本发明涉及板蓝根药物制剂，具体涉及具有抗病毒、抗氧化和免疫调节作用的板蓝根活性糖肽及其制备方法，属医药、保健食品技术领域。
背景技术：
近年来，由病毒引起的疾病对人类健康的威胁日益严峻。数千年来，病毒性疾病造成了严重的社会和经济损失，剥夺了无数的生命。流行性感冒病毒，对人类的生命和健康构成了很大的威胁。每年全球季节性的流感暴发感染约6亿人，并导致25万～50万人死亡，其中甲型流感病毒对人类健康危害最为严重，除每年季节性暴发感染大量人群，偶尔的大流行更会造成灾难性的后果，如1918年的西班牙流感，全球累计死亡大约5千万人。病毒感染给社会带来的经济损失和精神压力不可估计，因此防治病毒性疾病是重要的公共卫生问题。
最新人口普查表明，现在我国60岁以上的老年人口有约1.3亿，我国已经提前步入老龄化社会。到2050年老年人将达到4.39亿，占总人口的1/4。目前，我国老年性痴呆和帕金森氏病的患病人数在800万以上，2010年将达到1500万以上。人口老龄化和老年变性疾病对社会、家庭和医学界造成巨大的压力和负担。老年退行性疾病在衰老过程中起着重要作用，研究发现，自由基在引起老年退行性疾病的过程中发挥着重要作用，而天然抗氧化剂在预防和治疗老年退行性疾病中可能具有重要应用价值。
人类的进化使得人类对有害自由基产生了一套比较完善的抗自由基体系。例如抗氧化酶体系，体内就有超氧化物岐化酶(sod)、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等。抗氧化剂有维生素c、维生素e、谷胱甘肽、尿酸、胡萝卜素等。这些抗氧化酶和抗氧化剂在体内组成了一道道防线，防止有害自由基对机体的伤害，维持体内自由基产生和清除的平衡，保证机体的健康。我们应当尽量保持体内这一平衡，不破坏这一平衡。一旦出现不平衡而体内又无法调节时，补充一些天然抗氧化剂可以帮助机体维持平衡防止疾病的发生。自由基生物学和天然抗氧化剂研究的进展很可能对衰老这一重大基础科学提供新的线索和希望。
板蓝根作为传统清热解毒中药，抗病毒活性确切，且能调节机体免疫功能，相对抗病毒化学药物，其副作用小。板蓝根中的糖肽，近年来由于具有独特的药理活性受到研究者的广泛关注。前期研究表明板蓝根糖肽具有显著的抗病毒活性，且具有一定的抗氧化和免疫调节作用。本发明所述的两种板蓝根糖肽属于全新的糖肽，目前尚未有文献报道。两种板蓝根糖肽具有较好的体内外抗病毒、抗氧化和免疫调节等生物活性，具有开发成安全有效的抗病毒药物和提高机体免疫功能、抗衰老功效的保健食品的潜力，具有广泛的应用价值。
技术实现要素：
发明目的：本发明的目的是为了提供一种板蓝根糖肽及其制备方法及其板蓝根糖肽在治疗病毒感染性疾病和抗衰老药物中的应用。
本发明的目的可通过下列技术方案来实现：
具有抗病毒活性的板蓝根活性糖肽，它包括第一活性糖肽和第二活性糖肽；
所述的第一活性糖肽中多糖的组成为摩尔比10.19:1.96:13.58:1.30:0.97的甘露糖、半乳糖醛酸、无水葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖；
第一活性糖肽中氨基酸组成为重量比为1.07:1.07:1.78:1.35:0.41:1.38:0.96:0.20:0.29:0.43:0.25:0.35:0.90:0.46:0.23:0.44的天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、苯氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸和脯氨酸；
第一活性糖肽的重均相对分子质量为418145da
第二活性糖肽由甘露糖组成；
第二活性糖肽中氨基酸组成为重量比为0.16:0.17:0.12:0.10:0.36:0.20:0.23:0.080.11:0.04:0.02:1.56:0.30:1.25:1.00的天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、苯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸和脯氨酸。
第二活性糖肽的重均相对分子质量为1503da。
以上所述的板蓝根活性糖肽，它是通过以下方法制备得到的：
(1)取板蓝根药材，粉碎后过20～40目筛，采用超临界co2的方法萃取板蓝根药材中的油脂；温度设定为30℃～60℃、压力在10～40mpa、气体流速在10～40l/h、提取时间为0.5h～6h；取脱脂后的板蓝根药渣加水回流提取2次，每次2小时，合并滤液，提取液离心，取上清液，加入乙醇，使溶液乙醇的体积浓度达到60～70％％，静置过夜，离心，除去沉淀，取上清液，浓缩，加乙醇使溶液中乙醇体积浓度达到80％～90％，静置，离心，冷冻干燥，得板蓝根粗糖肽；
(2)称取适量板蓝根粗糖肽，加入5～25倍量水超声、涡旋使充分溶解，离心，取上清液，加入体积比为4:1的氯仿和正丁醇，充分混匀，离心，分离出上清液，重复2～3次；合并上清液，旋转蒸发至干，得板蓝根精制糖肽；
(3)取步骤(2)已除去蛋白的板蓝根精制糖肽，加水复溶，进akta蛋白纯化仪，分离纯化，采用superdextm75凝胶柱层析进行分离，洗脱溶剂为超纯水，以220nm、280nm为检测波长，每8ml收集一管，根据分离曲线，合并每个色谱峰，收集获得两个主要色谱峰，经冷冻干燥或喷雾干燥，分别得到第一活性糖肽和第二活性糖肽。
本发明的板蓝根活性糖肽在制备抗病毒药物中的应用。所述的病毒为甲型流感、呼吸道合胞病毒、肝炎病毒、疱疹类病毒、艾滋病毒、人乳头状瘤病毒等。
本发明所述的板蓝根活性糖肽在制备治疗抗病毒药物中的应用，将板蓝根活性糖肽和药学上可接受的载体制备成胶囊剂、片剂、滴丸、颗粒剂、注射剂或微囊剂的药物。
本发明所述的板蓝根活性糖肽在制备抗衰老药物及保健品中的应用。
本发明所述的板蓝根活性糖肽在制备抗衰老药物及保健品中的应用，将板蓝根活性糖肽和药学上可接受的载体制备成胶囊剂、片剂、滴丸、颗粒剂、注射剂或微囊剂的药物。
本发明所述的第一活性糖肽和第二活性糖肽分别命名为btt-f1和btt-f2，重均相对分子质量分别为418145da、1503da。
本发明所述的板蓝根活性糖肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)取板蓝根药材，粉碎后过20～40目筛，采用超临界co2的方法萃取板蓝根药材中的油脂；取脱脂后的板蓝根药渣加水回流提取，提取液离心，取上清液，加入乙醇，使溶液乙醇的体积浓度达到60～70％％，静置过夜，离心，除去沉淀，取上清液，浓缩，加乙醇使溶液中乙醇体积浓度达到80％～90％，静置，离心，冷冻干燥，得板蓝根粗糖肽；
(2)称取适量板蓝根粗糖肽，加入5～25倍量水超声、涡旋使充分溶解，离心，取上清液，加入体积比为4:1的氯仿和正丁醇，充分混匀，离心，分离出上清液，重复2～3次；合并上清液，旋转蒸发至干，得板蓝根精制糖肽；
(3)取步骤(2)已除去蛋白的板蓝根精制糖肽，加水复溶，进akta蛋白纯化仪，分离纯化，采用superdextm75凝胶柱层析进行分离，洗脱溶剂为超纯水，以220nm、280nm为检测波长，每8ml收集一管，根据分离曲线，合并每个色谱峰，收集获得两个主要色谱峰，经冷冻干燥或喷雾干燥，分别得到第一活性糖肽和第二活性糖肽。
作为优选方案，以上所述的具有抗病毒活性的板蓝根活性糖肽的制备方法，步骤(1)中，采用超临界co2的方法萃取板蓝根药材中的油脂；温度设定为30℃～60℃、压力在10～40mpa、气体流速在10～40l/h、提取时间为0.5h～6h，夹带剂为石油醚或体积浓度为80％～95％的乙醇；
取脱脂后的板蓝根药渣加水回流提取，提取1～3次，每次30～120min。
本发明采用细胞病变(cpe)法检测板蓝根糖肽有效部位的体外抗病毒作用，采用流感病毒鼠肺适应株(fm1)滴鼻感染小鼠建立体内抗流感病毒模型，评价板蓝根活性糖肽的体内抗病毒作用，实验结果表明两种板蓝根糖肽具有较好的体内外抗病毒作用。
本发明具有以下优点：
本发明通过大量实验筛选，采用优选的方法制备得到板蓝根活性糖肽，实验结果表明，本发明制备得到的板蓝根活性糖肽具有显著的抗病毒作用；并且本发明制备得到的板蓝根活性糖肽，经检测具有良好的抗氧化活性，同时可以显著改善氧化损伤小鼠的体征性状及免疫功能。
本发明单独或与其它抗病毒药物联合使用均有抗病毒作用，用于各种病毒性感染疾病的治疗和辅助治疗，如甲型流感、呼吸道合胞病毒、肝炎病毒、疱疹类病毒、艾滋病毒、人乳头状瘤病毒等。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品或原料。
实施例1板蓝根糖肽的制备
板蓝根药材经粉碎后过20目筛，采用超临界co2的方法萃取板蓝根药材中的油脂。温度设定为40℃、压力在30mpa、气体流速在15l/h、提取时间为2h。脱脂后的板蓝根药渣加水回流提取2次，每次2小时，合并滤液，离心取上清液，缓慢加入95％乙醇，使溶液含醇浓度达到60％，静置过夜，离心除去沉淀，上清液经浓缩后，加95％乙醇使溶液中乙醇含量达到80％，静置12h，离心，冷冻干燥，得板蓝根粗糖肽。
称取适量板蓝根粗糖肽，加入20倍量水超声、涡旋使充分溶解，离心，上清液加入sevage试剂(氯仿：正丁醇＝4：1)充分混匀，离心，分离出上清重复3次；上清液旋转蒸发至干，得板蓝根精制糖肽。
取已除去蛋白的精制板蓝根糖肽适量，加水复溶，进蛋白纯化仪，分离纯化。采用superdextm75凝胶柱层析进行分离，洗脱荣剂为超纯水，以280nm为检测波长，每8ml收集一管，根据分离曲线，合并每个色谱峰，收集获得两个主要色谱峰，得到第一活性糖肽和第二活性糖肽，分别命名为btt-f1和btt-f2，经冷冻干燥，备用。
实施例2板蓝根糖肽分子量测定
1.样品制备
称取不同分子量的标准葡聚糖及实施例1制备得到的板蓝根糖肽btt-f1和btt-f2适量，加蒸馏水后超声溶解，过0.45μm微孔滤膜备用。
2.色谱条件
色谱柱：tsk-gelg5000pwx1(7.8mm×30cm)流动相：超纯水；流速：0.8ml/min；柱温：30℃；进样量：10μl；气体流速：1.5l；漂移管温度：110℃。
3.标准曲线的制备
取均一分子量分别为5000000da、496000da、289000da、110000da、70000da、50000da、20000da、12600da、4320da、2000da的标准葡聚糖对照品，以蒸馏水配成标准溶液。照上述液相条件检测，以标准葡聚糖的保留时间和相对分子质量自然对数作图，绘制标准曲线。标准曲线为：y＝-0.2579x+8.9888(r2＝0.9925)。保留时间(rt)为横坐标，相对分子质量自然对数lgmw为纵坐标。表明在分子量5000000da～2000da范围内呈现良好的线性关系。
4.纯度检测结果
取适当blg-70dt、btt-f1、btt-f2配成溶液，以上述色谱条件进行检测。根据标准曲线计算，btt-f1的重均相对分子质量为418145da；btt-f2的重均相对分子质量为1503da。
实施例3板蓝根糖肽的单糖组成分析
1.板蓝根糖肽样品酸水解
精密称取实施例1制备得到的板蓝根糖肽btt-f19.6mg、btt-f29.36mg溶于5ml超纯水中，分别取500μl样品于水解管中，加入10ml2mol/l的三氟乙酸，封口，110℃下反应8小时，水解完成。
将水解完成的样品70℃水浴旋蒸至三氟乙酸(tfa)挥干，用甲醇洗数次，每次1ml，旋蒸至干，洗至ph呈中性，加2ml超纯水复溶。
2.单糖1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)衍生化样品制备
分别取水解后样品100μl加100μl0.3mol/lnaoh、200μl10％1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)甲醇溶液，涡旋混匀，70℃水浴45min，冷却至室温，加入100μl0.3mol/lhcl中和，涡旋混匀，加500μl超纯水，涡旋混匀。加入1ml氯仿涡旋30s后于13000r/min下离心10min，吸取上清850μl加850μl氯仿涡旋30s后于13000r/min下离心10min,吸取上清700μl加700μl氯仿涡旋30s后于13000r/min下离心10min，吸取上清550μl，过微孔滤膜后待进hplc。
3.hplc分析
对照品：d-葡萄糖醛酸、d-甘露糖、d-半乳糖、鼠李糖、d(+)-木糖、d-半乳糖醛酸、d(+)-无水葡萄糖、d-阿拉伯糖
将上述对照品均配成1mg/ml的溶液，分别吸取10μl于离心管中，以衍生水解后样品方法衍生各单糖，制成单标以及8个单糖的混标。
色谱条件：alltimatmc18色谱柱、流动相为0.1mol/l磷酸缓冲液(0.1mol12h2o·na2hpo4和0.1mol2h2o·nah2po4ph6.7)乙腈(体积比为82:18)；流速为1ml/min；检测波长：250nm；柱温：30℃；进样量10μl；等梯度洗脱。
将混标以上述色谱条件依次进样5μl、10μl、15μl、20μl、30μl。以对照品溶液各单糖的峰面积(y)对相应进样质量的106倍(x)进行线性回归。
4.板蓝根糖肽中单糖摩尔质量比值结果
根据高效液相比对btt-f1中含有甘露糖、半乳糖醛酸、无水葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖。btt-f2只含有甘露糖。根据btt-f1中各单糖的峰面积，计算可知btt-f1中甘露糖、半乳糖醛酸、无水葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的物质的量比为10.19:1.96:13.58:1.30:0.97。
实施例4板蓝根糖肽的氨基酸测定
分别精确称取实施例1制备得到的样品9mg(btt-f1)和17mg(btt-f2)置于厌氧水解管中，加入6m盐酸5ml；然后放入冷冻剂(液氮或干冰)中冷冻，待溶液凝固后取出，在真空泵抽气管上抽真空封管；然后在110℃的恒温干燥箱内水解24h，冷却后定容至10ml，用0.45μm水系滤膜过滤；吸取1ml滤液置于ep管中，然后在真空浓缩仪中干燥；残留物用1ml去离子水溶解，再干燥，反复进行2次；最后加入1mlph2.2缓冲液溶解，用0.22μm水系滤膜过滤；上氨基酸自动分析仪进行分析。含量测定结果见表1，研究结果表明板蓝根糖肽中富含氨基酸，主要含有16种氨基酸，但不同的氨基酸含量差异较大。
表1btt-f1和btt-f2氨基酸含量
实施例5板蓝根糖肽的体外抗病毒作用
1.材料和仪器
1.1病毒株
呼吸道合胞病毒(rsv)(武汉病毒研究所)。扩增方法：把0.5ml的病毒接种在已长满细胞的培养瓶中，加入1.5ml培养基，每隔15分钟摇一次。1.5h以后，去上清，加入4ml含2％血清的培养基。培养3-4天，待cep达到80～90％时，将细胞培养瓶反复冻融3次，收集悬液，3000rpm离心5分钟，将上清液分装贮存于-80℃备用。
h3n2流感病毒(南京中医药大学微生物免疫教研室)。扩增方法：将病毒接种于9-11龄的鸡胚，反复扩增2次，以增强它的毒力。取其尿囊液，测定红细胞凝集活性，得病毒血凝滴度为1:640，分装贮存于-80℃备用。
1.2细胞株
mdck细胞(狗肾细胞，中科院细胞所)，vreo细胞(非洲绿猴肾细胞，中科院细胞所)。
1.3试剂与耗材
二甲基亚砜(dmso)(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；胰蛋白酶(美国gibco公司产品)；噻唑盐(mtt，solarbio公司产品)；dmem培养基(美国gibco公司产品)；胎牛血清(美国gibco公司产品)；青霉素(solarbio公司产品)；链霉素(solarbio公司产品)；利巴韦林(四川百利药业有限公司)。
2方法
2.1病毒毒力的测定
将mdck细胞按1×105/ml的浓度，接种到96孔细胞培养板上，每孔0.2ml，18～24h长成单层细胞，弃去上清液，备用。将h3n2型流感病毒稀释成不同浓度(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7)，加入50μl病毒，每个浓度6个复孔，吸附2h，弃去未吸附的病毒，加入dmem维持液0.2ml，37℃5％co2培养72h。3-4天后，根据细胞出现病变的情况，计算病毒的半数细胞培养物感染量(tcid50)。
将vero细胞按2×104/ml的浓度，接种到96孔细胞培养板上，每孔0.2ml，18～24h长成单层细胞，弃去上清液，备用。将rsv呼吸道合胞病毒稀释成不同浓度(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7)，加入50μl病毒，每个浓度4个复孔，吸附2h，弃去未吸附的病毒，
加入2％血清的dmem维持液0.2ml，37℃5％co2培养72h。3-4天后，根据细胞出现病变的情况，计算病毒的tcid50。
2.2受试样品对mdck细胞和vero细胞的毒性
取长成单层mdck细胞的96孔培养板，弃去上清液，将含不同浓度实施例1制备得到的板蓝根糖肽的细胞维持液0.2ml加入细胞，每个浓度4个复孔，37℃5％co2培养72h。每孔加入20μl5mg/ml的mtt溶液，继续培养4h，倾去上清液，加入0.2mldmso，570～630nm双波长法计算od值，计算细胞存活率和受试样品半数毒性浓度(tc50)，以最大无毒浓度为起始浓度，倍比稀释几个浓度，进行抗病毒实验。
细胞存活率＝(受试样品组平均od值/对照组平均od值)×100％
取长成单层vero细胞的96孔培养板，弃去上清液，将含不同浓度的实施例1制备得到的板蓝根糖肽的细胞维持液0.2ml加入细胞，每个浓度4个复孔，37℃5％co2培养72h。每孔加入20μl5mg/ml的mtt溶液，继续培养4h，倾去上清液，加入0.2mldmso，570～630nm双波长法计算od值，计算细胞存活率和受试样品半数毒性浓度(tc50)，以最大无毒浓度为起始浓度，稀释几个浓度，进行抗病毒实验。
细胞存活率＝(受试样品组平均od值/对照组平均od值)×100％
2.4抗病毒实验
抗h3n2型流感病毒试验：设空白对照组、病毒感染组、利巴韦林阳性对照组和实施例1制备得到的板蓝根糖肽不同浓度组。将mdck细胞按1×105/ml的浓度接种于96孔板，等长成单层的细胞,弃去上清，加入50μl100tcid50病毒液，吸附2h，用pbs液洗去未吸附的病毒，加入含不同浓度受试样品的细胞维持液0.2ml，每个浓度4个复孔，37℃5％co2培养72h，每孔加入20μl5mg/ml的mtt溶液，继续培养4h，倾去上清液，加入0.2mldmso，570nm(630nm作为参考波长)双波长法测od值，计算样品的病毒抑制率和50％抑制病毒细胞病变的受试样品浓度(ic50)。
抗rsv呼吸道合胞病毒试验：设空白对照组、病毒感染组、利巴韦林阳性对照组和实施例1板蓝根糖肽不同浓度组。将vero细胞按2×104/ml的浓度接种于96孔板，等长成单层的细胞，弃去上清，加入50μl100tcid50病毒液，吸附2h，用pbs液洗去未吸附的病毒，加入含不同浓度板蓝根糖肽的含2％血清的细胞维持液0.2ml，每个浓度4个复孔，37℃5％co2培养72h，每孔加入20μl5mg/ml的mtt溶液，继续培养4h，倾去上清液，加入0.2mldmso，570nm(630nm作为参考波长)双波长法测od值，计算样品的病毒抑制率和50％抑制病毒细胞病变的板蓝根糖肽浓度(ic50)。
病毒抑制率＝(实验组平均od值-病毒对照组平均od值)/(细胞对照组平均od值-病毒对照组平均od值)×100％
2.5实验统计方法
实验数据采用spss软件进行方差分析和t检验。
3.实验结果
3.1病毒毒力的测定
根据细胞病变抑制结果，计算h3n2甲型流感病毒的tcid50值是10-6，rsv呼吸道合胞病毒的tcid50值是10-3。
3.2板蓝根糖肽的细胞毒性测定
如表2和表3所示，受试样品在浓度为62.5～1000μg/ml浓度范围内对mdck细胞和vero细胞均未表现出明显细胞毒性作用，说明板蓝根糖肽具有较好的安全性。
表2板蓝根糖肽对mdck细胞的毒性
表3板蓝根糖肽对vero细胞的毒性
3.3板蓝根糖肽体外抗病毒实验结果
如表4所示，两种板蓝根糖肽btt-f1和btt-f2对h3n2甲型流感病毒和rsv呼吸道合胞病毒均有明显的抑制作用。btt-f1对h3n2甲型流感病毒和rsv呼吸道合胞病毒的ic50浓度分别为215.63μg/ml、178.21μg/ml；btt-f2对h3n2甲型流感病毒和rsv呼吸道合胞病毒的ic50浓度分别为150.21μg/ml、95.56μg/ml，说明本发明制备得到的板蓝根糖肽具有较好的抗病毒作用。
表4板蓝根糖肽抗病毒ic50
实施例6板蓝根糖肽体内抗病毒作用
balb/c小鼠，体重16～18g，雌雄各半，经适应性饲养后，随机分为正常组、模型组、阳性药物组(利巴韦林)和实施例1板蓝根糖肽低、中、高3个剂量组，每组20只。除正常对照组外，各组动物用乙醚轻度麻醉，以5倍ld50的流感病毒鼠肺适应株(fm1)滴鼻感染，每只50μl。感染1h后开始灌胃给药，连续给药5d，模型组、正常对照组以等体积生理盐水灌胃。在感染后14d内观察动物的死亡情况，计算死亡率、死亡保护率、平均存活天数和生命延长率，称体重后，解剖小鼠，取肺组织称重，计算肺指数及其抑制率。
肺指数＝肺脏重量(g)/体重质量(g)×100
表5板蓝根糖肽对甲型流感病毒fm1感染小鼠死亡的保护作用
注：**表示与模型组比较p＜0.01；*表示与模型组比较p＜0.05。
如表5所示，板蓝根中两种糖肽均具有明显的保护流感病毒感染小鼠的作用，存活天数和保护率显著提高，不同剂量组相对于模型组具有显著抑制肺部炎症的作用。
实施例7板蓝根糖肽抗氧化活性
1.dpph自由基清除试验
向96孔板中精密移取实施例1制备得到的btt-f1、btt-f275μl，再加入0.25mmol/ldpph甲醇溶液75μl，混匀，室温避光反应30min后每个样品平行加样两次，于517nm波长下测定其吸光度(a1)；以超纯水代替dpph甲醇溶液，测定吸光度(a2)；水加dpph甲醇溶液作为对照，测定吸光度(a0)。
清除率(％)＝[a0-(a1-a2)]×100％
式中：a0为不加样品溶液的空白吸光度；a1为加有样品的dpph甲醇溶液的吸光度：a2为加有样品和水的吸光度，用于校正空白。实验重复三次，取平均值，具体实验结果如表6。
表6板蓝根糖肽清除dpph自由基能力
2.abts自由基清除试验
精密称取1mgabts溶于0.735ml水，1mgk2s2o8溶于1.43ml水，然后以1:1的体积混合，避光12～14h，在12小时后14小时前用完。精密移取btt-f1、btt-f250μl于96孔板上，再加入abts稀释液150μl。每个样品平行加样两次在734nm波长下测定其吸光度(a1)；以蒸馏水代替abts稀释液，测定吸光度(a2)；水加abts稀释液作为对照，测定吸光度(a0)，具体实验结果如表7。
清除率(％)＝[a0-(a1-a2)]×100％
式中：a0为不加样品溶液的空白吸光度；a1为加有样品的dpph甲醇溶液的吸光度：a2为加有样品和水的吸光度，用于校正空白。
表7板蓝根糖肽清除abts自由基能力
如表6、表7所示btt-f1、btt-f2均有一定的清除dpph和abts自由基的能力，表明板蓝根糖肽具有一定的抗氧化活性。
实施例8板蓝根糖肽对raw264.7巨噬细胞免疫调节作用的影响
1材料与仪器
1.1细胞株
raw264.7巨噬细胞株购于江苏省药物研究所。
1.2试剂
dmem培养基(gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；0.25％胰酶-edta(gibco公司)；磷酸缓冲盐(pbs)(博士微生物工程有限公司)；mtt(solarbio，批号m8180)；双抗(青霉素-链霉素)(sigma公司)；dmso(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；脂多糖(lps)(sigma公司)；其他试剂均为分析纯。
2方法
2.1raw264.7细胞增殖实验
采用mtt法测定raw264.7细胞的增殖活性。取对数生长期细胞以含10％胎牛血清dmem完全培养液按105个/孔接种于96孔培养板，每孔200μl，37℃、5％co2培养箱中培养12h，待细胞贴壁后，弃去上清液，分别加入实施例1不同浓度的板蓝根糖肽样品(6.25、12.5、25、50、100μg/ml)，空白对照组为含10％胎牛血清的dmem培养基，每组设6个复孔。在37℃、5％co2条件下分别继续培养24h，每孔加入0.5mg/ml的mtt20μl，继续培养4h后，弃去培养液，每孔加入150μldmso，充分震荡5min，使结晶彻底溶解，在酶标仪上490nm波长处测od值，并计算细胞增殖指数。计算公式如下：
细胞增殖指数＝样品的od值/空白对照的od值
2.2raw264.7细胞吞噬中性红实验
细胞的前期培养参照“2.1”节的方法。加入空白对照和不同浓度的板蓝根糖肽样品组，每组6个复孔，在37℃、5％co2条件下培养24h后弃掉培养上清液，加入0.075％中性红溶液100μl，37℃、5％co2培养箱中继续培养1h，弃去中性红，用pbs洗2遍，每次100μl。加入醋酸-乙醇(1:1，v/v)细胞溶解液100μl/孔，放入37℃、5％co2条件下培养1小时后，酶标仪540nm处测定od值。细胞对中性红吞噬能力用吞噬指数表示。
吞噬指数＝样品的od值/(空白对照的od值×样品的增殖指数)
3.结果与分析
3.1板蓝根糖肽对raw264.7细胞增殖的影响
表8为不同浓度板蓝根糖肽作用于raw264.7细胞24h后的增殖指数。板蓝根糖肽btt-f1、btt-f2不同浓度可显著促进巨噬细胞的增殖的作用，且表现出一定的剂量关系。
表8板蓝根糖肽对raw264.7细胞增殖指数的影响
注：与空白对照组比较*p<0.05，**p<0.01
3.2板蓝根糖肽对raw264.7细胞吞噬作用的影响
结果如表9所示，用6.25～100μg/ml的板蓝根糖肽样品溶液作用raw264.7细胞24h后，吞噬能力与空白对照相比，具有显著性差异(p<0.05)，在浓度为100μg/ml时btt-f1吞噬指数为1.54，btt-f2吞噬指数为1.61，表明两个板蓝根糖肽能够激活raw264.7巨噬细胞，提高其吞噬能力。
表9板蓝根糖肽对巨噬细胞吞噬指数的影响
注：与空白对照组比较*p<0.05，**p<0.01
以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。