。鉴定了4个mp2x7家族，其包括来自dna和pb文库二者的家族变体，即，家族2,15,25和5(图3.5)。从dna和pb全体成员二者中鉴定了这些克隆中的两个克隆，即为16d9(家族15,美洲驼414)和6a11(家族5,美洲驼418)。然而，如早先关于cxcr4所示，大部分家族完全在‘dna’(15个家族中有4个)或‘pb’文库(15个家族中有7个)中鉴定。这表明，在基因免疫后细胞加强在体内引起纳米抗体全体成员的成熟(表3.1)，所述成熟在仅进行基因免疫后产生的文库中是不容易鉴定的。

表3.1.筛选在mp2x7基因免疫和细胞免疫后的击中率。

实施例3.8.验证特异性并且排列结合mp2x7的克隆用于选择每个家族的代表性克隆。

将所有非冗余mp2x7-特异性克隆重新阵列布置在96-孔平板中，用于在1ml96-深孔平板中生产pes，如实施例1所述。为了验证在关于与固定的细胞结合筛选后鉴定的mp2x7特异性纳米抗体也可以结合天然的mp2x7，使用检测用的myc-标签，在facs中分析所有非冗余克隆的pe与mp2x7-hek293细胞的直接结合。将10倍稀释的pe用在0.1mlpbs/10％fcs中的0.5μg抗-mycfitc-缀合的抗体(abdserotec,货号mca2200f)(产生假-二价纳米抗体，以增加结合强度)在4℃预先温育45分钟。pe稀释液用hek293-mp2x7和未转染的细胞(每种5×10⁵个)的混合物在4℃温育0.5小时，然后漂洗细胞，并且通过流式细胞术检测细胞-结合的荧光。备选地，在与所述细胞温育后，用抗-mycfitc-缀合的抗体进行10-倍稀释的pe的连续染色。对于纳米抗体家族1,2,4,5,25(来自dna/pb文库)和10与11(来自细胞免疫文库)的成员，观察到明显的抗体亲抗原性益处，这表明，这些纳米抗体的表位仍然是假-二聚体化纳米抗体容易接近的。预先温育纳米抗体2c4(家族1)和5a1(家族3)的作用示例在图3.7中。在每个家族中，选择最好的结合剂用于进一步表征。家族6,26-29仅表现出与mp2x7-表达细胞的低结合，甚至在用抗-myc抗体预先温育后，并且因此排除进一步表征。从具有来源于dna和pb文库(家族2,5,15,和25)的独特克隆的家族，至少选择2个代表性的克隆以允许比较dna和pb-来源的克隆。这又将允许确定细胞加强对各个纳米抗体的功效和亲和性的可能的贡献。选择进行进一步表征的纳米抗体的组显示在图3.8和表3.2中。

实施例3.9.生产并纯化mp2x7-特异性纳米抗体。

将所选纳米抗体的编码序列重新克隆到来源于puc119的表达载体中，所述载体包含lacz启动子，卡那霉素抗性基因，多克隆位点和ompa信号肽序列(如实施例2.8所述)。与纳米抗体编码序列符合阅读框地，该载体编码c-端c-myc标签和(his)6标签。以250ml培养体积在大肠杆菌tg-1细胞中进行表达，表达为c-myc,his6-标记的蛋白。表达通过加入1mmiptg诱导并且允许在37℃持续3小时。在离心细胞培养物后，通过冻融沉淀物并且重悬在dpbs中而制备周质提取物。这些提取物用作使用histrapff粗制柱(gehealthcare(ge卫生保健),uppsala,瑞典)的固定化金属亲和层析(imac)的起始物质。用250mm咪唑从柱上洗脱纳米并且随后用dpbs脱盐。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)验证所有纳米抗体的纯度和完整性，而标签的存在通过使用检测用抗-his抗体进行蛋白质印迹法验证。

实施例3.10.没有一种小鼠p2x7纳米抗体与人p2x7或p2x4交叉反应。

在facs中使用稳定表达mp2x7的cho细胞分析纯化的纳米抗体的浓度依赖性mp2x7结合。制备在1.2um-6.7pm范围内的纳米抗体连续稀释液，并用在补充了10％fbs(facs缓冲液)的0.1mldpbs中的2×10⁵个细胞在4℃温育0.5小时。接着，将细胞洗涤三次，并且用小鼠抗-myc(serotecmca2200)和用抗-小鼠igg-pe(jacksonimmunoresearchlaboratories(杰克逊免疫研究实验室)115-115-164)顺序染色而检测结合的纳米抗体。使用大鼠hano43抗体杂交瘤上清作为阳性对照，其通过抗-大鼠igg-pe(jacksonimmunoresearchlaboratories(杰克逊免疫研究实验室)112-116-143)显现。结果显示在图3.8中。使用不相关对照纳米抗体获得的最大mcf值在314-355(浓度为1.2μm-6.7pm)范围内。对于纳米抗体7d5(家族14),13a7(家族22)和7e2(家族3),ec50值分别为3,3.4和4.3nm。对于所有其它检测的纳米抗体,没有获得s型曲线，并且因此没能确定ec50值(图3.8)。应该注意，最强结合的纳米抗体全部来源于用hek293-p2x7细胞免疫的三头美洲驼。对于所有纳米抗体，证实特异性结合，除了2c4,20a11和13f6之外，对于它们没有检测到高于600的mcf值。

其次，通过分析与表达p2x7的人直向同源物的hek293细胞和表达hp2x4(p2x嘌呤受体家族的另一个成员)的cho细胞的交叉反应性结合，而确定所有24个家族的纳米抗体的特异性(等purinergicsignal(嘌呤能信号)3:359-366,2007)。按照实施例3.7所述的相同步骤，不同的是不包括未转染的hek细胞，将250ng的每种纳米抗体(终浓度147nm)用抗-myc-fitc缀合的抗体预先温育。使用抗体l4(特异性针对hp2x7,buell等.blood(血液)15:3521-3528)和cr29(特异性针对hp2x4,等purinergicsignal(嘌呤能信号)3:359-366,2007)作为阳性对照，而包括不相关的纳米抗体作为阴性对照。没有发现一种纳米抗体结合hp2x7-hek293或表达hp2x4的cho细胞。尽管有从用h和mp2x7免疫的美洲驼分离了一些纳米抗体(家族5,7,16,和17)的事实，但是这些中无一与hp2x7交叉反应。

实施例3.11.鉴定增强或阻断mp2x7受体功能的纳米抗体。

分析所有来自24个不同家族的纯化的纳米抗体调控mp2x7嘌呤受体功能性活性的能力。通过细胞外atp(直接激活)或nad-依赖性adp-核糖基化(间接激活)而发生p2x7的活化，并且导致钙释放，磷脂酰丝氨酸暴露和cd62l释放，最终导致细胞程序性死亡(scheuplein等.2009,j.immun.(免疫学杂志)182(5):2898-908)。配体诱导的cd62l-释放用来确定纳米抗体是否能够干扰mp2x7功能。

在第一种方法中，将5×10⁵个yac-1细胞(内源性表达mp2x7)在rt下在补充了10％fbs的rpmi中用单一浓度的纳米抗体(5μg,终浓度为2μm)温育15分钟。随后，通过加入atp至终浓度100μm，或加入nad至终浓度20μm，然后将细胞混悬液在37℃进一步温育20分钟，而激活p2x7离子通道。先前的滴定实验表明，这些配体浓度诱导最大的cd62l-胞外结构域裂解。洗涤细胞，并且在facs中使用抗-cd62l-pe缀合的抗体(bdpharmingen,货号553151)检测细胞表面cd62l的存在。cd62l-阳性染色的细胞的百分数视为是关于p2x7功能调控的测量。没有包括纳米抗体或不相关的纳米抗体作为对照，这导致80-98％的细胞的cd62l-释放，即，2-20％保持为cd62l阳性，这取决于配体和个体实验。当保持为cd62l阳性的细胞的百分数是用不相关纳米抗体获得的值的3倍以上时，认为该纳米抗体是mp2x7阻断剂。10种纳米抗体，代表7个家族(家族5,7,11,16,19,22,和23),阻断atp和nad二者诱导的cd62l释放，其中家族7中的两种纳米抗体仅高于阈值。此外，属于家族16和19的两种纳米抗体似乎阻断nad-诱导的而不是atp-诱导的反应，这表明这些可能选择性靶向mp2x7上的nad-依赖性adp-核糖基化位点(adriouch等.fasebj22:861-869,2008)。为了在atp和nad介导的cd62l释放测定中证实抑制性能力，以及排列纳米抗体阻断功效，在两个平行实验中在连续稀释液中检测这10种纳米抗体中的9种。代表性实例显示在图3.9中。在两种配体介导的测定中可以证实所有阻断剂对p2x7功能的抑制，并且ic50值显示在表3.2中。这表明，没有证实针对家族19纳米抗体13b5的nad-选择性。基于阻断功效，纳米抗体可以排列如下：13a7>8g11,13g9,8g12>7h6>13b5,8f5>8c7,8e7。

为了验证纳米抗体本身能否激活mp2x7通道，还用2μm纳米抗体温育细胞，而没有进行随后的配体处理。所检测的单价纳米抗体中没有一种能够直接激活mp2x7。然而，对于某些纳米抗体，在核苷酸处理后观察到cd62l胞外结构域释放的增加，这表明这些克隆可以促进mp2x7的选通(gating)。使用亚最佳配体浓度验证atp-和nad-诱导的p2x7激活的增强：对于atp低于100μm，并且对于nad低于20μm。将yac-1细胞用固定浓度的纳米抗体(2μm)处理，并且接着用增加浓度的atp(1-2700μm)或nad(1-540μm)刺激。在atp的情形中，发现3种纳米抗体明显增强cd62l的释放，其功效次序如下：14d5>4b4＝7d6(图3.10)。对于nad，增强较不明显。

还在相同的测定中检测了阻断纳米抗体(以固定浓度的纳米抗体相对于增加浓度的配体)。在所检测的最高nad浓度(540μm)，大部分阻断剂仍然最大程度抑制裂解，例外的是13b5和8f5，其达到约60％抑制的平台(图3.10)。基于用atp获得的滴定曲线，可以做出阻断剂的下述排列：13a7,13g9,7h6>8g11,8g12>8f5,13b5(表3.2)。比较3个家族5种纳米抗体，来源于pb文库的两个克隆(8g11和8g12)是优于来源于dna文库的克隆(8f5)的阻断剂。

从所有三种全体成员‘dna’,‘pb’或‘细胞’鉴定调节受体的纳米抗体(阻断剂和增强剂)，其中从‘细胞’文库鉴定功效最强的阻断剂，即13a7,(在atp和nad测定中ic50s分别为6nm和11nm)。相反，功效最强的增强剂，即14d5，是从‘dna’文库鉴定的。

实施例3.12.具有提高的受体调控功效的多价纳米抗体。

由功能阻断纳米抗体13a7(家族22,细胞)和8g11(家族5,pb),以及由部分激动剂14d5(家族17,dna)产生二价纳米抗体构建体，其由通过35个氨基酸的glyser接头连接的两个相同的纳米抗体序列的头-尾遗传融合体组成。通过使用包括特定限制性位点的不同引物组进行独立的pcr反应(一种用于n端，一种用于c端纳米抗体亚单位)制备构建体。使用来源于puc119的表达载体，其包含lacz启动子，卡那霉素抗性基因和ompa信号肽序列。在紧跟信号肽下游存在多克隆位点以用于纳米抗体插入，接着是35gly-ser接头编码dna序列和用于克隆第二纳米抗体序列的第二多克隆位点。与所产生的纳米抗体-35gly-ser-纳米抗体编码序列符合阅读框地，该载体编码c-端c-myc标签和(his)6标签。在验证核苷酸序列后，表达并且纯化所有三种二价mp2x7纳米抗体构建体。在大肠杆菌tg1细胞中进行生产，然后利用imac通过该his-标签从周质级分中纯化，并且脱盐，基本上如实施例3.9所述进行。

通过测量以亚最佳核苷酸浓度(33μmatp,1.5μmnad)的cd62l-胞外结构域释放的增强，来比较单价和二价14d5在增强mp2x7活性中的功效，其中在yac-1细胞中不发生胞外结构域释放(如实施例3.11所述)。关于atp诱导的释放，二价14d5相对于单价14d5的功效增加约为220-倍(ec50为0.1vs.22.6nm)，并且关于nad为40-倍(ec500.06vs.4.1nm)。在不存在配体的条件中，单价和二价14d5都不能诱导p2x7的选通。

如图3.11所示，在100μmatp和20μmnad分别确定两种阻断纳米抗体13a7和8g11的功效。13a7和8g11的二价体在纳摩尔以下范围内具有针对atp和nad二者的功效。二价13a7相对于单价13a7的功效增加仅是中度的，在nad的情形中为23倍增加，在atp-诱导的释放情形中是9-倍增加(对于atpic50二价为0.1nm,和对于nad为0.3nm)。对于8g11，单价-到二价的功能增加要强得多，为146-倍(nad)和84-倍(atp)(对于atpic50二价为0.2nm,对于nad为0.52nm)。

实施例3.13.针对mp2x7三聚体上不同表位的纳米抗体绘图。

最近公布了斑马鱼嘌呤受体p2x4的晶体结构(kawate等.2009.nature(自然)460:592-598)。基于可获得的p2x4结构(pdb3i5d和pdb3h9v，分辨率分别为3.5和),使用同源性建模软件(modelerbuiltindiscoverystudio,accelrys)建立关于mp2x7的模型。斑马鱼p2x4和mp2x7之间的序列同一性包括在细胞外区域的49％。首先，将小鼠p2x7的序列与已知的p2x4结构的序列进行比对。序列比对关心在这两种序列之间的缺口的正确定位和保守二硫键的正确定位。其次，使用已知的p2x4结构的3d坐标来预测未知的mp2x7的那些3d坐标。概率密度函数(pdf)描述了对几何特征的限制，并且用来评价该3d模型。在表现出与mp2x7wt相似水平的细胞外mp2x7表达的现有的mp2x7精氨酸突变体组中，选择了7个突变体(adriouch等.2008,fasebj22:861-869,schwarz等.purinergicsignal(嘌呤能信号)5:151-161,2009)。按照所产生的模型，这7个突变体在mp2x7分子上呈现6个结构上分散的区域；突变体r125a(位点i；对于nad介导的核糖基化很重要的r125残基),r294a(位点i；对于atp结合很重要的位于缝隙的残基),r206a(位点ii；位于两个mp2x7相互作用单体的界面附近的获功能突变体(gain-of-functionmutant))；r151a(位点iii；对于结合抗-mp2x7mabhano44很重要的残基；adriouch等2008,fasebj22:861-869)；r178a(位点iv)；r230a(位点v)；r53k(位点vi；位于两个mp2x7相互作用单体的界面处跨膜结构域附近的残基)。为了确定纳米抗体与mp2x7的结合能否被这些替换影响，评价了代表不同家族的24种纯化的纳米抗体与未转染的hek293细胞或用wt或突变mp2x7受体瞬时转染的hek293细胞的结合。对于流式细胞术测定，通过抗-myc和随后的山羊抗-小鼠-pe缀合物进行纳米抗体检测，而通过用大鼠单克隆hano43而后二级抗-大鼠-pe缀合物染色而获得对p2x7表达密度的估测。在通过减去与hek293细胞的背景结合、标准化不同瞬时转染体(wtmp2x7和7个突变体)的表达密度后，计算1μm的不同纳米抗体的残余结合。

仅对6种纳米抗体检测到>90％的结合减少，其全部针对突变体r151a:纳米抗体7h6(细胞,415,fam11),7d5(细胞,415,fam14),6b7(pb,405,fam16),7e2(细胞,413,fam3),8g11(pb,418,fam5),8g12(pb,418,fam5)。这暗示，所有其它纳米抗体均不很重要地依赖于arg151进行结合，或者是因为它们结合独立的区域，或者是因为这些纳米抗体不结合在它们足迹内的arg残基。如预测的，mp2x7特异性大鼠抗体hano44没有表现出针对r151a突变体的任何结合。

实施例3.14.‘dna’全体成员的平均功效与‘pb’的平均功效相当，但是低于‘细胞’全体成员的平均功效。

仅从‘dna’和‘pb’文库中鉴定了4个家族。我们相对于最紧密相关的美洲驼v-种系序列(包括fr1-fr3)评估特定纳米抗体家族中的每个变体的体内成熟，如实施例2.10所述，并且比较纳米抗体变体功效(表3.3)。对于家族2,5,15和25,相对于亲本v-基因种系序列，‘pb’来源的纳米抗体表现出平均19.5,16.5,10和14个aa突变，而对于来源于‘dna’文库的纳米抗体分别为19.5,17,10.3和15个，这证明‘dna’和‘pb’来源的纳米抗体的相等的突变。当比较dna和pb来源的家族成员的cdr3区序列时，仅对于家族5和25观察到相对于dna序列的pb的多样性增加。

表3.3.体内成熟的纳米抗体相对于亲本v-种系序列的遗传距离。

¹任何变化，包括缺失或添加，被考虑用来计算突变数目。

分别来源于‘dna’,‘pb’和‘细胞’全体成员的20,37和29种纳米抗体变体的平均吸附比率(elisa)分别为13,13和26(图3.12)，这表明‘细胞’来源的纳米抗体关于该靶标的优越性。这些观察还反映在单克隆纳米抗体水平上，因为功效最强的结合剂(13a7,7d5和7e2,实施例3.10)和功效最强的结合剂(13a7)从‘细胞’全体成员中鉴定。然而，当考虑个体家族时，对于家族5(而不是其它的)，相对于dna全体成员，观察到pb平均功效的明显增加(23vs18吸附比率，和95vs.66平均荧光强度facs)。这表明，在该家族中，亲和力成熟作为细胞加强的结果而发生。在其余3个家族中，细胞加强没有提高功效。然而，在功能纳米抗体的全体成员的排列中，功效最强的增强剂14d5来源于dna全体成员，而次最佳的阻断剂来源于pb全体成员的家族5。两个家族都从美洲驼418中鉴定，其是在dna免疫后表现出最强hcab介导的血清反应的美洲驼(图3.4b)。

实施例3.15.使用靶标混合物进行基因免疫允许鉴定对每种单个靶标特异性的纳米抗体。

对杂种动物如美洲驼的免疫导致在个体动物之间高度可变的靶标特异性体液反应幅度。这种作用在用包含多个跨膜结构域的低免疫原性细胞表面表达的受体(如gpcrs和离子通道)的基因免疫后甚至更加明显(实施例2.4和3.1)。预测可检测的hcab介导的靶标特异性反应将至少提高发现效率。因此，用任何类型(细胞结合的和非细胞结合的分子)的靶标混合物基因免疫杂种动物将是有利的：更多数目的动物增加鉴定更多靶标响应剂(高幅度)的机会，而不会增加供给负担。作为混合物dna疫苗接种的实施例，我们用小鼠和人来源的两种离子通道p2x7免疫两头美洲驼(405和418)，如实施例3.2所述。由于小鼠和人p2x7之间的氨基酸同一性充分不同(80.5％序列同一性)，并且所有小鼠p2x7鉴定的纳米抗体缺乏与人p2x7的交叉反应性(实施例3.10)，因此，小鼠和人p2x7可以用作相关的靶标实例来证明混合物基因免疫方法。

为了鉴定hp2x7特异性纳米抗体，进行基于细胞的选择，来富集hp2x7特异性纳米抗体，基本上与实施例3所述。在来自美洲驼405和418每头的汇集的‘dna’(pbl1+2)和‘pb’(pbl2+pbl3+ln)文库上进行选择，以保持所有的多样性，但是保持每头动物文库分开。将稳定的hp2x7转染的yac-1细胞和hp2x7-art2.2-转染的cho细胞分别用于第一轮和第二轮选择。在第二轮选择后，富集计算为从hp2x7转染的细胞洗脱的噬菌体的数目与未转染的cho细胞洗脱的噬菌体的数目之间的比率。对于来自美洲驼405和418的文库，富集分别为15-和7-倍，这表明hp2x7纳米抗体的存在，并且表明针对两种离子通道的纳米抗体的成功鉴定。

用hp2x7选择后的噬菌体输出感染大肠杆菌tg1后，挑取个体克隆，并且如实施例1.4所述制备周质提取物。周质提取物用来通过流式细胞术确定针对人p2x7的特异性，与关于小鼠p2x7相似进行(实施例3.5)。表现出在hp2x7转染的细胞系(诸如cho或hek293)上的明显染色但不高于在用小鼠p2x7转染的同样的亲本细胞系或相同的未转染wt细胞系的背景的周质提取物被认为是针对hp2x7特异性的。使用纯化的纳米抗体，通过与确定ec50s相同的方法，以剂量-依赖性方式证实hp2x7特异性。

实施例4.1.在使用helios基因枪基因免疫美洲驼后诱导体液cxcr7特异性血清滴度。

选择趋化因子受体cxcr7作为第二gpcr实例来鉴定基因免疫后的靶标特异性纳米抗体。将编码人cxcr7的cdna克隆在pvax1中，并且纯化质粒dna，如实施例2.1所述。转染后，pvax1-cxcr7构建体表现出在细胞表面的天然cxcr7表达，这通过按照与实施例2.2所述的方法相似的检测方法进行的cxcr7转染的相对于亲本wt细胞的差异性染色而证实(数据未显示)。

将4头美洲驼(391,395,396和397)通过皮内喷射注射免疫，如实施例2.4所述。在第4次dna免疫后42-56天实施单次2x10⁷个细胞caki/hcxcr7注射。3头美洲驼(385,387和404)用4次14天时间间隔的2x10⁷个稳定转染的cxcr7/hek293细胞的注射免疫。如实施例2.4所述相似，用免疫前和在dna疫苗接种后和单次细胞加强后的免疫血清，确定cxcr7特异性血清igg滴度。7头美洲驼中没有一头在两种免疫方案后表现出cxcr7特异性体液反应。

在另一个免疫实验中，4头美洲驼(434,439,441和444)用helios基因枪基因免疫，如实施例3所述。简言之，以2周时间间隔施用4个剂量的dna(每剂量24次发射)，然后进行caki转染的cxcr7细胞(2e7个细胞)的单次细胞加强。在第4次dna施用后8天从每头美洲驼收集一份免疫前血样，并且在单次细胞加强后8天从每头美洲驼收集最后一份血样，并且通过facs确定靶标特异性血清滴度，如实施例2.4所述。与检测的所有稀释液的免疫前水平相比，在4头免疫的美洲驼中，使用关于cxcr7-转染的hek293细胞的‘dna’和细胞加强后血清样品，仅一头美洲驼(444)表现出中等但是持续增加的mcf。平行地，将4头美洲驼(435,436,437,440)通过4次以2周时间间隔进行的细胞注射(每次注射2×10⁷个细胞)用cxcr7-转染的caki细胞免疫。与美洲驼444相反，后4头美洲驼无一表现出可检测的cxcr7血清滴度。

实施例4.2.在不存在可检测的cxcr7特异性血清转换的条件下，鉴定靶标特异性纳米抗体。

从在基因免疫和在细胞加强后(分别为dna和pb全体成员)从每头美洲驼391,395,396和397收集的免疫组织构建文库。从细胞免疫的美洲驼385,387和404构建三个其它的文库。文库的概述总结在表4.1中。如先前所述(实施例2.6)，使用全部11个文库对10(第1轮和第2轮选择)和1(第2轮选择)个单位的cxcr7膜小泡进行噬菌体展示选择。筛选来自所有第2轮选择输出的853个克隆(每个文库31-155个个体克隆)；结果总结在表4.1中。使用由1ml培养物制备的噬菌体上清的10-倍稀释液，通过关于2个单位的cxcr7膜小泡的噬菌体elisa来确定cxcr7特异性。234种纳米抗体被认为是cxcr7特异性的,相对于未转染的对照膜小泡，其表现出关于hcxcr7膜小泡的最低2-倍增加的elisa。每头动物和全体成员的第2轮击中率总结在表4.1中，在4-61％范围内。基于按照不同免疫策略的第2轮选择输出的平均击中率，关于‘dna’,‘pb’和‘细胞’全体成员，发现效率分别计算为29,28和26％(图4.2)。甚至在不存在可检测的针对cxcr7的hcab滴度的条件下，从所有免疫策略(dna,pb,细胞)鉴定靶标特异性纳米抗体。将所有234种cxcr7特异性纳米抗体测序，并且去除冗余纳米抗体(相同的aa序列)。这导致鉴定出78种独特的序列，其属于46个不同的纳米抗体b细胞谱系(表4.1)。在一个家族内鉴定的变体(最少1个aa残基不同)的数目在1-12范围内。分别地，在细胞免疫(385,387,404)后，每头美洲驼鉴定的cxcr7特异性纳米抗体家族的平均数目为5.3，并且通过dna免疫(dna+细胞加强；391,395,396,397)为7.5，这表明，对于该靶标，与通过细胞免疫获得的多样性相比，基因免疫(dna+pb)导致更高的纳米抗体家族多样性。

表4.1.cxcr7特异性纳米抗体家族的发现总结。

为了鉴定受体功能介导的纳米抗体，使用cxcr7/hek293膜提取物，以关于cxcr4所述(实施例2.7)类似地，进行sdf-1配体置换测定。认为在与cxcr7/hek293膜提取物的残余[¹²⁵i]-sdf-1结合中表现出明显减少的纳米抗体是配体竞争剂。评分为配体置换剂的纳米抗体家族的数目示例在表4.1中，这表明与免疫策略(表示为dna,pb和细胞的全体成员)无关，鉴定配体竞争性纳米抗体。

实施例4.3.基因免疫后进行细胞加强产生不同的纳米抗体全体成员。

从美洲驼391,395,396和397,鉴定了29个cxcr7特异性纳米抗体家族，其由55个纳米抗体序列变体组成(在测序的234个中)。在美洲驼396的dna和pb全体成员中可以鉴定包含最少1个相同变体的2个家族，这与实施例2(cxcr4)和3(p2x7)的发现相反。这29个家族中仅有2个(7％的总家族多样性)，由‘dna’和‘pb’文库鉴定属于同一家族的纳米抗体变体(表4.1和图4.3)，这也表明在dna疫苗接种(dna)或细胞加强(pb)后的纳米抗体成员是不同的。仅基因免疫导致不同的纳米抗体全体成员，这表明在细胞加强后全体成员中的一部分没有鉴定到或者丢失。