一种用于乳腺癌诊断的锁核酸修饰分子信标及其制备方法与流程

本发明属于一种测定或检验核酸的分子信标，特别涉及一种测定或检验血清UHRF1 DNA的分子信标。

背景技术：

循环DNA广泛存在于人和动物的体液中，是一段500bp～30kb的双螺旋DNA结构，可用于肿瘤的诊断和预后评估。随着微量定量检测技术的飞速发展，循环DNA，特别是血液循环DNA，作为一种微创检查中的生物大分子标志物，日益受到人们的关注。目前用于检测临床血清标本中循环DNA的方法主要以PCR为基础，存在步骤多、耗时长、试剂/仪器昂贵等缺点。此外，循环DNA是一段双链DNA，以复合体的形式存在或者通过蛋白质结合在细胞表面。因此，在现有检测循环DNA技术中，有两个首要问题需要解决：1、将循环DNA与复合体或蛋白质分离开来；2、解螺旋。

循环DNA的检测被认为是一个潜在的肿瘤早期诊断和预后判断的有力手段。通过对肿瘤相关循环DNA的分析，将有助于临床上对肿瘤进行诊断、分期及预后的估计。研究发现，乳腺癌血清中UHRF1 DNA水平与无进展期生存负相关。分子信标具有背景信号低、灵敏度高、特意识别性强、操作简单、不必与未反应的探针分离即可实时监测、可用于活体分析等优点。本发明选择与乳腺癌诊断及预后相关的UHRF1 DNA进行检测，但常规分子信标用于检测血清标本时，由于核酸酶对分子信标骨架的降解和破坏作用，常导致假阳性信号的产生。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种能够抵抗血清中核酸酶的降解作用，与双链DNA杂交形成三股螺旋，无须变性直接对双链DNA进行检测分析，能够识别双链DNA分子，从而实现对乳腺癌的诊断与预后评估的特殊分子信标。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种经过锁核酸修饰的分子信标，用于乳腺癌的诊断。所述分子信标其序列为

5’-6-FAM-tCgA-tGtCaTtCaGgCgGaCcTcGtAg-TcGa-DABCYL-3’，其中tCgA为5’端茎部序列，TcGa为3’端茎部序列，荧光基团为6-FAM，淬灭基团为DABCYL，tGtCaTtCaGgCgGaCcTcGtAg为环状序列，其中环状序列中用小写表示的碱基是锁核酸修饰处理后的碱基。

针对待测基因选取特异性强的DNA片段，并以此序列信息来设计分子信标，分子信标的具体设计依据网站(www.molecular-beacons.org)中分子信标的设计原则来进行，环状探针结构设计原则为：长度在15～30个碱基之间；与目标DNA能互补配对。茎状序列结构设计原则：探针序列的长度为4～6个碱基；GC含量一般在70～80％之间；融链温度比检测温度要7～10℃；G碱基不能连接荧光基团。荧光基团与淬灭基团的选择：荧光基团能被相应的淬灭基团所淬灭，两个基团有一高的信号背景比(2.0以上)。

为了提高分子信标检测的灵敏度和稳定性，并实现直接检测双链DNA的目的，采用锁核酸来修饰本发明所述的分子信标。锁核酸(LNA)是一种寡核苷酸衍生物，与DNA或RNA具有相同的磷酸盐骨架，在识别DNA或RNA上具有明显的优势。LNA有以下几个特点：1、LNA与DNA的结合能力高于DNA与DNA的结合能力；2、LNA/DNA双链比DNA/DNA双链稳定性高；3、LNA对核酸酶的抗性高。除了以上优越性，选择锁核酸作为分子信标修饰方式的最主要原因是，锁核酸能够直接识别双链DNA，省去解螺旋及其后续的一系列复杂步骤。

附图说明

图1.锁核酸修饰的分子信标与双链DNA杂交示意图

图2.锁核酸修饰的分子信标结构示意图

具体实施方式

本发明用于乳腺癌诊断的分子信标，所述分子信标其序列为

5’-6-FAM-tCgA-tGtCaTtCaGgCgGaCcTcGtAg-TcGa-DABCYL-3’，其中tCgA为5’端茎部序列，TcGa为3’端茎部序列，荧光基团为6-FAM，淬灭基团为DABCYL，tGtCaTtCaGgCgGaCcTcGtAg为环状序列，其中环状序列中用小写表示的碱基是锁核酸修饰处理后的碱基。

现介绍本发明用于乳腺癌诊断的分子信标设计及其制备方法。

a.针对待测基因选取特异性强的DNA片段。通过序列比对软件如Blast来保证所选的序列的唯一性：选择的UHRF1 DNA片段为：5’-TCGACTACGAGGTCCGCCTGAATGACA-3’。

b.根据所选序列设计需要合成的分子信标。设计的UHRF1 DNA的分子信标环状序列为TGTCATTCAGGCGGACCTCGTAG，荧光基团为6-FAM，淬灭基团为DABCYL。为了有效避免黏末端结合，分子信标的一端茎部区域与目标序列互补。

c.确定锁核酸修饰的位置和数量。查询文献可知，在保证杂交速率的前提下，使得分子信标抗核酸酶分解，则分子信标需要每隔一个DNA碱基修饰一个锁核酸。即合成的分子信标序列为

5’-6-FAM-tCgA-tGtCaTtCaGgCgGaCcTcGtAg-TcGa-DABCYL-3’，其中tCgA为5’端茎部序列，TcGa为3’端茎部序列，荧光基团为6-FAM，淬灭基团为DABCYL，tGtCaTtCaGgCgGaCcTcGtAg为环状序列，其中环状序列中用小写表示的碱基是锁核酸修饰处理后的碱基。

根据上述确定的分子信标序列可交由相关公司(如生工)进行合成。

本发明分子信标使用方法：用QIAamp DNA提取试剂盒抽提游离DNA，分别加入2μL提取的DNA，10nM分子信标于Tris-HCI缓冲液中(含100mM NaCl，5mM KCl，5mg MgCl2·6H2O)，形成200μL体系，室温放置30min，用荧光仪检测荧光强度。