本发明涉及金黄色葡萄球菌，尤其是涉及一种二维编码的金黄色葡萄球菌分子分型方法。
背景技术：
：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，简称金葡)属于革兰氏阳性细菌，广泛分布于自然界，可以引起人和动物的感染。金葡在其进化过程中具备了强大的遗传适应性，具有抗干燥、耐热、耐低温、耐高渗的特点，为金葡的大规模感染提供了必备条件。金葡是引起院内感染和社区感染的主要病原菌之一[1-3]。据估计，超过20％的人类是金葡的携带者[4,5]。金葡是一种引起高死亡率的致病菌，主要原因之一是金葡的感染部位多样，可造成皮肤和软组织、呼吸系统、肠道、血液、泌尿系统等各种组织器官的感染，引起外科切口、创面的局部化脓性感染，骨髓炎、化脓性关节炎和深部脓肿等深组织感染及肺炎、食物中毒、败血症、心内膜炎等全身感染疾病[6,7]。其次，金葡易感人群众多，疾病患者及新生儿是其主要的易感人群[8,9]，在重症加强护理病房(ICUs)，由于金葡导致的患者死亡率可达到50％，并且不断成增长趋势[10]。1961年，英国Jevons首次报道发现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)，自此以后，逐渐发现金葡除对β-内酰胺类抗生素药物产生耐药性，对红霉素、克林霉素等多种抗生素也可形成耐药性，并呈多重耐药趋势[11]。目前，针对金葡，临床常检的抗生素种类接近20种，MRSA也被广大学者称为“超级细菌”[12]。目前治疗金葡的最有效抗生素是万古霉素，但是，20世纪90年代后，世界各地也相继发现了耐万古霉素金黄色葡萄球菌(vancomycin-resistantStaphylococcusaureus，VRSA)菌株[13-16]，使临床治疗陷入困境。2009年1月，《NEngJMed》将MRSA列为耐药菌中首位“临床超级挑战”[17]。MRSA在世界各大医院均具有很高的流行性，据统计[18]马俊英,刘健华,陈杖榴,etal.细菌分型的分子生物学技术研究进展[J].中国兽医科学,2007,37(10):914-918，北美、南美和马耳他的MRSA分离率大于50％，而中国、澳大利亚、非洲和欧洲部分国家和地区的MRSA分离率达到了25％～50％(例如葡萄牙为49％，希腊40％，意大利为37％)，而仅荷兰、斯堪的纳维亚等少数欧洲国家的MRSA分离率较低。亚洲部分国家和地区院内MRSA的分离率也远远超过50％，尤其在斯里兰卡(86.5％)、南韩(77.6％)、越南(74.1％)、中国台湾(65.0％)、泰国(57.0％)和中国香港(56.8％)[19-22]。由金葡，尤其是MRSA导致的疾病暴发流行事件遍及全球，死亡率不断攀升，已经引起世界各地医疗工作人员和科学研究者的广泛重视[23,24]。据2007年美国疾病控制和预防中心统计，世界每年约有100000人感染MRSA，与艾滋病、病毒性乙型肝炎并列成为世界三大感染性疾病，严重威胁着人类的健康[25]。根据日本卫生部公布的数字，日本在20年间(1980～1999)由金葡引起的食物中毒共有2525起暴发事件，包括59964人，3人死亡。由金葡引起的食物中毒暴发事件，首推2000年“雪印奶粉”事件，超过14000人受感染。面对金葡感染如此严峻的形势，减少社会损失的重要策略是防控为主，即控制金葡，尤其是MRSA的流行传播，因此，需要利用病原微生物分型技术明确流行环节、切断传播途径、中止耐药菌株在人群中的传播。金葡是MLST分型具有代表性的成功例子，自金葡的MLST方案提出以来[26]，MLST数据库中的菌株数目已达到4246株，序列类型2151个(见http://saureus.mlst.net/，2012年3月5日)。其中从1961～2008年，世界各地主要报道了五大金葡克隆群(clonalcomplex，CC)，包括CC5、CC8、CC22、CC30和CC45[27-29]它们各包含了多种序列型，其中CC5和CC8是世界最主要流行克隆群，美国和欧洲国家的主要流行型为CC30-ST36和CC45[28-32]，而亚洲国家最要流行型为CC8-ST239，CC5-ST5和CC22-ST22[20,33-39]。病原微生物引起的传染性疾病是全球公共卫生领域面临的严峻课题。通过病原微生物分型，可实现对病原微生物的流行病学调查、跟踪和阻断传播途径以遏制其暴发流行。理想的病原微生物分子分型技术，应具有分型能力强、操作简便、重复性好、准确快速、高通量自动化、成本低廉的特点。本发明以沙门氏菌和金黄色葡萄球菌为模型，建立了一种新型的数字化病原微生物分子分型技术-基于熔点编码的分子分型(MLMT)。目前病原微生物的分型技术主要分为表型分型技术和核酸指纹分型技术。表型分型技术主要是通过观察病原微生物的外部形态特征及生化特性对其进行分型鉴定的方法，这种方法虽然具有简单直观的优点，是获得菌株基本信息和进行流行病学调查不可缺少的手段，但表型特征数量有限且易受环境因素的影响，具有较强的主观性，且分型方法一般耗时较长，延误了疾病传播控制的最佳时间。包括血清分型、噬菌体-生物分型、抗药性分型、免疫印迹分型等。核酸指纹分型技术是以病原微生物的核苷酸序列差异作为分析对象的分子生物学检测方法，主要分为基于电泳图谱分析的分子分型技术和基于PCR的分子分型技术。基于电泳图谱的分子分型技术包括核糖体分型(ribotyping)[19]、随机扩增多态性DNA(RAPD)[20]、限制性片段长度多态性(RFLP)[21]、扩增片段长度多态性(AFLP)[22]、脉冲场凝胶电泳(PFGE)[23]、可变数目串联重复分析(VNTR)[24]、多位点可变数目串联重复分析(MLVA)[25]等。这些方法在研究病原菌的流行病学特征、了解病原菌的传播途径、追溯传染源及在临床传染性疾病的诊断中都发挥了重大作用，PFGE技术也已成为许多病原微生物分型的“金标准”[26]。但是基于电泳图谱的分型技术存在一些局限[27]，主要表现为：(1)通过电泳条带的大小和有无进行判断分析，不排除存在片段大小相近的条带，序列差异却较大的可能。(2)不同实验室间的重复性较差，需要专业人员操作判读，数据不具有共享性。(3)操作繁琐，技术复杂，耗时较长，实验结果影响因素较多等。基于PCR的分子分型技术主要包括多位点序列分型技术(MultilocusSequenceTyping，MLST)及其基于MLST技术的改进方案(PCR/质谱技术和PCR/HRM技术)。(一)MLST技术MLST技术于1998年提出[28-31]，是一种建立在管家基因核苷酸序列基础上的分型方法，目前已成为部分病原微生物的长期流行病学和遗传分析的金标准。其原理是根据菌种的流行病学和分型的研究背景，选择具有代表性的菌株，在此基础上，筛选细菌基因组上相对保守又可允许局部碱基发生点突变的6～10个管家基因(一般是7个)，设计特异性引物，并进行PCR扩增和产物测序(长度一般为400～500bp)[32,33]。每个基因位点的突变对应此管家基因的一种等位基因型别，将每个菌株在各管家基因的等位基因型按照顺序串联排列起来，就形成菌株的等位基因图谱(alleleprofile)或称序列类型(SequenceType，ST)，代表该菌株特有的核苷酸序列信息。由于ST包含多个基因位点的序列变异情况，对于某些细菌，可由此获得十分精细的分型，并通过构建系统发育树图用于各组群菌株间的基因组相关性分析[34,35]。MLST序列信息具有无歧义和可传输的优点，目前主要致病菌都已建成了MLST数据库(http://www.mlst.net/；http://pubmlst.org)，可以方便世界各地的实验室通过互联网传递数据，形成某菌种详尽的信息，使不同实验室间的结果具有可重复性和可比性[36]。MLST实验上仅需PCR扩增和测序，无需电泳步骤，且对样品来源要求低，可不经细菌培养进行分析。另外，高通量测序技术的发展，也为MLST的应用提供了新的契机[37]。MLST技术拥有许多优点，但其局限性也不容忽视。首先，MLST不适于管家基因变异程度低或者无变异的菌株。其次，MLST不适合多数一线实验室，测序技术本身操作复杂，难以在疾病暴发时由医院本身完成，实效性较差。此外，测序仪价格高昂，MLST需要多个目标片段的测序分析，对大量菌株进行研究时，显然存在成本问题和时间问题，这些都限制了MLST的推广。目前，我国的MLST应用尚处在初步阶段，应用不多。(二)PCR/质谱技术2007年，Honisch等[38]提出用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(Matrix-assistedLaserDesorption/IonisationTime-of-flightMassSpectrometry，MALDI-TOFMS)代替测序，进行MLST分析的思路。该方法结合特意性酶切(C和U碱基)技术和质谱分析技术，实现对菌株的分型和鉴定，结果可在2个工作日内获得。该方法使用384孔自动加液器进行PCR操作，在自动化程度和检测通量上具有优势，并取得了与MLST相当的重现性和分辨力，与MLST方法的一致率为98％。2009年，Hall等[39]提出采用电喷雾离子化质谱(ElectrosprayIonizationMassSpectrometry，ESI-MS)代替测序进行MLST分析。通过计算碱基组成(A、G、C、T四种碱基的数目)，实现对菌株的分型和鉴定。该方法将PCR与ESI-MS相结合，1天内可分析180份样品。但该方法无法分辨碱基组成相同，但碱基排序差异较大的菌株，从这点上讲，ESI-MS可能不如MALDI-TOFMS与MLST方法的符合程度高。上述两种离子源质谱，在检测通量和自动化程度上都有了显著进步，但共同缺点是仪器成本高。另一方面，无论是利用碱基酶切图谱还是碱基组成，都无法达到测序的分辨能力。(二)PCR/HRM技术2011年，一个加拿大和美国联合小组报道了另一种利用高分辨熔解分析技术(HighResolutionMeltingAnalysis，HRM)进行多位点分型的策略[40]。他们以空肠弯曲菌为研究对象，直接将MLST方法中的各个片段分成若干小片段进行HRM分析(7个MLST片段共分成17个HRM片段)，然后将这些小片段的HRM曲线组合起来与MLST的等位基因型相对照，结果表明绝大多数的等位基因(92％)都可被区分。该文章同时指出，利用HRM进行MLST分型，费用为测序的20％～30％。同年，来自澳大利亚的一个研究组连续发表3篇文章[41-43]报道了利用HRM进行多位点分型的新模式，命名为“SNPnucleatedmini-MLSTtyping”，简称为“Minimtyping”。他们首先利用自主研发的MinimumSNPs软件[44-48]，从MLST数据库包含的7个管家基因片段中选取数个单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms,SNPs)位点。这些SNPs位点在菌株中一旦发生变异，会引起相应片段G+C百分比发生变化，继而引起HRM曲线形状的变化。通过获得包含这些SNPs位点的HRM曲线类型，就可以获得这些SNPs位点的基因型，进而推算出其对应的菌株的ST型。由于HRM曲线还具有检测片段内部其它变异位点(特别是能引起G+C含量变化的位点)的能力，因此比单纯的SNP分型具有更高的分辨力。两个小组都认为采用HRM的好处是操作简便、成本低，分辨能力不低于质谱法，且通过384孔实时PCR仪器的使用，能对大量菌株进行高通量分析。但同时也都指出，无论是对基因实行分段检测还是采用优选的SNPs，HRM方法都不能对扩增片段中的突变位点进行定位，而引起分辨能力下降。同时，HRM方法每PCR反应只能检测一个扩增片段，不能实现真正意义上的高通量检测[49]。综上所述，最理想的分型技术应具有以下特点[50-53]：(1)结果明晰，高重复性，可操作性；(2)不同实验室间结果的可对比性；(3)病原菌暴发时，用于分型以用于控制疫情的实时阶段是1.5～3天，因此，要求分型快速、高通量、自动化；(4)操作简便，便于储存、传递和更新数据；(5)方法具有通用性，适用于多种病原微生物的分型；(6)成本低廉。因此，随着基因组学及PCR技术的完善发展，以及高通量和低成本核酸测定的实现，一系列基于PCR的分子分型技术逐步取代了基于电泳图谱的分子分型技术。参考文献：[1]MadiganMT,MartinkoJM,ParkerJ,etal.Biologyofmicroorganisms:prenticehallUpperSaddleRiver,NJ,1997.[2]李维彬,郭辰虹,王玉炯.病原微生物快速检测方法及研究进展[J].生物技术通报,2006,2.[3]PerryRD,FetherstonJD.Yersiniapestis--etiologicagentofplague[J].Clinicalmicrobiologyreviews,1997,10(1):35-66.[4]BaruaD.Historyofcholera.Cholera.Springer,1992:1-36.[5]FennerF,HendersonDA,AritaI,etal.Smallpoxanditseradication.][J].1988.[6]SwaminathanB,FengP.Rapiddetectionoffood-bornepathogenicbacteria[J].AnnualReviewsinMicrobiology,1994,48(1):401-426.[7]PanT-M,WangT-K,LeeC-L,etal.Food-bornediseaseoutbreaksduetobacteriainTaiwan,1986to1995[J].Journalofclinicalmicrobiology,1997,35(5):1260-1262.[8]BrennanP.Structure,function,andbiogenesisofthecellwallofMycobacteriumtuberculosis[J].Tuberculosis,2003,83(1):91-97.[9]ZijlstraE,El-HassanA,IsmaelA,etal.Endemickala-azarineasternSudan:alongitudinalstudyontheincidenceofclinicalandsubclinicalinfectionandpost-kala-azardermalleishmaniasis[J].TheAmericanjournaloftropicalmedicineandhygiene,1994,51(6):826.[10]乌正赉,曾光.病原微生物的耐药性问题[J].中华流行病学杂志,1997,18(2):114-117.[11]SalaunL,SnyderLA,SaundersNJ.Adaptationbyphasevariationinpathogenicbacteria[J].Advancesinappliedmicrobiology,2003,52:263-302.[12]ConsortiumCSME.MolecularevolutionoftheSARScoronavirusduringthecourseoftheSARSepidemicinChina[J].Science,2004,303(5664):1666-1669.[13]罗成旺,卢金星.病原微生物实验室生物安全管理工作进展与对策[J].中华流行病学杂志,2007,27(12):1093-1094.[14]OrganizationWH.Pandemic(H1N1)2009-update56[J].2009.[15]Real-TimeR.EmergenceofanovelswineorigininfluenzaA(H1N1)virusinhumans[J].NEngljMed,2009,360:2605-2615.[16]谢学勤,高建华,杨晓英,etal.当前新发传染病的流行特点及防控建议[J].首都公共卫生,2007,1(5):205-206.[17]李雪,金莉莉,王秋雨.病原微生物分子分型技术研究进展[J].中国公共卫生,2007,23(3):373-374.[18]马俊英,刘健华,陈杖榴,etal.细菌分型的分子生物学技术研究进展[J].中国兽医科学,2007,37(10):914-918.[19]AarestrupFM,WegenerHC,JensenN,etal.Astudyofphage-andribotypepatternsofStaphylococcusaureusisolatedfrombovinemastitisintheNordiccountries[J].ActaVeterinariaScandinavica,1996,38(3):243-252.[20]ChansiripornchaiN,RamasootaP,BangtrakulnonthA,etal.ApplicationofrandomlyamplifiedpolymorphicDNA(RAPD)analysisfortypingavianSalmonellaentericasubsp.enterica[J].FEMSImmunology&MedicalMicrobiology,2000,29(3):221-225.[21]GohS-H,ByrneS,ZhangJ,etal.MoleculartypingofStaphylococcusaureusonthebasisofcoagulasegenepolymorphisms[J].Journalofclinicalmicrobiology,1992,30(7):1642-1645.[22]vanBelkumA,MellesDC,PeetersJK,etal.Methicillin-resistantand-susceptibleStaphylococcusaureussequencetype398inpigsandhumans[J].Emerginginfectiousdiseases,2008,14(3):479.[23]BoschT,deNeelingA,SchoulsL,etal.PFGEdiversitywithinthemethicillin-resistantStaphylococcusaureusclonallineageST398[J].BMCmicrobiology,2010,10(1):40.[24]MellmannA,WenigerT,BerssenbrüggeC,etal.BasedUponRepeatPattern(BURP):analgorithmtocharacterizethelong-termevolutionofStaphylococcusaureuspopulationsbasedonspapolymorphisms[J].BMCmicrobiology,2007,7(1):98.[25]SobralD,SchwarzS,BergonierD,etal.Highthroughputmultiplelocusvariablenumberoftandemrepeatanalysis(MLVA)ofStaphylococcusaureusfromhuman,animalandfoodsources[J].PloSone,2012,7(5):e33967.[26]ChurchDL,ChowBL,LloydT,etal.Comparisonofautomatedrepetitive-sequence–basedpolymerasechainreactionandspatypingversuspulsed-fieldgelelectrophoresisformoleculartypingofmethicillin-resistantStaphylococcusaureus[J].Diagnosticmicrobiologyandinfectiousdisease,2011,69(1):30-37.[27]刘金华,贺丹,etal.多位点测序分型技术在病原微生物分型鉴定中的应用[J].微生物学通报,2007,34(6):1188-1191.[28]MaidenMC,BygravesJA,FeilE,etal.Multilocussequencetyping:aportableapproachtotheidentificationofcloneswithinpopulationsofpathogenicmicroorganisms[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1998,95(6):3140-3145.[29]JolleyKA,ChanM-S,MaidenMC.mlstdbNet–distributedmulti-locussequencetyping(MLST)databases[J].BMCbioinformatics,2004,5(1):86.[30]AanensenDM,SprattBG.Themultilocussequencetypingnetwork:mlst.net[J].Nucleicacidsresearch,2005,33(suppl2):W728-W733.[31]ChanM-S,MaidenMC,SprattBG.Database-drivenmultilocussequencetyping(MLST)ofbacterialpathogens[J].Bioinformatics,2001,17(11):1077-1083.[32]张少敏,徐建国.多位点序列分型及其应用[J].疾病监测,2008,23(10):648-650.[33]TurnerKM,FeilEJ.Thesecretlifeofthemultilocussequencetype[J].Internationaljournalofantimicrobialagents,2007,29(2):129-135.[34]SaitouN,ImanishiT.RelativeefficienciesoftheFitch-Margoliash,maximum-parsimony,maximum-likelihood,minimum-evolution,andneighbor-joiningmethodsofphylogenetictreeconstructioninobtainingthecorrecttree[J].MolBiolEvol,1989,6(5):514-525.[35]SokalRR,SneathPH.Principlesofnumericaltaxonomy[J].Principlesofnumericaltaxonomy,1963.[36]PfallerMA.Molecularepidemiologyinthecareofpatients[J].Archivesofpathology&laboratorymedicine,1999,123(11):1007-1010.[37]BakerS,HanageWP,HoltKE.Navigatingthefutureofbacterialmolecularepidemiology[J].Currentopinioninmicrobiology,2010,13(5):640-645.[38]HonischC,ChenY,MortimerC,etal.Automatedcomparativesequenceanalysisbybase-specificcleavageandmassspectrometryfornucleicacid-basedmicrobialtyping[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2007,104(25):10649-10654.[39]HallTA,SampathR,BlynLB,etal.RapidmoleculargenotypingandclonalcomplexassignmentofStaphylococcusaureusisolatesbyPCRcoupledtoelectrosprayionization-massspectrometry[J].JClinMicrobiol,2009,47(6):1733-1741.[40]LevesqueS,MichaudS,ArbeitRD,etal.High-resolutionmeltingsystemtoperformmultilocussequencetypingofCampylobacterjejuni[J].PloSone,2011,6(1):e16167.[41]LilliebridgeRA,TongSY,GiffardPM,etal.Theutilityofhigh-resolutionmeltinganalysisofSNPnucleatedPCRamplicons--anMLSTbasedStaphylococcusaureustypingscheme[J].PLoSOne,2011,6(6):e19749.[42]RichardsonL,TongS,TowersR,etal.Preliminaryvalidationofanovelhigh-resolutionmelt-basedtypingmethodbasedonthemultilocussequencetypingschemeofStreptococcuspyogenes[J].ClinicalMicrobiologyandInfection,2011,17(9):1426-1434.[43]TongSY,XieS,RichardsonLJ,etal.High-resolutionmeltinggenotypingofEnterococcusfaeciumbasedonmultilocussequencetypingderivedsinglenucleotidepolymorphisms[J].PloSone,2011,6(12):e29189.[44]PriceEP,HuygensF,GiffardPM.FingerprintingofCampylobacterjejunibyusingresolution-optimizedbinarygenetargetsderivedfromcomparativegenomehybridizationstudies[J].Appliedandenvironmentalmicrobiology,2006,72(12):7793-7803.[45]StephensAJ,HuygensF,Inman-BamberJ,etal.Methicillin-resistantStaphylococcusaureusgenotypingusingasmallsetofpolymorphisms[J].Journalofmedicalmicrobiology,2006,55(Pt1):43-51.[46]PriceEP,Inman-BamberJ,ThiruvenkataswamyV,etal.Computer-aidedidentificationofpolymorphismsetsdiagnosticforgroupsofbacterialandviralgeneticvariants[J].BMCBioinformatics,2007,8:278.[47]StephensAJ,HuygensF,GiffardPM.Systematicderivationofmarkersetsforstaphylococcalcassettechromosomemectyping[J].AntimicrobAgentsChemother,2007,51(8):2954-2964.[48]HuygensF,Inman-BamberJ,NimmoGR,etal.Staphylococcusaureusgenotypingusingnovelreal-timePCRformats[J].JClinMicrobiol,2006,44(10):3712-3719.[49]WittwerCT.High-resolutionDNAmeltinganalysis:advancementsandlimitations[J].Humanmutation,2009,30(6):857-859.[50]StruelensM.Consensusguidelinesforappropriateuseandevaluationofmicrobialepidemiologictypingsystems[J].Clinicalmicrobiologyandinfection,1996,2(1):2-11.[51]vanBelkumA,NiestersHG,MacKayWG,etal.Qualitycontrolofdirectmoleculardiagnosticsformethicillin-resistantStaphylococcusaureus[J].Journalofclinicalmicrobiology,2007,45(8):2698-2700.[52]StefaniS,ChungDR,LindsayJA,etal.Meticillin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA):globalepidemiologyandharmonisationoftypingmethods[J].Internationaljournalofantimicrobialagents,2012,39(4):273-282.[53]LindsayJA.EvolutionofStaphylococcusaureusandMRSAduringoutbreaks[J].Infection,geneticsandevolution:journalofmolecularepidemiologyandevolutionarygeneticsininfectiousdiseases,2013.[54]CaliendoAM,GilbertDN,GinocchioCC,etal.Bettertests,bettercare:improveddiagnosticsforinfectiousdiseases[J].Clinicalinfectiousdiseases:anofficialpublicationoftheInfectiousDiseasesSocietyofAmerica,2013,57Suppl3:S139-170.[55]BaronEJ,MillerJM,WeinsteinMP,etal.Aguidetoutilizationofthemicrobiologylaboratoryfordiagnosisofinfectiousdiseases:2013recommendationsbytheInfectiousDiseasesSocietyofAmerica(IDSA)andtheAmericanSocietyforMicrobiology(ASM)(a)[J].Clinicalinfectiousdiseases:anofficialpublicationoftheInfectiousDiseasesSocietyofAmerica,2013,57(4):e22-e121.技术实现要素：本发明的目的在于提供一种二维编码的金黄色葡萄球菌分子分型方法。本发明所述一种二维编码的金黄色葡萄球菌分子分型方法，包括以下步骤：1)从MLST数据库获取金黄色葡萄球菌7个管家基因的各等位基因序列信息；2)利用MinimumSNPs软件将7个管家基因进行连锁，并计算筛选出对于提高分型分辨率具有最大贡献的15个SNPs位点；3)针对选出的SNPs位点合理设计特异性探针和引物；4)建立实时PCR体系；5)在实时PCR仪上运行反应程序，产生3组菌株的熔点特征值；6)对3组菌株熔点特征值进行等位基因图谱转换，确定熔解类型(MeltingType，MT)，建立具有传输性的标准MLMT数据库，简称McMLST数据库；7)将MT的等位基因图谱转化为条形码，便于菌株信息的记录和数据的电子快速读取，最终，MLMT技术实现SNPs-熔点特征值-等位基因图谱-MT类型-条形码的一条完整的菌株数字化分型系统。在步骤1)中，所述MLST数据库参见http://www.mlst.net/；http://pubmlst.org。在步骤2)中，所述SNPs位点的筛选原则可为：要求筛选出的每个SNPs位点仅存在两种碱基的转换；探针对两种碱基获得的ΔTm比较大，区分度比较好；对于三种或四种碱基时，两两之间的ΔTm区分度较差。在步骤3)中，所述特异性探针的设计原则可为：(1)SNPs尽量位于整条探针的中央部分，中央碱基错配可引起探针Tm的变化幅度较大；(2)探针覆盖区域尽可能的避免其它SNPs位点对目的SNPs位点区分的干扰作用，使目的SNPs位点能够得到较好的区分，存在干扰位点时，可通过碱基修饰等方式缩小干扰，探针序列如表2所示。表2所述引物的设计方法可为：为了产生更多的单链产物用于探针熔解曲线的分析，利用LATE-PCR(见参考文献[44,45])进行扩增，限制性引物的Tm值要高于过量引物的Tm值，设计引物时要对应探针设计所在的基因组链，引物的序列如表1所示。表1在步骤4)中，所述建立实时PCR体系的具体方法可为：建立3个PCR反应，每个PCR反应中含有4对引物和5条标记有不同荧光基团的双标记自淬灭探针，对应于实时PCR仪的ROX、FAM、HEX或CY5通道，同时检测5个SNPs位点。在步骤6)中，所述等位基因图谱转换的原则可为：以目的SNPs位点为基准，凡是目的SNPs位点与探针匹配的靶序列，其等位基因编码均设为0；凡是目的SNPs位点与探针错配的靶序列，其等位基因编码均设为1；从熔解曲线的直观结果来看，对两种编码的Tm可划定一条界线，凡是Tm高于此界线，其等位基因编码则为0，反之，等位基因编码则为1；所述具有传输性的标准MLMT数据库包括MT1(110001110010111)。MLMT方法是一种针对SNPs位点进行的分型技术，因此，在设计过程中，对于SNPs位点的筛选、探针的设计均具有一定的要求，这些要求决定了等位基因图谱编码的原则。MLMT方法以一种新型的数字化分型方式，利用多色探针熔解曲线，实现了从熔点特征组合到等位基因图谱之间的无歧义的转化，从而建立起一种快速高效、高通量、不失真、且具成本优势的理想的新型MLST分型方案。附图说明图1为本发明实施例1的一种二维编码的金黄色葡萄球菌分子分型方法原理示意图；图2为本发明实施例2的一种二维编码的金黄色葡萄球菌分子分型方法特征熔解峰；图3为本发明实施例1的一种二维编码的金黄色葡萄球菌分子分型方法灵敏度结果。具体实施方式实施例1：一种二维编码的金黄色葡萄球菌分子分型方法体系设计MLST数据库中下载2151个序列型的管家基因的等位基因序列信息，7个管家基因分别为arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi、yqiL，各管家基因含有的序列数目分别为arcC-261个序列，aroE-346个序列，glpF-292个序列，gmk-172个序列，pta-258个序列，tpi-266个序列，yqiL-268个序列。这7个管家基因既相对保守，又会发生局部点突变，具有相对变化缓慢的突变累积效应，可用于长期追踪菌株间遗传关系和宏观进化过程。同时，MLST数据库中具有2151个序列型的连锁序列，可下载直接被MinimumSNPs软件使用。为了进一步增加SNPs位点的选择，探讨提高MLMT分辨率的途径，将MinimumSNPs软件的D值设置为0.97，筛选出15个SNPs位点，每个SNPs位点有两种碱基变异类型。实施例1的一种二维编码的金黄色葡萄球菌分子分型方法原理示意图参见图1，该方法第一步通过MinimumSNPs软件筛选分型率高的SNP，根据SNP位点设计检测探针，然后进行体系建立，实时PCR扩增后进行熔解曲线分析，得到结果。实施例1的一种二维编码的金黄色葡萄球菌分子分型方法灵敏度结果参见图3。其最低检测限为10^1拷贝/μL。实施例2：一种二维编码的金黄色葡萄球菌分子分型方法特征熔解峰反应体系：反应A：反应总体积为25μL，包含67mMTris-HCl(pH8.8)，16mM(NH4)2SO4，0.01％(W/V)Tween20，3.5mMMgCl2，1.0UTaqHSDNA聚合酶，0.01UUNG酶，0.2mMdNTPs，0.2mMdUTP，0.08μM限制性引物，0.8μM过量引物，探针(FAM-glp-195P、FAM-aro-132P、HEX-arc-180P、ROX-arc-78P、ROX-gmk-129P)各0.2μM，5μL模板DNA。反应B：反应总体积为25μL，包含67mMTris-HCl(pH8.8)，16mM(NH4)2SO4，0.01％(W/V)Tween20，3.5mMMgCl2，1.0UTaqHSDNA聚合酶，0.01UUNG酶，0.2mMdNTPs，0.2mMdUTP，0.08μM限制性引物，0.8μM过量引物，探针为(FAM-aro-252P、ROX-aro-309P、ROX-tpi-69P)为0.1μM，HEX-arc-210P和FAM-pta-85P各0.2μM，5μL模板DNA。反应C：反应总体积为25μL，包含67mMTris-HCl(pH8.8)，16mM(NH4)2SO4，0.01％(W/V)Tween20，3.5mMMgCl2，1.0UTaqHSDNA聚合酶，0.01UUNG酶，0.2mMdNTPs，0.2mMdUTP，0.08μM限制性引物，0.8μM过量引物，探针(FAM-yqi-333P、FAM-yqi-192P、ROX-pta-294P、ROX-aro-212P)为0.15μM，HEX-tpi-36P为0.25μM，5μL模板DNA。反应程序：实时PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性10s，64℃退火15s(每循环一次温度下降1℃)，78℃延伸20s，10个循环；95℃变性10s，55℃退火15s(采集FAM、HEX、ROX通道的荧光信号)，78℃延伸20s，共55个循环。PCR反应结束后，进行探针熔解曲线分析，程序为：95℃变性1min，35℃保温3min，随后以0.5℃/step的升温速率，从35℃逐渐升温至90℃，在升温过程中采集FAM、HEX、ROX通道的荧光信号。实施例2的一种二维编码的金黄色葡萄球菌分子分型方法特征熔解峰参见图2，在图2中，A为原始熔解曲线图；B、C为熔点结果转化为二维编码结果的过程；D图为得到的二维码结果。实施例3：一种二维编码的金黄色葡萄球菌分子分型方法体系灵敏度分析灵敏度是考察分型体系性能的一个参考指标，随机选取一份标本为模板(已用ND-1000紫外可见分光光度计计算其浓度)，对体系灵敏度进行考察。用1×TE缓冲液将模板DNA梯度稀释，得到10^5、10^4、10^3、10^2、10^1拷贝/μL一系列浓度梯度的模板，每个浓度梯度上样5μL，阴性对照以1×TE缓冲液代替。考察体系对10^5、10^4、10^3、10^2、10^1拷贝/μL一系列浓度梯度模板的检出能力，每个反应模板为5μL。结果显示，反应A、B、C的最低检测限为最低检测限为10^1拷贝/μL。每个检测通道中，不同初始浓度的样本在扩增后，产物的熔解曲线峰对应的Tm值基本一致，波动范围为±0.5℃，模板浓度的改变不会影响到检测结果的稳定性。表3金黄色葡萄球菌等位基因编码谱参见图3。序列表<110>厦门大学<120>一种二维编码的金黄色葡萄球菌分子分型方法<130>2016<160>34<170>PatentInversion3.3<210>1<211>25<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>1caaggtatgataggctattggttgg25<210>2<211>19<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>2tataaccacgtcctgcatc19<210>3<211>26<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>3atcggaaatcctatttcacattcctg26<210>4<211>25<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>4atcctttaacataaccaataccatc25<210>5<211>20<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>5gcggtgtctttagctcttgc20<210>6<211>24<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>6atgccattgttccgataatatcac24<210>7<211>25<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>7aatgacaacacgtcaaatgcgttaa25<210>8<211>23<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>8tcatgaccttcgtccattgtatc23<210>9<211>26<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>9cagattatgttacaccaatcgtgtta26<210>10<211>25<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>10aatcataaagaagatacctgatgtc25<210>11<211>20<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>11tccaacaagctaaatcgaac20<210>12<211>22<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>12tataaccacgtcctgcatcttc22<210>13<211>25<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>13tgaagctttaaatattccaattgag25<210>14<211>22<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>14aatacctttacttgcaccacct22<210>15<211>24<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>15agtacaatcatttgttgaacgacg24<210>16<211>26<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>16tacacctggtttcgttttgatgattg26<210>17<211>25<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>17gcagatttaggcgttaaatacgttg25<210>18<211>25<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>18agctttcttaacttgctcacctaca25<210>19<211>26<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>19ttgattaaatacatctattaaaccca26<210>20<211>35<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>20tgtcggagcaacgattgtatggttaatgtacttgc35<210>21<211>25<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>21acaattcctcataaagagcgtatca25<210>22<211>33<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>22cgtgtggaagtagacaaaaatgatccacgattt33<210>23<211>32<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>23tggtgcaatgtcacaaggtatgataggctatt32<210>24<211>26<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>24ttgaagctttaatcaaagatgaccaa26<210>25<211>30<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>25ctgtgcaatccttttacataaccaatacca30<210>26<211>20<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>26tagcccaaaaacttaacttg20<210>27<211>25<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>27ggaccaattggtttggttgggttat25<210>28<211>21<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>28acttgcaccacctgcgcccaa21<210>29<211>24<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>29tgtttccccaacacatataattgg24<210>30<211>32<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>30tgtcccatttgaaaaccgaagcgactgttgtt32<210>31<211>27<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>31ccacatactttattgaccgtaaatgca27<210>32<211>27<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>32atccatgtttgaaaatagcatgcgctt27<210>33<211>30<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>33cgcacagtgtctcctgttgaatgtgctgca30<210>34<211>30<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>34gttttgataacagatgacaagtggataggg30当前第1页1 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