一种生物活性肽Gly‑Leu‑Pro‑Asn及其制备与应用的制作方法

本发明涉及蛋白领域，尤其是涉及一种生物活性肽gly-leu-pro-asn及其制备与应用。

背景技术：

生物活性肽(bioactivepeptides，bap)是一类具有多种生物学功能、对动物机体的生命活动有益的肽类化合物。食物中的蛋白质在被动物消化吸收利用过程中，会变为多肽或者游离的氨基酸，通过小肠上皮细胞的吸收转运直接进入动物的血液循环。在这些多肽中，有一部分具有特殊的生理功能，例如促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等功能，被称为“生物活性肽”。生物活性肽是一种极具应用前景的功能物质，因此，也是当前国际食品界最热门的研究课题。

免疫活性肽是继阿片肽发现后首次从乳蛋白中获得并证明其生理活性的一类生物活性肽。1981年jolles等人首次发现，利用胰蛋白酶水解人乳蛋白，可以得到一个氨基酸序列为val-glu-pro-ile-pro-tyr的六肽，体外实验证明该肽能够增强小鼠腹腔巨噬细胞对绵羊红细胞的吞噬作用。migliore-samour等人发现来自酪蛋白的六肽thr-thr-met-pro-leu-trp能够刺激绵羊血红细胞对小鼠腹膜巨噬细胞的吞噬作用以及增强对于肺炎克雷伯菌的抵抗。李素萍等人用合成的乳源免疫调节肽(pgpipn)饲喂大鼠发现大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬作用和红细胞相关的免疫调节功能有显著的增强。

研究表明，免疫活性肽不仅能够调节机体免疫力，刺激机体淋巴细胞的增殖，增强巨噬细胞的吞噬功能，促进细胞因子的释放、提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，而且不会引起机体的免疫排斥反应。

目前关于生物活性多肽的研究有很多，比如中国专利cn105254738a公布了一种来源于β-酪蛋白的乳源性生物活性多肽delqdkih，中国专利cn105254739a公布了一种来源于αs1-酪蛋白的乳源性生物活性多肽gtqytd，中国专利cn105254740a公布了一种来源于αs2-酪蛋白的乳源性生物活性多肽nqfyqkf。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了提供一种生物活性肽gly-leu-pro-asn及其制备与应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明第一方面，提供一种生物活性肽，其氨基酸序列为gly-leu-pro-asn(简写表达形式为glpn)，见seqidno：1。

较优的，所述生物活性肽具有促进机体免疫力活性或调节机体免疫力的功能。

本发明第二方面，提供一种编码所述生物活性肽gly-leu-pro-asn的核苷酸片段，所述核苷酸片段的序列如seqidno：2所示。

本发明第三方面，提供所述生物活性肽gly-leu-pro-asn的制备方法，包括采用化学合成的方法合成所述生物活性多肽glpn。

本发明第四方面，提供所述生物活性肽gly-leu-pro-asn的应用。本发明所述生物活性肽具有促进机体免疫力活性或调节机体免疫力的功能。因此，本发明提供了前述生物活性肽在制备具有提高机体免疫力的食品或者保健品以及提高机体免疫力药物中的应用。

本发明第五方面，提供提高机体免疫力的药物、食品或保健品，其包含所述生物活性肽gly-leu-pro-asn或所述生物活性肽gly-leu-pro-asn的衍生物。

所述生物活性肽gly-leu-pro-asn的衍生物，是指在多肽的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。

与现有技术相比，本发明的生物活性肽glpn具有较好的促进机体免疫力的生物活性；本发明的生物活性肽glpn能够调节机体免疫力，增强淋巴细胞和巨噬细胞的体外增殖能力，促进巨噬细胞一氧化氮诱生量增加，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，而且不会引起机体的免疫排斥反应，对开发具有调节免疫功能的乳制品和保健品具有十分重要的意义。

附图说明

图1：质量色谱图；

图2：一级质谱图；

图3：分子式分析图。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1生物活性肽的合成

一、生物活性肽的合成

1.称取rink树脂3g(取代度0.3mmol/g)于150ml的反应器中，用50ml的二氯甲烷(dcm)浸泡。

2.2小时后，用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(dmf)洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用。

3.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/dmf＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的fmoc保护基团。脱完保护后用3倍树脂体积的dmf洗涤四次，然后抽干。

4.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检a、检b各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。

5.称取氨基酸gly适量和1-羟基-苯骈三唑(hobt)适量于50ml的离心管中，加入20ml的dmf将其溶解，然后加入3ml的n,n二异丙基碳二亚胺(dic)振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。

6.2小时后，用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐:diea:dcm＝1:1:2,v:v；v)半小时，然后用3倍树脂体积的dmf洗涤四次，抽干待用。

7.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/dmf＝1:4，v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的fmoc保护基团。脱完保护后用dmf洗涤四次，然后抽干。

8.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检a、检b各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。

9.称取后面第二个氨基酸适量和hobt适量于50ml的离心管中，加入25ml的dmf将其溶解，然后加入2.5ml的dic振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。

10.1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测(检a、检b各两滴，100℃反应1min)，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。

11.待反应完全后，用dmf洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/dmf＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的fmoc保护基团。脱完保护后用dmf洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。

12.按照步骤9-11依次接上氨基酸leu、pro、asn。

13.待接上最后一个氨基酸后，脱去保护，用dmf洗涤四次，然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3，异丙基硅烷:水＝95:2:2:1,v:v:v:v)将多肽从树脂上切割下来(每克树脂加10ml切割液)，并用冰乙醚(切割液：乙醚＝1:9，v:v)离心沉降四次。

至此，人工合成了生物活性肽glpn。

二、生物活性肽的确认

1)uplc分析

uplc条件如下：

仪器：watersacquityuplc超高效液相-电喷雾-四级杆-飞行时间质谱仪

色谱柱规格：behc18色谱柱

流速：0.4ml/min

温度：50℃

紫外检测波长：210nm

进样量：2μl

梯度条件：a液：含有0.1％甲酸(v/v)的水，b液：含有0.1％甲酸(v/v)的乙腈

2)质谱分析

质谱条件如下：

离子方式：es+

质量范围(m/z)：100-1000

毛细管电压(capillary)(kv)：3.0

采样锥(v)：35.0

离子源温度(℃)：115

去溶剂温度(℃)：350

去溶剂气流(l/hr)：700.0

碰撞能量(ev)：4.0

扫描时间(sec)：0.25

内扫描时间(sec)：0.02

根据以上分析方法，利用超高效液相-电喷雾-四级杆-飞行时间质谱，对生物活性肽glpn进行色谱分析和质谱分析，其质量色谱图如图1所示，提取此峰的一级质谱图如图2所示，由图可得此峰的多肽质荷比为400.22da，保留时间是1.54min。

分别对图2一级质谱图中出现的2个峰230.1141da和400.2193da进行元素分析，经过单质量分析和单一同位素质量，偶电子离子分析后，可以得出230.1141da峰对应的分子式为c9h16n3o4，和碎片肽段pn的y离子一致；400.2193da峰对应的分子式为c17h30n5o6，和肽段glpn的一致。分子式分析图如图3所示，可以得出分子量为399.21da，质荷比为400.21da的多肽片段的分子式为c17h29n5o6，氨基酸序列为gly-leu-pro-asn(glpn)，记为seqidno：1。

实施例2生物活性肽glpn促进机体免疫力活性实验

一、mtt法测定生物活性肽glpn的体外巨噬细胞增殖能力实验

1.实验试剂及仪器

试剂：

实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)，由上海交通大学农业与生物学院动物实验中心提供；

生物活性肽glpn，采用实施例1中人工合成的方法得到；

3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(mtt)，来自于amresco公司；

lps(脂多糖)，来自于sigma公司；

牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，bsa)，来自于genebase公司；

三联溶解液，含10％sds、5％异丁醇(v/v)以及0.012mol/lhcl的水溶液。

仪器设备：

lrh-250f生化培养箱，来自于上海恒科技有限公司；

gl-22m高速冷冻离心机，来自于上海卢湘仪离心机仪器有限公司；

heracell150co2培养箱，来自于heraeus公司；

dragonwellscanmk3酶标仪，来自于labsystems公司。

2.试验方法：

balb/c小鼠腹腔注射2ml的2％(w/w)灭菌淀粉溶液，连续注射三天，最后一次注射24小时后断颈处死。剥去腹部皮肤，用注射器吸取4℃磷酸盐缓冲液(pbs)反复冲洗腹腔，离心管收集冲洗液后，离心(1000rpm，4℃)10分钟后弃上清，用4℃rpmi1640完全培养液(含10％fbs)(v/v)洗涤两次，0.2v/v％台盼蓝溶液染色做细胞活力检测，确认采集到的有活力巨噬细胞占95％以上。细胞计数板读数后，调整细胞浓度至2×10⁵个/ml。

将已吹打至完全悬浮的细胞悬液以100μl/ml加入96孔细胞培养板，37℃、5％co2环境下培养4小时后，吸弃孔中液体，用37℃rpmi1640完全培养液小心清洗细胞培养板孔底，洗去未贴壁的细胞和细胞碎片，得到纯化后的贴壁腹腔巨噬细胞。每孔加入0.2mlrpmi1640完全培养基，实验用小肽样品及lps事先溶解于培养基后加入，开始细胞培养。

加入细胞个数为2×10⁵/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含生物活性肽glpn(100，500，1000μg/ml)的rpmi1640完全培养液(10％fbs)(v/v)200μl/孔，设置阴性对照组(500μg/mlbsa)和空白组连续培养48小时，炎症组在24小时时加入lps至终浓度100ng/ml。44小时时加入5％mtt20μl/孔，达到48小时后加入100μl/孔的三联溶解液以终止培养，隔夜溶解后，在波长570nm下用酶标仪测各孔的吸光度值(od570)，生长指数(growthindices)的计算公式如下：

其中，空白组为不施加小肽和bsa的细胞处理组，bsa组为阴性对照。

3.实验结果

实验结果见表1，在实验组中生物活性肽glpn的添加浓度分别为50、100μg/ml。在正常组中，和阴性对照组相比，在浓度为100μg/ml时，具有极显著差异(p<0.01)。说明生物活性肽glpn具有促进巨噬细胞增殖的能力，能够有效提高机体的非特异性免疫能力。

表1生物活性肽glpn对体外巨噬细胞增殖的影响

注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(p＜0.05)；**，与阴性对照组比较，有显著性差异(p＜0.01)

二、生物活性肽glpn的促巨噬细胞一氧化氮分泌量实验(griess法)

1.实验试剂及设备

试剂：

实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)，由上海交通大学农业与生物学院动物实验中心提供；

合成多肽glpn(由上海强耀生物技术有限公司合成)；

lps，来自于sigma公司；

一氧化氮检测试剂盒，来自于碧云天生物技术研究所。

仪器设备：

lrh-250f生化培养箱，来自于上海恒科技有限公司；

gl-22m高速冷冻离心机，来自于上海卢湘仪离心机仪器有限公司；

heracell150co2培养箱，来自于heraeus公司；

dragonwellscanmk3酶标仪，来自于labsystems公司。

2.试验方法

加入细胞个数为2×10⁶/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含肽的rpmi1640完全培养液(含10％fbs)(v/v)200μl/孔，设置不加小肽的细胞空白组。炎症组在24小时时加入lps至终浓度1μg/ml，连续培养48小时后，收集培养液上清50μl/孔，在培养液上清中依次添加griess试剂1和griess试剂2各50μl/孔，室温反应10分钟后，在540nm波长下测定吸光度值(od540)。

3.实验结果

实验结果见表2，与细胞空白相比，正常组在glpn浓度为500μg/ml时具有显著性差异(p＜0.05)，说明glpn具有促进巨噬细胞诱导一氧化氮分泌的能力，能够有效促进巨噬细胞的免疫能力。

此外，一氧化氮作为炎症严重程度的指标之一，在炎症组中，最高浓度到达500μg/ml的glpn也未引起一氧化氮分泌量的显著性增加，说明在lps引起的炎症状态下，glpn不会进一步加重炎症的程度，体现了一定的安全性。

表2生物活性肽glpn对巨噬细胞一氧化氮诱生量的影响

注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(p＜0.05)；**，与阴性对照组比较，有显著性差异(p＜0.01)

三、glpn的促巨噬细胞吞噬中性红能力实验

1.实验试剂及设备

试剂：

实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)，由上海交通大学农业与生物学院动物实验中心提供；

合成多肽glpn(由上海强耀生物技术有限公司合成)；

lps，来自于sigma公司；

中性红染色液，来自于碧云天生物技术研究所。

仪器设备：

lrh-250f生化培养箱，来自于上海恒科技有限公司；

gl-22m高速冷冻离心机，来自于上海卢湘仪离心机仪器有限公司；

heracell150co2培养箱，来自于heraeus公司；

dragonwellscanmk3酶标仪，来自于labsystems公司。

2.试验方法

加入细胞个数为2×10⁶/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含肽的rpmi1640完全培养液(10％fbs)(v/v)200μl/孔，炎症组在24小时时加入lps至终浓度10μg/ml，连续培养48小时后，吸弃细胞培养液。pbs清洗孔底后加入37℃的中性红染液80μl/孔，10分钟后吸弃染液，用pbs清洗两次后，每孔加入150μl细胞裂解液(冰醋酸：无水乙醇＝1:1，v/v)。4℃隔夜溶解后，在波长540nm下测定吸光度值(od540)。

3.实验结果

实验结果见表3，作为巨噬细胞免疫作用中最直观的一项，中性红染料的吞噬实验结果说明了在一定浓度的glpn作用下，巨噬细胞确实在吞噬外源性物质的能力上获得了提高，这有助于提高机体的天然免疫能力，清除可能的侵入机体的病原性微生物。

表3生物活性肽glpn促巨噬细胞吞噬中性红能力的测定

注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(p＜0.05)；**，与阴性对照组比较，有显著性差异(p＜0.01)

四、glpn的促巨噬细胞分泌细胞因子的实验(elisa法)

1.实验试剂及设备

试剂：

实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)，由上海交通大学农业与生物学院动物实验中心提供；

合成多肽glpn，由上海强耀生物技术有限公司合成；

lps来自于sigma公司；

一氧化氮检测试剂盒、细胞因子elisa试剂盒(tnf-α、il-1β和il-6)，来自于武汉博士德生物工程有限公司。

仪器设备：

lrh-250f生化培养箱，来自于上海恒科技有限公司；

gl-22m高速冷冻离心机，来自于上海卢湘仪离心机仪器有限公司；

heracell150co2培养箱，来自于heraeus公司；

dragonwellscanmk3酶标仪，来自于labsystems公司。

2.试验方法

加入细胞个数为2×10⁶/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含肽的rpmi1640完全培养液(10％fbs)(v/v)200μl/孔，炎症组在24小时时加入lps至终浓度10μg/ml，连续培养48小时，炎症组在培养终止前24小时加入lps至终浓度100ng/ml。培养终止后，离心收集细胞培养液上清液。在已包被细胞因子抗体的酶标板中加入100μl上清液，37℃反应90分钟后，加入生物素标记抗体，37℃反应60分钟，pbs洗涤后，加入亲和素-过氧化物酶复合物，反应30分钟。pbs洗涤后加入显色液，反应20分钟。加入显色终止液后，使用酶标仪在波长450nm下测定吸光度值(od450)。

3.实验结果：

实验结果如表4所示，从表4中可知，在tnf-α、il-1β和il-6这三种细胞因子的实验结果中，tnf-α、il-1β在0.2mg/ml及以上出现了显著性差异(p＜0.01)，il-6在0.5mg/ml出现了显著性差异(p＜0.01)，证明了一定浓度下的glpn可促进小鼠腹腔巨噬细胞活化并释放tnf-α、il-1β、il-6，提高这些细胞因子在正常巨噬细胞静息状态下的底值，从而调节机体的免疫力。

表4生物活性肽glpn对巨噬细胞细胞因子水平影响的测定

注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(p＜0.05)；**，与阴性对照组比较，有显著性差异(p＜0.01)

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

<110>浙江辉肽生命健康科技有限公司

<120>一种生物活性肽gly-leu-pro-asn及其制备与应用

<160>2

<210>1

<211>4

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

glyleuproasn

<210>2

<211>12

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ggtctcccaaat12