一种与卵巢癌和子宫内膜癌相关的长链非编码RNAABHD11‑AS1的siRNA和应用的制作方法

本发明属于肿瘤分子生物学领域，尤其涉及一种与卵巢癌和子宫内膜癌相关的长链非编码RNA ABHD11-AS1的siRNA和应用。

背景技术：

卵巢癌和子宫内膜癌都是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率高，近年来呈上升趋势，严重威胁着我国女性的生命健康。早期筛查与及时诊治对卵巢癌和子宫内膜癌患者的预后及疗效至关重要。目前，用于临床的早期筛查方法及诊断指标（如CA125）尚不理想。

近年来，长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）在肿瘤的发生、侵袭、转移和耐药中的作用，成为医药行业的研究热点。长链非编码RNA是一类长度超过200个核苷酸且不编码蛋白质的RNA分子，能够通过多种途径和分子机制调控基因表达，参与多种生物学功能。lncRNA的表达及调节异常与许多恶性肿瘤密切相关，它在细胞增殖、分化及凋亡中的重要作用也逐渐被证实。随着对lncRNA 功能研究的不断深入，lncRNA与肿瘤发生、发展关系的研究，也取得了令人瞩目的成果。

然而，卵巢癌、子宫内膜癌发生的分子机制尚不清楚，深入研究卵巢癌、子宫内膜癌相关基因的异常表达机制，将有助于其早期诊断、预防及治疗，具有重要的意义。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提供一种与卵巢癌和子宫内膜癌相关的长链非编码RNA ABHD11-AS1的siRNA和应用。该长链非编码RNA与癌细胞的增殖、凋亡能力相关，针对其设计的siRNA可应用于抗肿瘤的药物的制备。

为了实现上述目的，本发明提供一种与卵巢癌和子宫内膜癌相关的长链非编码RNA ABHD11-AS1，其DNA序列如SEQ.ID. NO.1所示；针对该长链非编码RNA设计的siRNA，所述的siRNA的sense和antisense的核苷酸序列分别如SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示。

SEQ.ID.NO.2 ： GCUACGAGAUCAUGAGCCA。

SEQ.ID.NO.3 ： UGGCUCAUGAUCUCGUAGC。

所述的与卵巢癌和子宫内膜癌相关的长非编码RNA的siRNA可以用于制备抗卵巢癌和子宫内膜癌药物。

本发明的有益效果。

本发明首次发现LncRNA ABHD11-AS1在卵巢癌和子宫内膜癌患者中的表达均高于正常卵巢组织和子宫内膜组织；LncRNA ABHD11-AS1表达异常和卵巢癌、子宫内膜癌的发生与发展的相关性，为卵巢癌和子宫内膜癌的LncRNA的临床治疗和科学研究提供了基础。

本发明提供的与卵巢癌和子宫内膜癌相关的LncRNA，是由上海SIGMA生物公司独家的Rosetta算法，确保基因设计时的高效特异性基础上设计siRNA序列；其质粒序列由苏州吉玛基因股份有限公司设计。分别将质粒载体和si-RNA干扰片段转染到卵巢癌细胞系A2780、OVCAR3及子宫内膜癌细胞系HEC-1B、Ishikawa中，发现肿瘤细胞的增殖活性上升/下降，因此认为该基因的功能与癌细胞的增殖能力相关。

附图说明

图1利用qRT-PCR检测ABHD11-AS1在卵巢癌及正常组织中的表达情况。

图2利用MTT法检测ABHD11-AS1过表达/干扰对卵巢癌细胞增殖的影响。

图3检测ABHD11-AS1过表达/干扰对卵巢癌细胞凋亡的影响。

图4利用qRT-PCR检测ABHD11-AS1在子宫内膜癌及正常子宫内膜组织中的表达情况。

图5利用MTT法检测ABHD11-AS1过表达/干扰对子宫内膜癌细胞增殖的影响。

图6检测ABHD11-AS1过表达/干扰对子宫内膜癌细胞凋亡的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。在实施例中未作特殊说明的操作方法均为本技术领域常规操作方法。

实施例1。

一、Lnc RNA ABHD11-AS1在卵巢癌组织、正常卵巢组织及子宫内膜癌组织、正常子宫内膜组织中的表达情况。

1、标本采集。

在患者知情的情况下，于术中采集卵巢癌、正常卵巢组织及子宫内膜癌组织、正常子宫内膜组织标本，生理盐水清洗后，保存于液氮或-80℃超低温冰箱中，备用；组织标本于2014年6月-2016年6月，在中国医科大学附属第一医院手术室，由陈医生采集。

2、引物设计。

PCR检测所用引物。

上游引物（SEQ.ID.NO.4）：CTCCACCTGACAGCAACATC。

下游引物（SEQ.ID.NO.5）：TTCTTGGCAATGGCTTCA。

3、应用qRT-PCR方法分别检测ABHD11-AS1在卵巢癌、正常卵巢组织及子宫内膜癌组织、正常子宫内膜组织的表达量。

3.1、收集的组织标本总RNA提取。

将收集正常卵巢组织、卵巢癌组织以及正常子宫内膜组织、子宫内膜组织标本用Trizol浸泡，以备提取总RNA；加入 Trizol1/5体积量的氯仿，剧烈振荡15秒，待溶液充分乳化后，室温静置5分钟；4℃条件下，12,000g离心处理20分钟，吸取上清液转移至另一个新的离心管中，向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在30℃下静置10分钟；4℃条件下，12,000g离心处理20分钟，弃去上清，沿管壁加入lml的75％的乙醇，上下颠倒洗涤离心管管壁，4℃条件下12,000g离心处理10分钟后，弃去乙醇，室温干燥沉淀5-10分钟，加入适量（10-20ul）的RNase-free水溶解沉淀后，用UV-2800A型紫外可见分光光度计测定RNA浓度和纯度（定量RNA浓度1ug/ul， OD260/OD280 1.8-2.0之间表示RNA纯度较高）。

3.2、逆转录合成cDNA。

采用Promega GoScript 反转录系统（A5000、A5001），按照以下操作步骤进行反转录得到的 cDNA。

第一步：取一定量模板 RNA 加入引物。

RNA ( 1µg/ul) 5 μl。

Random Primers (0.5 µg /ul) 1 μl。

Oligo(dT)15 Primer (0.5 µg/ul) 1 μl。

Nuclease-Free Water (加至 10 μl) 3 μl。

第二步：将模板 RNA 与反转录引物（ Random Primers和Oligo(dT)15 Primer）的混合物进行 70℃、5 min 预变性，完成后取出置于冰上。

第三步：配制 RT-Mix，向每个样品管加入 10 μl。

组分 反转录混合液 终浓度。

Nuclease-Free Water 1.6 μl。

GoScript™ 5X Reaction Buffer 4 μl 1X 。

MgCl₂ (25 mM) 2 μl 2.5mM 。

PCR Nucleotide Mix 1 μl 0.5mM 。

Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor 0.4 μl 20units。

GoScript™ Reverse Transcriptase 1 μl。

第四步：设置反转录程序，包括退火、延伸、逆转录酶失活三步（退火25℃ 5min，延伸42℃ 60 min，失活70℃ 15 min，4℃ + ∞。程序完成后得到 cDNA。

3.3、Real-time PCR。

（1）按下列配置PCR反应混合液（反应液配置可在室温进行），并分至各反应管，然后加入2ul模板。

组分 体积（20ul反应体系） 终浓度。

Nuclease-Free Water 7 μl 。

上游引物（10 uM) 0.4ul 0.2uM。

下游引物（10 uM) 0.4ul 0.2uM。

GoTaq®qPCR Master Mix,2X 10ul 1X。

CXR 100X 0.2ul 1X。

（2）采用ABI PRISM®7500 Real-Time PCR System，两步法进行PCR标准扩增程序。

（3）导出数据，Realtime PCR结果用2-△△CT法进行分析。利用Graphad Prism软件分别绘制出卵巢癌和正常卵巢组织、子宫内膜癌及正常子宫内膜组织表达水平的图表，结果如图1-3和图4；其中图1-1表示lncRNA ABHD11-AS1表达在上皮性卵巢癌中比在正常卵巢组织中显着更高；1-2表示lncRNA ABHD11-AS1表达与肿瘤分期呈正相关（根据国际妇产科学联合会（FIGO）分期系统I/II期与III/IV期），1-3表示 lncRNA ABHD11-AS1在高分化程度组较在低/中度分化组低，^*P <0.05；图4表示lncRNA ABHD11-AS1表达在子宫内膜癌中比在正常子宫内膜组织中显着增高。

以上说明lncRNA ABHD11-AS1与卵巢癌、子宫内膜癌发生、发展相关。

二、体外细胞功能实验。

1、卵巢癌细胞株A2780、OVCAR3购自中科院细胞库，子宫内膜癌细胞株HEC-1B购自中科院细胞库，细胞培养基DMEM/RPMI 1640和胎牛血清均购自HyClone公司，ABHD11-AS1质粒表达载体购自苏州吉玛技术有限公司，siRNA干扰片段序列由上海SIGMA生物公司合成，RNA抽提试剂RNAiso Plus购自宝生物工程有限公司，逆转录试剂盒High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits购自Invitrogen公司，定量PCR试剂盒Power SYBR Green PCR Master Mix购自Invitrogen公司，ABHD11-AS1基因和管家基因18S引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.1、细胞培养：卵巢癌和子宫内膜癌细胞用含10%的胎牛血清细胞培养基，于37℃，5%CO₂的培养箱中培养，利用ABHD11-AS1基因RNA干扰和过表达质粒转染卵巢癌细胞系A2780、OVCAR3和子宫内膜癌细胞系HEC-1B，按照lipo2000说明书分别将ABHD11-AS1的siRNA及ABHD11-AS1质粒转入细胞中，进行培养。

2、过表达∕干扰效率检测：转染效率结果采用QRT-PCR检测，干扰效率在50%以上，过表达效率在5倍以上。

2.1、过表达∕干扰ABHD11-AS1后进行细胞增殖实验（MTT）。

增殖实验：选取细胞系中ABHD11-AS1过表达∕干扰作为实验组，转染空载体的细胞作为对照组，进行细胞计数，将细胞种到96孔板中，每孔3000个细胞，加100ul培养液，分别于0，24，48，72小时加入20ul 5 mg/mL MTT溶液细胞培养箱孵育2-4小时后，在37℃孵育4小时，弃掉上清液，再加入150ul DMSO，使用分光光度计在490nm下测OD值,整理数据绘制成折线图，见图2和图5。

2.1.1、过表达ABHD11-AS1后的卵巢癌细胞系及子宫内膜癌细胞系细胞增殖实验结果，见图2-1至图2-4和图5-1；其中图2-1至图2-2表示在卵巢癌A2780和OVCAR3细胞中转染 ABHD11-AS1 质粒，其表达升高；图2-3至图2-4表示ABHD11-AS1表达升高，细胞增殖能力显著增强；其中图5-1表示转染ABHD11-AS1质粒提高其在子宫内膜癌细胞中的表达水平。

可见，过表达ABHD11-AS1基因后, 卵巢癌及子宫内膜癌细胞增殖能力增强。

2.1.2、ABHD11-AS1干扰后的卵巢癌细胞系及子宫内膜癌细胞细胞增殖实验结果见图2-5至2-8和图5-2至图5-4，其中图2-5至图2-6表示卵巢癌细胞系转染si-ABHD11-AS1降低其表达；图2-7至图2-8表示沉默ABHD11-AS1，细胞增值能力明显下降；图5-2表示利用siRNA能够沉默其在子宫内膜癌细胞中的表达；图5-3表示ABHD11-AS1表达增加，细胞增殖能力显著提高；图5-4表示沉默表达，细胞增殖能力受到抑制。

可见，干扰掉ABHD11-AS1基因后,卵巢癌及子宫内膜癌细胞增殖能力下降。

2.2 、干扰∕过表达ABHD11-AS1后细胞凋亡实验。

实验前将细胞在6cm盘培养，加入处理因素(ABHD11-AS1基因RNA干扰或过表达质粒)转染48小时后，进行实验。细胞用不含EDTA胰蛋白酶消化，1500r离心处理5分钟后收集细胞，预冷的PBS洗涤两次，离心后，收集细胞约5×10 ⁵个，加入1×Binding Buffer，重悬细胞100ul，加入5μL Annexin V-FITC和5uL PI Staining Solution(干扰)或者5μL Annexin V-7AAD和5uL PE Staining Solution（高表达），轻轻混匀，室温避光孵育10分钟，再加入400μL 1×Binding Buffer，轻轻混匀；样品在1小时内流式细胞仪检测。

2.2.1、过表达ABHD11-AS1后的卵巢癌细胞系及子宫内膜癌细胞系细胞凋亡实验结果见图3-1至3-2和图6-1；其中图3-1至图3-2表示ABHD11-AS1表达上升，卵巢癌细胞凋亡比例明显下降；图6-1表示在子宫内膜癌细胞系中，ABHD11-AS1表达升高，细胞凋亡比例明显下降。

可见，过表达ABHD11-AS1基因后，卵巢癌及子宫内膜癌细胞凋亡能力减弱。

2.1.2、ABHD11-AS1干扰后的卵巢癌细胞系及子宫内膜癌细胞系凋亡实验结果见图3-3至3-4和图6-2；其中图3-3至图3-4表示利用siRNA沉默ABHD11-AS1的表达，卵巢癌细胞系凋亡率增加显著；图6-2表示沉默ABHD11-AS1显著促进子宫内膜癌细胞凋亡。

可见，干扰掉ABHD11-AS1基因后，卵巢癌及子宫内膜癌细胞凋亡能力增加。

序列表

＜110＞中国医科大学附属第一医院

＜120＞一种与卵巢癌和子宫内膜癌相关的长链非编码RNA ABHD11-AS1的siRNA和应用

＜160＞5

＜210＞1

＜211＞1660

＜212＞DNA

＜213＞长链非编码RNA ABHD11-AS1的核苷酸序列

＜400＞1

ctcgagtgaa gacggaaatg gggcggggct gcgagctagg gcgggagaag gagcgcgggg aggacgtacc 70

ttgtgagatg cgagccggcc aacagcttgc aagcatgctc cgctggaccc gagcctggag gctcccgcgt 140

gagggactcg gcccccacgg ccctagcttc gcgagggtgc ctgtcgcacc cagcagcagc agcggcggcc 210

gagggggcgc cgagccgagg ccgcttccgc tttcctacag gcttctggac ggggaggcag ccctcccggc 280

cgtcgtcttt ttgcagggct cttcggcagc aaaactaact tcaactccat cgccaagatc ttggcccagc 350

agacaggccg tgctgacggt ggatgctcgt aaccacggtg acagccccca cagcccagac atgagctacg 420

agatcatgag ccaggacctg caggaccttc tgccccagct gggcctggtg ccctgcgtcg tcgttggcca 490

cagcatggga ggaaagacag ccatgctgct ggcactacag agggtgagcc gcccatgtct ggggcctcct 560

cccattcagt atataccctg agggccctgc aggcaacctg ggactcacat gatcgttgga tgaccaagtt 630

caggctccag gagccatgcc tgagactccc tatgtctgcc taagactggt cccagttcgg ttctctccca 700

cagccagagc tggtggaacg tctcattgct gtagatatca gcccagtgga aagcacaggt gtctcccact 770

ttgcaaccta tgtggcagcc atgagggcca tcaacatcgc agatgagctg ccccgctccc gtgcccgaaa 840

actggcggat gaacagctca gttctgtcat ccaggacatg gccgtgcggc agcacctgct cactaacctg 910

gtagaggtag acgggcgctt cgtgtggagg gtgaacttgg atgccctgac ccagcaccta gacaagatct 980

tggctttccc acagaggcag gagtcctacc tcgggccaac actctttctc cttggtggaa actcccagtt 1050

cgtgcatccc agccaccacc ctgagattat gcggctcttc cctcgggccc agatgcagac ggtgccgaac 1120

gctggccact ggatccacgc tgaccgccca caggacttca tagctgccat ccgaggcttc ctggtctaag 1190

agttgctggc aagaagatgg ccgggcgtgg tggctcatgc ctgtaattcc agcactttgg gaggctaagg 1260

cgggaggatg acttgaggcc aggagttgga gaccagcctg gccaacatgg tgaaaccctg tctctactaa 1330

aaatacaaaa attagcctgg cgtggtggtg cacacctgta atcccagcta ctctggaggc tgaggcagga 1400

gaatcacttg aaccctggag gcagaggttg caatgagccg agatcacacc actacactcc agcctaggca 1470

acagagcaag actctgtctc aaaaaaaaca aaacaaaaag gaggcacaaa accccaggct tcaagtctct 1540

gcagcctgct ccacatttgg gcacagaagg actcagacag gcactgtgtg ggcacgaggt tttacagggg 1610

tggtcagacc tcaggcttta atgaataaag acactactcc caaaggtacc 1660

＜210＞2

＜211＞19

＜212＞RNA

＜213＞外引物sense

＜400＞2

gcuacgagau caugagcca 19

＜210＞3

＜211＞19

＜212＞RNA

＜213＞外引物antisense

＜400＞3

uggcucauga ucucguagc 19

＜210＞4

＜211＞20

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜400＞4

ctccacctga cagcaacatc 20

＜210＞5

＜211＞18

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜400＞5

ttcttggcaa tggcttca 18