专利名称：一种具有抗氧化作用的鹰嘴豆肽及分离纯化方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物活性肽的制备技术领域，涉及一种具有抗氧化作用的鹰嘴豆肽及分离纯化方法及用途。
背景技术：
鹰嘴豆肽是由鹰嘴豆蛋白水解得到的产物，其氨基酸组成与鹰嘴豆蛋白相同，必需氨基酸配比合理、易被人体吸收利用，同时具有比其蛋白更优越的加工特制和功能特性。 鹰嘴豆肽分子量小，易于消化吸收，无蛋白变性、无腥味、易溶于水、在酸性条件下不聚沉、 粘度小、受热不凝固等加工特性，而且还具有降低血清胆固醇含量、促进脂肪代谢、降血压、 抗还原性、迅速缓解疲劳等功能特性。目前已经从鹰嘴豆中分离出了抗菌肽、低致敏性蛋白酶解物、血管紧缩素抑制肽等等。抗氧化肽为生物活性肽的一种，Yoshinori Mine等人认为肽的抗氧化性至少能部分影响其他的生物活性，大量研究已表明肽的抗氧化性与免疫调节、降血压、降胆固醇、类阿片拮抗活性、抗肿瘤等都有一定的联系，可能是其它生理功能的基础。它通过减少氧自由基、羟自由基，从而达到抗衰老的功能。具有生物功能的多肽都是有序结构，都有一定的氨基酸百分比组成、排列顺序及特殊的高级结构。因此，从鹰嘴豆中分离出具有抗氧化性的多肽，并从结构上对其活性进行解析，既对天然抗氧化肽的应用拓宽道路，也为人工合成抗氧化肽奠定坚实的基础，显示出其在医药、食品、饲料等领域应用的优势。凝胶过滤色谱是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物的分子大小来进行分离。分离条件温和、样品回收率高、实验结果重现性高、设备简便经济。质谱法目前被认为是测定小分子分子量最精确最灵敏的方法。近年来，随着各项技术发展，质谱所能测定的分子量范围大大提高。基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱成为测定生物大分子尤其是蛋白质、多肽分子量和一级结构的有效工具。物质的红外光谱具有高度的特征性， 谱图中的吸收峰与分子中各基团的振动形式相对应，可用于研究分子的结构和化学键，鉴别多肽的二级结构，是近年发展起来的一种新型分析测试技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗氧化作用的鹰嘴豆肽。本发明的第二个目的是提供一种具有抗氧化作用的鹰嘴豆肽的分离纯化方法。本发明的第三个目的是提供一种具有抗氧化作用的鹰嘴豆肽的用途。一种具有抗氧化作用的鹰嘴豆肽，用CPe-III表示，所述CPe-III的分子量为 115OTa，氨基酸组成为 Arg-Gln-Ser-His-Phe-Ala-Asn-Ala-Gln-Pro，二级结构以 α -螺旋占 66%。一种具有抗氧化作用的鹰嘴豆肽的分离纯化方法，包括如下步骤(1)将脱脂后的鹰嘴豆粉与水按质量比为1 8-15的比例混合，用NaOH水溶液调 pH = 8. 3，搅拌提取 0. 5-1. 5h，3500r/min-5000r/min 离心 15min_25min，沉淀再按固液质量比为1 3-7的比例提取2-3次，合并上清液，以HCl水溶液调pH= 5.0沉淀蛋白，分离出上清液，将上清液再次用HCl水溶液调pH = 3. 7进行二次沉淀蛋白，弃上清，合并两次沉淀，用去离子水洗涤沉淀2-3次，以NaOH水溶液调pH = 7. 0，搅拌使沉淀复溶，冷冻干燥即为鹰嘴豆清蛋白；(2)将所述鹰嘴豆清蛋白溶解于蒸馏水中制成质量浓度为3-5%的鹰嘴豆清蛋白水溶液；按碱性蛋白酶Alcalase (丹麦NOVO公司)与鹰嘴豆清蛋白的比例为0. 3-0. 4AU/ g，将Alcalase酶放入所述鹰嘴豆清蛋白水溶液中，在pH = 8. 0，反应温度45-55°C的条件下，水解50-70min ；按Flavourzyme复合风味酶(丹麦NOVO公司)与鹰嘴豆清蛋白的比例为50LAPU/g，再加入Flavourzyme酶，pH = 7. 0，反应温度50°C的条件下，水解90_120min ； 将酶解液加热至沸腾，灭酶lOmin，冷却后离心取上清液冷冻干燥即得鹰嘴豆肽粉末；(3)将处理好的葡聚糖凝胶kphdex G-25，装柱1. 6X50cm，用记录仪记录流出液吸光度情况，待蒸馏水洗脱至基线平稳，取鹰嘴豆肽粉末溶解于蒸馏水中后加入到所述葡聚糖凝胶kphdex G-25柱中，以蒸馏水洗脱，流速为0. 61^/1^11，在^Onm处检测洗脱液吸光度，分时段共出现3个洗脱峰，收集第三个洗脱峰液体，冷冻干燥后即得到具有抗氧化作用的用CPe- III表示的鹰嘴豆肽。上述的鹰嘴豆肽在制备抗氧化保健品的用途。本发明的优点在于利用kphdex G-25可以将粗品鹰嘴豆肽中不同分子量的肽段分离开，获得具有抗氧化效果的CPe-III，分离条件温和、样品回收率高、实验结果重现性高、设备简便经济。利用LC/MS，可以对CPe-III进一步分离纯化，并获得相对分子质量和氨基酸组成等信息。最后通过红外光谱对一级结构进行验证，并得出二级结构的信息。可以从结构水平对CPe- III的抗氧化机制进行解析，对天然抗氧化肽的应用开辟道路，也为人工合成抗氧化肽奠定坚实的基础。从鹰嘴豆肽中分离纯化抗氧化肽并测定其结构的方法。该方法过程简单，能耗低， 且产品具有抗氧化的作用，并对抗氧化肽的人工合成提供依据。
图1为鹰嘴豆肽层析图谱。图2为CPe-III液相图谱。图3为CPe- III—级质谱图谱。图4为CPe- III二级质谱图谱。图5为CPe- III的红外光谱图。图6为鹰嘴豆肽各组分还原能力的测定。图7为鹰嘴豆肽各组分清除DPPH自由基的能力。图8为鹰嘴豆肽各组分清除· OH自由基的能力。
具体实施例方式本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，并不能对本发明作任何限制。下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1—种具有抗氧化作用的鹰嘴豆肽的分离纯化方法，包括下述步骤(1)将脱脂后的鹰嘴豆粉与水按质量比为1 10的比例混合，用NaOH水溶液调 PH = 8. 3，搅拌提取lh，4000r/min离心20min，沉淀再按固液质量比为1 5的比例提取2 次，合并上清液，以HCl水溶液调pH = 5. 0沉淀蛋白，分离出上清液，将上清液再次用HCl水溶液调pH = 3. 7进行二次沉淀蛋白，弃上清液，合并两次沉淀，用去离子水洗涤沉淀3次， 以NaOH水溶液调pH = 7. 0，搅拌使沉淀复溶，冷冻干燥Mh即为鹰嘴豆清蛋白；(2)将所述鹰嘴豆清蛋白溶解于蒸馏水中制成质量浓度为4. 87%的鹰嘴豆清蛋白水溶液；按Alcalase酶与鹰嘴豆清蛋白的比例为0. 38AU/g JfAlcalase酶放入所述鹰嘴豆清蛋白水溶液中，在pH = 8. 0，反应温度50°C的条件下，水解70min ；按Flavourzyme酶与鹰嘴豆清蛋白的比例为50LAPU/g，再加入Flavourzyme酶，在pH = 7. 0，反应温度50°C， 的条件下，水解IOOmin ；将酶解液加热至沸腾，灭酶lOmin，冷却后离心取上清液冷冻干燥即得鹰嘴豆肽粉末；(3)将处理好的葡聚糖凝胶kphdex G-25，装柱1. 6X50cm，用记录仪记录流出液吸光度情况，待蒸馏水洗脱至基线平稳，取鹰嘴豆肽粉末溶解于蒸馏水中后加入到所述葡聚糖凝胶kphdex G-25柱中，以蒸馏水洗脱，流速为0. 61^/1^11，在^Onm处检测洗脱液吸光度，分时段共出现3个洗脱峰，分别用CPe- I，CPe- II和CPe-III表示，收集第三个洗脱峰液体，冷冻干燥后即得到具有抗氧化作用的用CPe-III表示的鹰嘴豆肽，见图1层析图谱。液质联用(HLPC-MS)确定CPe- III的一级结构色谱条件进样量:5 μ L ；流动相=A液水(0. 1 % TFA) ；B液乙腈(0. 1 % TFA)； 柱温室温；流速:0. 7mL/min。质谱条件采用电喷雾电离(ESI)，喷雾电压4. 5kv,雾化气( )流量35个任意值单位，辅助气(N2)流量5个任意值单位，毛细管温度300°C ；全扫描范围150m/z-2000m/z ； 进行正离子检测模式；进行在线MS/MS，强度阀值105，离子宽度2，碰撞归一化能量30 %。应用BioWorks3. 3软件分析碎片信息，从而获得CPe- III的一级结构信息，分子量1155Da，氨基酸组成Arg-Gln-Ser-His-Phe-Ala-Asn-Ala-Gln-Pro。见图 2 (保留时间为 3. 55 处所对应的峰为CPe-III的主要成分)。见图3 (—级质谱获得CPe-III的相对分子质量为1155Da)。 见图 4 ( 二级质谱确定 CPe-III的氨基酸组成=Arg-Gln-Ser-His-Phe-Ala-Asn-Ala-Gln-Pr ο)红外光谱对一级结构进行检测，并推测抗氧化性CPe- III的二级结构CPe- III与KBr混合压片，采用全反射光谱测定法(ATR)，欧洲采样器采样32次。在 4000^-400^1范围内进行扫描。见图5。(图5_1和图5_2对酰胺I区谱带进行谱傅里叶自去卷曲和求二阶导数，使用波谱分析软件OMNIC对CPe- III原始谱带进行高斯/洛伦兹拟合，计算峰面积，得知CPe- III二级结构以α -螺旋为主，占66%。鹰嘴豆肽各组分还原能力的测定还原能力测定方法取ImL—定浓度的鹰嘴豆肽溶液，加入2. 5mL 0. 2mol/L pH6. 6的PBS缓冲溶液和2. 5mL 1 %的铁氰化钾溶液，充分混勻，在50°C水浴中反应20min 后，迅速冷却，再加入2. 5mL 10%的三氯乙酸，于3000r/min离心lOmin。去沉淀，取上清液 2mL,依次加入2mL蒸馏水和0. 4mL 0.1% FeCl3,充分混合，静置IOmin后，在700nm波长处比色。从图6中可以看出，CPe-III的还原能力明显高于组分CPe- I和II，在0. 1 25mg/ mL的浓度范围内，随着浓度增大，还原能力显著增高。鹰嘴豆肽各组分清除DPPH自由基的能力清除DPPH自由基的测定方法取ImL不同浓度的CPe溶液与ImL 0. Immol/LDPPH 标准液混合并剧烈震荡，在室温下避光反应一段时间(约20min)，然后与517nm处测吸光值 Ai0样品空白组以等体积无水乙醇代替DPPH标准液，在然后与517nm处测吸光值，记为Aj, 对照组以等体积蒸馏水代替样品溶液，在然后与517nm处测吸光值，记为k0。清除率按照下式计算清除率(％) = [I-(Ai-Aj)A0] X 100%其中Hki分别代表对照组，样品组及样品空白组的吸光度如图7可见，鹰嘴豆肽各集份对DPPH自由基均有显著的清除作用。在浓度0. 2 5mg/mL的范围内，随着浓度的增大，清除DPPH自由基的能力也有所增加。相同浓度下，鹰嘴豆肽各集份的清除DPPH自由基的能力如下CPe- III> CPe- II > CPe- I。CPe- III在 0. 1 lmg/mL的范围内，随浓度增大，清除速率显著增加，表现出明显的剂量效应关系，在 1 5mg/mL的浓度范围内，清除速率趋于平缓。鹰嘴豆肽各组分清除· OH自由基的能力对·0Η清除能力的测定方法在干燥的试管中依次加入0. 4mL 50mmol/L磷酸盐缓冲液(PH = 7. 5),0. ImL 一定浓度的鹰嘴豆肽溶液(空白管以等体积的蒸馏水代替鹰嘴豆肽溶液)，0· ImL 1. 04mmol/L 的 EDTA溶液，0. ImL IOmmol/L H2O2,0. ImL 2mmol/L VC, 0. ImL 60mmol/L脱氧核糖(DR)(对照组不加DR，补充蒸馏水)，0. Iml lmmol/L FeCl3,各管最终体积1. 0ml，置于37°C的恒温水浴中保温Ih后取出，迅速加入ImL 25% (v/v)HCI终止反应， 再加入lmLl%硫代巴比妥酸，沸水浴反应15min，取出后立即冷却，于波长532nm处测定吸光值，按下式计算清除率· OH 清除率(% ) = {[A0- (A1-A2) ] /A0} X 100其中k0、、、k2分别代表对照组、样品组及样品空白组的吸光度从图8可见，鹰嘴豆肽各集份对·0Η自由基均有显著的清除作用，并表现出明显的剂量效应关系，在0. 1 20mg/mL的浓度范围内，CPe- III的清除能力均高于组分CPe- I和 II。实施例2一种具有抗氧化作用的鹰嘴豆肽的分离纯化方法，包括下述步骤(1)将脱脂后的鹰嘴豆粉与水按质量比为1 8的比例混合，用NaOH水溶液调pH =8. 3，搅拌提取1. 5h,5000r/min离心15min，沉淀再按固液质量比为1 3的比例提取3 次，合并上清液，以HCl水溶液调pH = 5. 0沉淀蛋白，分离出上清液，将上清液再次用HCl水溶液调pH = 3. 7进行二次沉淀蛋白，弃上清液，合并两次沉淀，用去离子水洗涤沉淀2次， 以NaOH水溶液调pH = 7. 0，搅拌使沉淀复溶，冷冻干燥24h即为鹰嘴豆清蛋白；(2)将所述鹰嘴豆清蛋白溶解于蒸馏水中制成质量浓度为3%的鹰嘴豆清蛋白水溶液；按Alcalase酶与鹰嘴豆清蛋白的比例为0. 4AU/gdfAlcalase酶放入所述鹰嘴豆清蛋白水溶液中，在pH = 8. 0，反应温度45 °C的条件下，水解60min ；按Flavourzyme酶与鹰嘴
6豆清蛋白的比例为50LAPU/g，加入Flavourzyme酶，在pH = 7. 0，反应温度50°C，的条件下， 水解IOOmin ；将酶解液加热至沸腾，灭酶lOmin，冷却后离心取上清液冷冻干燥即得鹰嘴豆肽粉末。(3)同实施例1。实施例3一种具有抗氧化作用的鹰嘴豆肽的分离纯化方法，包括下述步骤(1)将脱脂后的鹰嘴豆粉与水按质量比为1 15的比例混合，用NaOH水溶液调 PH = 8. 3，搅拌提取0. 5h,3500r/min离心25min，沉淀再按固液质量比为1 7的比例提取2次，合并上清液，以HCl水溶液调pH = 5. 0沉淀蛋白，分离出上清液，将上清液再次用 HCl水溶液调pH = 3. 7进行二次沉淀蛋白，弃上清液，合并两次沉淀，用去离子水洗涤沉淀 3次，以NaOH水溶液调pH = 7. 0，搅拌使沉淀复溶，冷冻干燥24h即为鹰嘴豆清蛋白；(2)将所述鹰嘴豆清蛋白溶解于蒸馏水中制成质量浓度为5%的鹰嘴豆清蛋白水溶液；按Alcalase酶与鹰嘴豆清蛋白的比例为0. 3AU/gdfAlcalase酶放入所述鹰嘴豆清蛋白水溶液中，在pH = 8.0,反应温度55°C的条件下，水解50min ；按Flavourzyme酶与鹰嘴豆清蛋白的比例为50LAPU/g，加入Flavourzyme酶，在pH = 7. 0，反应温度50°C，的条件下，水解90min ；将酶解液加热至沸腾，灭酶lOmin，冷却后离心取上清液冷冻干燥即得鹰嘴豆肽粉末。(3)同实施例1。
权利要求
1.一种具有抗氧化作用的鹰嘴豆肽，用CPe-III表示，其特征是所述CPe-III的分子量为 115OTa，氨基酸组成为 Arg-Gln-Ser-His-Phe-Ala-Asn-Ala-Gln-Pro，二级结构以 α -螺旋占 66%。
2.权利要求1的一种具有抗氧化作用的鹰嘴豆肽的分离纯化方法，其特征是包括如下步骤(1)将脱脂后的鹰嘴豆粉与水按质量比为1 8-15的比例混合，用NaOH水溶液调ρΗ =8. 3，搅拌提取0. 5-1. 5h，3500r/min-5000r/min离心15min_25min，沉淀再按固液质量比为1 3-7的比例提取2-3次，合并上清液，以HCl水溶液调pH = 5.0沉淀蛋白，分离出上清液，将上清液再次用HCl水溶液调pH = 3. 7进行二次沉淀蛋白，弃上清，合并两次沉淀， 用去离子水洗涤沉淀2-3次，以NaOH水溶液调ρΗ = 7. 0，搅拌使沉淀复溶，冷冻干燥即为鹰嘴豆清蛋白；(2)将所述鹰嘴豆清蛋白溶解于蒸馏水中制成质量浓度为3-5%的鹰嘴豆清蛋白水溶液；按碱性蛋白酶Alcalase与鹰嘴豆清蛋白的比例为0. 3-0. 4AU/g，将Alcalase酶放入所述鹰嘴豆清蛋白水溶液中，在PH = 8. 0，反应温度45-55°C的条件下，水解50-70min ；按 Flavourzyme复合风味酶与鹰嘴豆清蛋白的比例为50LAPU/g，再加入Flavourzyme酶，pH = 7. 0，反应温度50°C的条件下，水解90-120min ；将酶解液加热至沸腾，灭酶lOmin，冷却后离心取上清液冷冻干燥即得鹰嘴豆肽粉末；(3)将处理好的葡聚糖凝胶kphdexG-25，装柱1.6X 50cm，用记录仪记录流出液吸光度情况，待蒸馏水洗脱至基线平稳，取鹰嘴豆肽粉末溶解于蒸馏水中后加入到所述葡聚糖凝胶kphdex G-25柱中，以蒸馏水洗脱，流速为0. 6mL/min,在280nm处检测洗脱液吸光度， 分时段共出现3个洗脱峰，收集第三个洗脱峰液体，冷冻干燥后即得到具有抗氧化作用的用CPe- III表示的鹰嘴豆肽。
3.权利要求1所述的鹰嘴豆肽在制备抗氧化保健品的用途。
全文摘要
本发明公开了一种具有抗氧化作用的鹰嘴豆肽及分离纯化方法及用途，鹰嘴豆肽用CPe-Ⅲ表示，分子量为1155Da，氨基酸组成为Arg-Gln-Ser-His-Phe-Ala-Asn-Ala-Gln-Pro，二级结构以α-螺旋占66％。本发明的方法分离条件温和、样品回收率高、实验结果重现性高、设备简便经济。本发明的方法过程简单，能耗低，且产品具有抗氧化的作用，并对抗氧化肽的人工合成提供依据。
文档编号A23L1/305GK102391361SQ20111035239
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月9日 优先权日2011年11月9日
发明者寇晓虹, 彭吕杨, 王 华, 胡冬梅, 薛照辉, 高捷 申请人:天津大学